KR101202622B1 - 톨루엔 흡입여부 진단스트립 및 이를 포함하는 진단키트 - Google Patents

Abstract

톨루엔 흡입여부 진단스트립이 제공된다.

본 발명에 따른 톨루엔 흡입여부 진단스트립은 마뇨산-운반자 단백질 접합체가 검사선 부위에 흡착되어 있는 전개 멤브레인과, 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 복합체가 함침되어 있는 골드패드를 상기 전개 멤브레인의 상부 일측에 구비하며, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 중사슬의 가변성 부위와, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 경사슬의 가변성 부위를 포함하며, 상기 검사선에 흡착되어 있는 마뇨산-캐리어 단백질 접합체와 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 간의 항원-항체 반응에 의한 발색에 의하여 톨루엔 흡입여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르는 톨루엔 흡입여부 진단 스트립을 사용하면 특별한 검사장비나 훈련된 인원이 없이도 간단하게 면역학적으로 소변내의 마뇨산을 진단함으로써 본드 흡입 여부나 유해 용재에 작업자의 노출 여부를 간편하고 신속하게 진단할 수 있다.

마뇨산, 톨루엔 흡입여부

Description

톨루엔 흡입여부 진단스트립 및 이를 포함하는 진단키트{Diagnosis strip for inhalation of toluene and diagnosis kit comprising the same}

도 1은 마뇨산에 대한 단일클론항체들의 competitive ELISA 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2은 정제된 단일클론항체[4D31G111B7(1) and (2)]의 HA에 대한 competitive ELISA 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3는 다양한 농도의 HA(8㎎/㎖ 내지 0.0019㎎/㎖) 및 정제된 IgG(4D31G111B7)(3.25㎍/㎖ 및 1.625㎍/㎖)의 competitive ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 항체(IgG) 분자와 그 단편들(fragments)의 구조를 나타내는 그림이다.

도 5은 7가지 MHV 78 primers를 이용하여 hybridoma의 cDNA를 증폭한 PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 분석 사진이다.

도 6은 11가지 MKV 75 primers를 이용하여 hybridoma의 cDNA를 증폭한 PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 분석 사진이다.

도 7은 V_H, V_K, 및 scFv PCR 산물의 전기영동 분석 사진이다.

도 8는 pCANTAB5E의 발현 벡터 지도이다.

도 9은 PCR에 의해 pCNATAB5E내로 클론된 scFv를 확인한 전기영동 사진이다.

도 10은 scFv 유전자의 염기서열과 추론된 아미노산 서열이다.

도 11는 scFv에서 추론된 중사슬과 경가슬(kappa chain)의 가변부위 (V_H and V_K)의 아미노산 서열이다.

도 12은 scFv 발현의 SDS-PAGE 및 Western blot analysis 사진이다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 진단 스트립의 개략도이다.

도 14는 양성인 경우에 본 발명에 따른 진단 스트립의 작동메커니즘을 나타내는 개략도이다.

도 15는 음성인 경우에 본 발명에 따른 진단 스트립의 작동메커니즘을 나타내는 개략도이다.

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 진단 스트립을 내장한 진단키트의 개략도이다.

도 17은 시험예 1에 따른 결과를 나타내는 도면이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

10...전개 멤브레인 20...골드패드

30...검체적용패드 40...흡습패드

50...검사선 60...대조선

본 발명은 대표적인 유해 환각 물질중의 하나인 톨루엔의 대사체인 마뇨산(Hippuric Acid)에 대한 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 톨루엔의 인체노출기준에 적합한 mg/ml 범위의 역가를 가지고 있으며, 운반자 단백질과는 교차 반응을 하지 않으며, 마뇨산의 농도가 높아질수록 경쟁적 억제가 심하게 일어나므로, 톨루엔의 인체노출여부를 진단하는데 유용하게 이용될 수 있는 마뇨산에 대한 단일클론항체에 관한 것이다.

톨루엔(메틸벤젠, C₇H₈)은 분자량 92.14, 녹는점 －95 ℃, 끓는점 110.8 ℃, 비중 0.87(15 ℃)이며, 특이한 냄새가 나는 무색의 방향족 용제로서, 뛰어난 용해력과 증발속도를 가지기 때문에 페인트, 잉크, 접착제, 농약용제 및 각종 화학 반응의 반응원료로서 다양한 산업분야에 사용되고 있다.

이러한 톨루엔에 인체가 노출된 경우에는 후각 상실, 메스꺼움, 불규칙한 심장박동, 술취한 감 등의 영향이 나타나며, 심한 경우에는 간 및 신장 손상, 신경장애 및 뇌손상 등을 일으킬 수 있다. 최근에는 국내의 한 테니스공 제작회사에서 10여 년 동안 테니스공 접착일을 했던 근로자에게 팔, 다리, 어깨는 물론 폐까지 굳어지는 희귀한 직업병이 발생하였다는 보고가 있었는데, 이는 접착제에 함유된 톨루엔에 의한 톨루엔 중독에 의한 것임이 밝혀졌다.

현재, 산업안전보건법에 의하면 상기 톨루엔의 인체노출기준은 TWA:100 ppm 으로 정하여져 있고, 2005년 2월 10일부터 시행된 대한민국 악취방지법 시행령에 의하면, 톨루엔의 배출허용기준은 2008년 2월 10일부터 공업지역에서는 30ppm, 기타지역에서는 10ppm이하로 규제되게 된다. 따라서, 이러한 허용 기준을 준수하기 위해 톨루엔을 사용하는 업체에 대하여 국소배기나 공정밀폐 배기시설을 설치할 것과 작업장 내에 호흡용 보호구를 비치할 것 등이 강제되고 있다.

한편, 이러한 산업적인 문제 이외에도 톨루엔이 다량 포함된 본드의 흡입은 우리 나라 등의 개발도상국에서 특이하게 나타나는 병리 사회학적 현상이다. 특히 청소년 등이 마리화나나 코카인 등의 마약에 유사한 몽환, 환각증상 등을 느끼기 위하여 본드를 오용하는 현상이 심각한 사회적 병폐현상으로 대두되고 있는데, 이러한 본드 흡입의 폐해는 상기 마약보다 오히려 심각하다고 할 수 있다. 그 이유는 정신분열 또는 뇌손상에 따른 뇌위축 때문에 회복할 수 없는 후유증을 남길 수 있기 때문이다.

이처럼 산업안전의 측면이 강화됨에 따라, 작업환경 내에서 톨루엔 등의 유해한 환경요소에 대한 노출여부를 확인하는 한편, 청소년 등의 약물 오남용을 방지하고 억제하기 위하여 상기 톨루엔의 흡입여부를 측정할 수 있는 방법의 필요성이 증대되고 있다.

현재 통상적으로 사용되는 방법은 분석화학적인 방법을 사용하여 혈액이나 뇨 중에 존재하는 톨루엔 그 자체의 양을 측정하거나 톨루엔의 대사물질인 마뇨산을 측정하는 것인데, 이러한 측정을 수행하기 위해서는 기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/ Mass spectroscopy(GC/MS)) 또는 액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography(HPLC)와 같은 고가의 장비가 필요할 뿐만 아니라, 이러한 장비를 다루고 그 결과를 분석할 수 있는 전문인력이 필요하다는 문제점이 있었다. 또한, 이런 방법을 적용하기 위해서는 용매추출을 통한 시료의 조제 및 농축 등의 시간이 많이 소요되는 과정이 수반되어야 하기 때문에, 산업체 근로자 집단, 중고생 집단 또는 군인 집단 등 그 검체의 수가 많은 경우에는 실질적으로 상기 방법들을 적용하기가 불가능하다는 문제점이 있었다.

이러한 단점을 극복하고 빠른 시간 내에 간편한 방법으로 객관적인 검사 결과를 얻기 위하여 항원-항체 반응을 이용한 면역 측정법의 사용이 널리 권장되고 있다. 면역측정법에 의한 마뇨산 검출을 위해서는 체액, 특히 소변 중에 존재하는 마뇨산과 특이적으로 반응하면서 다른 성분들과는 반응하지 않는 특이항체가 필요하다. 그러나, 항원의 분자량이 3,000 Da 이하인 경우 면역체계의 활성화가 이루어지지 않기 때문에 항원에 대한 특이적인 항체가 생성되기가 어렵다 (Harlow and Land, 1988). 따라서, 마뇨산은 분자량(179 Da)이 작고 면역원성이 낮기 때문에 보통 널리 쓰이는 면역화 방법으로는 목적하는 항체를 얻기가 어렵다.

이미 언급한 바와 같이, 국내의 경우 톨루엔의 인체노출기준은 TWA:100 ppm으로 정하여져 있고, 이 경우 요중 마뇨산의 함량을 요중 크레아티닌 기준으로 환산하면, 약 2.5g/g of creatinine 이 된다. 한편, 경희의료원 자료에 의하면 일반인이 정상상태에서 하루에 1.6L의 소변을 배출하므로, 상기 기준치인 2.5g/g of creatinine을 평균값으로 보고 소변의 배출량을 25% 편차를 두고 계산 했을 때에는 1.2～2.0L이므로 뇨중 마뇨산의 양은 약 1.25～2.08mg/ml가 된다. 따라서, 이 기준 치를 측정할 목적의 마뇨산에 대한 항체는 일반적인 항체와 같은 낮은 농도(ng/ml 또는 μg/ml 수준)의 측정 범위(standard curve dynamic range)를 가져서는 안되며, 상기 범위 내에서 흡입여부가 판정될 수 있는 측정 범위(mg/ml 수준)를 갖도록 조절할 필요가 있다.

체내에 흡수된 톨루엔은 20%는 호흡기로 그대로 배출되며, 80%는 microsomal mixed function oxidase system에 의해 벤조일 알콜(benzoyl alcohol)로 되고 알콜 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) 시스템에 의해 산화대사를 거쳐서 안식향산이 되며 글리신과 결합하여 마뇨산으로 되어 요중으로 배설된다. 그런데, 상기 안식향산은 음식에 의해서도 인체에 잔존할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 진단스트립은 이처럼 음식에 의해 인체에 흡수되는 안식향산에 의해 오줌에 배출되는 적은량의 마뇨산에 대해서는 오히려 측정 감도를 보이지 않아야 한다. 따라서, 마뇨산에 대한 항체는 단순히 마뇨산의 존재여부를 판단하는 것이 아니라, 진단 목적에 따라 일정농도 이상의 마뇨산이 존재하는지 여부를 판단할 수 있도록 제작하는 것이 바람직하다. 즉, 진단의 컷오프 농도가 약 1.25 mg/ml이상인 것을 측정하기 쉬운 항체가 바람직하며, 그 이하이면 음식물 기타 다른 요인에 의한 마뇨산 배출까지도 감지하게 되는 문제가 있다.

그런데, 지금까지는 competitive assay로 ng/ml 내지 ㎍/ml 수준까지 측정할 수 있는 단일클론항체만을 개발되어 왔는데, 이는 mg/ml 측정 수준의 둔감한 항체는 대게 특이성(specificity)이 떨어져 다른 항원(단백질 등)과의 교차반응성 (cross reactivity)이 많아져 진단스트립에 사용하기 곤란하기 때문이다. 따라서, 교차반응성이 적고 마뇨산에만 특이적으로 반응하면서도, 일반 음식물에 의해 인체에 잔존하는 마뇨산과 구별하여 톨루엔 인체노출기준에 적합한 mg/ml 범위의 마뇨산을 검출할 수 있는 역가를 갖는 단일클론항체의 필요성이 절실하다.

