KR101184365B1 - 코디셉스 밀리타리스 ｋｃｔｃ 11455 ｂｐ로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 성장촉진용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 성장촉진용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것으로, 본 발명의 조성물은 항산화를 통한 건강증진 및 성장촉진에 유용하다.

Description

코디셉스 밀리타리스 ＫＣＴＣ 11455 ＢＰ로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 성장촉진용 조성물 및 그 제조방법{Composition having antioxidative and growth promoting function which comprises Cordyceps militaris KCTC 11455BP as an active ingredient, and a preparation method thereof}

본 발명은 녹용 발효 활성을 갖는 신규한 코디셉스 속의 균주로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 성장촉진용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

녹용(antler, Cervus cornu parvum)은 매화록(Cervus nippon Temminck) 또는 마록(Cervus elaphus Linnaeus) 및 동속 근연동물의 털이 밀생되고 골질화되지 않은 어린 뿔로 동양의학의 중요 약재로 중국 및 일본 등의 동양권 국가에서 오래 전부터 활용되고 있는 양록산업의 주 생산물이다. 녹용은 전 세계 생산량의 80%를 한국에서 소비한다고 알려져 있는데(Choi et al., 2005), 현재 국내에서 이용되는 녹용(녹각도 포함한다)은 대부분 수입에 의존하고 있으며, 2000년에 의약용으로 녹용 159톤을 수입하여 1,600만 달러가 지출되었고, 국내 생산 생녹용은 75 kg에 불과한 실정이다. 한국은 전세계에서 가장 큰 녹용 수입국으로, 대부분 국내에서 소비되고 있다.

녹용은 인삼과 더불어 오래 전부터 가장 대표적인 강장 생약재로 한국, 중국, 일본을 중심으로 애용되어 왔으며, 현대에 와서 녹용에는 혈압강하, 조혈기능, 고콜레스테롤 혈증 개선, 항스트레스 효과가 있다는 것이 밝혀지고 있다(Kim and Park, 1982; Yong, 1976; Han 1970; Kang and Kim, 1989). 인삼, 녹용과 같이 강장효과를 가진 생약재의 약성은 특정 장기에만 선택적으로 작용하여 강한 효과를 나타내는 것이 아니라 비록 그 효과는 단일 성분 의약품에 비해 약하나 신체 전반에 걸쳐 복합적으로 효능을 나타내는 것이 특징이다(Kim et al., 1994).

최근들어 녹용의 생리활성 성분에 대한 활발한 연구가 진행되고 있는데, 녹용 추출물은 면역기능 증진, 항산화, 항피로, 항혈전, 항노화, 혈압강하, 항염증작용 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 보고되었다(Cho 등, 2005).

그러나, 녹용은 설사 등의 부작용이 있어, 한방에서 수렴작용이 있는 한약과 병용하여 사용하게 되며, 이 경우 기대했던 효과가 상실되거나 감소될 수 있다. 또한, 한방의 유용한 자원인 녹용은 한약에 이용하기 위해 알코올에 담근 후, 이를 세절하여 사용하게 되는데, 이 과정에서 녹용의 많은 유효성분이 소실되는 문제점이 있다.

한편, 간은 호흡과정을 통하여 생존을 위해 필수불가결한 에너지를 얻게 된다. 호흡이란 간단히 말해 체외로부터 산소를 받아들이고 체내의 축적된 탄산가스를 배출하는 과정인데, 받아들여진 산소는 세포내의 미토콘드리아에서 NADH로부터 전자를 전달받아 물로 전환되는 전자전달계를 거치게 되고 그 결과 생성된 ATP를 통해 세포 내에 에너지를 공급하게 된다. 그런데 생물체의 호흡에 따라 이루어지는 산소환원과정의 부산물로서 독성을 나타내는 중간 대사산물이 생성될 수 있다. 이러한 과정에서 생성된 매우 불안정한 성질을 가진 물질을 통틀어서 프리라디칼(free radical)이라고 한다

프리라디칼은 자유기, 활성산소 또는 유해독성산소라는 말로도 사용되는데 이들은 넓은 의미에서 비슷한 말이다. 우리 몸 속은 여러 물질이 서로 짝을 못 이룬 물질이 만들어지므로 자연히 프리라디칼의 종류도 여러 가지가 된다.

예를 들어 안정된 구조를 가진 단백질이 어떤 이유로 불안정한 전자구조를 가진 물질이 생기면 이를 단백질라디칼이라고 한다. 산소가 주성분이 되어 짝을 못 이룬 전자를 가진 물질이 만들어지면 이를 산소라디칼이라고 한다. 산소라디칼을 우리말로 번역하면 활성산소가 된다. 여러 가지 프리라디칼 중에서 인체 내에서 가장 흔하게 많이 생기며 주목을 받아온 것이 바로 활성산소이다.

