KR101237696B1

KR101237696B1 - 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 ｗｄｒ２１ａ 유전자의 단일염기다형성 마커

Info

Publication number: KR101237696B1
Application number: KR1020100110151A
Authority: KR
Inventors: 박춘식; 신형두
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2013-02-26
Also published as: KR20120048789A

Abstract

본 발명은 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 마커, WDR21A 유전자 단일염기다형성 검출용 키트 및 WDR21A 유전자 단일염기다형성을 검출하여 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 본 발명은 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성 차이를 보여주는 유전적 변이를 입증한 발명으로서 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 마커를 제공할 수 있고, 천식의 예방 및 치료 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 ＷＤＲ２１Ａ 유전자의 단일염기다형성 마커{SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER OF WDR21A GENE FOR PREDICTING RESPONSIVENESS TO STEROIDS OF ASTHMATICS}

천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성과 유전자 변이와의 관련성에 관한 것이다.

글루코코르티코이드는 실질적으로 염증 캐스캐이드의 매 단계를 억제하여서 천식 치료의 기본을 구성한다. 여러 종류의 코르티코이드 중에서 흡입 글루코코르티코이드(glucocorticoids:GCs) 는 천식 치료에 혁명적이었고, 만성 천식 환자를 위한 치료의 메인스테이(mainstay)가 되어 왔다. 초기의 조정과 효과적인 용량과 흡입 스테로이드 요법의 충분한 기간이 천식 증상을 조절하고 유지하는 가장 좋은 방법이었다. 천식 관리 가이드라인에 따르면, 중간의 지속적 천식(moderate persistent asthma )환자들은 중간 또는 고용량의 흡입 GC(ICS) 또는 저용량의 ICS와 함께 LABA 요법을 시작하는 것이 권장된다. 심각한 지속적 천식(severe persistent asthma)을 가진 환자에게는 중간 또는 고용량의 ICS와 함께 LABA 요법을 시작하는게 권장된다. 그러나, 천식 환자의 작은 퍼센트는 최대한의 폐 기능을 확립하기 위해 고함량의 GCs가 요구될 정도로 심각한 증상을 가지고 있다. 게다가, 개체 간의 큰 변이가 ICS에 대한 치료반응에 있어서 존재한다. 이전의 관찰에서, 우리는 1000 ug 의 fluticasone으로 고용량 스테로이드 흡입 4주 후에 - 21 내지 126.8% 의 FEV1 변화를 알아냈다. 물론, 천식의 46%는 반응이 없었고, 고용량 흡입 GC 요법에 FEV1 반응에서 12% 미만이 증가하였다. 다른 발명에서, 흡입 베클로메타손(beclomethasone)을 투여한 22%의 개인이 치료 12주가 넘어서야 FEV1 감소를 보였고, 환자의 38%가 24주 넘게 5% 미만의 FEV1 개선을 보였다.

최근까지 ICS 요법에 대한 반응성의 결핍과 관련된 유전적인 변이에 대한 보고는 없었다. 미슨스(missence) 돌연변이나 선택적 스플라이싱 돌연변이가 GC 저항성과 관련되어 NR3Cl 유전자에서 보고된 바가 있다. 코르티코트로핀-방출 호르몬 리셉터 1(CRHR1) 유전자의 3개의 변이가 아이와 성인 천식에서 ICS 치료 8주 후에 FEV1에서의 개선과 연관되어 있다. 그러나, 이들 유전자의 유전적 효과는 스테로이드 반응의 모든 개인차를 완전히 설명해주지 못한다. 따라서 스테로이드 반응성의 개체간 변이 뒤의 유전적 배경을 밝히기 위해 생물학적으로 관련된 유전자 변이를 발견할 필요가 있었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphims: SNP) 마커, WDR21A 유전자 단일염기다형성 검출용 키트 및 WDR21A 유전자의 단일염기다형성을 검출하여 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 WD 리피트 도메인 21A(WD repeat domain 21A: 이하 WDR21A) 유전자 내에서 선택되며, 번역 개시점(서열번호 1의 11603번째 염기)으로부터 -10073번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 -10073번째 염기를 포함하는 8~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로서, 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 마커를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 1) 피검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 를 포함하는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 WDR21A 유전자 -10073C>G 단일염기다형성 마커는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성 차이를 보여주는 유전적 변이를 입증한 발명으로서 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 마커가 될 수 있고, 천식의 예방 및 치료 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 WDR21A 유전자의 유전자 지도, 일배체형을 나타낸 것이다. (a)는 엽색체 14q24.3에 있는 WDR21A의 유전자 지도와 SNPs이다. 검정 블록은 암호화 지역인 엑손을 나타내고, 흰 블록은 5'와 3' UTR을 나타낸다. 번역 개시 지점의 첫 번째 염기는 뉴클레오티드 +1로 표시하였고, 타겟 SNP는 붉은 박스 안에 있다. (b)는 WDR21A의 일배체형이고 (c)는 WDR21A SNPs 사이에서 LD 계수 (|D'|및 r2)를 나타낸 것이다.
도 2에서 (a)는 TM-align을 사용하여 WDR21A 를 예상한 것이고, (b)는 Gβ와 Gγ 단백질 복합체(녹색)의 구조 정렬한 것과 PyMol을 사용하여 예상되는 WDR21A (파란색)이다. 두 구조의 동일성은 0.145이고, 두 구조의 TM-스코어는 약 0.92814이다. (c)는 글루코코르티코이드 리셉터(GR)에 WDR21A가 바인딩한 것을 예상한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시예는 서열번호 1의 DDB1과 CUL4 결합 펙터 4( DDB1 and CUL4 associated factor 4 :DCAF4))라고 부르는, WD 리피트 도메인 21A (WD repeat domain 21A: 이하 WDR21A) 유전자 내에서 선택되며, 번역 개시점(서열번호 1의 11603번째 염기)으로부터 -10073번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 -10073번째 염기를 포함하는 8개 이상, 바람직하게는 8~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로서, 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 마커를 제공한다. 상기 번역 개시점으로부터 -10073번째 염기인 -10073C>G는 서열번호 1의 1530번째 염기이다.

상기 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예를 들면 아래와 같다.

서열번호 1: tttacagt c aacaactc

서열번호 2: ctaaaatgttgttttacagt c aacaactcctaactgctggg

서열번호 3: ttgttttttaagtcagctgtctaaaatgttgttttacagt c aacaactcctaactgctgggattataggca tgcaccacca

서열번호 4: agtgttaagagaaaattttgttgttttttaagtcagctgtctaaaatgttgttttacagt c aacaactcctaactgctgggattataggca tgcaccaccacacccggctaatttttaaat

서열번호 5: gcgttagtacaaagcttgcgcctgaagtatttcttaaataagtgttaagagaaaattttgttgttttttaagtcagctgtctaaaatgttgttttacagt c aacaactcctaactgctgggattataggcatgcaccaccacacccggctaatttttaaattatttgttaagatggggcggaggggtgtctcactatgttg

상기 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 다형성 마커 중 어느 하나 이상을 포함하는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 스테로이드는 구체적으로는 글루코코르티코이드이고, 더욱 구체적으로는 흡입 방법으로 투여하는 글루코코르티코이드이다.

본 발명의 일 실시예는 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 검출용 키트를 제공한다.

상기 프라이머(Primer)는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머쌍은 특별히 제한되지 않고 당업자가 통상의 방법으로 설계할 수 있다.

상기 프로브(probe)는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보적 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 의미하며 펩티드 핵산을 포함하며 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들어 dNTP, 중합효소, 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트는 마이크로어레이 형태로 제공할 수 있다. 마이크로어레이는 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭 (piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀 (pin) 형태의 스폿터 (spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 1) 피검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 를 포함하는 천식 환자의 스테로이드에 대한 반응성을 예상하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 피검체 또는 진단 대상으로부터 게놈DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직, 혈액 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사증폭 (transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

분리된 게놈 DNA 상에 존재하는 SNP 위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시 법에 의하여 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있다.

