KR101227322B1

KR101227322B1 - 나노 크기의 멜라닌 입자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101227322B1
Application number: KR1020100103413A
Authority: KR
Inventors: 이진규; 주국연
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-23
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2013-01-28
Also published as: US20120205590A1; CN102666671A; US8937149B2; EP2492302A4; CN104017202B; CN102666671B; CN104017202A; WO2011049406A9; EP2492302B1; WO2011049406A2; EP2492302A2; WO2011049406A3; KR20110044712A

Abstract

본 발명은 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화반응시키는 단계; 및 도파민을 공기 중에서 산화시키면서 중합(polymerization)시키는 단계를 동시 또는 연속적으로 수행하여 멜라닌을 형성하되, 상기 염기 첨가시 도파민·H⁺X^-(a)과 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1로 조절하여 나노 크기의 멜라닌 입자를 형성시키는 것이 특징인 멜라닌 입자 제조 방법, 및 나노 크기의 멜라닌 입자를 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은 단시간 내에 나노 크기의 멜라닌 입자를 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따라 제조된 나노 크기의 멜라닌 입자는 천연 멜라닌 또는 종래 합성 멜라닌과 달리 용매 내 분산성이 우수하여 다양한 분야에 응용될 수 있다.

Description

나노 크기의 멜라닌 입자 및 이의 제조방법{NANO SIZED MELANIN PARTICLE AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 용매 내 분산성이 우수한 나노 크기의 멜라닌 입자, 이의 제조방법, 및 멜라닌 입자 제조용 중간체에 관한 것이다.

멜라닌은 식물, 동물, 원생 생물 등 여러 생명체들의 다양한 부위에 존재하는 생물학적 고분자(bio-polymer)로서, 흑갈색의 유멜라닌(Eumelanin)과 황적색의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 분류된다. 유멜라닌은 3,4-디하이드로시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, L-DOPA) 또는 2-(3,4-디하이드로시페닐)에틸아민[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamine, dopamine]으로부터 유래된 것이고, 상기 페오멜라닌은 시스테인(cysteine), 글루타티온(glutathione) 등의 티올기(-SH) 함유 물질 존재하에서 L-DOPA 또는 도파민(dopamine)으로부터 유래된 것이다. 유멜라닌은 포유류에서 우세하게 존재하는 형태의 멜라닌으로서, 카테콜아민(catecholamine)의 산화로 유발된 o-퀴논(o-quinones)의 아민기(amine group) 부분의 분자 내 첨가(intramolecular addition)에 의해 형성된 인돌 유닛(indole units)을 포함하는 불균일한 구조의 생체 고분자로 알려져 있다.

멜라닌은 단순히 색소로서 일정량 이상의 자외선을 차단할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 생물학적 기능을 갖고 있기 때문에, 멜라닌 자체에 대한 연구나 그 제조 방법과 그 응용 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

현재까지 알려진 멜라닌의 생물학적 기능으로는 넓은 영역의 전자기 복사(electromagnetic radiation)를 흡수하는 광보호(photoprotection) 기능을 포함하여, 감광(photosensitization, 광감작), 금속 배위(metal ion chelation), 항생 작용(antibiotic), 체온 조절(thermoregulation), 자유 라디칼 억제(free radical quenching) 등과 같이 그 기능이 다양하다. 이러한 멜라닌은 광전지(photovoltaic cell), 감지장치(sensor), 광전자와 에너지 저장장치(optoelectric and energy storage), 광활성/광보호 물질(photoactive and photoprotective materials), 항산화 물질, 생물 의학(biomedical), 화장품 등 다양한 응용 분야에서 이용되고 있다.

이러한 멜라닌은 종래 자연계에서 얻을 수 있고, 또는 효소에 의한 반응이나 산화제의 의한 반응을 포함하는 인공합성 방법에 의해서도 얻을 수 있다.

구체적으로, 멜라닌은 생체 내에서 얻을 수 있는데, 생체 내 아미노산의 일종인 타이로신(tyrosine)이 효소인 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine, DOPA)으로 전환된 다음, 디하이드록시 페닐알라닌이 일련의 산화 과정을 통해 멜라닌으로 얻어진다. 그러나, 자연계로부터 얻은 멜라닌의 경우, 물과 같은 용매에 용해되지 않아 여러 분야에 응용하기 어려울 뿐만 아니라, 생성되는 멜라닌의 양이 일정하지 않고, 또한 생체 내에서 생성된 순수한 멜라닌을 획득하는 일반화된 공정이 미흡한 상태이다. 또, 인공 합성 방법에 의해서 멜라닌을 얻은 경우, 불규칙한 형상을 가진 물질로서, 멜라닌을 획득하는 데 장시간이 요구되었고, 물 등의 용매에 용해되지 않았을 뿐만 아니라 용매에도 잘 분산되지도 않는 문제점으로 인해서 다양한 분야에 이용하는 데에 있어 한계가 있다.

종래에는 멜라닌이 물과 같은 용매에 분산될 수 있는 나노 크기의 입자 상태로 합성이 되지 아니하였으며, 천연 멜라닌의 경우도 용매에 분산되지 않았다.

본 발명자들은 실험을 통해 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)과 염기(base)의 화학 반응에 의해 형성된 도파민을 산화시키면서 중합반응(polymerization)시켜 멜라닌을 제조하는 데 있어, 상기 염기의 첨가시 도파민·H⁺X^- 과 염기의 몰비를 조절하면, 멜라닌을 일정한 형상을 갖는 입자 상태로 제조할 수 있고, 나아가 입자 크기를 나노 크기로 조절할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.

또한, 본 발명은 표준환원 전위가 약 1.4 ~ 2 정도인 산화제를 이용하여 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 중합시킴으로써, 멜라닌 입자를 제공하고자 한다.

나아가, 본 발명은 반응속도에 영향을 미치는 여러 합성 조건을 조절하여 멜라닌 입자의 크기 및 형상을 정교하게 조절하고자 한다.

본 발명은 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화반응시키는 단계; 및 도파민을 공기 중에서 산화중합(polymerization)시키는 단계를 동시 또는 연속적으로 수행하여 멜라닌을 형성하되, 상기 염기 첨가시 도파민·H⁺X^- (a)과 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1로 조절하여 나노 크기의 멜라닌 입자를 형성시키는 것이 특징인 멜라닌 입자 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 나노 크기의 멜라닌 입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 표준환원 전위가 약 1.4 ~ 2인 산화제의 존재 하에서 도파(DOPA)를 중합시켜 멜라닌 입자를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 멜라닌 입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 나노 크기의 멜라닌 입자를 제공한다.

