KR101218699B1

KR101218699B1 - 산화 억제능 또는 피부 미백능이 증진된 선학초 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR101218699B1
Application number: KR1020100094885A
Authority: KR
Inventors: 이선구; 김미정
Original assignee: 주식회사 케이엠포유
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2013-01-04
Also published as: KR20120033394A

Abstract

본 발명은 산화 억제능 또는 피부 미백능이 증진된 선학초 추출물의 제조방법에 관한 것인데, 본 발명에서 제공하는 추출방법에 의할 경우, 항산화능 또는 피부 미백능이 향상된 선학초 추출물을 수득할 수 있다

Description

산화 억제능 또는 피부 미백능이 증진된 선학초 추출물의 제조방법{Method for production of the extract of Agrimonia pilosa Ledeb with enhanced anti-oxidative activity and anti-melanogenesis effect}

본 발명은 산화 억제능 또는 피부 미백능이 증진된 선학초 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

선학초(또는 용아초)는 장미과의 다년생 초본 식물로, 학명은 아그리모니아 필로사 레뎁(Agrimonia pilosa Ledeb.)이다. 선학초는 수렴지혈(收斂止血), 익기강심(益氣强心), 지사, 건위, 지혈 등의 한방 약재로 사용되어 왔는데, 그 성분으로는 아그리모닌(agrimonin), 아그리모노라이드(agrimonolide), 탄닌(tannin), 스테롤(sterol), 유기산, 사포닌 등이 있다.

한편, 선학초 추출물을 포함하는 항노화 화장품(일본 특허 번호 제10,226,617호), 선학초 추출물의 항암 효과(ACS Symp. Ser. (1997), 662, 245-259), 미백 효과(일본 특허 번호 제8,175,957호)에 대한 연구가 종래에 보고되어 있다.

또한, 대한민국 공개특허 특2001-0053978호에 항자극 화장료 조성물이 보고되어 있고, 대한민국 공개특허 10-2006-0018937호에 선학초 추출물을 함유하는 항산화, 지질대사 개선 및 당뇨병합병증 예방 및 치료용 약학 조성물이 보고되어 있다.

하지만, 상기 특허들은 선학초 추출물의 각종 효능을 단순 규명하였을 뿐, 해당 효능을 발휘하는 성분들의 추출 수율을 높일 수 있는 방법에 대한 제시는 없었다. 특히, 항산화 활성 또는 피부 미백능을 증진시킬 수 있는 추출방법의 제시는 더 더욱 없었다.

이에 본 발명은 산화 억제능 또는 피부 미백능이 증진된 선학초 추출물의 제조방법을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1형태로 선학초에 추출용매로 pH가 4~7인 물 또는 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 첨가하고, 초음파를 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 선학초 추출물의 제조방법을 제공한다. 추출용매로 pH가 4~7인 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 사용하고, 초음파를 가할 경우, 항산화능이 현저히 증가한 선학초 추출물을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명은 제2형태로 선학초에 추출용매로 pH가 3~5 또는 10~12인 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 첨가하고, 초음파를 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 선학초 추출물의 제조방법을 제공한다. 추출용매로 pH가 3~5 또는 10~12인 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 사용하고, 초음파를 가할 경우, 미백 효능이 현저히 증가한 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에서 제공하는 추출방법에 의할 경우, 항산화능 또는 피부 미백능이 향상된 선학초 추출물을 수득할 수 있다.

도 1은 선학초 추출물의 항산화 평가 인자로서, DPPH 어세이(assay)에 의한 전자공여능 측정 결과이다.
도 2는 선학초 추출물의 항당뇨 평가 인자로서 α-글루코시다제 억제 효능 측정 결과이다.
도 3은 선학초 추출물의 미백능 평가 인자로서 도파크롬 타우토머라제(Dopachrome Tautomerase, DCT) 프로모터(promoter) 어세이 결과이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 : 선학초 추출물의 제조

선학초 50g을 물 또는 50%(v/v) 알코올 수용액 500g과 각각 혼합한 후, 각각의 pH를 4, 7, 11로 각각 조정하고, 일반 추출기 또는 초음파 병합추출기에서 각각 60℃의 온도로 180분 동안 추출하여 샘플을 12가지 제조하였다. 추출한 후, 추출물을 동결건조하였다.

한편, 상기에서 각각 동결건조한 시료는 10 mg/ml의 농도로 D.W.에 용해시킨 후, 침전물 형성 유무를 확인하여 침전물 형성이 없는 조건으로 용해하였으며, 용해된 시료는 미니사르트(Minisart) RC15 시린지 필터(0.20 μm; Sartorius stedium biotech, Germany)를 사용하여 불순물을 제거하였다. 준비된 시료는 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였으며, 실험에 사용할 시료는 농도별로 희석하여 4℃ 냉장고에 보관 사용하였다.