대표적인 활성산소의 종류로는 슈퍼옥사이드라디칼(Superoxide radical(O2)), 하이드록시라디칼(hydroxy radical(HO·), 과산화수소(hydrogen peroxide(H2O2)) 및 일중항산소(singlet oxygen(1O₂))등이 있는데, 이들 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 유전자 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 산화반응을 유발하여 면역체계를 파괴함으로써 노화 및 각종 질병을 일으키는 것으로 밝혀졌다(Blake and Winyard, 1995; Lopaczynski and Zeissel, 1995). 활성산소는 정상적인 세포 대사과정에서도 일부 생성되고 있으며 체내에서는 각종 항산화효소와 항산화물질로 이를 제어하고 있다(Cook and Samman, 1996). 그러나 현대생활에서는 각종 환경요인에 의하여 과량의 활성산소가 생성되어 인체 내의 항산화물질은 부족한 상태이며, 이로 인해 각종 질병과 노화가 유발된다. 항산화물질은 식품산업, 의약산업, 화장품산업 등 다양한 분야에서 이용될 수 있기 때문에 국가 경제 산업적 측면에서 매우 큰 파급효과를 기대할 수 있다(Namiki, 1990). 따라서 발효녹용의 라디칼 소거능은 유리 라디칼이 원인이되는 질병을 예방할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

산소 유리기(oxygen free radical)는 산소를 이용하여 생존하는 세포 내에서 생성되는 독성이 강한 물질로서 세포의 DNA나 세포막 지질 및 단백질 등을 손상시키므로 세포 내에서는 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione peroxidase 등의 항산화 효소와 glutathione, uric acid 등의 여러 가지 비효소적 항산화 물질이 있어 산소 유리기에 의한 산화적 손상으로부터 각종 세포 구조물을 보호한다. SOD는 유리산소를 H₂O₂와 O₂로 전환시키며, 생성된 H₂O₂ catalase와 glutathione peroxidase에 의해 소거되는데 glutathione peroxidase는 환원형 glutathione(GSH)을 산화형 glutathione (GSSG)으로 산화 시키면서 H₂O₂를 제거하며 GSSG 는 glutathione reductase에 의해 다시 GSH로 환원되어 인체 내에서 glutathione은 GSH와 GSSG의 두 가지 형태로 균형을 이루면서 존재하게 된다. 만약 세포 내에 독성 또는 산화적 손상이 일어난 경우에는 GSSG가 서서히 증가하게 되어 GSH/GSSG의 불균형을 초래하게 되어 방어 기전으로서의 역할이 소실된다. GSH는 산소유리기에 의한 세포 손상을 방지하고 세포 내 해독 작용을 담당하는 중요한 물질로 여겨지고 있다. 따라서 건강한 개체의 세포는 산화적 세포손상을 일으킬 수 있는 산소 유리기를 소거하는 방어기전에 의해서 충분히 보호받을 수 있다(De Haan et al., 1995).

성장 호르몬(Growth Hormone)은 성장과 밀접한 연관성이 있다. 유아, 어린이 및 청소년의 정상적인 발육을 위해 요구되는 내분비 요인 중 성장호르몬(GH)은 말초에서 지질, 탄수화물, 단백질 대사에 작용하여 성장에 영향을 미치며, IGF-1(insulin like growth factor-1)의 합성과 분비에 많은 영향을 미친다 (Campbell and Andress, 1997). IGF-1은 성장호르몬(growth hormone)과 관련 깊은 성장인자로 성장호르몬의 자극을 받은 뇌하수체 전엽에서 분비한다. IGF-1은 특히 성장판에서의 연골세포 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Gerard and Sandra, 2003). 또한 성장호르몬의 발현 기제에도 관여하여 성장호르몬의 발현과정을 조절하며 인체 대부분의 장소에서 세포의 분화(differentiation)와 증식(proliferation), 성숙(maturation)을 조절한다(Scriver et al., 1995).

대부분의 호르몬과는 다르게 IGF-1은 여러조직에서 합성되며, 간이 주요 생산지로 간에 있는 성장호르몬 수용체는 IGF-1 m-RNA의 농도를 조절한다. IGF-1은 성장호르몬(growth hormone)과 관련 깊은 성장인자로 성장호르몬의 자극을 받은 뇌하수체 전엽에서 분비한다. IGF-1은 특히 성장판에서의 연골세포 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Gerard and Sandra, 2003). 또한 성장호르몬의 발현 기제에도 관여하여 성장호르몬의 발현과정을 조절하며 인체 대부분의 장소에서 세포의 분화(differentiation)와 증식(proliferation), 성숙(maturation)을 조절한다(Scriver et al., 1995).