나아가, 본 발명은 도파민·H⁺X^-(a)와 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1로 조절한 상태에서, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화 반응시킨 후 동결 건조시킨 멜라닌 입자 제조용 중간체를 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법은 단시간 내에 나노 크기의 멜라닌 입자를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 나노 크기의 멜라닌 입자는 천연 멜라닌 또는 종래 합성 멜라닌과 달리 용매 내 분산성이 우수하여 다양한 분야에 응용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자와 오징어 먹물의 TEM 및 SEM 사진으로서, (a) 및 (c)는 각각 오징어 먹물 및 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진이고, (b) 및 (d)는 각각 오징어 먹물 및 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 SEM 사진다.
도 2는 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자가 물에서의 분산성이 우수함을 나타내는 사진이다.
도 3 내지 6은 각각 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 CP/MAS ¹³C Solid state NMR, FT-IR, EPR, 및 UV-VIS의 스펙트럼이다.
도 7은 실시예 1에서 멜라닌 입자를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 8은 실시예 2 내지 4에 따라 멜라닌 입자의 제조시 도파민·H⁺Cl^- 함유 수용액과 염기의 혼합 비율에 따른 반응 시간 - 도파민·H⁺Cl^- 함유 수용액의 pH의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9 내지 도 14는 각각 실시예 2, 4 내지 8에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진이다.
도 15의 (a) 내지 (c)는 각각 실시예 1, 10 및 11에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진이다.
도 16은 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자와 금속의 반응시 멜라닌 입자의 분산성 유지 여부를 나타낸 사진이다.
도 17(a)는 도파민·H⁺Cl^-의 ¹H-NMR 스펙트럼이고, 도 17(b)는 실시예 12에서 제조된 멜라닌 입자 제조용 중간체(반응 생성물)의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 18은 멜라닌 입자를 염기 조건에서(pH 8 ~ 11) mPEG-Nu로 표면 처리시 1,4-첨가 반응을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 19는 실시예 13 내지 15에 따라 멜라닌 입자를 표면 처리한 후 인산염 버퍼 용액(PBS)에 분산시키는 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 20 내지 22는 각각 실시예 13 내지 15에서 얻은 표면 처리된 멜라닌 입자 TEM 사진이다.
도 23은 실시예 13 내지 15에서 얻은 표면 처리된 멜라닌 입자, 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자 및 mPEG-SH의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 24(a)는 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자(표면 처리되지 않음)를 인산염 버퍼 용액(PBS) 및 우태아혈청(FBS)에 각각 분산시킨 것을 나타낸 사진이고, 도 24(b)는 실시예 13에서 얻은 멜라닌 입자를 인산염 버퍼 용액(PBS) 및 우태아혈청(FBS)에 각각 분산시킨 것을 나타낸 사진이다.
도 25는 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자와 실시예 13에서 얻은 멜라닌 입자의 첨가량에 따른 DPPH 라디칼 제거 능력을 나타내는 그래프이다.
도 26은 실시예 1 ~ 8에서 각각 얻은 크기가 다른 멜라닌 입자와 대조군인 아스코르브산의 첨가량에 따른 DPHH 라디칼 제거 능력을 나타내는 그래프이다.
도 27은 실시예 1의 멜라닌 입자의 첨가량에 따른 ESR(Electron spin resonance) 시그널의 강도 변화를 나타낸 그래프로서, EN은 eumelanin nanoparticle을 의미한다.
도 28은 실시예 13의 표면 처리된 멜라인 입자의 첨가량에 따른 ESR(Electron spin resonance) 시그널의 강도 변화를 나타낸 그래프로서, PEN은 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자를 의미한다.
도 29는 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 독성 여부를 측정한 그래프이다.
도 30은 실시예 16에서 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진이다.
도 31은 실시예 17에서 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진이다.
도 32는 DOPA 대비 산화제 KMnO₄의 함량을 0.1 eq, 0.3 eq 및 0.5 eq로 변화시켜 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진이다.
도 33은 DOPA 대비 산화제 NaIO₄의 함량을 0.1 eq, 0.5 eq 및 1 eq로 변화시켜 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서 나노 크기의 멜라닌 입자란, 평균 입경이 나노미터 수준으로 매우 작은 멜라닌 입자를 의미한다.

도파민(Dopamine)의 산화(oxidation)에 의해 멜라닌(melanin)이 형성되는 메커니즘(mechanism)을 보면, 도파민 분자(dopamine molecule)로부터 두 개의 수소 원자(hydrogen)가 떨어져 qunone type으로 바뀌는 단계가 속도 결졍 단계(rate determining step)이고 그 이후의 고리화 단계는 에너지적으로 favorable하여 굉장히 빠르게 진행된다. 전체적인 반응 속도에 영향을 미치는 요소로 pH와 반응 온도, [O₂] [dopamine] 등이 있다.

본 발명자들은 도 7에 나타낸 바와 같이, 실험을 통해 도파민·H⁺X^-을 염기를 이용하여 산 염기 중화 이후 자발적으로 산화(oxidation)시키는 과정에서, 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 양을 조절하여 멜라닌을 입자로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 도파민·H⁺X^-의 농도, 및/또는 도파민·H⁺X^-와 염기의 중화반응 온도를 바꾸어 줌으로써, melanin particle의 scale을 control할 수 있었다. 나아가, 도파민 산화 반응 속도에 영향을 주는 요인을 조절하여 멜라닌 입자(melanin particle)의 크기를 조절할 수 있었다.

구체적으로, 도파민·H⁺X^-와 염기와의 중화 반응을 통한 멜라닌 입자 형성에서 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 mole 비에 따라 멜라닌 입자의 크기가 변하였다(도 9 및 10 참조). 또, 염기의 양이 늘어남에 따라 입자(particle)의 크기는 작아졌으나, 도파민(dopamine)의 mole수 보다 많은 양의 염기 이후로는 일정한 형상의 입자(particle)가 형성되지 않았다. 도파민·H⁺X^-의 농도가 높아짐에 따라 멜라닌 입자의 크기는 증가하였고(도 11 및 12 참조), 반응온도가 증가함에 따라 멜라닌 입자의 크기는 감소하였다(도 13 및 14 참조). 위의 조건들을 조합함으로써, 멜라닌 입자의 크기를 조절할 수 있었고, 400 nm 이하, 바람직하게는 100 nm 이하의 크기가 되는 조건으로 합성할 경우 중성의 물에서 나노 입자의 형태로서 분산될 수 있어 생체의학분야의 여러 분야에 그 응용성이 많을 것으로 예상된다.

이하, 멜라닌 입자 형성시 동시 또는 연속적으로 수행되는 각 단계에 대해 설명하도록 하겠다.

(1) 도파민·H ⁺ X ^- 함유 수용액에 염기( base )를 첨가하여 산 염기 중화반응시키는 단계

본 발명은 도파민·H⁺X^- 함유 수용액에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화반응시킬 때, 상기 도파민·H⁺X^-(a)과 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1로 조절하여 멜라닌 입자의 크기 및 형상을 조절하는 것이 특징이다.

상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액에는 도파민·H⁺(

), H⁺ 및 X^-이 포함되어 있다. 이러한 도파민·H⁺X^- 함유 수용액에 염기를 첨가하게 되면, 상기 염기에 의해서 상기 수용액 내 도파민·H⁺가 중화되어 도파민으로 변환되고, 이와 함께 부수적으로 물(H₂O), 및 NaCl와 같은 염이 생성된다.

본 발명자들은 상기 염기의 첨가시 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 사용 비율에 따라 추후 도파민 중합반응을 통해 제조되는 멜라닌이 일정한 형상을 갖는 입자 상태로 제조될 수 있고, 아울러 상기 멜라닌 입자의 크기(평균 입경)를 나노 크기로 조절할 수 있다는 것을 발견하였다. 구체적으로, 도파민·H⁺X^-에 대한 염기의 몰비가 증가할수록 추후 형성되는 멜라닌 입자의 크기가 작아지고, 도파민·H⁺X^-(a)에 대한 염기(b)의 몰비가 b/a = 1 초과일 경우, 제조되는 멜라닌이 특정 형태를 갖지 않는다. 특히, 본 발명에서는 도파민·H⁺X^-(a)와 염기(b)의 혼합 비율을 a : b = 1 : 0.1 ~ 1의 몰비로 조절함으로써, 일정한 형상(ex. 구형)을 가지면서 나노 크기(평균입경이 약 400 ㎚ 이하, 바람직하게는 약 30 ~ 400 ㎚, 보다 바람직하게는 약 50 ~ 100 ㎚)의 멜라닌 입자를 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 도파민·H⁺X^- 함유 수용액은 HCl과 같은 산(H⁺X^-)으로 인해 도파민이 산성화(

)된 용액으로서, 상기 H⁺X^-에서 X^-의 비제한적인 예로는 할라이드 이온, HSO₄ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^-, CH₃COO^- 등이 있다.