구체적으로, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법 (allele-specific amplification), 서열분석법 (sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법 (5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법 (molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법 (size analysis), TaqMan 프로브 PCR 분석방법 및 단일 가닥 배좌 다형성법 (singlestranded conformation polymorphism)으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

NR3C1(nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1)로 알려진, 글루코코르티코이드 리셉터(GR)는 코르티졸과 다른 글루코코르티코이드가 바인딩하는 리셉터이다. 주로 세포질에 위치하여 있고, 코르티코스테로이드의 신호 전달을 개시하여, 수 시간에서 수 일의 기간 후에 유전자 발현에 있어서 변화를 초래한다. 리셉터가 GC에 바인딩하고, GR이 구조적 변화를 겪은 후 활성화 과정으로 핵공을 통해 핵으로 이동한다. 리셉터-글루코코르티코이드 복합체는 두 경로 중에 하나를 택할 수 있다. 리간드-활성화된 GR은 타겟 유전자의 프로모터 지역에서, 직접적으로 글루코코르티코이드 반응 엘리먼트(GREs)와 상호작용하거나, 다른 전사 요소의 시토졸에서 핵으로의 이동을 막음으로써 그들의 타겟 유전자에서 나중의 활성에 간접적으로 영향을 미치는 단백질-단백질 상호작용 경로로 다른 전사 요소와 상호작용할 수 있다.

G 프로테인 (heterotrimeric guanine nucleotide-binding proteins:G proteins) 은 G프로테인-커플링된 리셉터(G protein coupled receptors (GPCRs)를 위한 하부의 신호전달자로 1000개 멤버로 구성되어 큰 패밀리로 형성하고 있다. 3개의 서브유닛인, Gα, G β 및 G γ가 있다. 유리된 GTP-G α 와 Gβ/Gγ 복합체는 그들의 하부 효과 분자와 상호작용하여 생체 작용을 한다. G β2 는 GR의 특이적 상호작용자로 전사적 활성을 음성적으로 조절한다. G-β 단백질이 많은 신호전달 캐스캐이드의 키 역할을 하기 때문에, GR-결합된 G β는 G 단백질 시스템이 영향을 받는 상태에서 타겟 조직 저항성이나 과민성의 발전에서 역할을 할 수 있어서 글루코코르티코이드에 대한 민감성이 변화된다. G β는 WD [tryptophan-aspartic acid (aspartate) (W-D) dipeptide] 리피트(repeat)이라고 부르는 7번 반복된 블레이드 같은 구조 특징의 부분을 포함하고 있다. WD 리피트를 포함하는 단백질은 대량적으로 40개 아미노산의 짧은 구조 모티프이고, 종종 트립토판-아스파테이트(W-D) 디펩티드(tryptophan-aspartic acid (aspartate) (W-D) dipeptide)에서 끝난다. 몇몇의 이들 리피트는 WD 도메인이라고 불리는 단백질 도메인 타입을 형성하면서 결합되어 있다. 결정학상 분석에서 G-β의 모든 WD-리피트가 4번 꼬인 가닥으로 이루어져 있고 링으로 배열되어 있어서, 프로펠라 같은 구조를 형성하는 것으로 드러났다. WDR 도메인은 다른 단백질과 상호작용하기 위한 부위로서 행동한다.

DDB1과 CUL4 결합 펙터 4( DDB1 and CUL4 associated factor 4 (DCAF4))라고 부르는, WDR21A (WD repeat domain 21A)는 WD-리피트를 포함하는 단백질을 암호화하고, Cul4-Ddb1 E3 리가제 거대분자 복합체와 상호작용하지만, 정확한 기능은 최근까지 밝혀지지 않았다. WD-리피트 도메인을 가지는 WDR21A가 Gβ/Gγ 복합체와 같은 다른 GR 리간드와 경쟁을 초래하여 스테로이드 리셉터와 결합한다면, WDR21A의 구조적 변경 또는 정량적 변경이 스테로이드 치료에 대한 반응성에서 개체간 차이와 관계가 있을 수 있다. 천식환자들에게 흡입 스테로이드에 대한 반응성에서 WDR21A 유전자의 유전적 역할을 밝히기 위해, 우리는 WDR21A 유전자의 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphisms)을 동정하였고, 환자들에게 고용량의 ICS로 4주간 치료한 후에 FEV1의 증가에 대한 유전적 연관성 분석을 수행하였다. 우리는 WDR21A의 구조와 GR에 바인딩하는 것을 예상하였고, G-beta와 비교하였다.

본 발명은 중간 내지 심각한(moderate-severe) 천식에서 고용량의 흡입 코르티코스테로이드의 조정 효과에 대한 WDR21A 유전자 변이를 밝힌 최초의 전망 있는 평가이다. 우리는 WDR21A 유전자의 총 15개의 다형성 중에 WDR21A -10073C>G가 중간 내지 심각한 천식환자들에게 흡입 스테로이드로 4주간 치료한 후에 FEV1의 변화와 상당히 관련이 있다는 것을 입증하였다. WDR21A -10073C>G의 열성 대립유전자 동형접합체를 가지는 천식환자들은 WDR21A -10073C>G의 CG 나 CC 제노타입을 가지는 환자들의 FEV1의 반응성보다 두 배 높은 것을 보여주었다. 이러한 데이터는 WDR21A -10073C>G의 열성 대립유전자가 흡입 스테로이드 치료에 대한 반응 경로에서 증진 효과 역할을 할 수 있다는 것을 증명해준다.

천식은 가역적인 기류 차단의 존재에 의해 밝혀졌지만, 비가역적인 기류 차단이 장기간 동안 지속된 일부 천식 환자들에게서 밝혀졌다. 따라서 초기와 장기간의 GC 치료법에 의한 조정이 필요하고, 심지어 상대적으로 약한 천식을 가진 환자들에게도 필요하다. 천식과 관련된 기도의 구조적 변화에 대해서 스테로이드에 민감한 구성물질과 스테로이드에 민감하지 않은 구성물질이 있다. 스테로이드에 민감하지 않은 구성물질은 고용량의 흡입 코르티코스테로이드로도 FEV1의 감소의 회복을 완전하게 하기에 충분하지 않다

GC 리셉터에서의 변화, GC 리셉터에 대한 바인딩에서의 비정상 및 (전사 팩터 조절 및) GC 반응성 유전자로의 이동에서의 변경이 GC 비민감성(insensitivity)로 알려져 있었지만 WDR21A 가 천식에서, 특히 스테로이드 반응성의 견지에서 평가된 적은 없었다. 따라서, 우리의 발명은 코르티코스테로이드 치료에 대한 세포 또는 조직 반응성에서 WDR21A 의 분자적 기능을 강조할 수 있다. 수많은 WD40 리피트 구성물질이 핵에서 발견되었고, 일부 경우에, 잠재적 기능이 G-프로테인-커플링 리셉터 시그널링의 다운 스트림에서 설명되어 왔고, WDR21A는 GR과 상호작용하여 핵으로 함께 이동하고 글루코코르티코이드-반응성 유전자의 GR-유도된 트랜스-활성화를 억제한다고 알려져 있었지만, G 프로테인의 Gβ/Gα에서처럼 글루코코르티코이드 리셉터에 WDR21A 가 바인딩한다는 것은 밝혀지지 않았다.