IGF-1은 조직의 성장과 발달 기능에 중요한 역할을 하며, 근모세포를 증식시키고 근세포 분화를 촉진 시키며, 연골의 성장과 세포증식, 분화에도 작용한다(Florini등, 1986). 출생 전에는 성장호르몬 보다는 IGF-I과 IGF-II가 길이 성장에 더 중요하다(Woods et al., 1996). 출생 후에는 길이 성장에 IGF-I과 함께 성장호르몬이 중요한 역할을 차지한다.

ALP는 파골세포에서 분비되는 당단백질로 임상에서 가장 흔히 이용되는 골형성 지표이다. 골연화증, 파젯병, 신성 골이영양증, 일차성 부갑상선기능 항진증 등의 진단과 치료경과 추적에 유용한 검사로 50년 이상 널리 사용되어 왔다(Duda et al., 1988). 연령증가에 따라 ALP는 증가하는 경향이 있다. ALP 외 골형성지표에는 총알칼리성 포스파타제(total alkaline phosphatase, ALP), 골특이성 알칼리성 포스파타제(bone specific alkaline phosphatase, BALP), OC, PICP 등이 있으며, 최근 BALP의 사용이 증가 하고 있다.

성장판(growth plate)은 장골의 양단에 위치해 있는 수평적으로 정형화된 구조를 지닌 연골세포집단으로서 뼈몸 통끝(metaphysis)과 뼈끝(epiphysis) 사이에 위치하고 있다(Hunziker, 1994). 성장판 내 연골세포(chondrocyte)의 증식, 비대(hypertrophy), 세포외간질(extracellular matrix) 분비, 혈관과 골전구세포의 침입과 이에 따른 골화(ossification) 과정을 거쳐 결국 연골이 골로 변화하게 되는 연골내 골화(endochondral ossification) 과정을 거치면서, 성장판의 뼈몸통끝 부위에 새로운 골이 지속적으로 형성되고, 이에따라 장골의 길이가 길어지게 된다. 성장판은 성장호르몬, 인슐린양 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 갑상샘호르몬, 성호르몬, 글루코코르티코이드 등의 호르몬(Robson et al., 2002)과 여러 시토카인에 의해 조절을 받으며, 결국 사춘기 후에 골화되면서 주위 뼈와 융합된다.

한편, 지금까지 녹용을 코디셉스 밀리타리스 속 곰팡이 균주를 이용하여 발효시킨 경우는 찾아볼 수 없다. 이에, 본 발명자들은 발효녹용의 유효성분 효율을 높이고 새로운 약리작용을 일으키기 위하여, 코디셉스 속 미생물을 분리하고자 본 연구를 수행한 결과, 버섯 자실체로부터 새롭게 분리한 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 녹용을 발효시킬 경우 종래의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 비하여 발효추출물의 수율이 훨씬 높고 유효성분의 함량을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

또한 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 로 발효시킨 녹용 발효물에 대하여 연구를 계속한 결과, 상기 녹용 발효물이 자유 라디칼 소거능이 높고 환원형 글루타티온 함량을 증가시킨다는 것을 알아내었으며, 상기 바실러스 서브틸리스 KCTC 11454BP 로 발효시킨 녹용 발효물이 성장호르몬 및 ALP 등을 증가시킴으로써, 성장촉진 효과가 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 목적은 항산화 및 성장촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 항산화 및 성장촉진용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 성장촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항산화 활성 및 성장촉진 기능을 갖는다. 그러므로 본 발명의 식품 조성물 및 약학적 조성물은 항산화를 통한 노화 방지, 건강증진에 도움이 되며 성장기 어린이의 성장촉진에 효과가 있다.

도 1은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용 발효물의 S-GAG 및 sialic acid 함량 변화를 나타낸다.
도 2는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용 발효물의 총 당 및 uronic acid 함량 변화를 나타낸다.
도 3은 비발효 녹용 추출물(NF), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물(FC) 및 초유(PC)가 MC3T3-E1 골아세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 본 실험에서 측정한 3주령 SD 래트의 경골 및 경골 성장판의 부위를 나타낸다.

본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP를 접종하여 녹용을 발효시키는 단계를 포함하는, 항산화 및 성장촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 녹용을 발효시키는 경우에 있어서, 상기 녹용은 녹용 또는 녹각이 될 수 있으며, 국산, 일본, 러시아, 중국, 미국, 캐나다 등 녹용의 산지는 어느 것이든 무방하다. 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 로 발효시 녹용은 분말 또는 추출액의 형태로 발효될 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 성장촉진용 및/또는 항산화 조성물은 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 약학적 조성물이 될 수 있다.

본 발명의 항산화용 식품 조성물 및 약학적 조성물은 체내 활성산소를 제거함으로써, 체내 지방, 콜레스테롤과 활성산소가 반응하여 과산화지질을 생성하는 것을 저해하고, 이로써, 과산화지질이 혈전, 색전을 생성하는 것을 예방할 수 있다. 또한 본 발명의 항산화용 식품 조성물 및 약학적 조성물은 활성산소를 제거함으로써, 활성산소과 관련된 혈전, 색전, 과산화지질로 인한 혈액순환장애, 뇌졸중, 중풍, 뇌혈전, 심근경색, 동맥경화를 예방 및 치료하고, 활성산소에 의한 DNA, 세포, 조직의 변성을 저해함으로써, 아토피, 알레르기, 종양, 관절염, 백내장, 피부종양을 예방 및 치료하며, 노화진행을 저해한다.