또, 상기 염기는 상기 수용액 내 도파민·H⁺을 중화시킬 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 물질의 비제한적인 예로는 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 금속의 탄산염, 알칼리 토금속의 탄산염, 알칼리 금속의 중탄산염, 알칼리 토금속의 중탄산염, 알칼리 금속의 아세트산염, 알칼리 금속의 인산염, 알칼리 금속 알콕사이드(탄소수 1 ~ 20임), 암모니아(NH₃), 암모니아수(NH₄OH), 아민 등이 있다. 바람직한 염기의 예로서, NaOH, NH₄OH, KOH, Ca(OH)₂, LiOH, K₂CO₃, 메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다.

한편, 전술한 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 혼합 비율 이외에, 산 염기 중화반응의 속도에 영향을 미치는 여러 합성 조건, 예컨대 염기 첨가 전·후 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH 범위, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도 범위, 및 산 염기 중화 반응의 온도 범위를 조절하여 멜라닌 입자의 크기 및 형상을 정교하게 조절하는 것을 또 다른 특징으로 한다.

구체적으로, 산 염기 중화반응에 참여하는 도파민·H⁺X^-의 양은 한정되고, 이로 인해 산 염기 중화반응에 의해 생성되는 도파민의 양도 한정되게 된다. 그래서, 산 염기 중화반응의 속도가 빠를 경우, 형성되는 도파민의 대부분이 멜라닌 입자의 seed 형성에 사용되고, 이로 인해 상대적으로 멜라닌 입자의 성장(growth)에 사용되는 도파민의 양이 적기 때문에, 크기는 작으나 많은 수의 멜라닌 입자를 얻을 수 있다. 반면, 산 염기 중화반응 속도가 느릴 경우, 형성되는 도파민이 멜라닌 입자의 seed 형성보다는 상대적으로 멜라닌 입자의 growth(입자 성장)에 주로 사용되기 때문에, 크기는 크나 소수의 멜라닌 입자를 얻을 수 있다.

이에, 본 발명에서는 나노 입자 크기를 가지면서 일정한 형상을 갖는 멜라닌 입자를 얻을 수 있도록, 염기 첨가 전·후 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH 범위, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도 범위, 및 산 염기 중화 반응의 온도 범위를 각각 또는 전반적으로 조절한다.

예를 들어, 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 몰 비율에 따라 염기 첨가 직후의 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH 범위에 차이가 생기게 되고, 이로 인해 반응 속도도 영향을 받게 되는데, 이때 염기 첨가 전의 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH 값에 따라 또한 반응 속도가 달라지게 된다. 따라서, 본 발명에서는 입자의 크기(평균 입경)가 나노 크기 정도로 조절된 멜라닌 입자를 얻기 위해서, 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 몰 비율을 조절하면서, 염기 첨가 전·후의 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH 범위를 조절하여 산 염기 중화반응의 속도를 제어한다. 여기서, 염기 첨가 전의 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH는 약 2 ~ 7 범위이고, 바람직하게는 약 5 ~ 7 범위인 것이 적절하고, 염기 첨가 직후의 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH는 약 8 ~ 11 범위인 것이 적절하다.

또, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도가 커질수록 추후 제조되는 멜라닌 입자의 크기가 커지나, 제조되는 멜라닌 입자의 크기가 너무 클 경우 용매 내 분산성이 좋지 못하다. 또한, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도가 너무 낮거나 높을 경우 추후 제조되는 멜라닌 입자의 형상이 일정하지 못하다. 이에, 본 발명에서는 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도를 조절하여 멜라닌 입자의 크기(평균 입경이 약 30 ~ 400 ㎚) 및 형상(ex. 구형)을 조절한다. 특히, 추후 제조되는 멜라닌 입자가 용매에 보다 용이하게 오랜 시간 동안 분산될 수 있도록 멜라닌 입자의 크기 및 형상을 조절하는데, 이를 위해 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도를 1 m㏖/ℓ(mM) 내지 1 ㏖/ℓ(M) 범위로 제어하는 것이 바람직하다.

또, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 산 염기 중화반응시, 반응 온도가 높을수록 중화 반응 이후의 산화 및 중합 속도가 빨라지고, 추후 제조되는 멜라닌 입자의 평균 입경이 작다. 아울러, 추후 도파민의 중합반응 온도가 멜라닌 입자의 크기에 영항을 미친다. 따라서, 평균 입경이 약 400 ㎚ 이하 수준이면서 일정한 형상을 갖는 멜라닌 입자를 얻기 위하여, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액에 염기의 첨가는 약 20 내지 100 ℃ 범위의 온도에서 수행하는 것이 적절하다.

한편, 전술한 바와 같은 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 산 염기 중화반응 및/또는 도파민의 중합반응을 티올기(thiol group, -SH)를 함유하는 화합물의 존재하에서 수행하면, 황(Sulfur)을 함유하는 멜라닌을 얻을 수 있다.

상기 티올기 함유 화합물의 비제한적인 예로는 시스테인(cystein), 글루타티온(glutathione) 등이 있다.

상기 티올기 함유 화합물의 사용 함량은 그 종류에 따라 적절하게 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도파민·H⁺X^-(α), 티올기 함유 화합물(β)와 염기(γ)을 α : β : γ = 3 : 1~3 : 2~3의 몰 비율 범위로 혼합할 경우, 크기(평균 입경)가 약 100 내지 200 ㎚인 페오멜라닌을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명은 도파민·H⁺X^-(a)과 염기(base)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1~1로 조절한 상태에서, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기를 첨가하여 산 염기 중화반응시킨 후 건조시킴으로써, 멜라닌 입자 제조용 중간체를 제공할 수 있다. 바람직하게는 상기 건조 전에 산 염기 중화반응의 결과물을 여과하여 염을 제거할 수 있다.

다만, 상기 산 염기 중화반응의 반응 결과물인 도파민(dopamine)은 반응성이 좋기 때문에, 약 1 내지 5 ℃의 온도에서 중화시킨 후 건조하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 1 내지 5 ℃의 온도에서 중화반응 후 동결·건조하는 것이 좋다.

상기 반응 결과물의 여과 방법으로는 추출(extraction) 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다. 여기서, 추출 용매로는 메탄올, 에탄올 등이 있다.

(2) 형성되는 도파민을 중합(polymerization)시키는 단계

이후, 전술한 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 산 염기 중화반응에 의해 형성되는 도파민이 공기 중에서 중합되어 멜라닌 입자를 얻을 수 있는데, 이때 산 염기 중화반응과 도파민의 중합반응은 동시 또는 연속적으로 수행될 수 있다.

상기 도파민의 중합반응은 종래와 달리 과량의 산소 공급 등 산화제 없이 염기의 첨가에 의해 형성되는 도파민이 공기 중에 노출되면, 자연 산화(spontaneous oxidation)되어 상기 도파민들 간에 중합반응이 개시되고 최종적으로 멜라닌 고분자가 생성된다.