또한, 기존의 단일클론항체의 생산 방식은 마우스와 같은 동물 실험에 제한되어 있고, 제조에 오랜 시간이 소요되며, 많은 수의 세포를 선별해야 하기 때문에 많은 노동력을 필요로 할 뿐만 아니라, 제조된 항체의 특이성(specificity)과 친화성(affinity)을 조절하는 데에도 어려움이 있었다. 따라서, 마우스와 같은 동물 실험 없이 DNA재조합 기술을 이용하여 항체에 대한 유전자를 확보한 후 E.coli로부터 단시일 내에 단일클론항체를 생산하고 그 항체의 특이성과 친화성을 엔지니어링 할 수 있는 기술을 개발하는 것이 필요하다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는 교차반응성이 적어서 마뇨산에만 특이적으로 반응하면서도, 일반 음식물에 의해 인체에 잔존하는 마뇨산과 구별함으로써, 톨루엔 인체노출기준치 이상의 톨루엔의 흡입여부를 현장에서 신속하고 간단하게 검사할 수 있는 진단스트립을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 두 번째 기술적 과제를 상기 진단스트립을 이용하여 간편하게 검사에 적용할 수 있는 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여,

마뇨산-운반자 단백질 접합체가 검사선 부위에 흡착되어 있는 전개 멤브레인과, 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 복합체가 함침되어 있는 골드패드를 상기 전개 멤브레인의 상부 일측에 구비하며, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 중사슬의 가변성 부위와, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 경사슬의 가변성 부위를 포함하며, 상기 검사선에 흡착되어 있는 마뇨산-캐리어 단백질 접합체와 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 간의 항원-항체 반응에 의한 발색에 의하여 톨루엔 흡입여부를 확인할 수 있는 톨루엔 흡입여부 진단스트립을 제공한다.

본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여,

상기 본 발명에 따른 진단스트립을 포함하는 진단키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 톨루엔 흡입여부 진단스트립은 빠른 시간 내에 간편한 방법으로 객관적인 검사 결과를 얻기 위하여 항원-항체 반응을 이용한 면역측정법에 기초하여 산업체 내의 근로자들이 기준치 이상의 톨루엔에 노출되었는지 여부를 측정할 수 있으며, 중고생 등의 청소년 내지 군인들의 본드 흡입여부도 진단할 수 있다는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 진단스트립에는 소변 중에 존재하는 마뇨산과 특이적으로 반 응하면서 이와 유사한 구조(예컨대, 메틸 마뇨산)와 반응하지 않는 특이항체를 사용하였다.

본 발명에 있어서, CDR(complementarity determining regions)은 단일클론항체의 가변영역내에서 항원결합부위를 구조적으로 구성하고 있는 항원과의 특이적 상보성을 결정짓는 중요한 부위이다. 이 CDR의 서열을 유지한다면 항원 binding affinity에 영향을 주지않으면서 다른 부위의 서열을 바꿔서 다양한 항체 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다(Biochemistry. 2003 Feb 18;42(6):1517-28). 본 발명에서는, 단일클론항체의 중사슬의 가변성 부위를 아미노산 서열을 결정 한 후, 인터넷상의 IMGT/V-QUEST database를 이용하여 CDR과 FR의 할당 영역을 분석하였고(도 11A 참조), 마찬가지로 단일클론항체의 경사슬의 가변성 부위를 아미노산 서열을 결정 한 후, 인터넷상의 IMGT/V-QUEST database를 이용하여 CDR과 FR의 할당 영역을 분석하였다 (도 11B 참조).

본 명세서에서, 중사슬 가변부위의 CDR1, 2 및 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3으로 표시하였다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 마뇨산 항원에 대하 단일클론항체의 중사슬의 가변성 부위는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에서, 경사슬 가변부위의 CDR1, 2 및 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 5, 6, 7로 표시하였다. 바람직하게는, 본 발명의 단일클론항체의 경사슬의 가변성 부위는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 사용되는, 상기와 같은 가변성 부위를 갖는 단일클론항체는 톨루 엔의 인체노출기준에 적합한 mg/ml 농도 범위에서 standard curve dynamic range를 갖는 역가를 가지고 있으며, 운반자 단백질과는 교차 반응을 하지 않을 뿐만 아니라, 마뇨산의 농도가 높아질수록 경쟁적 억제가 심하게 일어나서, 톨루엔의 인체노출여부를 진단할 수 있는 마뇨산 검출용 진단키트에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 단일클론항체에 있어서, 상기 중사슬의 가변성 부위와 상기 경사슬의 가변성 부위가 일정길이의 펩티드 링커로 연결된 단일사슬항체(scFv)일 수 있는데, 이 경우 마우스와 같은 동물 실험 없이 DNA재조합 기술을 이용하여 E.coli로부터 단시일 내에 단일클론항체를 생산하고 그 항체에 대한 유전자를 확보하여 항체의 특이성과 친화성을 엔지니어링하는 것이 가능하다.

본 발명에 사용되는 마뇨산 항원에 대한 단일클론항체에 있어서, 상기 단일사슬항체(scFv)는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있는데, 상기 서열번호 9는 본 발명의 실시예에서 클로닝된 단일사슬항체 유전자의 서열로부터 추론된 것이다 (도 10 참조).

항체 생산을 위한 면역원 중에서 특히 분자량이 작은 마뇨산을 면역원으로 사용하기 위해서는 마뇨산을, 분자량이 큰 운반자 단백질(carrier protein)과 직접 또는 cross-linker를 사용하여 결합시켜야 한다 (Harlow and Lane, 1988). 이러한 운반자 단백질을 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, keyhole limpet hemacyanin(KLH), bovine serum albumin(BSA) 또는 ovalbumin(OVA) 등을 운반자 단백질로 사용할 수 있다.

면역반응을 유도하기 위해서, 마뇨산(Hippuric Acid: HA)을 운반자 단백질 (carrier protein)인 bovine serum albumin (BSA)과 ovalbumin (OVA)에 접합시킨 후 그 생성물을 10% non-denatured PAGE로 확인하였다. BSA-HA를 면역원으로 BALB/c 마우스에 면역화를 시킨 후 비장세포를 취해 골수종세포 (SP2/0)와 융합시켰다. 융합된 세포들을 선별배지 (HAT media)에 배양하여 일차 선별한 후, 이들 세포로부터 HA에 대한 항체를 생산하는 세포주를 제한 희석법을 사용하여 선별하였다. 이때 세포주의 선별은 효소 결합 면역 측정법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA)을 사용하였다.

최종적으로 19종의 단일클론항체 생산 세포주를 확보하여 이들로부터 생성되는 단일클론항체 중 역가가 높은 6종을 선별하여 subclass의 isotype을 결정하였다. 그 결과 6 종 모두 κ light chain을 가진 IgG₁를 생산하는 것으로 확인되었다. 그리고 ELISA 방법을 사용하여 각 단일클론항체의 운반자 단백질에 대한 교차 반응성을 확인한 결과, 두 종류의 운반자 단백질(BSA, OVA) 모두에 교차 반응이 없음이 규명되었다. 특히, 세포주 4D31G111B7 단일클론항체는 Western blotting 분석을 통해서도 운반자 단백질들(BSA, OVA)과는 교차 반응이 없음이 확인되었으며 오직 179 Da의 분자량을 갖는 HA에 대해서만 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다. 따라서 세포주 4D31G111B7 단일클론항체는 뇨에 존재하는 마뇨산을 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Ascite는 4D31G111B7 세포주로부터 생성되었고, 항체는 protein G affinity 컬럼 크로마토그래피 기술로 정제되었다. 세포주 4D31G111B7 단일클론항체는 assay 용 항원 중합체의 농도가 2㎍/㎖일 때, HA 농도 0.5 ～ 0.0078㎎/㎖범위에서 항원 중합체에 대한 결합능력이 79.3%에서 7.9%로 약 10배 정도 떨어지는 것이 관찰되었다. 즉 본 항체가 HA 자체에 대한 결합력이 충분함을 확인하였다. 정제된 항체로 항원 중합체와 HA와의 경쟁적 분석 (competition ELISA)를 실시한 결과, 항체가 HA와 반응이 잘 일어남을 확인할 수 있었다.

이와 같은 실험 결과를 바탕으로 본 발명에 따라 확립된 단일클론항체는 ㅋ콜로이달 골드 컨쥬게이트(colloidal gold conjugate) 형태로서 시료(뇨)에 존재하는 톨루엔의 대사체인 마뇨산과 항원-항체 반응을 일으키며 결합하게 된다. 뇨에 많은 양의 마뇨산이 존재하게 될 경우, 항원-항체 반응은 강하게 일어나며 진단 키트 멤브레인에서 모세관 현상에 의해서 위로 이동하게 된다. 항원-항체 반응을 끝낸 시료 중의 마뇨산은 이동하며 멤브레인에에 고정된 항원을 만나지만 반응하지 않고 계속 이동하게 된다. 만약 시료 중에 마뇨산이 없다면 멤브레인에에 고정된 항원과 만나기 때문에 상기 콜로이달 골드 컨쥬게이트 항체가 가시적으로 보이게 된다.

기존의 단일클론항체의 생산 방식은 마우스와 같은 동물 실험에 제한되어 있고, 제조에 오랜 시간이 소요되며, 많은 수의 세포를 선별해야 하기 때문에 많은 노동력을 필요로 할 뿐만 아니라, 제조된 항체의 특이성(specificity)과 친화성(affinity)을 조절하는 데에도 어려움이 있다. 그러나, 본 발명에 따르면 DNA재조합 기술을 이용함으로써 항체에 대한 유전자를 확보한 후 E. coli로부터 단시일 내에 단일클론항체를 생산할 수 있으며, 그 항체의 특이성과 친화성을 엔지니어링 할 수 있는 기반 기술을 구축할 수 있다.

현재 면역학적 분석에서 표적물질을 검출하는 수단으로 항체를 많이 사용하고 있다. 이때 항체의 팔로 불리는 가변부 (variable region)는 검출 기능을 갖는다. 마뇨산에 대한 단일클론항체를 생산하는 기존에 확립된 세포주를 이용하여 기능적인 중사슬 (heavy chain)의 가변부와 경사슬 (light chain)의 가변부를 암호화하는 유전자를 RT- PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 기술을 사용하여 증폭하였다. 이때 사용된 primer는 마우스에서 제조될 수 있는 항체들에 대한 거의 모든 경우의 수를 충족시킬 수 있는 조합으로 만든 degenerated primer였다. 증폭된 중사슬과 경사슬의 가변부 유전자를 linker DNA를 사용하여 SOE-PCR (Splicing by Overlap Extenion-PCR) 기법으로 증폭시켜 단일사슬항체 (single chain variable fragment, scFv) 형태로 완성시켰다. 이 생성물을 pCANTAB5E 벡터에 클로닝하여 염기서열을 확인하였다.