또한 본 발명의 성장촉진용 식품 조성물 및 약학적 조성물은 성장부진, 발육부진, 체력저하, 저체중을 개선, 치료한다. 그러므로 본 발명의 성장촉진용 식품 조성물 및 약학적 조성물은 성장부진 개선제로 이용될 수 있으며 소아 영양실조 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 포함하는 항산화 용 약학적 조성물 및 성장촉진용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 포함하는 항산화용 약학적 조성물 및 성장촉진용 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 1g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및/또는 성장촉진용 식품 조성물은 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성식품 또는 영양제 등이 될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 식품 조성물은 상기 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 60 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물에 있어서, 상기 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 성장촉진용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 포함하는 조성물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물의 제조 방법에 있어서, 화장품 제조에 허용되는 담체로는 본 발명의 화장료 조성물의 제형에 따라 다를 수 있다. 본 발명의 제형으로는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 리퀴드 파운데이션, 크림 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 항산화용 화장료 조성물은 보다 상세하세는 유연 화장수(스킨, 토너), 수렴 화장수, 영양 화장수(로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 젤, 피부 접착용 패치, 파우더, 피부외용연고, 첩포제, 현탁액, 에멀젼 스프레이, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 위터, 팩, 헤어 에센스 또는 미용액 등의 통상의 화장료 형태로 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤의 경우 담체 성분으로는 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라킨트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 포함하는 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우 담체 성분으로는 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 그의 예로서는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤젠 알코올, 벤젠 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 화장료 조성물의 제형이 현탄액의 경우 담체 성분으로는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 바람직하다.

상기 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 화장료 조성물의 제형이 계면 활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로는 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤. 지방산 에스테르 등이 바람직하다

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP의 분리

1. 야생버섯 5종의 균주로부터 성장이 좋은 균주 검정

가. 야생 버섯으로부터 균주의 분리

야생 채집균은 2-3% Sodium hypochloride로 소독한 자실체를 petri dish 뚜껑에 멸균테이프로 고정 후 water agar(WA) 배지상에 떨어진 하기 표 1에 기재된 버섯의 자낭 포자를 분리하여 각각 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 정치배양하여 균주를 분리하였다.

나. 균주의 배양

나-1. 녹용 분말 고체배지에서의 배양

녹용분말 4 g에 증류수 200 ml를 가하여 현탁 후 agar 4 g을 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25 ℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장 여부를 확인하였다.

나-2. 녹용 추출물 함유 고체배지에서의 배양

녹용 10 g에 증류수 200 ml를 가하여 100 ℃에서 3시간 환류 추출하였다. 원심분리하여 추출액을 회수하였으며, 원심분리에 의하여 얻은 침전에 증류수 150 ml를 가하여 2차 환류 추출하였다. 원심 분리에 의하여 얻은 2차 환류 추출액과 1차 추출액을 혼합 농축하여 농축액(7.5 brix) 80 ml를 얻었다. 농축 추출액 80 ml에 증류수 120 ml와 agar 4 g을 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25 ℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.

다. 성장정도 측정 및 균주 선정

상기의 녹용 분말 고체 배지와 녹용 추출물 고체 배지에서 성장 정도에 따라 균주의 성장 여부를 측정하여 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.

균주 성장이 매우 왕성: +++

균주 성장이 왕성: ++

균주 성장이 보통: +

균주 성장이 약함: -+

전혀 성장하지 않음 : -

녹용 추출물 함유 고체 배지에서의 균주 성장 정도

녹용 분말 함유 고체 배지에서의 균주 성장 정도

라. 균주의 동정

상기 표 1 및 표 2 모두에서 성장이 매우 왕성한 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 균주를 선정, 분리하고 genomic DNA preparation Kit(SGD62S120, Solgent Co. Ltd., Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출한 다음 유니버셜 프라이머(universal primer) ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'), EF-Tag(SEF16 R250, Solgent Co. Ltd., Korea)으로 PCR(Applied Biosystem 9700, CA, USA)를 실시하여 증폭시켰다. 아세테이트와 70% 에탄올을 이용하여 정제한 다음 시퀀싱 키트(Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)와 ABI Prism 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 분리균주의 18S rRNA 염기서열은 EMBL/DDBJ/PDB/GenBank 시쿼스 데이터베이스로부터 얻은 유연균주의 서열과 정렬시키고 상동성을 비교하여 표 3에 나타내었으며, 그 결과 녹용분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지 모두 성장이 매우 왕성한 균주는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)였다.