한편, 전술한 방법에 의해서 제조되는 멜라닌 입자는 나노 크기로서, 예컨대 크기(평균 입경)가 약 30 내지 400 ㎚ 범위, 바람직하게는 약 50 내지 100 ㎚ 범위일 수 있다. 이러한 나노 크기의 멜라닌 입자는 종래 방법에 의해 제조된 멜라닌 입자와 달리 물에 대한 분산성이 매우 우수하여 다양한 분야에 용이하게 응용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 멜라닌 입자 또는 이를 함유하는 분산 용액은 금속 제거제(metal scavenger), 항산화 물질, 조영제, 광 반응 물질, 광 보호 물질로서 사용될 수 있으며, 또한 금속 감지 장치나 금속의 정량을 분석하는 장치, 광 발전 소자, 광전자와 에너지 저장 장치 등에 이용될 수 있으며, 멜라닌 입자-금속 배위화합물을 이용한 생물의약분야나, 화장품 등 여러 분야에 이용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 멜라닌 입자는 carbonyl, amine, imine, phenol, O-diphenol 등과 같은 멜라닌 입자의 작용기로 인해서 금속에 용이하게 배위하여 금속과 함께 침전될 수 있으며, 이로 인해 금속을 제거하는 금속 제거제(metal scavenger)로서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 멜라닌 입자가 금속 제거제로 이용될 경우, 분산 용액 내 균일하게 분산된 멜라닌 입자가 분산 상태를 유지하는지 등을 통해 간접적으로 금속의 제거 여부를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 멜라닌 입자는 금속 감지 장치 내 금속 감지 수단으로서 사용될 수 있는데, 상기 금속 감지 장치의 경우, 금속 감지 수단 내 멜라닌 입자가 금속을 감지하여 금속과 상호 작용하면 미세 진동이 발생하고, 상기 미세 진동 발명 여부에 따라 on/off와 같은 신호를 방출하는 수단을 통해 금속의 존재 여부를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 멜라닌 입자는 종래 멜라닌 입자와 마찬가지로 전자적으로 들뜬 상태의 염료 분자(dye molecule)를 기저 상태로 만들 수 있고, 또 활성 라디칼족을 비활성화시킬 수 있으며, 산화환원 활성 상태의 금속 이온을 비활성 상태로 만들 수 있기 때문에, 생체 시스템 내에서 효과적인 항산화 물질로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명은 표준환원 전위가 약 1.4 이상인 산화제의 존재하에서 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)의 중합반응을 수행함으로써, 불규칙적인 형상을 가진 멜라닌이 형성되는 종래와 달리, 일정 형상의 멜라닌 입자를 얻을 수 있다.

상기 산화제의 표준 환원 전위는 약 1.4 이상이며, 바람직하게는 약 1.4 내지 2 범위이고, 보다 바람직하게는 약 1.4 내지 1.8 범위인 것이 적절하다.

상기 산화제의 비제한적인 예로는 과망산칼륨(potassium permanganate, KMnO₄), 과요드산 칼륨(potassium periodate, KIO₄), 과요드산 나트륨(sodium periodate, NaIO₄) 등이 있다.

또, 상기 산화제의 함량은 사용되는 산화제의 종류를 고려하여 적절하게 조절하여야 하는데, 바람직하게는 DOPA 몰수 대비 약 0.1 ~ 1 몰 범위로 조절할 수 있다. 만약, 산화제의 양이 DOPA 몰수 대비 약 0.1 ~ 1 몰 범위를 벗어날 경우, 생성되는 멜라닌의 양이 적어지거나 구형의 멜라닌 입자가 형성되지 않을 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 멜라닌 입자는 표면 개질을 통해 다양한 분야에 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 멜라닌 입자는 고분자 말단 부분에 티올기(-SH)를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)로 표면 처리할 수 있다. 구체적으로, 멜라닌 입자를 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)로 표면 처리하게 되면, 친핵체인 티올기 부분이 멜라닌의 퀴논 부분과 1,4-첨가 반응하여 상기 알콕시 폴레에틸렌 글리콜이 멜라닌 입자에 결합되어 멜라닌 입자의 표면이 개질될 수 있다(도 18 참조).

상기 멜라닌 입자의 표면 처리는 도 19에 도시된 바와 같이, 물에 멜라닌 입자를 분산시켜 얻은 분산용액에 상기 분산용액의 pH를 6 ~ 8에서 9.5 ~ 11.5로 변화시킬 수 있는 염기를 첨가하는 단계; 및 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)을 첨가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있는데, 이에 제한되지 않는다.

상기 분산용액 내 멜라닌 입자(A)와 티올기 함유 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(B)은 A : B = 1 : 3~20 중량 비율로 혼합되는 것이 적절하다.

또, 상기 티올기 함유 알콕시 폴리에틸렌 글리콜의 중량평균분자량은 약 1000 ~ 3000 범위인 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이 표면 처리된 멜라닌 입자는 생물학적 용액에서 용이하게 분산될 수 있으며, 또한 유기 용매에도 용이하게 분산될 수 있어 다양한 분야, 특히 생물학적 분야에 응용될 수 있다.

상기 생물학적 용액의 비제한적인 예로는 인산염 버퍼용액(phosphate buffer solution, PBS), 우태아 혈청(Fatal bovin serum, FBS) 등이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1>

Dopamine hydrochloride[(3,4-dihydroxyphenethylamine)HCl] 180 ㎎을 탈이온수(D.I. water) 90 ㎖에 용해시켜 몰 농도가 약 10.5 m㏖/ℓ인 도파민·HCl 함유 수용액(pH = 6.8)을 제조하였다. 이후, 도 7에 도시된 바와 같이, 상기 도파민·HCl 함유 수용액을 50 ℃의 온도에서 1 N의 NaOH 760 ㎕와 혼합하여(도파민·HCl : NaOH = 1 : 0.8 몰 비율) 중화반응시키면서, 5 시간 동안 공기 중에서 교반하여 중합반응을 수행하였다. 이어서, 교반 후 얻은 반응 생성물을 상온하에서 약 18,000 rpm의 속도로 약 20분간 원심 분리하여 정제하되, 이를 3회 반복하였다. 이후, 약 4,000 rpm의 속도로 약 10분간의 원심분리를 통해 size selection을 실시하여 물에 분산되어 있는 멜라닌 입자 70 ㎎을 얻었는데, 이때 수득된 멜라닌 입자의 크기는 약 80 ~ 100 ㎚이었다.

여기서, 상기 혼합 용액이 자발적으로 산화함에 따라, 도파민·HCl 함유 수용액의 pH는 약 6.8에서 NaOH의 첨가 직후 약 9.25으로 변하였다가, 점점 중성으로 변하여 NaOH 첨가 후 약 5 시간 후에는 pH 6.6 정도로 변하였다. 이때, 상기 혼합 용액의 색은 투명 → pale yellow → dark brown으로 변화하였다.

(1) 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM) 사진 및 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM) 사진을 각각 도 1의 (c) 및 (d)에 나타내었다. 이를 오징어 먹물의 TEM 사진[도 1(a)] 및 SEM 사진[도 1(b)]과 비교한 결과, 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자의 형상이 오징어 먹물 입자의 형상과 유사하였고, 또한 그 형상은 구형이었다.

(2) 또, 상기에서 얻은 멜라닌 입자(농도: 약 0.5 ㎎/㎖)를 물에 분산시킨 후, 한 달 동안 방치하여 멜라닌 입자가 물에서의 분산 상태를 유지하는지를 관찰하였다. 관찰 결과, 멜라닌 입자는 한달 이상 물에서 안정하게 분산되어 있었다(도 2 참조).

(3) 또한, 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 CP/MAS ¹³C Solid state NMR, FT-IR, EPR(Electro Paramagnetic Resonance) 및 UV-VIS 스펙트럼을 각각 도 3 내지 6에 나타내었다.

ⅰ) 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 CP/MAS ¹³C solid state NMR spectra를 살펴보면, 170 ppm부근의 quinoid carbonyl C atom; 145 ppm부근의 diphenolic phenoxy C atom; 115 ~ 135 ppm 부근의 arene 및 indole units의 C atom; 104 ppm부근의 indole 및 pyrole units C; 33 ppm 및 42 ppm의 지방성 신호(aliphatic signals)는 이전 연구(Peter, M. G.; Forster, H. Angew . Chem . Int . Ad. 1989, 28, 741. 참조)에서 dopamine을 oxidation시켜 얻은 melanin의 스펙트럼과 거의 일치하였다(도 3 참조). 또한, 상대적으로 작은 intensity의 104 ppm 부근의 indole/pyrrol units의 C signal 및 33 ppm과 42 ppm 부근에 확연하게 나타나는 aliphatic signal은 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자가 인돌(indole unit)뿐만 아니라, aliphatic을 갖고 있는 dihydroindole 또는 dopamine unit을 포함하고 있는 것으로 볼 수 있다. 다만, 멜라닌 자체의 heterogeneous한 구조로 인해서 보다 정확한 구조를 확인할 수 없었다.