본 발명에서, 우리는 TBM 방법으로 WDR21A의 구조를 예상하였고, TM-align 을 사용하여 Gβ/Gα단백질 복합체에 대한 예상되는 구조를 정렬하였다. 그 결과는 WDR21A의 예상되는 프로펠러 구조가 단백질 복합체(Gβ/Gα)의 구조와 매우 유사하다는 것을 보여주었다. 게다가, 우리는 Gβ1과 Gβ2가 하는 것처럼 예상되는 WDR21A가 Zdock 에 의해 GR에 바인딩할 강한 가능성을 가지고 있다는 것을 알아냈다. WD 리피트 단백질 Gβ1과 Gβ2는 아미노산 263과 419 사이에서 둘러싸인 NH2-말단 지역에서 GR 과 상호작용하고, Gβ2는 이 상호작용을 위해 블레이드 3-5를 사용하였다. GR 에 대한 이러한 바인딩은 글루코코르티코이드-반응성 GRE- 포함 MMTV 프로모터에 대한 GR 의 전사적 활성을 억제하였고 내인성 Gβ1과 Gβ2는 TAT 효소 활성과 Kv1.5 칼륨 채널 mRNA 발현의 글루코코르티코이드-유도된 자극의 음성 조절자로 기능을 하였다. Gβ1과 같이 WDR21A은 GR에서 GRE를 막음으로써 GR 활성화를 억제할 가능성이 있다. 게다가, WDR21A는 WD 리피트 도메인을 가진다면 Gβ/Gα복합체와 같이 다른 GR 리간드와 경쟁하여 스테로이드 리셉터와 바인딩 할 수 있다. WDR21A단백질의 양 또는 구조에서의 변경은 세포질에서 글루코코르티코이드 리셉터를 미리 점유함으로써, Gβ/Gα복합체의 이동을 변화시킬 수도 있다.

우리는 흡입 GCs 를 시행한 천식 환자들 중에 폐기능 변화와 연관된 다양한 패턴을 알아냈다. 더 짧은 기간의 천식은, 혈액 호산구와 기준선에서 더 낮은 FEV1이 흡입 GCs 에 대한 반응성에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 보통 흡입 수단으로 투여되는 GCs 는 지속성 천식의 기도의 염증 반응의 잠재적인 저해자이다. 천식환자에게 GCs 를 처리하는 것은 기도에서 많은 침투하는 호산구와 림프구를 감소시키고 전 염증 중개자와 시토킨의 생산과 방출을 감소시킨다. 결과적으로 천식환자의 기도의 구조적 비정상의 일부는 GCs 치료 후에 정상화된다. 따라서, 스테로이드 반응성과 WDR21A다형성과의 연관성은 기도 염증과 리모델링을 가지는 유전자 기능의 관계에서 나온 것일 수 있다.

보통, 증상, 피크 호기량, 구조 2-작용제(rescue 2-agonist) 및 폐 기능과 같은 공통적으로 측정되는 결과에서의 통계적으로 중요한 차이를 탐지하기 위해 흡입 스테로이드 용량에서 4배 이상 차이가 요구되어 왔다. 우리는 GCs 의 함량- 의존적인 효과를 배제하기 위해 고용량의 흡입 GC 치료법의 효과를 평가하였다. 따라서 고용량 흡입 스테로이드에 대한 반응성에서의 개인간의 차이는 스테로이드 비반응군에서 기도 기능장애의 개선을 위한 추가적인 약제를 필요로 한다. 이런 경우에 WDR21A 다형성의 분석은 반응성을 예상하게 해주었다.

요컨대, 우리는 15개의 WDR21A 유전자 다형성을 제노타이핑하였고, FEV1 의 개선을 유도하는 ICS 치료와 WDR21A -10073C>G가 중요한 연관성을 가짐을 입증하였다. WDR21A -10073C>G GG 동형접합체를 가지고 있는 피검자에게서 FEV1% 값은 CG 나 CC 제노타입을 가지는 피검자들보다 두 배 이상 높았다(58.04% vs. 24.51% vs. 27.65%). 예상되는 구조는 4개의 꼬인 가닥을 가지고 링(ring)으로 배열되어서, 프로펠러 같은 구조를 형성하였다. PyMol을 사용하여 (Gβ/Gγ) 단백질 콤플렉스와 비교하였을 때, 두 구조의 일치성(identity)는 0.145이고 두 구조의 TM-스코어는 약 0.9281이었다. Zdock 프로그램으로 WDR21A 결합 부위를 GR 단백질의 체인 D로 증명하였다. WDR21A 유전자의 -10073C>G의 열성 대립유전자가 흡입 스테로이드 치료에 좋은 반응을 하게 할 수 있고, WDR21A 단백질의 분자적 행동이 GR에 바인딩함에 있어서 (Gβ/Gγ)와 경쟁적이 될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 피검자 선정

본 발명에서 피검자는 한국에 있는 순천향 대학 부천병원의 천식 유전체 발명 센터로부터 모집하였고, 모든 피검자는 한국인이었다. 모든 환자는 의사에게 진단받은 환자였고, 세계천식기구(GINA) 가이드라인에 설정된 천식의 기준을 충족시켰다. 모든 환자는 지난 12개월 동안 호흡곤란과 헐떡임의 병력이 있었고, 15% 이상의 1초간 노력성 호기량(FEV1) 또는 단기-활성의 기관지확장제를 200ml 더 흡입하여 12% 이상 증가하거나; 10 mg/ml 미만의 PC20 메타콜린; 또는 스테로이드와 장기-활성 기관지확장제를 흡입을 2주 동안 처리했을 때 20% 이상의 FEV1 증가를 더 가졌다. 총 IgE는 CAP시스템(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Sweden)에 의해 측정되었다. 24가지 일반 흡입 알러젠(예를 들면, 먼지, 고양이털, 개털, 바퀴벌레, 풀, 나무, 두드러기 쑥 꽃가루와 같은)(Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)에 대해 피부 테스트를 수행하였다. 아토피는 피부 테스트로부터 하나 이상의 양성 반응 (>3mm 직경)으로 정의하였다. 피검자들에게 적어도 과거 4주 동안 흡입 또는 시스템적 스테로이드를 사용한 적이 없었고, ICS는 4주 동안 시작하여 유지시켰다. 세계천식기구(GINA) 가이드라인에 따른 중간에서 심각한(moderate-to-severe) 지속적 천식을 가진 230명의 환자들이 포함되었다.

1,000 ug/1일 Fluticasone propionate의 흡입 GC 용량이 멀티-도즈(multi-dose) 건조 파우더 흡입기((Diskhaler; GlaxoSmithKline; Research Triangle Park, NC) [two puffs bid] 경로로 자기 투여되었다. 실험 기간 동안, 환자들은 그들의 증상 점수를 기록하고, 필요하다면 단기-작용하는 기관지확장제를 사용하였다. 실험 기간 동안, 환자들은 FEV1에서 >12% 이상 감소하거나 천식 증상이 악화되는 경우 복합적이거나 추가적인 요법으로 바꾸었다. 1차적인 종결점은 ICS 치료 후의 근본적인 FEV1의 변화이었다. 8AM에서 10AM까지 8시간 이내에 단기 작용하는 기관지확장제 없이 FEV1을 얻었다. 배제 기준은 1년 미만의 천식 환자, 4주 이내에 매우 악화된 환자, 브리틀(brittle) 천식을 가진, 환자, 꽃가루에 대한 아토피 환자, 가슴 방사선에서 실질(parenchymal) 폐질환으로 나타난 환자, 80% 미만의 확산 용량을 가진 환자, 과거 4주 이내에 흡입 스테로이드나 시스템적 스테로이드를 사용한 환자, 테오필린(theophylline), 루코트리엔 길항제나 다른 추가적 치료요법으로 치료를 유지하는 환자였다. 피검자들의 임상학적 특징들을 표 1에 요약하였다. 본 실험은 순천향대 부속 병원의 윤리 위원회의 승인된 것이었고, 모든 피검자들에게 서면 동의를 받았다.