상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주를 2009년 1월 16일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 11455BP로 기탁하였다.

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP의 18S rDNA 염기서열 및 서열의 상동성

마. 분리 균주의 균학적 특성

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주는 곰팡이 균주이므로 일반적인 세균의 균학적 성질을 규명하는 것과는 다르게 기존 공지된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 속 균주와 탄소원에 대한 영양 요구성을 대비하여 균학적 특성을 비교실험하였다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양이 가능한 코디셉스 밀리타리스속 균주는 약 3가지 정도에 불과하고, 그 중에서 식물자원으로부터 유래된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주는 KCTC 6472(IFO 30377) 하나에 불과하며 분양이 가능한 균주이므로, 하기 실험에서는 생물자원센터에서 분양받은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472를 공지균주로 비교실험을 실시하였다.

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주와 코디셉스 밀리타리(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 균학적 특성을 비교하기 위하여 하기의 방법을 통하여 탄소원에 대한 영양요구도를 측정하였다.

Lily 배지(Maltose 9.5 g/ℓ, aspargine 2.0 g/ℓ, KH₂PO₄ 1.0 g/ℓ, MgSO₄7H₂O 0.5 g/ℓ, Agar 20.0 g/ℓ)를 기본배지로 사용하여, 탄소원(10 g/ℓ)에 대한 두 균주의 영양요구도를 측정하였다. 배지를 121 ℃에서 20 분간 고압멸균 후 상기 균주들을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하였다. 접종균은 25 ℃ 배양기에서 15일간 정치배양한 후 colony 직경 및 균사밀도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

탄소원에 대한 영양 요구도

^aColony diameter(mm): 25 ℃에서 15일 후 측정함.

^cMycelial densityl:+, thin:++, moderate:+++, compact

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 각 탄소원에 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472의 균사체를 같은 조건에서 배양한 결과 여러 탄소원에 대한 균사체 성장 정도는 유사하였으며, 아라비노스에서 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 균사체의 성장 정도가 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP보다 높았으나, 균사체가 자란 밀도는 오히려 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP가 훨씬 높았다.

이상의 결과에서 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP와 공지균주인 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 아라비노스에 첨가시 탄소원에 대한 이용도가 상이함을 알 수 있어 양 균주는 균학적 특성이 다른 것을 확인할 수 있다.

<실시예 2> 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP에 의한 녹용 발효

PDB(potato dextrose broth) 배지 20 ml를 이용하여 상기 실시예 2에서 분리된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 25 ℃에서 5일 배양한 것을 전 배양으로 하였다.

녹용분말 4 g에 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 30 ml를 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 25 ℃로 냉각한 후 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주의 전 배양액 1 ml를 가하여 25 ℃에서 5일간 배양하였다. 배양액에 증류수 60 ml를 가하여 100 ℃에서 3시간 환류 추출 후 원심분리하여 녹용 발효추출물을 얻었다.

<비교예 1> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472에 의한 녹용 발효

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 공지 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 이용하여 녹용 발효추출물을 제조하여 비교예 1로 하였다.

<실험예 1> 녹용 추출물의 수율 비교

상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 추출물의 수율을 측정하여 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율은 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율보다 2배 정도의 수율이 향상되었음을 알 수 있다.

<실험예 2> 녹용발효 추출물의 유효성분 함량 비교

녹용의 유효성분인 S-GAG(sulgated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이며, Sialic acid는 Gangliosides의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이고, Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

녹용 발효추출물에 대한 유효성분의 분석은 아래와 같은 방법으로 측정하였다. Total sugar는 phenol-sulfuric acid 법(Omran 등 1989)으로 측정하였으며, Sulfated-glycosaminoglycan(S-GAG) 측정을 Dimethyl-methylene blue dye binding 방법(Farndale 등, 1982)에 의하여 540 nm에서 측정하였고, Siallic acid 측정은 80 ℃에서 1 시간 동안 0.1 N 황산으로 가수 분해한 후에 Warren 방법(Warren, 1959)에 의해서 549 nm에서 측정하여 표 6에 나타내었다.

녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 분석한 결과, 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 유효성분인 Total sugar, S-GAG의 함량 및 Sialic acid의 함량은 발효 전 및 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 유사하였으나, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 114455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 3> 녹용 발효추출물의 항산화 효과

본 발명에 의한 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 항산화 활성효과를 알아보기 위하여 하기 시험을 실시하였다.

항산화 활성은 DPPH 라디칼에 대한 소거활성 및 ABTS 소거활성 두 가지를 측정하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 에탄올 적정량에 시료 0.2 ml과 4 X 10^-4 M DPPH 용액 0.8 ml를 가하여 10초간 혼합하고 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.