ⅱ) 상기에서 얻은 멜라닌 입자(synthetic eumelanin)의 FT-IR 스펙트럼의 경우, 종래 멜라닌(sepia eumelanin)의 작용기(functional group)를 나타내는 특징적인 스펙트럼의 형태와 거의 동일하였다(도 4 참조). 즉, 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자의 경우, 자연계에서 얻는 유멜라닌의 작용기(functional group)를 갖고 있는데, 특히 멜라닌의 가장 큰 특징 중의 하나인 세미퀴논(semiquinone) 형태의 randomly oriented π-electron free radical과 유사한 stable free radicals을 갖고 있었다.

ⅲ) Electro Paramagnetic Resonance를 통해 상기에서 얻은 멜라닌 입자 내 Semiquinone의 radical의 단일 피크를 확인 할 수 있었는데(도 5 참조), 이로부터 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자의 경우, indole unit 및 aliphatic chain을 가지고 있는 dihydroindol이나 dopamine unit의 heterogenious한 구조 및 semiquinone의 radical character를 가지고 있는 것을 확인 할 수 있었다.

ⅳ) 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 전체적인 UV-VIS absorbance는 800 ~ 200 nm Wavelength에서의 특징적인 peak 없이 증가하다 200 nm Wavelength에서 작은 peak가 나타남을 알 수 있었다(도 6 참조). 또한, 상기 멜라닌 입자의 UV/VIS spectroscope data는 기존에 연구(Meredith, P.; Powell, B. J.; Riesz, J.; Nighswander-Rempel, S. P.; Pederson, M. R.; Moore, E. G. Soft Mater. 2006, 2, 37 참조)되어 있는 melanin의 특징적인 넓은 띠의 단일 흡수(broad-band monotonic absorption)와 같은 형태의 흡수를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> ~ <실시예 8>

하기 표 1에서 제시한 바와 같이, 도파민·HCl 함유 수용액(a)과 NaOH(b)의 혼합 몰비율(a : b 몰 비율), 도파민·HCl 함유 수용액(c)의 몰 농도(mM, m㏖/ℓ), 및 도파민·HCl 함유 수용액과 NaOH의 산 염기 중화반응의 온도(℃)를 각각 변화시킨 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 멜라닌 입자를 제조하였다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6	실시예 7	실시예 8
a : b의 몰 비율	1:0.8	1:0.42	1:0.8	1:1	1:0.8	1:0.8	1:0.8	1:0.8
c의 몰 농도 (m㏖/ℓ)	10.5	10.5	10.5	10.5	7	21.1	10.5	10.5
중화반응 온도 (℃)	50	50	50	50	50	50	20	70

< 실험예 1> - 반응 조건에 따른 멜라닌 입자의 크기 변화

본 발명에 따라 멜라닌 입자의 제조시 입자 크기에 영향을 주는 요인(factor)을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

(1) 실시예 2 내지 4에 따라 멜라닌 입자의 제조 시 반응 시간 경과에 따른 도파민·H⁺Cl^- 함유 수용액의 pH 변화를 도 8에 나타내었다. 또, 실시예 2 및 4에서 각각 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진을 각각 도 9 및 10에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 도파민·H⁺Cl^-와 염기의 혼합 비율에 따른 pH의 차이는 멜라닌 입자의 형상 및 크기에 영향을 미친다는 것을 예상할 수 있다. 또한, 실시예 4에서 제조된 멜라닌 입자(도파민·HCl(a) : NaOH(b) = 1 : 1 몰 비율)[도 10 참조]에 비해, 실시예 2에서 제조된 멜라닌 입자(a : b = 1 : 0.42 몰 비율)[도 9 참조]가 최종 제조된 멜라닌 입자의 크기가 컸다. 이로부터 도파민·H⁺X^- 대비 염기의 몰 비율이 증가함에 따라 제조된 멜라닌 입자의 크기는 작아진다는 사실을 알 수 있었다.

(2) 실시예 5에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진을 도 12에 나타내었고, 실시예 6에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진을 도 11에 나타내었다. 이를 살펴보면, 실시예 5에서 제조된 멜라닌 입자(도파민·HCl 함유 수용액의 몰 농도(mM) = 7 m㏖/ℓ)[도 12 참조]에 비해, 실시예 6에서 제조된 멜라닌 입자(21.1 m㏖/ℓ)[도 11 참조]가 최종 제조된 멜라닌 입자의 크기가 컸다. 이로부터 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도가 높아짐에 따라 제조된 멜라닌 입자의 크기는 증가한다는 사실을 알 수 있다.

(3) 실시예 7 및 8에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진을 각각 도 13 및 14에 나타내었다. 이를 살펴보면, 실시예 8에서 제조된 멜라닌 입자(T₁ = 70 ℃)[도 14 참조]보다, 실시예 7에서 제조된 멜라닌 입자(T₁ = 20 ℃)[도 13 참조]가 최종 제조된 멜라닌 입자의 크기가 컸다(상기 T₁은 도파민·HCl와 NaOH의 중화반응온도임). 이로부터 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 반응 온도가 증가함에 따라 멜라닌의 크기가 감소한다는 사실을 알 수 있다.

(4) 상기와 같은 실험 결과로부터 멜라닌 입자의 제조시 반응 조건, 즉 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 혼합 비율, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 농도, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액과 염기의 반응 온도를 조절함으로써, 멜라닌 입자의 크기를 조절할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 9>

도파민·HCl : 시스테인의 몰 비율이 3 : 1 몰 비율이 되도록, Dopamine hydrochloride[(3,4-dihydroxyphenethylamine)HCl] 180 ㎎ 및 시스테인(cysteine) 38 mg을 각각 탈이온수(D.I. water) 90 ㎖에 용해시켜, 몰 농도가 0.94 mM(m㏖/ℓ)인 도파민·HCl 함유 수용액과 몰 농도가 0.3 mM인 시스테인 함유 수용액을 얻은 후, 이들을 혼합하였다. 이후, 50 ℃의 온도하에서 상기 혼합 수용액에 1N NaOH 0.78 ㎖를 첨가하여(도파민·HCl : 시스테인 : NaOH = 3 : 1 : 2.4 의 몰 비율) 산 염기 중화반응시키면서, 연속적으로 5 시간 동안 공기 중에서 교반하여 중합반응을 수행하였다. 이어서, 교반(중합반응) 후 얻은 반응 생성물을 상온하에서 약 18,000 rpm의 속도로 약 20분간 원심 분리하여 정제하되, 이를 3회 반복하였다. 이후, 약 4,000 rpm의 속도로 약 10분간의 원심분리를 통해 size selection을 실시하여 물에 분산되어 있는 페오멜라닌 입자 70 ㎎을 얻었는데, 이때 수득된 페오멜라닌 입자의 크기는 약 80 ~ 100 ㎚이었다. 이때, 상기 혼합 수용액의 색은 투명 → pale yellow → 적갈색으로 변화하였다.

<실시예 10>

도파민·HCl(a), 시스테인(b) 및 NaOH(c)을 3 : 1 : 2.4 몰비율로 혼합하는 대신에, a : b : c = 3 : 2 : 2.4 몰비율로 혼합하는 것을 제외하고, 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 멜라닌 입자를 제조하였다.