실험예 1: 상기 실시예 샘플의 항산화 활성 확인

상기 실시예에서 제조한 각각의 샘플에 대해 항산화 활성을 확인하고자 하였다. 항산화효과의 검증은 화학적인 방법인 DPPH 어세이를 통하여 수행하였다.

96 well ELISA 플레이트에 시료(최종농도: 50 μg/ml)를 20 μl/well의 농도로 넣은 후, 180 μl/well의 0.1 mM DPPH working solution(12 mg DPPH/300 ml 50% EtOH)을 넣었다. 반응액을 실온에서 빛이 없는 조건으로 10분간 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준물질로 아스코르브산(Ascorbic acid)을 사용하였으며, 대조군(Control)인 시료를 넣지 않은 반응물을 기준으로 전자공여능(Electron donating activity, %)를 하기 수학식 1로부터 산출하여 도표화하였다.

DPPH 어세이 결과는 도 1과 같았는데, 추출용매로 50% 에탄올 추출물을 사용하는 경우가 물을 사용하는 경우에 비해 활성이 높게 나타났고, pH는 4~7의 범위에서 그 외의 범위에 비해 활성이 높게 나타났으며, 초음파를 사용하는 경우가 그렇지 않은 경우에 비해 활성이 15~20% 정도 높게 검증되었다.

실험예 2: 상기 실시예 샘플의 항당뇨 활성 확인

상기 실시예에서 제조한 각각의 샘플에 대해 항당뇨 활성을 α-글루코시다제 억제능 어세이(α-glucosidase inhibition assay)를 통해 확인하고자 하였다. 혈당조절 효과(항당뇨 효과)는 단당류를 생성하는 효소인 α-글루코시다제의 저해도를 평가하여 검증할 수 있기 때문이다.

96 well ELISA 플레이트에 순차적으로 희석된(Serial dilution) 시료를 20 μl/well의 농도로 넣은 후, 130 μl/well의 2.5 mM pNPG(p-nitrophenyl-α-D-gluco-pyranoside)가 포함된 100 mM 포타시움 포스페이트 버퍼(Potassium phosphate buffer; pH 7.0)을 넣은 후, 37℃에서 5분 동안 전처리하였다. 시간경과 후, 40 mU/well의 α-글루코시다제(Type 1; Sigma)를 넣은 후, 405 nm에서 10분간 흡광도의 변화량을 측정하였다. 이때, 대조군인 시료를 넣지 않은 반응물을 기준으로 분당 흡광도 변화량(ΔOD; Activity)를 산출한 후, Specific activity(ΔOD/min/unit of enzyme)를 하기 수학식 2로부터 산출하여 도표화 하였다.

α-글루코시다제의 저해도 측정 결과는 도 2와 같았는데, 추출용매로는 50% 에탄올 수용액을 사용하는 경우가 물을 사용하는 경우보다 저해도가 높게 나타났고, pH 4~7에서 다른 pH에 비해 저해도가 높게 나타났다. 다만, 초음파를 사용하는 경우 저해효과가 초음파를 사용하지 않은 경우에 비해 약 10% 정도 증대되기는 하였으나, 상기의 항산화 효과가 증진된 비율(15~20%)에 비하면 다소 낮게 증대됨을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 상기 실시예 샘플의 미백 활성 확인

상기 실시예에서 제조한 각각의 샘플에 대해 미백 활성을 확인하고자 하였다. 미백 활성은 B16/F10 mouse Melanoma를 이용하여 검정하고자 하였다. B16/F1, F10 Mouse 유래 흑색종 세포주는 세포배양 중에 멜라닌(melanin) 생성 유도물질일 MSH(Melanin stimulating hormone)이나 IBMX를 처리할 경우 세포질 내에 멜라닌 형성이 증가한다. 이와 같은 이유로 상기 세포주는 미백활성 검증에 널리 사용된다.

본 실험은 우선 시료의 독성 유무를 파악하고 적정 처리 농도를 책정하기 위하여 세포 활성 어세이(MTT assay)를 수행하고, 결정된 농도를 토대로 멜라닌 형성에 관여하는 효소 중, 도파크롬 타우토머라제(TYRP-2; Tryrosinase Related Protein-2)의 프로모터 어세이를 수행하였다.

프로모터 어세이를 위한 pMDCT-Glu 플라스미드와 트랜스펙션 효율을 검증하기 위한 pCMV-gal 플라스미드는 경북대학교 식품공학과 식품효소생명공학 연구실 이상한 교수님으로부터 지원을 받아 사용하였다.