ABTS 소거활성은 Arnao 등(Arnao et al. 2001)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1.0 mM의 AAPH(2,2'-azobis(2-amodino-propane)dihydrochloride)은 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM의 ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68 ℃에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734 nm에서 0.650±10.2가 되도록 조정하였다. 여러 가지 농도의 시료 20 ㎕와 980 ㎕ ABTS 용액을 37 ℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도 정도를 측정하였다. 이때 라디칼 50 %를 소거하는 추출물의 양의 농도(IC₅₀)를 구하였다.

상기 DPPH 라디칼에 대한 소거활성과 ABTS 소거활성을 즉정한 결과는 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서 알 수 있듯이, 녹용 발효추출물의 라디칼 소거능의 정도를 표시한 IC50 값은 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능 모두에서 본 발명에 따른 녹용 발효추출물이 기존 공지의 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물보다 약 2-3배의 항산화 활성 효과가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다

<실시예 3> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 성분 변화

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP에 의한 녹용 발효물 제조시의 성분변화를 측정한 결과, S-GAG의 함량은 배양시간이 증가할수록 증가한 반면(도 1), sialic acid 함량은 배양시간이 증가할 때 다소 감소하다가 다시 증가하는 경향을 보였는데, 특히 배양 60-72시간까지는 증가하다가 그 이후 감소하였다(도 1, 표 9). 배양시간에 따른 total sugar와 uronic acid함량은 배양시간에 따라 증가하는 경향을 보였는데, 배양 36시간 이후 증가하는 경향이 뚜렷하였으며, 증가경향은 total sugar 함량에서 뚜렷하게 보였다(도 2). 배양시간 별 pH는 배양시간이 경과할수록 증가하는 경향을 보였다(표 8). 그러므로, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 이용하여 녹용을 발효하는 경우 72시간이 가장 적합한 것으로 보인다.

Time (h)	0	12	24	36	48	60	72	84
pH	7.4	7.41	7.5	7.68	7.96	8.19	8.51	8.74

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 이용한 녹용 발효 시간에 따른 pH 변화

구 분	0 H	24H	36H	48H	60 H	72 H	84 H
Uronic acid	106.1±10.2	74.9±3.6	90±0.6	129.4±0.6	146±0.3	153.5±3.3	165.7±1.4
S-GAG	103.4±10.6	264.2±4.4	290.5±3.6	276.3±4.2	312.8±20.6	358.3±9.7	354±4.1
Sialic acid	16.53±0.15	15.87±0.65	15.6±0	12.77±0.75	20.8±0	20.1±0.8	15±0.9

표준 물질: Total sugar as glucose, Uronic acid as galacturonic acid, Sulfated-GAGs (glycosaminoglycan) as chondroitin sulfate, sialic acid as N-acetylneuraminic acid

<실시예 4> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 항산화 활성

<실험예 1> 재료 및 방법

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 녹용 발효물의 제조

본 실험에 사용한 녹용은 광동제약으로부터 한약규격집 기준에 적합한 원료를 제공받아 녹용의 분골, 상대, 중대, 하대를 마쇄기로 분쇄하여 혼합 후 사용하였다. 녹용 발효물은 녹용 분말 40 g을 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 300 ml에 넣고 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 접종한 후 25-30℃에서 7일간 발효시킨 것을 시료로 하였으며 녹용 비발효물은 동일한 농도의 발효시키지 않은 녹용 분말액을 시료로 하였다. 각각 시료에 300 ml의 물을 가하고 100℃에서 3시간 동안 환류 추출한 후 8,000 × g에서 20분간 원심분리한 상징액을 회수하였다. 이러한 과정을 2회 반복하여 회수한 추출물을 농축하여 농축액 100 ml(7.5 brix)을 얻었으며 이를 각각 발효 녹용 추출액과 비발효 녹용 추출액으로 하였다.　

실험동물

실험 동물은 나라 바이오텍(Seoul, Korea)에서 공급받은 3주령의 웅성 Sprague-Dawley(SD) 계열 흰쥐(60±10 g)를 이용하였다. 실험 동물은 사육케이지(42 × 28 cm)을 이용해 실험실 온도 22-24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기(12시간 light/ 12시간 dark)가 자동 조절 장치에 의해 조절되는 고려대학교 동물실에서 1주간 예비 사육 후 2주 동안 본 연구를 위해 사육되었다.

그룹 설정

연구 그룹은 무작위 추출법에 의해 군당 6마리씩 3개군으로 분류하였다. 시료 처치군은 비발효 녹용 추출물 투여군(NF)과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)으로 분류하였다(표 10). 시료는 매일 일정한 시간에 존대를 이용해 경구로 투여하였으며 전 실험 기간 동안 물과 AIN-93 기본식이(Samyang Co., Seoul, Korea)는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이 섭취량은 주 2회, 체중은 주 1회 측정하였으며 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 측정된 식이 섭취량에 대한 체중 증가량으로 계산하였다.