9시간동안 단일사슬항체의 발현을 유도시킨 후 발현여부를 SDS-PAGE와 Western blot 분석법으로 확인하였다. 그 크기가 약 32kDa으로 확인된 수용성 단일사슬항체를 대향 발현시킨 후 HiTrap anti-E tag affinity 컬럼 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제하였다. 정제된 수용성 단일사슬항체와 마뇨산 항원과의 친화성을 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법으로 측정한 결과 약 10배 희석된 정도까지 역가가 측정되었다. 마뇨산에 대한 항체를 생성하는 세포주에서 분리된 mRNA를 사용하여 항체의 variable region만을 이용한 재조합 단일사슬항체를 제조하였고 이를 대량 발현시킴으로써 기존의 단일클론항체 생산방식의 여러 가 지 문제점을 극복하고, 항체에 대한 유전자를 확보함으로써 항체의 특이성과 친화성을 조절할 수 있는 기술적 발판을 마련했다는 점에서 그 의미가 크다고 할 수 있다.

이렇게 만들어진 단일사슬항체는 약 30kDa 크기의 작게 만들어진 항체로서, 유래된 단일클론항체의 항원 결합부위와 유사한 구조를 가지게 되며(Thirion et al., 1996), 짧고 유연성이 있는 polypeptide linker로 연결된다. Linker는 (Gly₄Ser)₃ 서열로 구성되고 Gly 잔기는 유연성을, Ser은 약간의 수용성을 제공해준다(Huston et al., 1988). NMR 분석에서도 이 서열이 매우 유동적이며 유연성을 가짐이 규명되었다(Kortt et al., 1994). 또한 linker는 한 도메인 (domain)의 C 말단에서 다른 도메인의 N 말단까지의 거리를 연결시킬 수 있을 만큼의 충분한 길이로 두 도메인 사이의 갈라진 틈에 꼭 맞도록 loop를 형성하여 Fv와 상호작용할 수 있다(Stemmer et al., 1993). 이 항체의 단편은 본래의 항원 결합 부위를 가지고 있으며, 항원에 대한 특이적 친화성이 유지될 수 있다(Hudson, 1998). 단일사슬항체는 단백질과 같은 안정성을 가지며 아미노산 서열을 변형시킴으로써 특이적 친화성을 향상시킬 수 있고 E. coli에서 대량 생산할 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명에서, 상기 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체에 사용되는 콜로이드 골드입자의 입경은 20～60nm이고 532nm 파장에서의 흡광도가 9～11이며 마뇨산항체의 흡착량은 5～15㎍/㎖이고. PEG 용액으로 안정화되어 있는 것일 수 있는데, 상기 콜로이드 골드입자의 입경이 20nm 미만이면 제조가 용이하지 않고, 60nm를 초 과하게 되면 적색 또는 보라색의 특정색을 띠지 않을 염려가 있다. 한편, 상기 마뇨산항체의 흡착량이 5㎍/㎖ 미만이면 진단스트립의 감도가 너무 떨어지고, 15㎍/㎖을 초과하게 되면 감도가 포화되어 그 이상을 사용할 필요가 없다.

본 발명에 사용되는 상기 전개 멤브레인은 모세관 현상에 의해 검체를 전개시킬 수 있는 것인 한 특별히 제한되지 않으며, 예컨대, 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트 또는 폴리에틸렌 멤브레인을 사용할 수 있다.

또한, 상기 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체가 함침되어 있는 골드 패드의 재질 역시 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며 예컨대, 폴리에스테르 또는 유리섬유로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 따른 톨루엔 흡입여부 진단스트립은 상기 골드패드의 상부에 검체를 적하하여 상기 스트립 내부로 침투시킬 수 있는 검체적용패드(30)가 적층되어 있고, 상기 전개 멤브레인의 또 다른 일측에는 반응하지 않은 검체를 흡수하는 흡습 패드(40)를 더 구비하는 것일 수 있다. 또한, 상기 전개 멤브레인의 소정부위에는 대조선이 구비되어 있고 상기 대조선에는 항-마우스 IgG가 흡착되어 있는 것일 수 있다.

도 13에는 본 발명의 일 실시예에 따른 진단스트립의 개략도를 도시하였다. 본 발명에 따른 진단스트립의 검체적용패드에 소변을 적하하였을 경우에는 모세관현상에 의하여 전개 멤브레인 상에 전개되게 되며, 마뇨산이 상기 소변 중에 존재하는 경우에는 콜로이드 골드입자에 접합된 항체와 항원-항체 반응이 일어나게 되고, 따라서 검사선에 고정되어 있는 마뇨산-캐리어 단백질 접합체와는 추가반응이 일어날 수 없게 된다. 그 결과 상기 항원-항체반응이 일어난 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체 + 마뇨산은 상기 검사선을 그냥 통과하여 계속 전개되게 되고 상기 검사선에서는 아무런 발색이 되지 않게 된다. 즉, 마뇨산 양성의 경우(톨루엔을 일정량 이상 흡입한 경우)에는 검사선에 아무런 발색이 일어나지 않게 되는데, 이러한 작동 메커니즘에 대한 개략도를 도 14에 도시하였다. 한편, 대조선 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 놓았으며, 소변 중에 마뇨산의 존재여부에 관계없이 항상 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체와 반응하여 적색 또는 보라색 밴드가 나타나게 되는데, 이는 본 발명에 따른 진단스트립이 제대로 기능을 하는지 여부를 판단할 수 있는 지표가 된다. 만일 상기 대조선에도 아무런 발색이 되지 않는다면, 상기 진단스트립이 불량이거나, 여하한 문제에 의해 제기능을 발휘하지 못하는 것으로 판단할 수 있다.

한편, 도 15에는 톨루엔 흡입 음성인 경우에 본 발명에 따른 진단스트립의 작동 메커니즘에 대한 개략도를 도시하였다. 도 15를 참조하면, 소변 내에 마뇨산이 존재하지 않거나, 컷오프 농도 미만으로 존재하기 때문에 허용기준치 이하인 때에는 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체가 검사선에 존재하는 마뇨산-캐리어 단백질 접합체와 항원-항체반응을 하게 되어, 검사선 부위에 적색 또는 보라색 밴드가 형성되게 된다. 또한, 잉여분의 마뇨산항체-콜로이드 골드입자 복합체는 계속 전개되어 대조선에 있는 항-마우스 IgG와 반응하여 대조선 위치에도 적색 또는 보라색 밴드가 발현되게 된다. 한편, 여분의은 검체(소변)은 흡습패드(40)에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있 도록 하였다.

본원발명에 따른 진단스트립은 종래의 임신진단키트 등과는 달리 소변 중에 마뇨산이 일정량 이상 존재하면(양성) 마뇨산에 대한 검사선에는 밴드가 나타나지 않고 대조선 위치에만 적색 또는 보라색 밴드를 나타내고, 소변 중에 마뇨산이 존재하지 않는 경우(음성)에는 검사선과 대조선 모두에 적색 또는 보라색 밴드가 동시에 형성되게 된다.

한편, 상기 검체 패드는 계면활성제로 처리되어 있는 것일 수 있는데, 이는 소변이 검체 패드의 상부에 적하된 때에 전개 멤브레인으로 원활하고 신속하게 전개될 수 있도록 하기 위함이며, 상기 계면활성제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지는 않는다.

또한, 상기 검체 패드 및 흡습 패드의 재질 역시 당업계에 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 셀룰로오즈로 이루어진 것일 수 있다.

이미 언급한 바와 같이, 국내의 경우 톨루엔의 인체노출기준은 TWA:100 ppm으로 정하여져 있고, 이 경우 요중 마뇨산의 함량을 요중 크레아티닌 기준으로 환산하면, 약 2.5g/g of creatinine 이 된다. 한편, 경희의료원 자료에 의하면 일반인이 정상상태에서 하루에 1.6L의 소변을 배출하므로, 상기 기준치인 2.5g/g of creatinine을 평균값으로 보고 소변의 배출량을 25% 편차를 두고 계산 했을 때에는 1.2～2.0L이므로 뇨중 마뇨산의 양은 약 1.25～2.08mg/ml가 된다. 따라서, 본 발명에 따른 진단스트립 내의 마뇨산항체의 컷오프 농도를 조절함으로써, 상기 범위 내 에서 흡입여부가 판정될 수 있도록 조절할 필요가 있다.

체내에 흡수된 톨루엔은 20%는 호기로 그대로 배출되며, 80%는 microsomal mixed function oxidase system에 의해 벤조일 알콜(benzoyl alcohol)로 되고 알콜 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase) 시스템에 의해 산화대사를 거쳐서 안식향산이 되며 글리신과 결합하여 마뇨산으로 되어 요중으로 배설된다. 그런데, 상기 안식향산은 음식에 의해서도 인체에 잔존할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 진단스트립은 이처럼 음식에 의해 인체에 흡수되는 안식향산에 의해 오줌에 배출되는 마뇨산에 대해서는 감도를 보이지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 진단스트립은 단순히 마뇨산의 존재여부를 판단하는 것이 아니라, 필요에 따라 일정농도 이상의 마뇨산이 존재하는지 여부를 판단할 수 있도록 제작하는 것이 바람직하다. 즉, 컷오프 농도가 약 1.25 이상인 것이 바람직하며, 그 이하이면 음식물 기타 다른 요인에 의한 마뇨산 배출까지도 감지하게 되는 문제가 있다. 한편, 필요에 따라 컷오프 농도가 다른 진단스트립을 별도로 제작(일반용, 특수용)하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 상기 마뇨산 항체의 컷오프 농도의 조절은 골드패드의 pH를 조절하거나 콜로이드 골드입자에 흡착되어 있는 마뇨산항체의 양을 조절하는 것에 가능하다. 즉, 상기 골드패드의 pH를 6.5 내지 7.5 범위에 고정시키게 되면, 항체가 활성화될 수 있는 최적의 pH이기 때문에 진단스트립의 민감도가 향상되게 되며, 컷오프 농도가 약 1.25mg/ml에 이를 수 있다. 이미 언급한 바와 같이, 국내의 경우 톨루엔의 인체노출기준을 뇨중의 마뇨산의 양으로 환산한 값이 약 1.25～2.3mg/ml 이므로, 컷오프 농도를 약 2.0mg/ml으로 조절함으로써, 1차적으로 스크린 테스트를 한 다음, 양성판정이 되게 되면, 기체크로마토그래피/질량분석기(Gas chromatography/ Mass spectroscopy(GC/MS)) 또는 액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography(HPLC) 등을 사용하여 좀 더 면밀하게 테스트할 수도 있다.

한편, 본드를 상습적으로 흡입하는 경우에는 본드 흡입 후 1 내지 2일까지는 체내에 잔존하는 톨루엔의 양이 과량일 수밖에 없다. 이 경우, 일단 컷오프 농도가 약 2.0mg/ml인 범용 진단스트립을 사용하여 본드 흡입여부를 판단한 후, 양성판정이 난 경우에는 컷오프 농도가 약 4.0mg/ml인 특수용 진단스트립을 다시 사용함으로써 본드 흡입여부를 좀 더 정확히 판단할 수도 있다.