상기에서 얻은 멜라닌 입자의 TEM 사진이 도 15(b)이다. 이것과 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진[도 15(a) 참조]과 비교한 결과, 실시예 10에서 얻은 멜라닌 입자의 형상은 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자의 형상과 유사하였다.

<실시예 11>

도파민·HCl(a), 시스테인(b) 및 NaOH(c)을 3 : 1 : 2.4 몰비율로 혼합하는 대신에, a : b : c = 3 : 3 : 2.4 몰비율로 혼합하는 것을 제외하고, 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 멜라닌 입자를 제조하였다.

상기에서 얻은 멜라닌 입자의 TEM 사진이 도 15(c)이다. 이와 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 TEM 사진[도 15(a) 참조]과 비교한 결과, 실시예 11에서 얻은 멜라닌 입자의 형상은 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자의 형상과 유사하였다.

< 실험예 2> - 티올기(-SH)를 함유하는 화합물 이용하여 제조된 멜라닌 입자 분석

실시예 10 및 11에서 각각 제조된 멜라닌 입자를 X-ray Photoelectron Spectroscope(XPS)를 이용하여 분석하였고, 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때, 실시예 1에 따라 제조된 멜라닌 입자와 비교하였다.

	Peak	Position binding energy(eV)	Relative Intensity
실시예 10 (a:b=3:1 몰 비율)	C 1s	283.300	6.6
	N 1s	397.850	1
	S 2p	161.900	0.13
실시예 11 (a:b=1:1 몰 비율)	C 1s	285.500	6.6
	N 1s	400.250	1
	S 2p	164.200	0.31
실시예 1	C 1s	284.200	7.9
실시예 1	N 1s	399.350	1

분석 결과, 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자와 달리, 실시예 10 및 11에 서 제조된 멜라닌 입자의 경우, 분자 내 황 원자가 존재하고 있었다. 또한, 도파민·HCl에 대한 시스테인의 몰 비율이 증가할수록 분자 내 황 원자의 비율이 증가하였다.

이러한 결과로부터, 티올기를 함유하는 화합물이 도파민·H⁺X^-과 염기의 반응에 참가하여 멜라닌 입자 내 일부를 이루고 있음을 알 수 있었고, 또한 티올기를 함유하는 화합물의 이용 여부에 따라 상이한 멜라닌, 즉 유멜라닌 또는 페오멜라닌을 형성할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실험예 3> - 멜라닌의 금속 제거 여부

실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자의 이용시 금속의 제거 여부를 하기와 같이 확인하였다.

상기 멜라닌 입자를 함유하는 분산 용액에 상자기성 금속인 Fe 및 Gd와, 반자기성 금속인 Zn 및 Pb를 첨가하되, 각 금속의 첨가량을 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1, 1 mmol로 달리하여 첨가하였다. 이후, 24시간 동안 교반하여 멜라닌 입자의 분산성 유지 여부를 관찰하였다. 이 결과는 도 16에 나타내었다.

관찰 결과, 상자기성 금속이나 반자기성 금속 모두 2×10^-2 μmol/㎎ 이하(멜라닌 1 ㎎ 당 metal 양)를 첨가할 경우, 분산 용액 내 멜라닌 입자가 분산 상태를 유지함을 알 수 있었다. 또한, 상자기성 금속인 Fe³ ⁺과 Gd³ ⁺를 2 μmol/㎎(멜라닌 1 ㎎ 당 metal 양) 정도 첨가한 경우, 분산 용액 내 멜라닌 입자가 분산 상태를 유지하는 반면, 반자기성 금속인 Zn² ⁺ 및 Pb² ⁺를 2×10^-2 μmol/㎎(멜라닌 1 ㎎ 당 metal 양) 정도 첨가한 경우, 분산 용액 내 멜라닌 입자가 분산 상태를 유지하지 못하고 상기 반자성 금속과 반응하여 침전되었다. 이로부터 본 발명에 따라 제조된 분산성이 우수한 멜라닌의 경우, 특정 금속을 제거하는 데에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 12>

Dopamine hydrochloride[(3,4-dihydroxyphenethylamine)HCl] 189 ㎎을 탈이온수(D.I. water) 90 ㎖에 용해시켜 몰 농도가 약 1 m㏖/ℓ인 도파민·HCl 함유 수용액(pH = 6.8)을 제조하였다. 이후, 상기 도파민·HCl 함유 수용액을 1 N의 NaOH 1.1 ㎖와 혼합한 후(도파민·HCl : NaOH = 1 : 1.1 몰 비율), 상기 혼합 용액을 1 내지 5 ℃의 저온에서 10 분 동안 중화반응시켜 반응 생성물을 얻었다.

상기에서 얻은 반응 생성물을 동결·건조시킨 다음, 수소 치환된 메탄올(methanol d₄)로 녹여 여과 필터(FEPT membrane filter)로 여과한 후 H¹-NMR을 측정하였고, 상기 반응 생성물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 17(b)에 나타내었다.

상기 반응 생성물의 ¹H-NMR 스펙트럼[도 17(b) 참조]과 상기 NaOH 첨가 전의 도파민·H⁺Cl^-의 ¹H-NMR 스펙트럼[도 17(a) 참조]를 비교한 결과, 도파민·H⁺Cl^-의 ¹H-NMR 스펙트럼의 경우, 아민기 주변의 carbon(C)에 결합된 proton(H)의 피크가 전기음성도가 큰 Cl로 인해서 down-field에 나타났다. 이에 비해, 반응 생성물의 ¹H-NMR 스펙트럼의 proton(H)의 피크는 도파민·H⁺Cl^-의 ¹H-NMR 스펙트럼의 proton(H)의 피크 보다 up-field로 이동하였음을 알 수 있다. 이는 도파민·HCl 함유 수용액에 NaOH를 첨가하여 반응시킴에 따라 도파민·HCl로부터 HCl이 분리되기 때문에, 반응 생성물의 ¹H-NMR 스펙트럼의 proton(H)의 피크가 도파민·H⁺Cl^-의 ¹H-NMR 스펙트럼의 proton(H)의 피크 보다 up-field로 이동한 것으로 여겨진다.

이러한 결과로부터 도파민·H⁺X^-함유 수용액에 염기를 첨가하여 산 염기 중화반응을 시킴에 따라 도파민이 생성됨을 알 수 있다.

<실시예 13>

실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자 5 ㎎를 물 5 ㎖에 분산시킨 후, 이 분산 용액에 NH₄OH를 첨가하여 제1 혼합 용액(pH 약 10.5)을 얻었다. 상기 제1 혼합 용액에 말단 부분에 thiol group가 결합되어 있는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG-SH)(M.W 2,000) 15 ㎎을 첨가(멜라닌 입자 : mPEG-SH = 1 : 3 몰비율)하여 얻은 제2 혼합 용액을 12 시간 동안 교반하였다. 교반한 후 얻은 혼합 용액을 19,000 rpm의 속도로 약 15 분간 원심분리한 후, 물에 재분산시키되, 원심분리 및 재분산을 3번 반복한 후, 3,800 rpm의 속도로 약 10분간 다시 원심분리하여 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자를 얻었다(도 19 참조). 이때, 얻은 멜라닌 입자의 TEM 사진이 도 20이다.

<실시예 14>

실시예 13에서 mPEG-SH 15 ㎎을 첨가하는 대신에 30 ㎎을 첨가하여 멜라닌 입자(a) 및 mPEG-SH(b)를 a : b = 1 : 6 몰 비율로 혼합하는 것을 제외하고는, 실시예 13과 동일한 방법에 의해서 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자를 얻었다(도 19 참조). 이때, 얻은 멜라닌 입자의 TEM 사진이 도 21이다.