특징	All subjects	반응자	비반응자
수(N)	230	157	73
연령[평균(범위)]	48.98(15-75)	47.72(15-75)	51.47(22-75)
성별(남성/여성)	105/125	70/87	35/38
현재 흡연자(%)	43.04	40.76	47.95
피부 테스트의 양성 비율 (%)	47.81	49.03	45.21
기본 FVC, 예상치	70.77±1.42	70.22±1.39	71.79±1.46
기본 FEV1, 예쌍치	64.38±1.89	64.08±2.34	65.10±0.98
4주 치료 시의 FVC% 예상치	81.63±4.90^a	87.17±3.00	69.73±1.40
4주 치료 시의 FEV1% 예상치	80.68±9.06^a	88.52±5.82	63.82±3.82
FEV1의 변화(%)	27.83 (-33.96-191.18)^a	41.78 (12.66-191.18)	-2.18(-33.96-11.29)
혈액 호산구(%)	6.05 (0-28.00)^b	6.48 (0-28)	5.13 (0-20.5)
혈액 호산구 개수	447.54 (0-2318)^b	481.39 (0-2318)	375.22 (0-1804)
PC20, 메타콜린 (mg/ml)	5.13 (0.01-37.00)	5.36 (0.08-31.00)	4.48 (0.01-37.00)
Log [총IgE (IU/ml)]	2.13 (0.30-3.70)	2.15(0.30-3.63)	2.09 (0.30-3.70)

<실시예 2> 유전자형 분석(genotyping)

증폭할 프라이머와 프로브를 TaqMan 용으로 디자인하였다. 프라이머 익스프레스(Applied Biosytem)를 사용하여 PCR 프라이머와 MGB TaqMan 프로브를 디자인하였다. WDR21A 다형성에 대한 프로브 정보를 표 2에 나타내었다.

Loci	Rs#	Assay-on-demand ID
-13347C>T	rs10483851	C__30373033_20
-13094C>T	rs7142086	C___2676203_10
-11595G>T	rs17781739	C__33691338_10
-11441C>G	rs3213729	C__27508904_10
-10073C>G	rs7160796	C__31535103_10
-9417C>T	rs11158993	C__31535108_10
-1754C>G	rs12892806	C__31535114_10
+65C>G	rs2302588	C__15757863_10
+3448G>A	rs12885397	C__31535117_10
+3669T>C	rs3742832	C___2676188_1_
+5512C>T	rs2240981	C__15872220_20
+9144G>A	rs2286833	C__25958593_10
+11131G>A	rs2806039	C__16125588_10
+20367C>T	rs7143683	C___1221323_10
+20995A>C	rs7144738	C___1221326_30

한 개의 대립 유전자 프로브는 6-carboxyfluorescein dye로 표지하였고, 나머지는 형광 VIC dye로 표지하였다. 900nM의 프라이머 농도와 200nM의 MGB-프로브 농도로 UNG(Applied Biosytem) 없이 TaqMan Universal Master 믹스에서 PCR을 하였다. 게노믹 DNA 20ng을 사용하여 총 반응 부피를 5㎕로 384-웰 포맷으로 반응을 수행하였다. 플레이트를 써멀 사이클러(PE 9700, Applied Biosytem)에 넣고, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 가열한 다음 95℃ 에서 15초, 60 ℃에서 1분으로 하여 40 사이클을 수행하였다. TaqMan assay 플레이트는 프리즘 7900 HT 기구(Applied Biosytem)로 이동시켜서 각각의 웰의 형광도(fluirescence intensity)를 기록하였다. 각각의 플레이트로부터 나온 형광 데이터 파일을 자동화된 소프트웨어(SDS 2.1)로 분석하였다.

<실시예 3> RNA 추출, 및 말초혈액세포(peripheral blood cells)의 RT-PCR

순천향대 부천 병원의 바이오뱅크(biobank)에서 얻은 말초혈액세포(PBC)의 총 RNA를 변형된 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름(guanidium thiocyanate-phenol-chloroform) 추출 방법을 사용하여 분리하였다. 37℃에서 15분 동안 RNase-free DNase I을 1 ㎕처리하여 DNA 오염을 제거하였다. RNA를 정량하였고, 총 RNA 의 4μg을 cDNA로 역전사시켰다. DNase(10,000 U/㎖(Stratagene, La Jolla, CA) 로 처리한 RNA를 42℃에서 50분 동안 0.5 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 5DTT, 1㎕ random hexamers (50μg/㎕), 및 SuperScript II RT (200unit/㎕) (Invitrogen, Grand Island, NY)으로 배양하여 역전사시켰다. 70℃에서 15분 동안 배양한 후 반응을 종결하였다. 역전사(RT) 후에, cDNA를 WDR21A 유전자에 특이적인 4개의 프라이머 쌍(exon 1 에서 exon 4를 위한 쌍 1, exon3에서 exon6를 위한 쌍 2, exon7- exon 10를 위한 쌍 3, 및 exon13 to exon 14를 위한 쌍 4) 과 β-actin (235-bp PCR 산물)을 사용하여 증폭하였다(표 3).

온도 조건으로 5분간 94℃에서 변성시키고; 94℃에서 30초; 54℃에서 30초, 및 72℃에서 30초(35회 반복)을 적용시키고; 마지막 연장은 7분간 72℃에서 하였다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 젤에서 전기영동시키고 에티디움 브로마이드 스테인(ethidium bromide stain)을 사용하여 시각화시키고, Kodak EDAS 1D 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. RT-PCR 산물을 직접 시퀀싱하였다.

<실시예 4> 통계적 분석

좌위 사이의 연관 불평형(LD)는 르원틴 D(Lewontin's D')(|D'|) 및 r²의 방법으로 측정하였다. 개체들의 일배체형을 스테판(Stephens)에 의해 개발된 PHASE 알고리즘(ver.2.0)을 사용하여 추론하였다. 스테로이드 반응과 WDR21A 유전자형 및 일배체형 분포와의 연관성을 연령(연속값), 성별(남성=0, 여성=1), 아토피 상태(비-아토피=0, 아토피=1), 및 흡연 상태(비흡연자=0, 금연자=1, 흡연자=2) 을 공변량으로 하여 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 분석하였다. △ FEV1 (%)의 분석을 회귀 모델을 사용하여 분석하였다. 통계적 분석은 SAS 버전 9.1 (SAS Inc., Cary, NC)를 사용하여 실행하였다. 다중 검사의 최적 보정을 얻기 위해, AGT에서 독립적인 마커 좌위의 효과적인 수를 SNPs사이의 페어와이즈(pair wise) LD의 매트릭스의 스펙트럼 분해(SpD)에 기초한 프로그램인 SNPSpD 소프트웨어 (http://genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD/)로 계산하였다. WDR21A (11.3966) 의 독립적 마커 좌위의 결과 숫자는 다중 테스팅으로 보정하여 분석한 것이다.

유전자의 총 15개의 다형성은 GenBank 데이터베이스(NT_026437.12)에 기초하였고, 본 발명 피검자들 샘플에서 제노타이핑을 하였다. 이들 SNPs의 열성 대립유전자 빈도(MAFs)가 표 4에 나타나 있다. 표 4는 피검자 사이의 대립유전자 빈도와 하디-바인베르그 평형을 나타낸 것이다. -1754C>G 와 +65C> G 의 분포는 하디-바인베르그 평형에 있지 않았다(P<0.01). 도 1A와 B를 보면, WDR21A유전자의 SNPs사이에서의 연관 불평형(LD) 계수((|D’| ) 및 r ² 을 모든 피검자들에게 계산하였다. 절대적LD ((|D’| = 1 and r ² = 1) 는 -13094C>T 와 -11441C>G 사이에 존재하였다. WDR21A 일배체형은 본 발명 피검자 규모가 작아서 공통적인 SNPs (MAF>10%) 11개로 만들었고, 3개의 블록으로 나누었다(도 1). 블록1-ht1, 블록2-ht1 및 블록3-ht2 을 더 분석하였다. 블록1-ht2, 블록1-ht3, 블록2-ht2, 블록3-ht1 및 블록3-ht3 은 -10073G>C, -13094C>T, +3448G>A, +65C>G, +3669T>C 및 +11131G>A의 평형성 때문에 분석하지 않았다. 0.05 이하 빈도를 가지는 일배체형도 분석하지 않았다.