상기 컷오프 농도는 pH를 9 내지 11로 조절한 경우 4mg/ml까지 조절할 수도 있으며, 상기 콜로이드 골드입자에 대한 마뇨산항체의 흡착량을 5㎍/㎖까지 낮춤으로써도 조절할 수 있다.

마뇨산은 일반 중금속과는 달리 생체내 배설 반감기가 짧으며, 뇨중에 3 내지 5일까지 잔존한다고 알려져 있다. 따라서, 특수건강진단기관이 해당 사업장의 생물학적 노출지표검사를 실시할 때는 정상작업이 이루어지고 있을 때 실시하여야 한다. 톨루엔의 경우에는 작업 종료 직후에 가장 높은 농도를 유지하다가 수 시간 이내에 농도가 상당히 낮아지기 때문에 시료채취는 당일 작업 종료 2시간 전부터 직후까지의 사이에 행해지는 것이 바람직하다. 한편, 시료채취용기는 오염되지 않은 것을 사용해야 하며, 산 세척 등으로 오염물질을 제거하고 사용해야 한다. 시료 채취량은 측정 및 분석 감도를 고려하여, 분석에 필요한 양을 충분히 확보할 필요가 있으며, 만일을 위해 재분석이 가능한 양을 확보하여 보관하는 것이 바람직하다. 작업 후 소변을 채취하는데 어려움이 따르는 것을 방지하기 위해, 시료 채취 2시간 전에는 배뇨를 하지 않도록 사전에 교육을 하는 것이 바람직하다. 소변이 지나치게 농축되었거나 묽을 경우 물질의 대사메커니즘에 변화가 일어나 요중 농도가 실제와 다르게 나타날 수 있는데, 통상적으로 크레아티닌이 0.5 이하이거나 3.0 이상인 경우, 비중이 1.01 이하이거나 1.03 이상인 경우에는 부적합한 시료로 판단한다.

도 16에는 본 발명에 따른 진단키트에 대한 개략도를 도시하였다. C는 대조선(control)을 의미하며, T는 검사선(test)를 의미한다. 또한 S는 검체 적용홀로서 소변을 적하하는 부위이다. 상기 진단키트는 본 발명에 따른 진단스트립을 검체 적용홀 및 결과 표시창이 구비되어 있는 플라스틱 재질의 케이스의 내부에 고정시켜 제조할 수 있다. 상기 케이스의 재질은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지는 않는다. 상기 검체 적용홀에는 소변을 약 100㎕(2 drops) 정도 적하하면 일정 농도 이상의 마뇨산 존재여부를 결과 표시창을 통하여 확인할 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.

예비 실시예 1

1-(1): 면역원과 assay용 항원 합성

마뇨산(HA)(Sigma, USA)를 운반자 단백질인 BSA(Sigma, USA, 21555) 또는 OVA(Sigma, USA, A-5378)를 사용하여 접합체를 만든 후 BSA-HA 접합체는 면역원으로 사용하였고, OVA-HA 접합체는 assay용 항원으로 사용하였다. 마뇨산을 운반자 단백질에 붙일 때는 직접 붙이는 방법과 cross-linker인 ACA와 SA를 사용하여 접합체를 만드는 방법을 사용하였다 (Pilch and Czech, 1979). 먼저 마뇨산과 DCC, NHS를 DMF에 녹인 후 상온에서 2시간 동안 천천히 교반하여 반응시킨 후 원심분리를 통하여 상층액만을 이용하여 운반자 단백질이 용해되어 있는 용액에 넣고 상온에서 4시간동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 그 후 원심분리를 통하여 생성된 침전물을 제거하고, 상층액을 2 차례 투석하여 잔재하는 DMF를 제거하여 단백질에 마뇨산을 직접 붙인 중합체(BSA-HA, OVA-HA)를 제조하였다. 크로스 링커(cross-linker)를 사용시, 마뇨산과 DCC, NHS를 DMF에 녹인 후 상온에서 2시간 동안 천천히 교반하여 반응시킨 후 원심분리를 통해서 상층액만을 이용하여 ACA 또는 SA가 녹아있는 용액에 혼합하여 상온에서 다시 2시간 동안 교반하면서 반응시킨다. 그 후 원심분리를 통해 생성된 침전물을 제거하고, 상층액을 2 차례 투석하여 잔재하는 DMF와 ACA 또는 SA를 제거한다. 운반자 단백질과 HA-conjugate는 10% Native gel을 이용한 전기영동을 통해서 확인하였으며, BCA 단백질 정량을 통해서 conjugation 수율을 측정하였다.

1-(2): 마우스의 면역화

Kohler와 Milstein (1975)과 Doyen 등 (1985)의 방법을 변형하여 마우스의 복강주사와 피하주사를 병행하여 시행하였다. BSA-HA conjugate 109㎕(BSA 농도 기 준)과 BSA-ACA-HA conjugate 46㎕(BSA 농도 기준) 각각 complete Freund's adjuvant와 1:1 로 혼합하였다. 1 주일 정도 안정화를 시킨 생후 5주된 수컷 BALB/c 마우스(Semtaco, Osan, Korea) 6마리를 2마리씩 짝을 지어 하나의 그룹으로 만들어 복강에 각 혼합액을 주입하여 면역하였다. 이때, 면역화 양은 마리 당 300㎕를 넘기지 않았다. 최초 면역 후 2주 간격으로 같은 양의 면역원들을 incomplete Freund's adjuvant와 혼합하여 3회 면역하였다.

면역화 유무를 확인하기 위해, indirect ELISA 법으로 OVA-HA 접합체를 이용하여 항체 역가를 측정하였다. 면역화 된 BALB/c의 항혈청에서 측정된 항체 역가는 BSA-HA로 면역된 마우스 2마리, BSA-ACA-HA로 면역된 마우스 2마리의 각각의 역가를 측정 후에 더한 값을 나누었다. 항체가 1,000배 희석된 경우 4마리의 평균값이 2.413으로 관측되었다. 이에 비해서 면역화 되지 않은 BALB/c의 경우 동일한 조건에서 측정된 항체의 역가는 0.102로 관측되었다. 각각의 접합체를 면역원으로 사용한 결과 BSA-HA가 가장 면역원성(antigenicity)이 높은 것으로 관측되었다. BSA-HA를 3차까지 면역을 실시한 결과 순차적인 항체 생성 증가가 관찰되었다.

1-(3): 세포융합

(i) 면역된 임파구의 준비

면역화 된 마우스들의 항혈청을 indirect ELISA 방법으로 항체 역가를 측정하여 그 중에서 가장 높은 항체 역가를 나타내는 마우스를 선정하여 세포 융합 3 일 전에 PBS에 녹인 HA-BSA 접합체 100 ㎍을 꼬리의 정맥을 통해 접종하였다. 선정된 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 다음 70% 에탄올로 소독한 후 복강을 열고 비장을 적출하여, RPMI 1640 배지(Gibco BRL, USA, 31800-022) 10㎖로 가볍게 세척하고, 30㎖의 RPMI 1640 배지 내에서 cell dissocation sieve tissue grinder kit을 이용하여 비장임파구 세포를 적출 하였다. 400g로 원심 침전시킨 후, 0.01M Tris-HCl buffer pH 7.5 (Sigma, St. louis, USA, R-7757)에 8.3g/L의 ammonium chloride가 함유된 red blood cell lysing buffer로 백혈구 성분을 용혈하여 분리하였다. 이 세포 성분을 RPMI 1640 배지 30㎖로 3회 세척하고 새로운 RPMI 1640 배지 10㎖에 침전된 세포를 잘 풀어준 후 형질세포종 세포를 준비할 동안 37℃ incubator에 방치하였다.

(ii) SP2/0 형질세포종 세포의 배양

모노클론 항체의 발현에 통상적으로 사용되는 SP2/0 형질세포종(ATCC #: CRL-1646)을 세포융합에 사용하기 위해서 배양하였다. 이 세포주는 돌연변이 세포주 (Mutant cell line)로써 면역글로불린을 생산하지 못하고 hypoxantin guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT)가 결여되어 있다. 이 세포주를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, Trace, A.C.N., Australia, 15-010-0500V), sodium bicarbonate, penicillin streptomycin (100㎍/㎖, Gibco BRL, New York, USA, 15140-122)과 Fungi-zone (Gibco BRL, New York, USA, 15295-017)이 함유된 RPMI 1640 medium (Sigma, St. Louis, USA, R6504)을 사용하여 계대 배양하였으며 세포융합 하루 전 1:1로 새 배지에 분주하여 세포가 건강한 상태를 유지하도록 하였다.

(iii) 세포융합

세포융합 방법은 Kohler와 Milstein (1975)의 방법을 변형한 Milstein 등 (1979)의 방법으로 수행하였다. 미리 배양한 형질 세포종 세포를 수확하고 400g로 원심 침전시킨 후 RPMI 1640 배지 30㎖로 3회 세척하고 새로운 RPMI 1640 배지 10㎖에 침전된 세포를 잘 풀어주었다. 준비된 비장 임파구 세포와 형질 세포종 세포를 trypan-blue solution (0.04%, Sigma, St. Louis, USA, T-8154)으로 염색하고 hemocytometer를 이용하여 생존 세포수를 측정하였다. 107개의 형질 세포종 세포와 108 개의 비장 임파구 세포의 비율이 되도록 섞고 이 혼합세포를 RPMI 1640 배지로 세척하였다. 마지막 세척 후 상층액을 완전히 제거하고 얻어진 침전된 세포가 들어있는 튜브를 가볍게 손가락으로 쳐서 잘 섞어 준 후 37℃로 유지하면서 50%(w/v) PEG/ DMSO (Sigma, St. Louis, USA, P-7306) solution을 1㎖/min의 속도로 1㎖을 점적하여 첨가한 후, RPMI 1640 배지를 3㎖/min의 속도로 30 ㎖을 첨가하였다. 융합이 끝난 세포를 400g에서 10 분간 원심 침전하여 모으고 융합된 세포만을 선택하기 위하여 Littlefield (1964)가 고안한 HAT(Gibco BRL, USA, 31062-011) RPMI 배지 (FBS를 20%로 첨가)에 부유시킨 후, feeder cell이 들어있는 5 개의 96 well 배양판에 50㎕/well씩 분주하였다. 여기에 다시 FBS가 20%로 첨가된 HAT RPMI 배지를 50㎕/well씩 분주하여 5% CO2 존재 하에서 37℃에서 24시간 배양한 후, 다시 HAT 배지를 50㎕/well씩 첨가하였다. 이 후 3-4일 간격으로 FBS가 20%로 첨가된 HAT RPMI 배지를 100㎕/well씩 교환해 주면서 융합세포의 증식여부를 역상현미경 (inverted microscope, Olympus, Japan, IMT2-21-W-PM20-35DX2)으로 관찰하였다.