(1) MTT assay

B16/F10 세포주를 48 well 배양 플레이트(Corning Costar)에 1 X 10³ cells/well에 넣은 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에 24시간 배양하였다. 시간 경과 후, 배양액을 제거하고 500 μl/well의 FBS-free DMEM으로 교체한 후, 6시간 동안 동일한 조건하에 배양하였다. 시간 경과 후, 배양중인 세포에 20 μl/well의 시료를 첨가 혼합한 후, 24시간 동일조건에서 배양하였다. 다음날, 20 μl/well의 5 mg/ml MTT(MTT Tetrazolium)을 첨가한 후, 3시간 후에 배지를 제거하고 세포 내에 침착된 MTT formazan을 500 μl/well의 DMSO(Dimethylsufoxide)에 녹여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖ 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며 이 농도로 하기에서 프로모터 어세이를 수행하였다.

(2) 도파크롬 타우토머라제(DCT) 프로모터 어세이

B16/F10 세포주를 24 well 배양 플레이트(SPL, Korea)에 1 X 10⁴ cells/well을 넣어 60% 정도 성장했을 때, 배양중인 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 300 μl/well의 TOM 배지(Wellgene, Korea)를 넣어 1시간 배양한다.

시간 경과 후, 150 μl/well의 트랜스펙션 혼합액(0.3 μg/well pMDCT-glu plasmid DNA, 0.3 μg/well pCMV-gal plasmid DNA, 1.2 μg/well Enhancer-Q, 2 μg/well Welfect-EX plus)를 넣어 4시간 동안 배양하였다.

시간 경과 후, 트랜스펙션 혼합액을 제거한 후 500 μl/well 시료가 첨가된 배지(DMEM, 10% FBS)를 넣고 24시간 배양하였다. 이때 음성대조군으로 IBMX를 사용하였고 양성대조군으로는 PTU를 사용하였다.

시간 경과 후, 배양액 100 μl/well을 96 well ELISA 플레이트로 옮긴 후 50 μl/well 가우시아 루시퍼라제 어세이 용액(Gauccia Luciferase assay solution; NEB)를 첨가한 후 빅터 멀티-플레이트 리더(Victor Multi-Plate Reader)를 이용하여 배지에 생성된 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.

트랜스펙션 효율을 검정하기 위하여 배양액을 제거한 세포를 맴말리안 프로테인 익스트랙션 용액(Mammalian Protein extraction solution, Thermo Scientific)을 이용하여 회수하였고 세포 추출액을 이용하여 베타-갈락토시다제(beta-Galactosidase)의 활성을 측정하였으며, 이때 단백질의 정량은 BCA kit(Sigma)를 사용하였다.

실험 결과는 도 3과 같았는데, 추출용매로 에탄올 수용액을 사용하는 경우가 물을 사용하는 경우보다 미백 활성이 높게 나타났고, 초음파를 사용할 경우 그렇지 않은 경우보다 미백 활성이 높게 나타났다.

실험예 4: 상기 실험예 1 내지 3의 결과 종합

상기 실험예 1 내지 3의 결과를 상대적 수치로 종합화한 결과는 하기의 표 2과 같았다.

항산화, 항당뇨 및 미백 효능의 실험 결과 종합

초음파 사용	초음파 사용 안함						초음파 사용함
추출용매	물			50% 에탄올 수용액			물			50% 에탄올 수용액
pH	4	7	11	4	7	11	4	7	11	4	7	11
항산화 효과	1	2	1	2	3	1	3	3	2	3	3	2
항당뇨 효과	0	0	0	2	1	0	0	0	0	2	2	0
미백 효과	0	1	0	0	2	0	0	0	0	3	0	3
주) 0: 활성 없음 1, 2, 3: 활성 수준

상기 표 1에서 보는 바와 같이 항산화능에 있어서, 초음파를 사용하는 샘플이 그렇지 않은 샘플에 비해 높게 나타났고, pH 4~7에서 높게 나타났다.

한편, 미백효과에 있어서는 추출용매로 50% 에탄올 수용액을 사용하여 추출한 샘플이 그렇지 않은 샘플에 비해 전반적으로 높게 나왔고, pH 4 내외 및 pH 11 내외에서 높게 나타났다. pH의 변화에 따른 미백 효능 측정에 관한 추가 실험 결과, pH 3, pH 5에서 상대적 수치 2 정도의 활성 정도가 각각 추가적으로 측정되었으며, pH 10, pH 12에서 상대적 수치 2 정도의 활성 정도가 각각 추가적으로 측정되었다.

Claims

선학초에 추출용매로 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 첨가하고 pH 4 ~ 7의 조건에서 초음파를 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 선학초 추출물의 제조방법.
선학초에 추출용매로 40~60%(v/v) 에탄올 수용액을 첨가하고 pH 3 ~ 5 또는 10 ~ 12의 조건에서 초음파를 가하여 추출하는 것을 특징으로 하는 선학초 추출물의 제조방법.