Experiment groups			Administrated sample
대조군		NC	Saline
실험군	비발효 녹용 투여군	NF	비발효 녹용 추출물 100 mg/kg BW
	발효 녹용 투여군	FC	코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 100 mg/kg BW

통계 분석

실험 결과는 SPSS ver 10.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 평균의 표준오차(standard error of the mean, SEM)를 산출하였다. 실험군간의 유의성은 ANOVA test 후 구체적인 사후 검증은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.

<실험예 2> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 라디칼 소거능

Cheung 등(2003)의 방법을 이용하여, 간 조직내 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. DPPH를 ethanol에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 0.4 ml와 시료 0.1 ml을 암소에서 10분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

　　간 조직내 ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re 등(1999)의 방법을 이용하였다. 7 mM ABTS에 2.45 mM potassium persulfate을 첨가하여 암소에서 실온으로 12-16시간 방치한 후 414 nm에서 흡광도가 1.4-1.5가 되도록 증류수로 희석시켰다. 간 조직 시료 12.5 ㎕에 희석된 ABTS radical 용액 250 ㎕를 넣어 암소에서 60분간 반응시키고 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능(%)은 다음과 같이 계산하였다.

<식 1>

Radical scavenging activity (%) = (1 - A_sample/A_control) × 100

A_sample: with sample, A_control: without sample

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 투여한 경우, 녹용 비발효 추출물 투여군 또는 대조군에 비하여 간내 ABTS 라디칼 및 혈중 Hydrogen peroxide 라디칼 소거 활성이 현저히 증가한 것이 확인되었다. 반면 DPPH 라디칼 소거능, 혈중 ABTS 라디칼 소거능 및 간내 Hydrogen peroxide 라디칼 소거능은 녹용 비발효 추출물 투여군 또는 대조군의 경우와 큰 차이가 없거나 약간 낮았다(표 11).

Group	DPPH		ABTS		Hydrogen peroxide
	Serum	Liver	Serum	Liver	Serum	Liver
NC	6.3±8.0c	21.1±2.2b	44.6±1.4ab	27.0±6.9b	44.5±15.9c	3.4±0.4a
NF	8.6±4.3bc	24.1±2.8ab	41.5±1.4b	16.5±1.7c	47.8±10.4c	3.0±0.3ab
FC	10.0±5.7bc	24.1±1.1ab	42.8±0.9ab	37.5±2.0a	73.04±13.5ab	2.0±0.4c

녹용 비발효 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 래트에 투여 시 라디칼 소거능

<실험예 3> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 환원형 글루타티온에 미치는 영향

　Tietz(1969)의 방법을 이용하여 혈액내 환원형 글루타티온(glutathione, GSH)의 함량을 측정하였다. 혈장에 동량의 5% sulfosalicylic acid를 첨가하고 4℃, 2,000 × g에서 10분간 원심 분리를 하였다. 상징액 100 ㎕에 0.3 mM Na₂HPO₄ 800 ㎕와 0.1% sodium citrate에 0.04%가 되도록 5,5'-dithiobis 2-nitrobenzoic acid(DTNB)을 섞은 용액 100 ㎕를 첨가하고 5분 후 412 nm에서 흡광도를 측정하였으며 환원형 글루타티온을 표준물질로 하여 정량하였다.

대조군의 혈장 내 GSH 함량이 253.3±52.1 μmol/ml, 간내 GSH 함량이 4.6±0.9 mmol/g인데 반하여, 녹용 비발효 추출물의 혈장내 GSH 함량은 192.4±49.7μmol/ml, 간내 GSH 함량은 3.8±0.8 mmol/g으로 대조군보다 GSH 함량이 모두 낮았다. 그러나 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 경우 혈장 내 GSH 함량이 393.7±60.6 μmol/ml, 간내 GSH 함량이 11.1±1.9 mmol/g로 녹용 비발효 추출물 투여군(NF)은 물론 대조군(NC)보다도 훨씬 증가한 것이 확인되었다(표 12). 이는 녹용을 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효 시, GSH 함량 증가능이 현저히 상승한다는 것을 의미한다.

Group	GSH
	Serum (μmol/ml)	Liver (mmol/g)
NC	253.3±52.1bcd	4.6±0.9c
NF	192.4±49.7d	3.8±0.8c
FC	393.7±60.6ab	11.1±1.9a

<실시예 4> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 성장촉진 기능

<실험예 1> 재료 및 방법

세포 배양

MC3T3-E1 세포배양에 사용한 α-MEM(α-modified eagle’s medium), FBS(fetal bovine serum)는 Gibco BRL (Life Technologies, Gibco BRL, Gaitherberg, MD) 제품을 사용하였다. 그 외 b-glycerophosphate disodium salt hydrate (b-GP; G9891), L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate (L-AA; A8960), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 및 Alizarin red S는 Sigma Chemical Co. (MO, U.S.A)에서 구입하여 사용하였다. 양성대조군(positive control, PC)으로 시용한 초유(100%)는 Fonterra Co-op Group Ltd. (Hautapu, New Zealand) 제품을 구입하여 사용하였다. 세포 배양용 용기와 기구는 Corning(Corning, NY, USA)과 Falcon(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) 제품을 사용하였고 세포의 RNA는 TRIzol LS reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 cDNA 합성에는 SuperScript^?Ⅲ Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 사용하였다.