1-(4): 단일클론항체 분비 세포주의 선별

세포 융합 후 역상 현미경 하에서 세포가 자라는 것을 계속 관찰하여 well의 바닥에 10-20% 정도 차지할 만큼 자라면 well 상층의 배지 원액을 취해서 Engvall와 Pelmann (1972)의 방법을 변형한 indirect ELISA 방법 OVA-HA 접합체를 이용하여 항체 역가를 측정하였다. 항체 역가가 negative control과 O.D. 값이 0.5이상 차이를 보이는 well을 선택하여 세포가 well에 50%정도 자랐을 때 24 well 배양판으로 옮겨서 배양하였다. 24 well 배양판에서 10-20 % 자란 세포들은 다시 indirect ELISA방법으로 항체 역가를 측정하여 역가가 높고 세포의 상태가 지속적으로 좋은 well을 선별하였다. 96 well 배양판에 5 cell/well 되도록 제한 희석법으로 분주하여 배양시킨 후, 다시 0.5 cell/well이 되도록 제한 희석법으로써 단일클론항체를 분비하는 세포주를 확립시켰다.

96 well 배양판에서 배양한 후 ELISA로 항체 역가를 측정하여 5개의 배양판 중에서 2번, 3번 4번, 5번 배양판에서 모두 6개의 1.857, 0.932, 0.829, 1.867, 0.745, 1.477, 1.695의 높은 값을 갖는 융합 세포가 배양된 것을 확인하였다. 그 후, 6개의 융합세포를 1 차 제한 희석에서는 5 cell/well로 희석하여 배양하였고, 2차 제한 희석에서는 0.5 cell/well로 희석하여 배양해서 최종적으로 19종의 단일클론항체를 분비하는 세포주를 획득하였다 (표 1). 표 1은 2차 제한 희석후 융합 세포의 역가 및 포화역가를 보여준다. 각 well의 상층액의 OVA-HA 접합체에 대한 역가를 indirected ELISA 법으로 측정하였다. 항-HA 혈청 및 PBS 또는 정상 배지를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. indirect ELISA 방법으로 실시한 결과, 19개의 확립된 단일클론항체는 최고 1.427의 역가(3C61D61B3)를 나타냈으며, 확립된 단일클론항체는 negative control보다 모두 높고, positive control과 같거나 높은 역가를 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 역가가 너무 높으면 일반 음식물에 의해 인체에 잔존하는 마뇨산과 구별하여 인체노출기준에 적합한 mg/ml 범위의 마뇨산을 선택적으로 검출하기 어려우므로 적당한 역가의 4D31G111B7를 단일클론항체 분비 세포주로 선별하였다.

상기에서 실시한 indirect ELISA 방법을 실시하면서 동시에 확립된 19개의 단일클론항체가 마뇨산 항원에 대해서도 작용하는지를 알아보기 위해 competitive ELISA를 수행한 결과 가장 높은 역가를 내는 세포주 3C61G111E11은 마뇨산 항원에 대해서도 0.339의 항원-항체 반응을 하는 것으로 나타났다. 19종의 세포주 중에서는 origin이 4D31G11에서 생산된 4D31G111B7 세포주가 indirect ELISA에서 1.283으로 높은 역가를 나타냈으며, competitive ELISA 반응에서도 0.107로 높은 포화상태(마뇨산과 항체가 직접 반응하여 well에 coating된 항체를 만나지 않은 상태)를 나타냈다 (표 1).

1-(5): Competitive ELISA를 통한 6개 세포주의 역가 측정

본 발명의 목적은 확립된 여러 개의 단일클론항체 중 가장 높은 competition을 일으키는 세포주를 찾아 표준곡선(standard curve)을 확립하는 것이다. 항체가 분비한 IgG가 존재하는 media를 이용하여 마뇨산의 농도를 8㎎/㎖부터 0.001㎎/㎖까지 측정하였다. 단일클론항체 4D31G111B7 세포주가 높은 농도의 마뇨산에 대해서 가장 낮은 값인 0.090을 갖고, 마뇨산이 존재하지 않은 농도에서는 1.291의 높은 값을 갖는 것으로 판단하여 competition이 가장 잘되는 세포주인 것으로 나타났다. 이것은 마뇨산 항체임을 의미한다. 따라서, 이 세포주의 항체를 대량 생산하기 위해 ascite fluid 제작에 사용하기로 결정하였다 (도 1). 도 1은 HA에 대한 단일클론항체들의 competitive ELISA 결과를 보여주는 그래프이다. 각각의 단일클론항체 상층액을 1차 항체로 사용하고 30분간 37℃에서 HA로 전배양하였다. 전배양 혼합물을 well에 옮겨서 OVA-HA로 precoat하고, 30분간 37℃에서 배양하였다. TMB 칼라 발색은 실온에서 5분간 수행하였다.

1-(6): 단일클론항체의 정제

대량의 단일클론항체를 얻기 위해 단일클론항체 분비세포를 BALB/c 마우스 복부에 접종시켜 복수를 취한 후 protein G column을 이용한 Affinity column chromatography 방법을 사용하여 4D31G111B7 항체를 정제하였다. protein G column (volume: 1㎖, Supelco, Bellefonte, USA, 54840-U)을 20mM 인산 나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 세척하여 column의 평형을 맞춘 후, Ammonium Sulfate로 분별침전된 복수 시료 1㎖을 가하였다. 그 후, 동일한 완충액을 세척하여 protein G와 결합이 안된 단백질들을 씻어낸 후 결합된 IgG를 0.1M Glycine-HCl 완충액 (pH 2.7)으로 용출시켰다. 용출된 시료에 용출액 부피의 1/10의 1M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)을 첨가하여 pH를 원래의 상태로 복원하였다 (Kerr et al., 1994). 용출된 시료는 농축기 (2㎖, Vivascience, USA, 99VS0248)를 사용하여 농축(200-500㎕)하였다.

1-(7): 단일클론항체의 특이성 결정

(i) Indirect ELISA를 통한 운반자 단백질과 교차반응성 측정

접합체 합성에 사용되었던 운반자 단백질인 BSA 또는 OVA를 각각 0.01M 탄산염 완충액 (pH 9.6)에 1㎕/㎖로 희석하여 96well microtiter plate (Costar, Corning, USA, 2580)에 200㎕씩 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후의 과정은 앞서 설명한 indirected ELISA 방법과 동일하며, 혈청대신 단일클론항체(4D31G111B7) 배양액을 처리하여 시행하였다. 운반자 단백질과의 교차반응성을 측정하기 위해서 well에 BSA, OVA, CASEIN, OVA-HA으로 각각 coating하여 indirect ELISA 방법으로 측정한 결과 ascite fluide 제작에 사용된 단일클론항체 세포주 4D31G111B7는 운반자 단백질들인 BSA와 OVA, indirect ELISA에 사용된 blocking 단백질인 casein과도 전혀 교차 반응을 하지 않는 것으로 확인되었다 (표 2). 표 2는 운반자 단백질들에 대한 항-HA 단일클론항체의 교차반응성을 측정한 결과를 나타낸다.

* Bovine serum albumin, ** Ovalbumin

(ii) Competitive ELISA

Competitive ELISA를 이용하여 정제된 항체 4D31G111B7의 competition되는 정도와 역가를 측정하였다. 분석용 접합체인 OVA-HA을 0.01 M 탄산염 완충액 (pH 9.5)에 10 ㎍/ml 농도가 되도록 희석하여 indirect ELISA와 같은 방법으로 항원을 부착하였다. 일정한 농도의 항체(13.0㎍/㎖부터 1.62㎍/㎖까지)와 여러 가지 농도의 HA(8㎎/㎖부터 0.001 ㎎/㎖까지)를 혼합하여 37℃에서 30분 반응시킨 후, OVA-HA가 부착되어 있는 plate에 넣고 다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이후의 단계는 indirect ELISA의 방법과 동일하게 시행하였다 (Pound, 1998). TMB 칼라 발색은 실온에서 5분간 수행하였다. 마뇨산 8㎎/㎖일때의 역가가 0.221, 0.203였고, 마뇨산이 없을때는 1.276, 1.212로 측정되었으며 competition되는 정도는 모두 95%이상의 효율이 나타나는 것으로 측정되었다 (표 3, 도 2). 표 3는 정제된 단일클론항체 4D31G111B7(1) 및 (2)의 마뇨산에 대한 competitive ELISA 결과를 나타낸다. 도 2는 상기 결과를 그래프로 도시한 것이다.

(iii) Standard curve 완성

세포주 4D31G111B7 (2㎍/㎖)과 HA 농도(0.5㎎/㎖부터 0.0078㎎/㎖까지) 사이의 standard curve를 완성하였다. 실험 방법은 상기의 방법과 동일하게 시행하였다 (Pound, 1998). 확립된 세포주(4D31G111B7)에서 분비되는 단일클론항체가 실제로 순수한 마뇨산과 얼마의 농도에서 높은 competition을 하는지 알아보기 위하여 실시한 실험이다. 단일클론항체의 농도를 13㎍/㎖부터 1/2배씩 희석하여 1.625㎍/㎖까지, 마뇨산의 농도는 8㎎/㎖부터 1/2배씩 희석하여 0.001㎎/㎖까지 측정하였다. 그 결과 단일클론항체의 농도 2.25 ㎍/㎖와 1.625㎍/㎖에서, 그리고 마뇨산의 농도는 0.25㎎/㎖부터 0.0039 ㎎/㎖까지 범위에서 얻어진 값이 일직선의 curve를 나타냈으며, 이는 standard curve를 구할 수 있는 그래프 값인 것으로 판단된다. standard curve에 따른 ｙ=a+bｘ의 값은 ｙ=(-0.1157)+(-0.5487)ｘ이었고, R²=0.983이었다. 이 그래프의 값을 기본으로 역으로 역가를 대입하여 시료 내에 존재하는 HA의 농도를 구할 수 있었다 (도 3). 도 3는 다양한 농도의 HA(8㎎/㎖ 내지 0.0019㎎/㎖) 및 정제된 IgG(4D31G111B7)(3.25㎍/㎖ 및 1.625㎍/㎖)의 competitive ELISA 결과를 나타내는 그래프이다. 정제된 단일클론항체를 30분간 37℃에서 HA로 전배양하였다. 전배양 혼합물을 well로 옮기고, OVA-HA로 precoat하고, 30분간 37℃에서 배양하였다. TMB 칼라 발색은 실온에서 5분간 수행하였다. 3.25㎍/㎖ 및 1.625㎍/㎖ 농도의 항체를 OVA-HA로 코팅된 플레이트에서 증가하는 농도의 HA와 경쟁(compete)시켰다. HA 농도가 0.25㎎/㎖ 내지 0.0156㎎/㎖인 구간에서 standard curve가 결정되었다. 이러한 농도 구간에서 일직선의 standard curve가 얻어지면 실제 진단키트에서 단일클론항체의 양이나 pH를 조절함으로써 실제 톨루엔의 인체노출기준인 1～4㎎/㎖ 범위의 농도 컷-오프 농도로 조절하는 것이 가능하다.

상기 실시예들에서 최종 선발된 세포주 4D31G111B7에서 분비되는 단일클론항체의 아미노산 서열을 결정하기 위하여 아래와 같은 실험들을 수행하였다. 도 4는 항체(IgG) 분자와 그 단편들(fragments)의 구조를 나타내는 그림이다. IgG 분자는 중사슬(Heavy chain)과 경사슬(Light chain)로 이루어지며, 각 사슬은 가변성 부위(variable domains)(흐린 색깔)와 고정 부위(constant domains)(진한 색깔)로 구성되어 있다. 화살표는 항원 결합 부위를 나타낸다. Fab 단편은 papain 분해에 의해 제조될 수 있으며, Fv 단편은 완전한 항원 결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편이다. scFv는 Fv 도메인들을 링커 펩티드로 연결시킨 단일사슬 항체이다. 고정 부위는 항원의 결합여부를 결정짓는 서열이 아니므로 본 발명에서는 단일클론항체(4D31G111B7)의 가변성 부위만을 아미노산 서열결정하였다.