Loci	rs	Position	Allele	Genotype				MAF	HWE
-13347C>T	rs10483851	5'	C>T	C	CT	T	N	0.033	0.608
				214	15	0	229
-13094C>T	rs7142086	5'UTR	C>T	C	CT	T	N	0.166	0.198
				162	58	9	229
-11595G>T	rs17781739	5'UTR	G>T	G	GT	T	N	0.087	0.148
				189	40	0	229
-11441C>G	rs3213729	5'UTR	C>G	C	CG	G	N	0.165	0.193
				163	58	9	230
-10073C>G	rs7160796	Intron1	G>C	G	CG	C	N	0.246	0.69
				132	83	15	230
-9417C>T	rs11158993	Intron1	C>T	C	CT	T	N	0.066	0.285
				196	30	0	226
-1754C>G	rs12892806	Intron1	C>G	C	CG	G	N	0.404	0.01
				72	129	28	229
+65C>G	rs2302588	Exon2	C>G	C	CG	G	N	0.192	0
				163	44	22	229
+3448G>A	rs12885397	Intron4	G>A	G	AG	A	N	0.219	0.342
				131	91	4	226
+3669T>C	rs3742832	Intron4	T>C	T	CT	C	N	0.41	0.484
				73	124	32	229
+5512C>T	rs2240981	Intron6	C>T	C	CT	T	N	0.402	0.029
				74	126	29	229
+9144G>A	rs2286833	Intron7	G>A	G	AG	A	N	0.052	0.403
				205	24	0	229
+11131G>A	rs2806039	Intron8	G>A	G	AG	A	N	0.174	0.175
				154	72	4	230
+20367C>T	rs7143683	Intron13	C>T	C	CT	T	N	0.463	0.178
				61	124	44	229
+20995A>C	rs7144738	Exon14	A>C	A	AC	C	N	0.187	0.08
				148	78	4	230

천식환자들에게 선형 회귀 모델을 사용하여 흡입 스테로이드에 대한 반응과 15 SNPs 및 3개의 일배체형과의 연관성을 분석하였다(표 5). 표 5는 나이, 성별, 흡연을 조절한 유전자형 및 일배체형과 △FEV1% 사이의 관계를 나타낸 것이다. 연관성 분석에서 WDR21A -10073C>G 가 FEV1 의 변화(FEV1%)를 유도하는 스테로이드 치료와 매우 연관성이 있음이 드러났다(공동 우성 모델과 열성 모델 각각, p=0.002, pcorr=0.03 및 p=0.002, pcorr=0.02). WDR21A -10073C>G GG 동형접합체를 가지는 피검자의 FEV1% 값은 CG 나 CC 제노타입을 가지는 피검자보다 두 배 이상이었다(예를 들어, 58.04% vs. 24.51% vs. 27.65%). WDR21A -1754C>G, +3448G>A, +11131G>A, +20995A>C, block1 - ht1 및 block3 - ht2는 근소한 연관성을 보여주었지만, 보정 후에는 연관성이 없었다(표 5). 후기 치료적 폐 기능에 있어서 초기의 폐기능 효과를 배제하기 위해, 15 SNPs 와 3개의 일배체형을 천식에서의 회귀 모델을 사용하여 초기 FEV1과의 연관성에 대해 분석하였다. 연관성 분석에서 어떠한 SNP와 일배체형도 스테로이드 치료 전의 초기의 FEV1과는 연관되지 않았던 것으로 드러났다(표 6). 표 6은 나이, 성별, 흡연을 조절한 천식환자 사이에서의 BFEV1(% 예측치) 를 회귀분석한 것이다.

Loci		C/C	C/R	R/R	Pa	Pa ^corr	Pb	Pb ^corr	Pc	Pc ^corr
-13347C>T	rs10483851	214(27.75±4.46)	15(26.01±7.70)	.	0.55	1	0.55	1	.	.
-13094C>T	rs7142086	162(29.54±5.38)	58(25.33±0.39)	9(17.54±2.09)	0.41	1	0.54	1	0.36	1
-11595G>T	rs17781739	189(28.62±3.41)	40(22.98±6.80)	.	0.1	1	0.1	1.09	.	.
-11441C>G	rs3213729	163(29.29±5.42)	58(25.33±0.39)	9(17.54±2.09)	0.44	1	0.58	1	0.37	1
-10073C>G	rs7160796	132(24.51±0.26)	83(27.65±5.60)	15(58.04±3.70)	0.002	0.03	0.03	0.28	0.002	0.02
-9417C>T	rs11158993	196(27.83±3.36)	30(26.93±9.73)	.	0.53	1	0.53	1	.	.
-1754C>G	rs12892806	72(23.32±7.62)	129(26.50±4.03)	28(43.94±4.05)	0.03	0.31	0.14	1.59	0.03	0.34
+65C>G	rs2302588	163(27.59±0.78)	44(29.62±9.16)	22(23.96±5.69)	0.89	1	0.85	1	0.55	1
+3448G>A	rs12885397	131(23.31±1.06)	91(30.77±3.61)	4(62.94±3.04)	0.01	0.16	0.03	0.34	0.08	0.86
+3669T>C	rs3742832	73(30.45±4.17)	124(25.42±4.88)	32(29.81±0.45)	0.84	1	0.75	1	0.97	1
+5512C>T	rs2240981	74(30.50±3.90)	126(24.85±4.98)	29(32.43±9.65)	0.92	1	0.87	1	0.68	1
+9144G>A	rs2286833	205(27.74±3.11)	24(26.71±1.77)	.	0.94	1	0.94	1	.	.
+11131G>A	rs2806039	154(23.90±2.29)	72(34.51±6.87)	4(58.88±.86)	0.02	0.27	0.03	0.34	0.3	1
+20367C>T	rs7143683	61(26.03±8.68)	124(27.92±8.32)	44(29.07±7.92)	0.64	1	0.47	1	0.99	1
+20995A>C	rs7144738	148(23.73±2.83)	78(34.02±5.61)	4(58.88±.86)	0.01	0.12	0.01	0.15	0.3	1
BL1 - ht1		41(38.29±7.55)	107(25.06±5.50)	82(26.22±9.44)	0.04	0.47	0.02	0.24	0.24	1
BL2-ht2		37(33.06±1.85)	113(28.45±5.57)	80(24.53±7.33)	0.13	1	0.33	1	0.16	1
BL3-ht2		93(32.49±3.69)	109(25.75±6.29)	28(20.45±3.63)	0.05	0.51	0.14	1.56	0.06	0.71

상기 표 5에서 C/C, C/R 및 R/R 은 각각 우성 동형접헙체, 이형접합체, 열성 동형접합체를 의미한다. Pa, Pb 및 Pc 는 각각 공동우성, 우성, 열성 모델에 대한 p-값을 의미한다.