<실시예 15>

실시예 13에서 mPEG-SH 15 ㎎을 첨가하는 대신에 45 ㎎을 첨가하여 멜라닌 입자(a) 및 mPEG-SH(b)를 a : b = 1 : 9 몰비율로 혼합하는 것을 제외하고는, 실시예 13과 동일한 방법에 의해서 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자를 얻었다(도 19 참조). 이때, 얻은 멜라닌 입자의 TEM 사진이 도 22이다.

< 실험예 4> - 멜라닌 입자의 표면 처리 여부

FT-IR를 통해 실시예 13 내지 15에서 얻은 멜라닌 입자의 표면 처리 여부를 확인하였고, 이 결과를 도 23에 나타내었다. 이때, 대조군 1로서 티올기를 함유하는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG-SH)을 사용하였고, 대조군 2로서 실시예 1에서 얻은 멜라닌 입자를 사용하였다.

측정 결과, 실시예 13 ~ 15에서 얻은 멜라닌 입자의 경우, 실시예 1에서 얻은 멜라닌과 달리 2950 cm^-1 및 1100 cm^-1의 파장에서 특정 피크가 나타났는데, 상기 특정 피크는 mPEG-SH에서도 나타났다. 이로부터 실시예 13 ~ 15에서 얻은 멜라닌 입자의 경우, 멜라닌 입자의 표면에 mPEG-SH가 결합되어 있음을 알 수 있다.

< 실험예 5> - 표면 처리된 멜라닌 입자의 버퍼 용액에 대한 분산성

멜라닌 입자의 표면 처리 여부에 따른 버퍼 용액에서의 분산성을 확인하기 위해, 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자와 실시예 13에서 제조된 멜라닌 입자를 각각 인산염 버퍼 용액(phosphate buffered saline, PBS)에 넣고 분산시켰다. 또한, 상기 멜라닌 입자들을 각각 우태아혈청(Fatal bovin serum, FBS)에도 넣은 후 분산시켰다. 실험 결과를 도 24에 나타내었다.

실험 결과, 실시예 1에서 제조된 멜라닌 입자(mPEG-SH로 표면 처리되지 않음)의 경우, PBS에서 천천히 침전이 진행되더니 하루 만에 완전히 침전되었고, 또한 FBS에서는 아주 천천히 침전이 진행되었다(도 24(a) 참조).

반면, 실시예 13에서 제조된 멜라닌 입자(mPEG-SH로 표면 처리됨)의 경우, PBS에서 2주 동안 안정하게 분산 상태를 유지하였으며, 또한 FBS에서는 무려 한달 동안 안정하게 분산된 상태를 유지하였다(도 24(b) 참조).

이러한 결과로부터, 표면 처리된 멜라닌 입자가 버퍼 용액에 대한 분산성이 우수함을 알 수 있었다.

< 실험예 6> - 멜라닌 입자의 항산화 효과

실시예 1 및 13에서 각각 제조된 멜라닌의 항산화 효과를 DPPH assay 및 Elctron spin resonance spectroscpoy를 통해 하기와 같이 각각 확인하였다.

(1) 0.1 mM의 95 % 에탄올에 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 용해시켜 DPPH 용액을 얻었다. 상기 DPPH 용액 4 ㎖에 표면 처리되지 않은 멜라닌 입자(Bare Eumelanin Nanoparticles, 크기: 94±20 ㎚)를 10 ㎍에서 180 ㎍까지 각각 첨가한 후, 빛에 노출되지 않도록 주의하면서 약 20 분 동안 방치한 다음, 516 nm에서의 흡광도(absorbance)의 감소 변화를 확인하였다. 또한, 표면 처리된 멜라닌 입자(크기 = 107±24 ㎚)도 동일하게 수행하였다. 실험 결과를 도 25에 나타내었다.

일반적으로 DPPH 라디칼(radical)의 농도가 50 % 감소되었는지를 기준으로 자유 라디칼 제거 능력 정도를 확인하는데, 도 25에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 멜라닌 입자가 120 ㎍이 첨가될 때까지, 멜라닌 입자의 자유 라디칼 제거량(Free Radical Scavenging Activity)은 약 85 %까지 증가하였다. 또한, 본 발명에 따라 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자도, 그 첨가량이 120 ㎍이 될 때까지 멜라닌 입자의 자유 라디칼 제거량이 약 79 %까지 증가하였다(도 25 참조).

이러한 실험 결과로부터 본 발명의 멜라닌 입자는 라디칼 제거 능력이 우수하다는 것을 알 수 있고, 나아가 멜라닌 입자의 표면 처리 여부와 상관 없이 멜라닌 입자가 라디칼을 용이하게 제거할 수 있다는 것을 알 수 있다.

(2) 또, 상기 DPPH 용액 4 ㎖에 크기가 68±21 ㎚인 멜라닌 입자를 10 ㎍에서 180 ㎍까지 각각 첨가한 후, 빛에 노출되지 않도록 주의하면서 약 20 분 동안 방치한 다음, 516 nm에서의 흡광도(absorbance)의 감소 변화를 확인하였다. 또한, 크기가 94±20 ㎚인 멜라닌 입자와 크기가 291±57 ㎚인 입자도 동일하게 수행하였으며, 이의 대조군으로서 아스코르브산(Ascorbic acid)을 사용하였다. 실험 결과를 도 26에 나타내었다.

도 26에서 알 수 있는 바와 같이, 멜라닌 입자의 크기가 작아짐에 따라 멜라닌 입자의 자유 라디칼 제거량이 증가하였다. 특히, 크기가 68±21 ㎚인 멜라닌 입자의 경우, 자유 라디칼 제거 정도가 항산화 물질로 잘 알려진 아스코르브산과 거의 동일 수준이었다.

이러한 실험 결과로부터 크기가 100 ㎚ 이하 정도인 본 발명의 멜라닌 입자가 우수한 라디칼 제거 능력을 가진다는 것을 알 수 있다.

(3) 또한, 상기 DPPH 용액 4 ㎖에 크기가 68±21 ㎚인 멜라닌 입자를 10 ㎍에서 180 ㎍까지 각각 첨가한 후, 빛에 노출되지 않도록 주의하면서 약 20 분 동안 방치한 다음, Electron spin resonance를 이용하여 라디칼 제거 여부를 확인하였다. 실험 결과를 도 27 및 28에 나타내었다.

실험 결과, DPPH 라디칼(radical)에서 기인한 자기장 3320 G에서의 ESR 시그널(signal)은 멜라닌 입자의 첨가량이 증가할수록 그 강도(intensity)가 감소하다가 멜라닌 입자의 첨가량이 120 ㎍일 때 완전히 소멸되었다(도 27 참조). 이와 마찬가지로 표면 처리된 멜라닌 입자의 경우도, 멜라닌 입자의 첨가량이 120 ㎍일 때 3320 G에서의 ESR 시그널이 완전히 소멸되었다(도 28 참조).

이러한 실험 결과로부터 본 발명의 멜라닌 입자가 라디칼 제거 능력이 우수함을 알 수 있다.

(4) 상기 실험 결과로부터 본 발명에 따라 제조된 멜라닌 입자가 우수한 라디칼 제거 능력을 갖고 있고, 나아가 생체 시스템 내에서 우수한 항산화 물질로서 작용할 수 있음을 예상할 수 있다. 또한, 멜라닌 입자의 표면 처리 여부와 상관없이 본 발명의 멜라닌 입자는 우수한 항산화 효과를 발휘하며, 또한 멜라닌 입자의 크기가 약 100 ㎚ 이하로 작을수록 보다 우수한 항산화 효과를 발휘할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 7> - 멜라닌 입자의 독성 테스트

실시예 13에서 얻은 mPEG-SH로 표면 처리된 멜라닌 입자의 농도를 6.25 ㎍/㎖ 에서 100 ㎍/㎖로 증가시켜 Hela 세포를 처리할 때 Hela 세포의 생존 정도를 확인하였고, 그 결과를 도 29에 나타내었다.