1-(8): Total RNA Isolation

상기 실시예에서 최종 선발된 세포주 4D31G111B7를 RPMI 1640 medium (Sigma, St Louis, USA)을 사용하여 계대 배양하였으며 total RNA를 분리하기 하루 전에 새 배지에 분주하여 세포가 건강한 상태를 유지하도록 하였다. Total RNA의 분리는 Trizol (Sigma, USA)을 사용하여 수행하였다. RNA는 1x10⁷개 정도의 세포에서 분리하였다. T flask에 배양된 세포를 plastic tube에 옮겨 담아 150xg에서 5분간 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 버리고 pellet은 재부유시켜 1.5mL tube에 옮겨 담았다. 1mL의 0.1% DEPC를 첨가하고 4℃에서 150xg로 5분간 원심분리하고 피펫으로 상층액을 제거하였다. Pellet에 1mL의 trizol reagent를 넣고 pellet을 완전히 재부유시켜고 상온에서 5분 동안 lysis시켰다. 0.2mL 클로로포름을 추가하고 15초 동안 tube를 잘 섞어준 후 상온에서 3분간 방치하였다. 그 후 4℃에서 원심분리 (12,000xg, 15분)하여 얻어진 세 층 중에서 무색의 맨 위층을 조심스럽게 새 tube에 옮겨 담고 0.5mL의 차가운 이소프로판올을 넣고 상온에서 10분간 방치한다. 그 후, 4℃에서 원심분리(12,000xg, 10분)하여 상층액을 제거하고 75% 에탄올을 가하여 RNA pellet을 2회 세척한 다음, 공기 중에서 10분 정도 말린다. 그 후, 30㎕의 DEPC로 처리된 물에 녹였으며, 이렇게 분리된 total RNA의 일부를 0.8%(w/v) agarose gel 상에서 18S 와 28S rRNA 밴드를 확인했으며, 나머지 RNA는 -20℃에 보관하였다.

1-(9): PCR primer 제작

항체의 다양성은 발현에 관여하는 유전자(V, D, J) 수의 조합에 따른 아미노산 서열로부터 결정되며 hypermutation 등에 의해서 추가로 다양성이 증가된다. 따라서 알려지지 않은 서열에 대한 중사슬과 경사슬의 가변부를 얻기 위해서는 가능한 많은 서열을 포괄할 수 있는 primer를 제작하는 것이 우선 중요한 문제이다. 실제로 마우스의 경우 항체가 보이는 최대한의 다양성이 1×10⁹?10¹¹정도로 알려지고 있다. 이러한 다양성을 75% 이상 충족시키기 위하여 중사슬에 대해서는 7종류, 경사슬에 대해서는 11종류의 degenerated primer를 사용하였다. IMGT bank (International ImMunoGeneTics database: http://www.imgt.cines.fr:8104)에 등재되어 있는 마우스 면역글로불린 중사슬의 gamma 1 과 경사슬 kappa chain의 유전자에 대한 정보를 얻은 후, constant region의 DNA 염기서열을 선정하여 이들을 토대로 중사슬과 경사슬 각각의 anti-sense primers와 S. Essono 등 (2003)에 의해 연구된 가변부 FR1을 암호화하는 forward primers (primer MKV75, MHV78)를 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 또한 발현용 벡터에 재조합을 하기 위해서 5′-MHV78 forward primer에는 Sfi I 제한효소 인식부위를 만들었으며, 3′-MKC anti-sense primer에는 Not I 제한효소 인식부위를 만들었다. single chain variable fragment (ScFv)를 형성하기 위해 중사슬과 경사슬 kappa chain을 연결시켜주는 flexible linker DNA (Gly₄Ser)₃를 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 본 발명의 RT-PCR 실험에 사용된 backward primers와 forward primers의 염기서열은 하기 표 4a 및 b에 기술되어 있다.

Backward primers의 DNA 서열

Primer Name	Sequence
heavy chain backward primer	5'-AGGGGCCAGTGGATAGACNGATGG-3'
Kappa chain backward primer	5'-ACCTGCGGCCGCTACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3'

＊Note : N = A/G/C/T

Forward primers의 DNA 서열

Primer Name	Sequence
MHV78 forward primer 1	5'-GCGGCCCAGCCGGCCSAGGTCCAGCAGCTGCAGYYTGG-3'
MHV78 forward primer 2	5'-GCGGCCCAGCCGGCCCAGGTRCAGCTGAAGSAGTCAGG-3'
MHV78 forward primer 3	5'-GCGGCCCAGCCGGCCGAKGTGCAGCTTCAGCAGTCRGG-3'
MHV78 forward primer 4	5'-GCGGCCCAGCCGGCCGAVGTGAWGCTGGTGGAGTCTGR-3'
MHV78 forward primer 5	5'-GCGGCCCAGCCGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGG-3'
MHV78 forward primer 6	5'-GCGGCCCAGCCGGCCGAGGTTVAGVTGCAGCAGTCTGK-3'
MHV78 forward primer 7	5'-GCGGCCCAGCCGGCCCAGGTTCACCTACAACAGTCTGG-3'
MKV75 forward primer 1	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATGYTKTKVTGACCCAAACTCC-3'
MKV75 forward primer 2	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGRACATTGTGCTGACMCAATCTCC-3'
MKV75 forward primer 3	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGSAAAWTGTKCTCWCCCAGTCTCC-3'
MKV75 forward primer 4	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGSAAAWTCTKCTCWCCCAGTCTCC-3'
MKV75 forward primer 5	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGSAAAWTTTKCTCWCCCAGTCTCC-3'
MKV75 forward primer 6	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGARCATTGTGATGACCCAGWCTCA-3'
MKV75 forward primer 7	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGARCATTGTGATGACCCAGWCTCC-3'
MKV75 forward primer 8	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGGRCATTGTGATGACCCAGWCTCA-3'
MKV75 forward primer 9	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGGRCATTGTGATGACCCAGWCTCC-3'
MKV75 forward primer 10	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATATCCAGATGACACAGACTAC-3'
MKV75 forward primer 11	5'-CTCTGGCGGTGGCGGATCGGAMATCMWGATGACCCARTCTCC-3'

＊R=A/G; Y=C/T; M=A/C; K=G/T; S=C/G; W=A/T; H=A/C/T;

B=C/G/T; V=A/C/G; D=A/G/T.

1-(10): 중사슬과 경사슬의 가변부 증폭(RT- PCR )

RT-PCR은 BD SMART^TM RACE Amplification Kit (BD Biosciences Clontech, USA)를 이용하여 수행하였다. 1㎍ 이상의 전체 RNA와 heavy chine과 kappa chain 각각의 anti-sense primer를 10pmol/㎕섞어 70℃에서 2분 동안 방치한 후, 얼음 위에 2분 동안 꽂아두었다. 1㎕의 5x First-strand buffer, 2mM DTT, 1mM dNTP mix, BD PowerScript Reverse Transcriptase를 혼합한 후 앞서 70℃에서 반응시킨 RNA를 넣고 배양기에서 42℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 100㎕의 Tricine-EDTA 완충용액을 넣고 72℃에서 7분 동안 반응시킨 후 바로 PCR과정을 진행하였고, 나머지는 -20℃에 보관하였다.

50㎕ PCR reaction시, 5㎕ cDNA product, 10x PCR 완충용액 (100 mM Tris-HCl, 15mM MgCl₂, 50mM KCl, pH 8.3), 1p㏖/㎕ primer set, 0.2mM dNTPs, 1mM MgCl₂, 5units의 Taq DNA polymerase를 넣고 최종 부피를 멸균된 3차 증류수로 조정하였다. 중사슬의 PCR 반응은 94℃에서 5분 (pre-denaturation)동안 열처리하여 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 30초 (denaturation), 55℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 30초 (polymerization)를 1 cycle로 35회를 반복하여 수행한 후 72℃에서 10분간 더 반응시켜서 반응을 종료하였다. 그리고 경사슬의 PCR 반응은 94℃에서 5분 (pre-denaturation)동안 열처리한 후, 94℃에서 30초 (denaturation), 51℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 30초 (polymerization)를 1 cycle로 35회를 반복하여 수행한 후 72℃에서 10분간 더 반응시켜서 반응을 종료하였다. PCR 반응 생성물 중 일부를 1x TAE 완충용액 (40mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)으로 만든 1.2% agarose gel 상에 전기 이동 후, ethidium bromide (0.5㎍/mL)로 염색하여 유전자의 증폭을 확인하였다.

total RNA를 주형으로 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성한 후, 이 cDNA를 주형으로 수행된 PCR 반응에는 마우스 중사슬 가변부를 78% 정도 대표할 수 있는 7개의 degenerated primer와 경사슬 가변부를 75% 정도 대표할 수 있는 11개의 degenerated primer를 사용하였다(표 4). 그 결과로 생긴 PCR 반응 생성물을 1.2% 아가로우스 젤상에서 분석하였다. 중사슬은 4번째 primer를 사용한 곳에서 밴드를 관찰할 수 있었고(도 5), 경사슬은 모든 primer에 대해서 밴드를 확인할 수 있었다(도 6). 이것은 사용된 primer의 서열이 degenerated primer이면서, 서열이 매우 유사하기 때문에 나타난 결과라 추정되며 가장 뚜렷한 3번째 primer를 다음 실험을 위하여 선택하였다. 그리고 중사슬과 경사슬의 kappa chain은 각각 320 bp와 340 bp정도 크기에서 밴드가 관찰되었다(도 5, 6). 도 5는 7가지 MHV 78 primers를 이용하여 hybridoma의 cDNA를 증폭한 PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 분석 사진이다. 레인 M은 100bp DNA ladder이고 레인 1 내지 7은 중사슬 가변부위 유전자의 PCR 산물이다. 도 6은 11가지 MKV 75 primers를 이용하여 hybridoma의 cDNA를 증폭한 PCR 산물의 아가로스 젤 전기영동 분석 사진이다. 레인 M은 100bp DNA ladder이고 레인 1 내지 11은 경사슬(kappa chain) 가변부위 유전자의 PCR 산물이다.