Loci	rs	C/C	C/R	R/R	Pa	Pa ^corr	Pb	Pb ^corr	Pc
-13347C>T	rs10483851	214(64.13±1.99)	15(68.73±.83)	.	0.18	1	0.18	1	.
-13094C>T	rs7142086	162(64.12±2.19)	58(65.21±1.48)	9(64.22±0.43)	0.49	1	0.4	1	0.96
-11595G>T	rs17781739	189(65.07±1.49)	40(61.38±3.39)	.	0.12	1	0.12	1	.
-11441C>G	rs3213729	163(64.10±2.16)	58(65.21±1.48)	9(64.22±0.43)	0.49	1	0.4	1	0.96
-10073C>G	rs7160796	132(63.75±1.96)	83(66.16±1.64)	15(60.13±1.78)	0.93	1	0.37	1	0.11
-9417C>T	rs11158993	196(64.02±1.99)	30(66.43±1.67)	.	0.28	1	0.28	1	.
-1754C>G	rs12892806	72(63.94±2.69)	129(65.53±1.25)	28(60.57±2.22)	0.46	1	0.76	1	0.06
+65C>G	rs2302588	163(64.33±2.11)	44(65.80±1.73)	22(62.45±0.77)	0.85	1	0.85	1	0.47
+3448G>A	rs12885397	131(64.31±1.90)	91(65.33±1.34)	4(54.75±4.29)	0.93	1	0.76	1	0.13
+3669T>C	rs3742832	73(63.25±2.51)	124(65.60±1.12)	32(62.59±3.20)	0.7	1	0.24	1	0.4
+5512C>T	rs2240981	74(63.07±2.38)	126(65.74±1.28)	29(62.21±2.90)	0.63	1	0.17	1	0.33
+9144G>A	rs2286833	205(64.48±1.85)	24(64.00±2.57)	.	0.93	1	0.93	1	.
+11131G>A	rs2806039	154(64.66±1.95)	72(64.58±1.52)	4(50.25±.91)	0.23	1	0.53	1	0.01
+20367C>T	rs7143683	61(63.87±2.70)	124(64.98±1.19)	44(63.66±2.85)	0.93	1	0.63	1	0.48
+20995A>C	rs7144738	148(64.26±1.98)	78(65.35±1.45)	4(50.25±.91)	0.56	1	0.97	1	0.01
BL1-ht1		41(64.07±1.96)	107(65.22±1.31)	82(63.44±2.64)	0.55	1	0.82	1	0.29
BL2-ht2		37(62.92±1.33)	113(65.22±1.64)	80(63.88±2.52)	0.93	1	0.43	1	0.63
BL3-ht2		93(63.75±2.43)	109(65.34±1.08)	28(62.75±3.20)	0.98	1	0.52	1	0.36

상기 표 6에서 C/C, C/R 및 R/R 은 각각 우성 동형접헙체, 이형접합체, 열성 동형접합체를 의미한다. Pa, Pb 및 Pc 는 각각 공동우성, 우성, 열성 모델에 대한 p-값을 의미한다.

<실시예 5> 구조와 구조 정렬의 예상

WDR21A의 구조를 예상하기 위해 모델링(TBM) 방법에 기초한 주형을 사용하였다. 우리는 WDR21A 서열을 퀘어링함으로써 3D 판단(jury) 메타-서버(meta-server)로부터 4개의 주형을 선택하였고, clustalW2 를 사용해서 선택된 4개 주형으로 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment (MSA)을 수행하였다. MSA 결과로 Modeller 9v8를 사용해서 WDR21A 구조를 예상하였다. 다른 구조와 WDR21A의 예상된 구조를 비교하기 위해, 우리는 구조 정렬 프로그램인, TM-align을 사용하였다. 바인딩 가능성을 알기 위해 바인딩 부위 예상 도구로 ZDOCK을 사용했다.