실험 결과, 농도가 100 ㎍/㎖인 멜라닌 입자로 hela 세포를 처리하였을 경우에도 Hela 세포의 생존력이 약 85 % 이상이었다.

이로부터 본 발명에 따라 표면 처리된 멜라닌 입자는 거의 독성이 없다는 것을 확인 할 수 있었다.

<실시예 16>

표준환원 전위가 약 1.5 내지 1.7 정도인 산화제 KMnO₄의 존재하에서, 0.1 m㏖의 DOPA를 10 ml의 물에 녹인 후, 약 50 ℃의 온도에서 약 5시간 동안 반응 시킨 결과, 크기가 약 100 ~ 400 ㎚인 멜라닌 입자를 얻었는데, 상기 멜라닌 입자의 수율이 40 % 이상이었다. 이때, DOPA 및 KMnO₄을 DOPA: KMnO₄ = 3 : 1 몰 비율로 사용하였다. 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진을 도 30에 나타내었다.

<비교예 1>

산화제 없이 공기 중에서 0.1 m㏖의 DOPA를 10 ml의 물에 녹인 후, 약 50 ℃의 온도에서 약 3일 동안 중합시킨 결과, 크기가 약 100 ~ 300 ㎚ 정도인 멜라닌 입자를 얻었으나, 그 양이 매우 적었다.

<실시예 17>

실시예 16에서 사용된 KMnO₄ 대신에 NaIO₄를 사용하였고, 이때 DOPA 및 NaIO₄을 DOPA : NaIO₄ = 2 : 1 몰 비율로 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 16과 동일한 방법으로 멜라닌 입자를 제조하였다. 상기에서 얻은 멜라닌 입자의 SEM 사진을 도 31에 나타내었다.

< 실험예 8> - DOPA 대비 산화제 함량에 따른 멜라닌 입자 형태 변화

DOPA 대비 산화제의 함량 변화에 따른 멜라닌 입자의 형태를 확인하기 위해, 하기와 같이 각각 수행하였다.

(1) 실시예 16과 동일하게 수행하되, 산화제 KMnO₄의 함량을 0.1 당량, 0.3 당량 및 0.5 당량으로 변화시켜 멜라닌 입자를 제조하였다. 이때 얻은 각각의 멜라닌 입자의 SEM 사진을 도 32에 나타내었다.

(2) 실시예 16과 동일하게 수행하되, 산화제 NaIO₄의 함량을 0.1 당량, 0.5 당량 및 2 당량으로 변화시켜 멜라닌 입자를 제조하였다. 이때 얻은 각각의 멜라닌 입자의 SEM 사진을 도 33에 나타내었다.

(3) 도 32 및 33에서 알 수 있는 바와 같이, DOPA 대비 산화제의 사용 함량을 특정 범위로 조절하여 멜라닌 입자의 형태가 구형이 되도록 조절할 수 있다는 것을 확인 할 수 있었다.

Claims

도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화반응시키는 단계; 및
형성되는 도파민을 공기 중에서 산화시키면서 중합(polymerization)시키는 단계
를 동시 또는 연속적으로 수행하여 멜라닌을 형성하되,
상기 염기 첨가시 도파민·H⁺X^-(a)과 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1로 조절하여 평균 입경이 30 내지 400 ㎚ 범위인 나노 크기의 멜라닌 입자를 형성시키는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 H⁺X^-에서 X^-는 할라이드 이온, HSO₄ ^-, NO₃ ^-, H₂PO₄ ^- 및 CH₃COO^-로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 염기는 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 토금속 수산화물, 알칼리 금속의 탄산염, 알칼리 토금속의 탄산염, 알칼리 금속의 중탄산염, 알칼리 토금속의 중탄산염, 알칼리 금속의 아세트산염, 알칼리 금속의 인산염, 알칼리 금속 알콕사이드(탄소수 1 ~ 20), 암모니아(NH₃), 암모니아수(NH₄OH) 및 아민으로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 도파민·H⁺X^-는 도파민 염산염(dopamine hydrochloride, C₈H₁₁NO₂·HCl)이고, 염기는 NaOH인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 pH는 2 내지 7인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액에 염기 첨가 직후의 pH는 8 내지 11인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 도파민·H⁺X^- 함유 수용액의 몰 농도가 1 m㏖/ℓ(mM) 내지 1 ㏖/ℓ(M) 범위인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 염기의 첨가는 20 내지 100 ℃의 온도에서 수행되는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 산 염기 중화반응 단계, 중합반응 단계 또는 이들 모두는 티올기(thiol group, -SH)를 함유하는 화합물의 존재하에서 추가적으로 수행되는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 티올기를 함유하는 화합물(β)은 도파민·H⁺X^-(α) 및 염기(γ)와의 혼합비율이 α : β : γ = 3 : 1~3 : 2~3의 몰 비율인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 멜라닌 입자는 구형인 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
표준환원 전위가 1.4 이상인 산화제의 존재하에서 도파(3, 4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 중합시켜 멜라닌 입자를 제조하는 단계; 및
상기 멜라닌 입자를, 고분자 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)로 표면 처리하는 단계를 포함하는 멜라닌 입자의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 산화제는 과망산칼륨(potassium permanganate, KMnO₄), 과요드산 칼륨(potassium periodate, KIO₄) 및 과요드산 나트륨(sodium periodate, NaIO₄)으로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 형성된 멜라닌 입자를, 고분자 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)로 표면 처리하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 표면 처리 단계는 물에 멜라닌 입자를 분산시켜 얻은 분산용액에 상기 분산용액의 pH를 6 ~ 8에서 9.5 ~ 11.5로 변화시킬 수 있는 염기를 첨가하는 단계; 및 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)을 첨가하는 단계를 포함하는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 표면 처리 단계는 물에 멜라닌 입자를 분산시켜 얻은 분산용액에 상기 분산용액의 pH를 6 ~ 8에서 9.5 ~ 11.5로 변화시킬 수 있는 염기를 첨가하는 단계; 및 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)을 첨가하는 단계를 포함하는 것이 특징인 멜라닌 입자의 제조방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 멜라닌 입자.
제17항에 있어서, 상기 멜라닌 입자는 물에 분산되는 것이 특징인 멜라닌 입자.
제17항에 있어서, 상기 멜라닌 입자는 말단 부분에 티올기를 함유하는 알콕시 폴리에틸렌 글리콜(알콕시기의 탄소수 1 ~ 50)로 표면 처리된 것이 특징인 멜라닌 입자.
제19항에 있어서, 상기 표면 처리된 멜라닌 입자는 인산염 버퍼용액(phosphate buffer solution, PBS) 및 우태아 혈청(Fatal bovin serum, FBS)으로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 용액에 분산되는 것이 특징인 멜라닌 입자.
제17항에 있어서, 상기 멜라닌 입자는 금속 제거제(metal scavenger), 항산화 물질, 금속 감지 수단, 조영제, 광 반응 물질 및 광 보호 물질로 이루어진 군에서 선택된 것으로 사용되는 것이 특징인 멜라닌 입자.
도파민·H⁺X^-(a)과 염기(b)의 몰비를 a : b = 1 : 0.1 ~ 1 로 조절한 상태에서, 도파민·H⁺X^- 함유 수용액(여기서, H⁺X^-는 산임)에 염기(base)를 첨가하여 산 염기 중화반응시킨 후 건조시켜 제조된 멜라닌 입자 제조용 중간체.
제22항에 있어서, 상기 산 염기 중화반응 온도는 1 내지 5 ℃인 것이 특징인 멜라닌 입자 제조용 중간체.
제22항에 있어서, 상기 건조하기 전에 반응 결과물을 여과하여 염을 제거한 것이 특징인 멜라닌 입자 제조용 중간체.
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