1-(11): Single chain variable fragment ( ScFv )의 조립

PCR 반응을 통해 얻은 산물은 발현용 벡터와 재조합하기 위해 PCR 산물을 모두 1.2% 아가로우스 젤로 전기이동 후, 정확히 증폭된 DNA 밴드를 UV-illuminator 상에서 면도칼로 오려낸 뒤, Geneclean Ⅲ kit (BIO101, USA)를 사용하여 젤에서 DNA를 분리, 정제하였다. 중사슬과 경사슬의 PCR 생성물을 Splicing by Overlap Extention PCR (SOE-PCR) (Horton et al., 1989)을 통해 single polypeptide로 결합시켰다. ScFv는 두 단계로 조립하였다. 첫 번째 단계는 50ng의 각각 정제된 PCR 생성물과 40pmol linker DNA, 10xPCR 완충용액 (100mM Tris-HCl, 15mM MgCl₂, 50mM KCl, pH 8.3), 0.2mM dNTPs, 1mM MgCl₂, 5units의 Taq DNA polymerase를 넣고 최종 부피 50㎕를 멸균된 3차 증류수로 조정하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 (pre-denaturation)동안 열처리한 후, 94℃에서 30초 (denaturation), 52℃에서 1분 (annealing), 72℃에서 1분 (polymerization)을 1 cycle로 7회를 반복하여 수행하였다. 이어서 5p㏖/㎕ 중사슬 sense primer와 5pmol/㎕ 경사슬 anti-sense primer와 0.2mM dNTPs, 5 units의 Taq DNA polymerase를 넣고 최종 부피 50㎕를 멸균된 3차 증류수로 조정한 후 잘 섞어주고 앞서 수행한 PCR 반응에 첨가하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 (pre-denaturation)동안 열처리한 후, 94℃에서 30초 (denaturation), 59℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 50초 (polymerization)를 1 cycle로 35회를 반복하여 수행한 후 72℃에서 10분간 더 반응시켜서 반응을 종료하였다. scFv gene의 조립에 사용된 linker DNA의 서열은 표 5에 기술되어 있다.

Linker Name	Sequence
linker DNA	5'-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCAGGGGCCAGTGGATAGAC-3'

PCR을 통해 증폭된 두 유전자를 분리, 정제하여 Gly과 Ser으로 구성되어 있는 linker DNA와 단일 유전자로 연결시켰다. SOE-PCR 방법을 사용하여 두 단계에 걸쳐 증폭시켰으며, 1.2% 아가로우스 젤 상에서 분석한 결과 약 800 bp정도의 생성물이 확인되었다(도 7). 도 7은 V_H, V_K, 및 scFv PCR 산물의 전기영동 분석 사진이다. 레인 M은 100bp DNA ladder이다. V_H 유전자는 중사슬 backward primer 와 MHV78 forward primer 4로 증폭하였다 (레인 1). V_K 유전자는 경사슬 backward primer 와 MKV75 forward primer 3으로 증폭하였다 (레인 2). 레인 3은 조합된 scFv 유전자이다. V_H 유전자 및 V_K 유전자가 SOE-PCR에 의해 링커 DNA로 연결되어 scFv를 형성하였다.

1-(12): 클로닝 벡터에 재조합

상기에서 추출한 PCR 생성물을 재조합시키기 위해서 PCR 생성물을 각각 Sfi I과 Not I 제한효소로 처리하고 Geneclean Ⅲ kit (BIO101, USA)를 이용하여 제한효소 처리된 PCR 생성물을 정제하였다. 클로닝 벡터로 Phagemid pCANTAB5E (Amersham Biosciences) 벡터를 이용하였다. 이 벡터는 leader sequence와 M13 중심부 사이에 항체의 가변부 유전자를 클로닝 할 수 있도록 제작되었다. 그리고 amber stop codon에 따른 peptide tag (E tag)을 암호화하는 서열을 갖고 있어 TG1과 같은 E. coli의 supE strain이 있을 때 translation은 amber stop codon을 통과해 ScFv-g3p 융합 단백질을 생산한다. 반면에, HB2151(Amershambiosciences, Sweden)과 같은 nonsuppression strain은 stop codon을 인식하여 ScFv 유전자 말단에서 단백질 합성이 중단되며, g3p 융합단백질을 합성하지 못하는 특징을 가지고 있다. 도 8는 pCANTAB5E의 발현 벡터 지도이다. 클론된 scFv 와 g3p 서열사이의 접점에 amber 번역 중지 코돈을 가지면 그 앞에 peptide E tag 암호화 서열을 포함한다.

제한효소 처리 후 정제된 PCR 생성물과 pCANTAB5E 벡터를 각각 3:1의 비율로 섞은 후 1㎕의 10xLigation buffer (0.66M Tris-HCl, pH 7.6, 50mM MgCl₂, 50mM Dithiotheitol)와 10mM ATP, 1 unit의 T4 DNA Ligase를 넣고 4℃에서 overnight 반응시켜 재조합 시켰다.

1-(13): 형질전환

상기 재조합 산물을 형질전환 시키기 위해서 E.coli JM109로 competent cell을 제조한 후 형질전환에 사용하였다. -70℃에 보관된 200㎕ competent cell을 얼음 속에서 천천히 해동시킨 후 재조합 반응물 10㎕를 넣고 30분간 얼음 속에 방치하였다. 42℃ 에서 90초간 열 충격을 준 뒤 다시 얼음 속에서 10분간 방치하였다. 여기에 SOC (2% Bacto-tryptone, 0.5% Bacto-yeast extract, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgSO₄, 10mM MgCl₂, 20mM glucose) 800㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양한 후 배양액 100㎕를 ampicillin (100㎍/mL)과 2% glucose가 들어 있는 SOB 평판배지에 spreading하여 37℃에서 12?16시간 배양하였다. 여기서 생성된 콜로니 중 몇 개를 선정하여 2xYT-AG medium (17g의 Bacto-tryptone, 10g의 Bacto-yeast extract, 5g의 NaCl, 100㎍/mL의 ampicillin, 2% glucose)에 재배양하여 삽입물의 여부를 확인하였다.

1-(14): PCR 을 통한 클로닝 확인 및 서열결정

상기 형질전환체로부터 alkaline lysis 방법을 사용하여 플라스미드를 추출하였다 (Sambrook & Russell, 1989). 삽입된 DNA의 존재는 추출된 플라스미드를 template로 사용한 PCR 반응을 통해 확인하였다. PCR 반응은 재조합된 플라스미드와 10xPCR 완충용액 (100mM Tris-HCl, 15mM MgCl₂, 50mM KCl, pH 8.3), 10p㏖/㎕ 중사슬 forward primer와 10p㏖/㎕ kappa chain anti-sense primer, 0.2mM dNTPs, 5 units의 Taq DNA polymerase (Promega, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분 반응하여 충분히 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 30초 (denaturation), 59℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 50초 (polymerization)를 1 cycle로 35회를 반복하여 수행한 후 72℃에서 10분간 더 반응시켜서 반응을 종료하였다. PCR 반응 후, 반응생성물 중 일부를 1xTAE 완충용액 (40mM Tris- acetate, 1mM EDTA)으로 만든 1.2% agarose 젤 상에서 전기이동한 후, ethidium bromide (0.5㎍/mL)로 염색하여 유전자의 증폭 여부를 확인하였다.

pCANTAB5E 발현벡터(Amershambiosciences, Sweden)에 800 bp의 DNA 단편을 클로닝한 후 이를 E. coli JM109에 형질전환 하였다. 항생제로 1차 선별한 후 선택된 콜로니에서 phagemid를 추출하여 중사슬 forward primer, 경사슬 anti-sense primer와 sequencing primer set(S1, S6)를 사용한 PCR 반응을 통하여 목적하는 콜로니를 확인, 비교하였다(도 9). 이때 사용된 sequencing primer set(S1, S6)의 염기서열은 하기 표 6에 기술되어 있다. 도 9은 PCR에 의해 pCNATAB5E내로 클론된 scFv를 확인한 전기영동 사진이다. 레인 M은 1kb PLUS DNA ladder이고, 레인 1은 pCANTAB5 sequence primer 1 및 6을 사용한 PCR 산물이고, 레인 2는 MHV78 forward primer 및 kappa chain backward primer를 사용한 PCR 산물이다.

Primer Name	Sequence
Sequencing primer 1	5'-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3'
Sequencing primer 6	5'-CATTTACTTAAAAGACATACTCC-3'

삽입물이 확인된 콜로니로부터 phagemid를 다시 추출하여 (주)제노텍에 DNA 염기서열 분석 (ABI PRISM 3700 DNA Analyzer)을 의뢰하였다. scFv의 염기서열을 분석하였을 때 321 bp로 이루어진 V_H와 324 bp로 구성된 V_L을 확인할 수 있었고, 완전한 형태의 linker DNA와 E-tag의 염기서열을 확인하였다(도 10). scFv의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시하였다. 그리고 Immunoglobulin에 대한 sequence alignment software인 인터넷상의 IMGT/V-QUEST database(http://imgt.cines.fr)를 이용하여 아미노산들의 구성과 CDR과 FR의 할당 영역을 분석하였다(도 11). CDR(complementarity determining regions)은 모노클로날 항체의 가변영역내에서 항원결합부위를 구조적으로 구성하고 있는 항원과의 특이적 상보성을 결정짓는 중요한 부위이다. 도 10은 scFv 유전자의 염기서열과 추론된 아미노산 서열이다. 도 11는 scFv에서 추론된 중사슬과 경가슬(kappa chain)의 가변부위 (V_H and V_K)의 아미노산 서열이다. CDRs 및 FRs가 표시되어 있다. 본 명세서에서, 중사슬 가변부위(서열번호 4)의 CDR1, 2 및 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3으로 표시하였다. 경사슬 가변부위(서열번호 8)의 CDR1, 2 및 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 5, 6, 7로 표시하였다.

1-(15): 단백질의 발현

염기서열이 확인된 재조합 플라스미드의 발현을 위해 E. coli HB2151에 형질전환시켰다. E. coli HB2151의 competent cell의 제조와 형질전환 방법은 앞에서 기술한 E. coli JM109의 방법과 동일하게 수행하였다. 재조합 플라스미드가 형질 전환된 콜로니를 선택하여 IPTG로 발현을 유도시킨 후, 발현 단백질을 Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시하여 확인하였다. 또한, E. coli HB2151에서 발현되는 수용성의 ScFv-E tag의 위치를 확인하기 위하여 mouse anti-E tag antibody를 사용하여 Western blot을 실시하였다. 앞에서 발현이 유도된 수용성의 ScFv-E tag을 용해시킨 것을 12% SDS-PAGE로 분리한 후, Trans-Blot SD semi-dry transfer (BioRAD, USA)를 이용해 26 V로 35분 동안 전이시켰다. NitroCellulose (NC) membrane을 적당한 크기로 잘라 pad와 함께 transfer 완충용액에 미리 담가 두었다가 사용하였다. 전이가 끝난 후 membrane을 blocking solution (5% skim milk)에 4℃에서 12시간 동안 membrane을 blocking시켰다. blocking이 끝나고, blocking solution에 mouse anti-E tag 항체가 1:500으로 희석된 용액을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 그리고 goat anti-mouse IgG-HRP (horseradish peroxide) (KBL, USA)를 1:5,000으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 각 단계를 처리하기 전에 0.05% (w/v) Tween 20 용액이 첨가된 phosphate buffered saline (PBST)로 5분씩 3회 세척하였다. 발색은 HRP의 기질인 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma, USA) 20mg과 0.015% 과산화수소를 50mL의 PBS에 혼합하여 membrane을 담그고 천천히 교반하여서 반응시켜 발색 결과를 관찰하였다. 도 12은 scFv 발현의 SDS-PAGE 및 Western blot analysis 사진이다. 레인 M은 protein size marker Ⅱ (Tefco. Japan)이고, 레인 1은 E.coli HB2151의 상층액이고, 레인 2는 IPTG 유도되지 않은 클론된 HB2151 세포의 상층액이고, 레인 3은 IPTG 유도한지 9시간 후 수확한 클론된 HB2151 세포의 상층액이다. 발현된 scFv-E tag가 화살표로 표시되어 있다.