WDR21A가 Gβ와 같이 WD 리피트를 가지기 때문에 WDR21A 단백질의 구조를 TM-align을 사용해서 예상하였다. 도 2A를 보면 4개의 꼬인 가닥을 가지고 프로펠러 같은 구조를 형성하는 링(ring)으로 배열됨을 알아냈다. 구조의 정렬을 PyMol를 사용하여 Gβ/Gγ 단백질 복합체의 구조와 비교했을 때, 두 구조의 동일성이 0.145 이고 두 구조의 TM-스코어가 약 0.92814였다(도 2B). 이것은 Gβ/Gγ 단백질 복합체가 가지는 것과 유사한 구조를 가지는 것을 의미한다. Gβ/Gγ 단백질 복합체처럼 WDR21A가 글루코코르티코이드 리셉터(GR)과 결합하는지 여부를 알기 위하여, 우리는 Zdock 프로그램을 사용하여 GR에 대한 바인딩 부위(site)를 예상하였다. WDR21A 단백질이 글루코코르티코이드 리셉터의 체인 D에 가능한 바인딩 부위를 가지고 있음을 알아냈다(도 2C). 게다가, Zdock 으로 한 예상처럼, Gβ도 GR에 바인딩하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER OF WDR21A GENE FOR PREDICTING RESPONSIVENESS TO STEROIDS OF ASTHMATICS <130> 10P481IND <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> marker <400> 1 tttacagtca acaactc 17 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> marker <400> 2 ctaaaatgtt gttttacagt caacaactcc taactgctgg g 41 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> marker <400> 3 ttgtttttta agtcagctgt ctaaaatgtt gttttacagt caacaactcc taactgctgg 60 gattataggc atgcaccacc a 81 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> marker <400> 4 agtgttaaga gaaaattttg ttgtttttta agtcagctgt ctaaaatgtt gttttacagt 60 caacaactcc taactgctgg gattataggc atgcaccacc acacccggct aatttttaaa 120 t 121 <210> 5 <211> 201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> marker <400> 5 gcgttagtac aaagcttgcg cctgaagtat ttcttaaata agtgttaaga gaaaattttg 60 ttgtttttta agtcagctgt ctaaaatgtt gttttacagt caacaactcc taactgctgg 120 gattataggc atgcaccacc acacccggct aatttttaaa ttatttgtta agatggggcg 180 gaggggtgtc tcactatgtt g 201 <210> 6 <211> 33273 <212> DNA <213> gene <400> 6 tgagaaggaa agaacggccg ctatagccct atcggctgct acaacaccaa aacgcatcca 60 cctaactggc tgacgctaca ccttggtctt tccgggtcct tgcacgcttc gctccaactc 120 ctgcagagct gagccggagg ggaatccgga agggacacgc tgaacaggta agactgtgct 180 gcctggggtg cctactggca tcgattcgag ggctgccgcg ctcccgctgc agagctcggg 240 gtgggagaca ggcgcggcga ggaaggccag ggaaaggggc ggggaggggc ggggaggagt 300 gagcacgtgg aacgccggcg ccaccgggcc taggtggcag ctgggccggc gcgctccgcc 360 cgttctgggg cgcgtggggc cctccggccg gatcagtgct gcaaccgtaa acacgcaggg 420 agggcacccc gagtgtcgcc gctgagggcg tttctctaag cgcttctctg agacctgctg 480 ctgaaggccc cacccgacac ctggcggggg ctgggctgcg ggccttgggg cggtgtcccc 540 tgtgaatgtt caggtcagca taacaggtta ggtgtggttg aagcttacga agtggccggc 600 tctgtgctgc cggcttcaca ggcgctaaca tttgccagcg ctatgatgtc cttgtcagac 660 gcagaaaggg gtgcagtttg gttgtccgtc ggggtagcgc acaactagca agtgatgggg 720 cctgggtttg gccctcgcct ccactctgag ttgtgagtta gcgagaaagc cacgcctcgt 780 gggctccccg ggggcttcag aaaccatgac gcctttcacc atggtgttct acaggcattg 840 tcttgtgact ccagcagcgc agccagaagc aaagaaaact gaggggacgg cttcctagag 900 gaaacaattc caaagtccca aactctgatt ttaaataacg atggaaatta gagtcgcggt 960 ggtgttcttt tttttttttt tttttttttt tttttgaggc ggagtctcgc tgtcgcccag 1020 gctggagtgc agtggcacga tctcgactca ctgcagcctc cgcccccggg gttcacgcca 1080 ttctcctgcc tcagcttccc gcgtagctgg ggctacaggc gaccaccacc tcgcccggct 1140 aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccgtgt tagccaggat ggtctcgatc 1200 tcctgacctc gtgatccgcc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc 1260 caccgcgccc ggcctgaggt ggtgttctgt gggtaaccag gcctgggggt cctaccaaca 1320 gaggtggaat ccctgttcca ccatttaact tacgctgggt gtggtaccta gtcctgtaag 1380 cctgtttcct catttgtaaa ataggattga aaataccaac tcagggtggg cgttagtaca 1440 aagcttgcgc ctgaagtatt tcttaaataa gtgttaagag aaaattttgt tgttttttaa 1500 gtcagctgtc taaaatgttg ttttacagtc aacaactcct aactgctggg attataggca 1560 tgcaccacca cacccggcta atttttaaat tatttgttaa gatggggcgg aggggtgtct 1620 cactatgttg cccaggctgg tcttgaactc ctgggctcaa gctatcctcc cacctcagcc 1680 tcccaaagtg ctgggattag aggcgtgagc caccgccctg gcctgtagaa gctactttgt 1740 attcagcttt acagaccagt ggcgttagcg ttttgcacat tacagcccgc tagtctacag 1800 aatcccccca cttttttttt tttttttttt ttttgatacg gaatttcact attgttgccc 1860 aggctggagc acagtggcgc gatctcggct caccgcaacc tccgcctccc aggtttaagg 1920 gattctcctg cttcagcctc ccgagtagct gagactacgg gcgcacgcca ccgcgcccgg 1980 ctaacttttt gtattttagt agagacaggt tttcaccatg ttggccagga tggtctcaca 2040 tatctgccga cctcgtgatc cgcccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat 2100 gagccaccgc gcccggccag tctacagact cttacaaaat tcccctgttg ttggatatct 2160 aggatgtttc tcactttaac tattacagca tggtgtagta aacatccttt atatatatat 2220 atatatatat atatatatat agttcacata ccctaaaatt aactttttta aaagggttca 2280 atccagtggg tttttttatt attatattgg caagattgtg caaccatcac cactgtctaa 2340 ttctggaaca ttctcatcca cccaagaagc aaccccgcgg ccccagggtg ccccagtctc 2400 agagccccgg ttgttgggct ccagtccagg ccccctaacc atgtgctaaa caagatggtg 2460 aggctcagcc tggaaaccag aacagccccg aggcccccaa actggagagc cccaagggga 2520 gatggagccc ctcccccatt ctgagttttg gccccgtgct aaggctggac cgaccccctg 2580 tgctgtcaag cctacctccc aggggaggcg aggccagccc cgatgtgtgc gggctgccat 2640 cccccacact tggctccggg gctggtcggt gttgggcgtc ccagcactgc gggcggcacg 2700 gacgcccggg gctgctccct actgggtgta gcgcaccccg ccccccaccc cgcccggcct 2760 cctctgggcc tgcgccttgg gcctattgag gccaggcctg gaatggtgcc ctggaagcag 2820 gaaagagcct gtaattccgg aagctgcggg ctcccaaacc agacaccatt ttggagaccg 2880 gtgcaaaaat gtgtgccgct tttgtgtgga aaactgctag actgtgagag agagccgacc 2940 tcctcatgca tgaaccttta tagagggtgg tccacatatt ctgtgcacta catacacata 3000 cgctgggcac atactggctc tctgtgttaa atctcagatt tgctgccgcg cgtggtggct 3060 cacgcctgtc atcccaacgc tgcgccaagg caggaggatc gctggaggcc agaaattcga 3120 gaccagcctg ggcggcaaca aagcgagacc ccgtctctac aaaaatattt tttattttta 3180 ttttattttt ccgtcaagct gttctttatt tcaggaagag ggcaggggag ggggctcagt 3240 ctttcttggc agcggctttc ctcatggcag ccagtacctt gctcagctcc tcccgcttcc 3300 tcttggcacg gatgtgcgtc cccacccttt tcttgatgaa cttgagggcc catttctcct 3360 tgaagacctt cagtgactcc atggcgcgca gctcgtacga agcgaagcca cacacctccc 3420 ggatcatgtc ccgctacaaa cttggtgcgt ttgctcagac gcccgcggcg gcggctgtgc 3480 ctgggcttgc tcacgttctt ggtcaccttg tggcccttgt tgaggcccac ggccataagg 3540 tagcgcagag ccatggctgc tgctctccat ggcggccgtg gcggaaggcc aaaaatattt 3600 tttaaattag cctggtgttg tggctcgtgc ctgtaattcc ggctactccg aggttgaggc 3660 aggaggacgg cttgagccgg ggagatggag gttgccggga gcggagatcg cgccactgca 3720 cttcagccaa aaggggggta ggagggaata agtaaataaa attaaataaa taaagtggta 3780 tctcactgtg gttttgattt gcatctacct aaggactaat gatgttgggt atcttttcat 3840 gtgccagttg gctatttgtg tagctttttc tttttttttt ttgagacgga gttttttttg 3900 tttgtttttg agacggagtt tcgctcttgt cgcccaggct gcaatgcagt ggcaccatct 3960 cggctcactg cagcctccac ctcccgggtt caagcgattg ttctggctca 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ttaattttgt 4860 taaatatatt cctaagtact ttttctcttt tttttttttt tttttgtaac tgagcctgag 4920 caggaccaga ggagtgcttt attctttttg atgccattgt aaatgtaact tttctttcat 4980 attcaggctg ttcattgcct gaaccagtgt atagaaatac aactggtttt tctatattga 5040 tcttgtatcc tgcaaccttg ctgaattcat ttgtgaggtc cagtagattt ttggtggatt 5100 ctttaggatt ttctgtatat aagatcatgt ttggttgcct tttctttgtc ttgcctaatt 5160 gcctgtctaa aacttccact acaatgttga acagatgtat tgagaaccaa catctttgtc 5220 ttattcctga ccatagaggg aaaactttgt ctttggccac taagtatgat gttaggtgtg 5280 ggtattttgt agatgctcct tatcaggttg aggaaactac cttctgtttc tagtatgttg 5340 aatgtttttt taatcatgag aggatgttgc attttgtcca gtgctttttc tgtgtatcaa 5400 ttgagaaaat catgtgaggt