1-(16): 발현단백질 분리 및 정제

ScFv-E tag을 분리, 정제하기 위하여 RPAS Purification Module을 구입하여 사용하였다. 먼저 1L의 2xYT-A 액체배지에 균주를 접종시킨 후 OD₆₀₀에서 0.5～ 0.6까지 배양하였다. 배양액에 1mM의 IPTG를 넣어준 후 5시간 발현을 유도한 후 얼음에 5분간 방치하여 단백질의 발현을 정지시켰다. 1L의 배양액을 1,500xg에서 원심분리하여 상층액은 버리고 pellet은 extraction buffer를 사용하여 용해시킨 후 12% SDS-PAGE를 실시하여 발현 유무를 확인하였다. 나머지는 PBS를 사용하여 4℃에서 3 시간씩 4차례 투석하여 완충용액 교환을 수행하였다. HiTrap^TM anti-E tag column과 AKTA purifier 10 (Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하여 scFv-E tag을 분리하였다. column은 0.2M phosphate 완충용액으로 세척하여 컬럼의 평형을 맞춘 후, 투석이 완료된 시료를 가하여 항체가 결합하도록 하였다. 그 후 동일한 0.2M phosphate 완충용액으로 세척하여 anti-E tag과 결합하지 않은 단백질을 씻어낸 후 결합된 scFv-E tag을 1.0M Glycine 완충용액 (pH 3.0)으로 용출시켰다. 용출된 시료에 용출액 부피의 1/10의 1M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)을 첨가하여 pH를 원래의 상태로 복원하였다. 그리고 100배 부피의 PBS를 사용하여 4℃에서 3시간씩 4차례 투석하여 완충용액 교환을 수행하였다. 정제된 수용성 scFv-E tag은 앞에서 설명한 indirect ELISA 방법을 사용하여 마뇨산 항원과의 반응성을 측정하였다. Rabbit anti-E tag antibody와 goat anti-rabbit IgG-HRP를 2차 항체로 사용하였다. 발현단백질 scFv와 마뇨산 항원과의 반응성을 측정하기 위해 indirect ELISA를 수행한 결과 10배 희석에서 0.516 수준의 항체 역가가 측정되었다(data not shown).

실시예 1

1-(1): 검출용 마뇨산-운반자 단백질 접합체의 제조

마뇨산 18.0 ㎎ 과 DCC 20 ㎎, NHS(N-Hydroxy succinic anhydride) 10 mg을 DMF(N,N-Dimethylformamide) 0.2 mL에 혼합하여 상온에서 2 시간 동안 교반하여 반응시켰다. BSA 10.0 ㎎ 을 10 mM PBS 완충용액 (pH 7.4) 10 ㎖에 용해시킨 다음, 여기에 상기에서 얻어진 반응용액을 한 방울씩 떨어뜨리고, 상온에서 3시간 동안 교반하여 반응시킨 다음, 상기 반응액을 10mM PBS 완충용액 (pH 7.4)으로 3 차례 투석하여 검출용 HA-BSA 접합체를 제조하였다.

1-(2): 골드패드의 제조

염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 골드 입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되게 제조하였다. 여기에 상기 예비 실시예 1-(6)에서 제조된 4D31G111B7 항체를 10㎍/㎖이 되도록 부착시키고 PEG용액으로 상기 컨쥬게이트된 골드입자를 안정화시켰다. 이처럼 제조된 단일클론항체-골드입자접합체를 폴리에스테르 메트릭스에 적셔 건조시킴으로써 골드패드를 제조하였다.

1-(3):진단용 키트의 제조

플라스틱 카드에 니트로셀룰로우즈 전개 멤브레인을 깔고 그 위에 상기 제조한 검출용 HA-BSA접합체와 산양 anti-마우스 IgG를 각각 1㎎/㎖ 농도로 PBS로 희석하여 도 16의 T, C 위치에 각각 흡착시켰다. 셀룰로우즈 패드를 준비하여 Tween20로 처리하여 검체적용패드로 사용하였으며, 흡습패드는 셀룰로우즈패드를 적당히 절단하여 사용하였다. 상기 전개 멤브레인, 검체적용패드, 골드패드 및 흡습패드를 도 13에서 도시된 바와 같이 적층하고 스트립형태로 절단하였다. 이 스트립을 플라스틱 디바이스(도 16)에 넣고 뚜껑을 덮었다.

시험예 1

본 발명에 따른 진단 키트의 진단 효능 시험

상기 실시예 1에 따라 제조된 진단 키트의 효능을 시험하기 위해 정상인으로 문답한 사람의 소변 50 검체와 정상인 검체에 마뇨산을 첨가(spike)하여 0, 1, 1.5, 2.0, 4.0mg/mL 으로 각각 농도를 조절한 후에 본 발명에 따른 진단키트의 타원형 검체 홀에 적하한 후 약 10분 경과한 다음 그 결과를 도 17에 도시하였다. 모든 경우에 C위치에 보라색 선이 나타나야 하고 C 위치에만 적색 또는 보라색 선이 있는 경우는 톨루엔 흡입에 대하여 양성이며, C, T 위치 모두에 적색 또는 보라색 선이 나타나면 톨루엔 흡입에 대하여 음성으로 판정하였다. 도 17을 참조하면, 본 발명에 따르는 진단 키트는 톨루엔 대사체인 마뇨산의 소변내의 유무를 검사할 수 있으며, 그 종래의 검사방식인 GC/MS나 HPLC에 비하여 간단하고 신속하면서도 민감성을 동시에 갖추고 있음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 톨루엔 흡입여부 진단 스트립에 사용되는 마뇨산항원에 대한 단일클론항체는, 톨루엔의 인체노출기준에 적합한 mg/ml 농도 범위에서 standard curve를 갖는 역가를 가지고 있으며, 운반자 단백질과는 교차 반응을 하지 않을 뿐만 아니라, 마뇨산의 농도가 높아질수록 경쟁적 억제가 심하게 일어나고, 뇨 안에 함유된 다른 단백질과는 교차 반응을 일으키지 않으므로, 본 발명에 따른 마뇨산 흡입여부 진단스트립을 사용하게 되면 특별한 검사장비나 훈련된 인원이 없이도 간단하게 면역학적으로 소변내의 마뇨산을 진단함으로써 본드 흡입 여부나 유해 용재에 작업자의 노출 여부를 간편하고 신속하게 진단할 수 있다.

<110> TEA, Kun Sik <120> Monoclonal antibody for hippuric acid antigen <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VH <400> 1 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VH <400> 2 Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Thr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VH <400> 3 Val Arg Met Tyr Ala Asp Val 1 5 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 4 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln 20 25 30 Ser His Val Lys Thr Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Thr Pro Tyr Asn 35 40 45 Gly Ala Thr Asn Tyr Thr Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Phe His Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Met Tyr Ala Asp Val 85 90 95 Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Lys Thr Thr Pro 100 105 110 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VL <400> 5 Gly Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Arg Leu Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VL <400> 6 Ala Thr Ser Ser Leu Asp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VL <400> 7 Leu Gln Tyr Asp Arg Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 8 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Leu Ala Cys Arg Gly Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly 20 25 30 Arg Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Ala Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Arg Ser Gly Asp Tyr Ser Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val 115 <210> 9 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 9 Ala Ala Gln Pro Ala Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Ala Ser Val 1 5 10 15 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met 20 25 30 His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Thr Leu Glu Trp Val Gly Arg 35 40 45 Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp 50 55 60 Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80 Phe His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 85 90 95 Met Tyr Ala Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Val Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu 130 135 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Ser Val Thr 145 150 155 160 Leu Ala Cys Arg Gly Ala Ser Gln Asp Ile Gly Gly Arg Leu Asn Trp 165 170 175 Leu Gln Gln Glu Ala Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr 180 185 190 Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser 195 200 205 Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe 210 215 220 Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Arg Ser Pro Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Asp Ala Ala Pro Thr Val 245 250 255 Ala Ala

Claims (15)

1. 마뇨산-운반자 단백질 접합체가 검사선 부위에 흡착되어 있는 전개 멤브레인과, 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 복합체가 함침되어 있는 골드패드를 상기 전개 멤브레인의 상부 일측에 구비하며, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 중사슬의 가변성 부위와, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 경사슬의 가변성 부위를 포함하며, 상기 검사선에 흡착되어 있는 마뇨산-캐리어 단백질 접합체와 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 간의 항원-항체 반응에 의한 발색에 의하여 톨루엔 흡입여부를 확인할 수 있는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
2. 제 1항에 있어서, 상기 중사슬의 가변성 부위는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
3. 제 1항에 있어서, 상기 경사슬의 가변성 부위는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
4. 제 1항에 있어서, 상기 중사슬의 가변성 부위와 상기 경사슬의 가변성 부위가 펩티드 링커로 연결된 단일사슬항체(scFv)인 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
5. 제 4항에 있어서, 상기 단일사슬항체(scFv)는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자 복합체에 사용되는 콜로이드 골드입자의 입경은 20～60nm이고 532nm 파장에서의 흡광도가 9～11이며 상기 단일클론항체의 흡착량은 5～15㎍/㎖이고. PEG 용액으로 안정화되어 있는 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
7. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산-운반자 단백질 접합체는 BSA, KLH 또는 OVA와 마뇨산이 크로스링커에 의해 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
8. 제 1항에 있어서, 상기 골드패드의 상부에는 검체를 적하하여 상기 스트립 내부로 침투시킬 수 있는 검체적용패드가 적층되어 있고, 상기 전개 멤브레인의 또 다른 일측에는 반응하지 않은 검체를 흡수하는 흡습 패드를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
9. 제 1항에 있어서, 상기 전개 멤브레인의 소정부위에는 대조선이 구비되어 있고 상기 대조선에는 항-마우스 IgG가 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
10. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자의 마뇨산에 대한 컷오프 농도는 1.25 내지 4.0mg/ml이며, 상기 컷오프 농도의 조절은 pH 또는 콜로이드 골드입자에 대한 상기 단일클론항체의 흡착량을 조절하는 것에 의하는 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
11. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자의 마뇨산에 대한 컷오프 농도는 1.25mg/ml이며, 이때의 상기 골드패드의 pH는 6.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
12. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자의 마뇨산에 대한 컷오프 농도는 4.0mg/ml이며, 이때의 상기 골드패드의 pH는 9 내지 11인 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
13. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자의 마뇨산에 대한 컷오프 농도는 1.25mg/ml이며, 이때의 상기 콜로이드 골드입자에 대한 상기 단일클론항체의 흡착량은 15㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여 부 진단스트립.
14. 제 1항에 있어서, 상기 마뇨산항원에 대한 단일클론항체-콜로이드 골드입자의 마뇨산에 대한 컷오프 농도는 4.0mg/ml이며, 이때의 상기 콜로이드 골드입자에 대한 상기 단일클론항체의 흡착량은 5㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 톨루엔 흡입여부 진단스트립.
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 진단스트립을 포함하는 진단키트.

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