tttccccatc tattagtatg gtatattgat tgattttcat 5460 atgttgaacc aaccttatat ttctgagata aatcgcgctt ggtcttggta tataattctt 5520 tttatatgct cctggatttt gcttgctagc attttgttaa ggatttttgt gtctctgtat 5580 tcataaccca tactgaccta tatttttcct tctttttttt ttttttttga gagatggagt 5640 cttgctctgt tgcccaggcg ggagtgcagt ggcatgatct cggctcactg caacctctgc 5700 ctcccaggtt caagcgattc tcctgcctca gcttcccaag tagctgagac tacaggtgtg 5760 caccaccacg cctaactaat tttttgtatt ttggtagaga tgaggtttca ctctatgttg 5820 gccaggctgg tcttgaactc ctgacctcag gcgatctgcc tgccttggcc tcccaaagtg 5880 ctgggcttac aggcgtgagc cactgcaccc ggccttgacc tatatttttc ttcctatatc 5940 tttgtctgat tttggtaaca aggtaatact ggccttataa aatgattcgg aaaaatgtag 6000 taaatatctt ggaatcattt ttgtaggagc agttcccaga aggaaggcat gtacatttgt 6060 aagttacttg ataaatattt tccagtcatt ttccaaaaaa ccaaattgtg tttatttgtg 6120 attaacattg cctttgcaga atagtagtct cttagaaatt ataattctta atgccttgag 6180 gtacttaaaa gtttctctga aagacaaagg caagcccaac cttctgcaac acacctgatt 6240 ttaacatcta gagcagctcc aaaggtgcta gatgcagcat gttaccagca aattgttttc 6300 gagtgcttcc tacatagaac aggttttctc agctttagca ctgttttggg ccaggtaact 6360 cttttgttgt tgtttttgag atggagtctt gctatgttgc ccacactggt ctcaaactct 6420 ggactcaagc catcctccca cctcagcctc ccaagcagtt ggaactgcaa gtgtgagcca 6480 tcacacccag ctgaataatt tttttttctt tctttctttc tttctttttt ttaatgttgt 6540 ttgtttgaga cgggatcttg ctatgttgcg caggctggtc ttgaactcct aggctcaagc 6600 aatcctcctg cctcggcttc ccgagcagct gggattatag gcatcagcca ctgcacccag 6660 ccctggataa ttcttgctga agaatgtgtg gaagctgccc tgcgcattgt agggtggtta 6720 gcagcatccc tggcttttac ccactaggcg ctagtagcag cctacccctc cttctcccga 6780 gctgtgacaa acaaaaatgt ctccagacat tgccagatgt cccctggtgg gcaaaataat 6840 ccttaagaag cactgatcta caaactgtga tgcatactgg gttttatatt attactagat 6900 aaaattgtct ctaatggcca ggtgcggtaa tcccagcact ttgggaggcc gagatgggca 6960 gatcacaagg tcaggagttc gagaccagcc tggccattat ggtgaaacca catctctact 7020 aaaaatacaa aaatgagcca ggcatggtgg catgcgcctg tagccccagc tattcgggag 7080 gctgaggcag aagaatcgct tgaacccagg aggcagaggt tgcagtgagc cgagattgtg 7140 ccattgcact ccagcctggg tgacagagca agactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaagt 7200 ctctaattct cactgtatac cattaccact ttggtgccat ttgtcccagt ccatgtcacc 7260 atatcctgtt tactttcaaa tctgtctctt taggctcaat ttctctctgt attctcagac 7320 ccgtatttcc cattgcctgc atcttgagat tgatttgttc aaaatcagac 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gcttgcctga 8220 cattttcatt cttcagactg cacttatctc cctcccccac ctccagccca ggcatgtgga 8280 gcagtcactc ccttctctcc caccacacct ggagagacct gggtcttcat ccttatcctg 8340 tgctgcaggg gttggtctgt gcatctgtct cccatattaa acaatcggtg cctccaagcc 8400 aggtagcaca gcttattatc tctgcccact ccccagtgcc tcacatggag tgggcgcttt 8460 gtaaatgtgt gtggagtagt aagtggaaat aacccagagc agaaagaagc tacctgggac 8520 ttaaatgtaa agtagccaca ggttttgttt tgctttgctt cagttcagca aaaatttact 8580 aagcaccaac taggtcatgg atgctaggaa tagaaaaaag aacaaagtag gatgtttgcc 8640 ttacagaatt cacctcacgt ccagtatgag atgggagtat gaacaaacag tcatgcagag 8700 tgatgagtgc aaacatggac tataaagcgg ccatagagaa tgaactgtgt ttgtgtttag 8760 agaagacaca ctccccaccc ctgaacaggc ttcttaaaag tactagaaag gtactgtctt 8820 tgtcctagcc tttaaactct tactgtattt ggaaggcttc tattagtatg tgacttttta 8880 aatgattttt ttttttgaga cggagtttca cccttttgcc caggctggag tgcggtggtg 8940 caatctcagc tcactgcaac ctccgccacc tgggttcaaa cgattctcct gcctcagcct 9000 cccaagtaac cgggattaca ggcaccagcc accacaccca gtgaactgtt gtacttttag 9060 tagagacggg gtttcaccac gttggccagg ctgatctcaa actcctgacc tcaggtgatc 9120 cacccgcatc ggcctcccaa agtgttggga ttacaggcgt gagccaccac atccggcctt 9180 taaaatgatt tttgcttgac cttgctaact atattacttg aggttggcag gctcccttac 9240 cagattgcag tgcctgtatg agttaggggt gaacacatgc tctccctggc ccaaattggc 9300 attcgccagt gattttatca tcggctgcgt cctgctgatt gtgcagcccc ctattgagaa 9360 taatggtgtg agtgggacac agtcctgcct cctgtgggtg atctgaagtc tttgactcac 9420 cagttcgtgt gttctttgct gtattcatgc attgttacat aattcaacaa attagaatca 9480 tttcatatac agaatatgca ctctaaagaa attttgacct ttttatagag ttggtaataa 9540 taataatctt tatgtcagta gagtttattt ttcctatcag tctttttctc tttttgagat 9600 ggggtctcac tctattgccc aggctggtct caaactctgg gctcaagaga tcctcccact 9660 tcagcctccc aaaagtgctg ggattacagg catgagctac tgcacgcagc cattttccta 9720 ccagtcttaa cactggccac acgtgcttcc cttcctgtgc gcagtccctt tcagcttgta 9780 acttaactat taataaatac aactgtattc tttagctggg gtataagata actgatccat 9840 agggaaaccc acacatggtg ttcaggagcc attgtttagg acaatgaata 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ctgtaaccca tgctgttgtg tgtcacagtc 31500 ctcagaactg gagccctgaa gacttaaacc ggtcctagga actgaagcat taaaccagaa 31560 agagctgtgg ggagagttgt caacctagcc catccccagg atgtaatgac tttgacagat 31620 cttttactat aacatgaaaa gatcaggcca ggtgtggtag ctataattcc agcacttagg 31680 gagcttgagg ccaggagttt aagaccagct ggggcaacac agcaagaccc tatctcaaaa 31740 aaaaaaaaaa ttaggcatgg cggcacacac ttgtagtccc agttaactca ggaggctgag 31800 gcagaaggat ggcttgggcc caggagttca aggctgcagt gagccctgat cacaccactg 31860 cactccagcc cgggcgacag agcaagaccc tgtccctaaa aaatggggga aatcagttgc 31920 atgtcaccta gaccaggtgg gccacactcg cacttgaacg ttccgtgaca tcaagagcag 31980 cagaataccc agacattagc caggatgtct ccgagccatt catggcatca cacagccaac 32040 cagggcatct tgtcattgtt ctagcacaac agggcgactt gggttatccg tagaaatact 32100 gtccgttaat gagtttgtgt tttggctcac atgaaatcac agccctgagg aatcttggga 32160 agccatgtcc acatgtaggt aagttttcct ttgcattctc tcactagcct gccatgtgtc 32220 tctcctcttt cctagtgggc caggactgct acacgagaat ctggagcctc cacgatgccc 32280 gcctactgag aaccataccc tccccgtacc ctgcctccaa ggccgacatt cccagtgtgg 32340 ccttctcgtc gcggctgggg ggctcccggg gcgcgccggg gctgctcatg gctgtcgggc 32400 aggaccttta ctgttactcc tacagctaat tctgcagggc acagcccaga gccatgtgga 32460 tttgacttac gggagtaaag cgtaactttt tactgcatct aatgagggtg ttttaagtga 32520 cactcagtgt acacagatcc catcctctgg ctgctaggag agaagtgctg aatgttccgt 32580 gtggagatgc tcaggaaagt tatttgagtt aaattgctgg ctgagagagc ttggaagtcc 32640 ttttcataaa aggtacctct ttccttttct tattgaattc ttagaactta gttaaccctc 32700 cctgcctttt cttaacaaaa aggacttttc taaggactga agattggcaa aaacgaaaag 32760 cttcttcctc caagagccca ttgaagaagc ccagtgatga gacggtgaga tggtttgagt 32820 cctcggtgcc tgggtagcag gaagaaagac ctgcatcctg catctgtact tggggaagcc 32880 agcggagagg acggggaggt tacttctcta agtttctgca gaaatattga aggctggagt 32940 ttggaatcct taaacttggc cttctcaaac tcagcagcag atctccggga ttctgctgtt 33000 attatccaaa ggcgttggaa ggaaagatgg atcttcttac atgctagaag ttttaaacgg 33060 tccttaacat gcctttgttc aagcaccttc cagaatgtaa ggttcagcag ctctggtttc 33120 tattacggtg 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Claims

삭제
서열번호 1의 WD 리피트 도메인 21A(WD repeat domain 21A: 이하 WDR21A) 유전자 내에서 선택되며, 번역 개시점(서열번호 1의 11603 번째 염기)으로부터 -10073번째 염기가 C 또는 G이고, 상기 -10073번째 염기를 포함하는 8~100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드인, 천식 환자의 글루코코르티코이드(glucocorticoids)에 대한 반응성 예상용 WDR21A 유전자 단일염기다형성 마커 조성물.
삭제
제2항의 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 천식 환자의 글루코코르티코이드(glucocorticoids)에 대한 반응성을 예상하기 위한 WDR21A 유전자 단일염기다형성 검출용 키트.
삭제
1) 피검체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 제2항의 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계; 를 포함하는 천식 환자의 글루코코르티코이드(glucocorticoids)에 대한 반응성을 예상하기 위한 정보 제공 방법.