MC3T3 - E1 세포배양

MC3T3-E1[subclone 4; CRL-2593] 세포는 ATCC로부터 분양 받아 실험실에서 배양하면서 사용하였다. MC3T3-E1 세포는 10% FBS를 함유하는 α-MEM 배지(a-MEM containing 10% FBS, 10 mM b-GP, and 50 ㎍/ml L-AA)를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하고 배지는 3일마다 교환하였다.

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 녹용 발효물의 제조

본 실험에 사용한 녹용은 광동제약으로부터 한약규격집 기준에 적합한 원료를 제공 받아 녹용의 분골, 상대, 중대, 하대를 마쇄기로 분쇄하여 혼합 후 사용하였다. 녹용 발효물은 녹용 분말 40 g을 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 300 ml에 넣고 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 접종한 후 25-30℃에서 7일간 발효시킨 것을 시료로 하였으며 녹용 비발효물은 동일한 농도의 발효시키지 않은 녹용 분말액을 시료로 하였다. 각각 시료에 300 ml의 물을 가하고 100℃에서 3시간 동안 환류 추출한 후 8,000 × g에서 20분간 원심분리한 상징액을 회수하였다. 이러한 과정을 2회 반복하여 회수한 추출물을 농축하여 농축액 100 ml(7.5 brix)을 얻었으며 이를 각각 발효 녹용 추출액과 비발효 녹용 추출액으로 하였다.　　　　

실험 동물

　　실험 동물은 나라 바이오텍(Seoul, Korea)에서 공급받은 3주령의 웅성 Sprague-Dawley(SD) 계열 흰쥐(60 ± 10 g)를 이용하였다. 실험 동물은 사육케이지(42 × 28 cm)을 이용해 실험실 온도 22-24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기(12시간 light/ 12시간 dark)가 자동 조절 장치에 의해 조절되는 고려대학교 동물실에서 1주간 예비 사육 후 2주 동안 본 연구를 위해 사육되었다.

그룹 설정

　　연구 그룹은 무작위 추출법에 의해 군당 6마리씩 5개군으로 분류하였다. 시료 처치군은 비발효 녹용 추출물 투여군(NF)과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)으로 분류하였다(표 13). 시료는 매일 일정한 시간에 존대를 이용해 경구로 투여하였으며 전 실험 기간 동안 물과 AIN-93 기본식이(Samyang Co., Seoul, Korea)는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 식이 섭취량은 주 2회, 체중은 주 1회 측정하였으며 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 측정된 식이 섭취량에 대한 체중증가량으로 계산하였다.

Experiment groups			Administrated sample
대조군		Control	Saline
실험군	비발효 녹용 투여군	NF	비발효 녹용 추출물 100 mg/kg BW
	발효녹용 투여군	FC	코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 100 mg/kg BW
	양성 대조군	PF-300	Foremilk 300 mg/kg BW
		PYH-300	효모 가수분해물 300 mg/kg BW

통계 분석

실험 결과는 SPSS ver 13.0(SPSS Inc., IL, USA)을 이용하여 통계 처리하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(mean)과 평균의 표준오차(standard error of the mean, SEM)를 산출하였다. 실험군간의 유의성은 ANOVA test 후 구체적인 사후 검증은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 실시하였다.

<실험예 2> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 골아세포에 미치는 영향

골아세포 증식유도 측정

시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 성장 정도는 Telloesson등 (Tollefson AE, Ryerse JS, Scaria A, Hermiston TW, Wold WSM. 1996. The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: Characterization of cells infected with ADP mutants. Virology 220: 152-162)의 방법에 따라 MTT 시약의 환원정도를 측정하는 MTT assay로 측정하였다. 먼저 배양한 세포를 2×105 cells/well로 조정하여 분주한 다음 각 시료(비발효 녹용 추출물(NFA) 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 발효물(FA))를 최종농도 10, 25, 50, 및 100 μg/mL 되게 첨가한 후 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 대조군은 시료 대신 배지를 동량 첨가하여 동일하게 배양하였다.

배양 후 MTT 시약을 1 mg/ml 농도가 되도록 각 well에 첨가하여 4시간 더 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 DMSO를 100 ㎕씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시켜 ELISA reader (Spectra MAX 340 pc, Molecular Device, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다(식 1).

<식 1>

골아세포 증식 (%)=(시료처리군의 흡광도-blank의 흡광도)/(대조군의 흡광도-blank의 흡광도)×100

MTT 분석을 통해 살아있는 세포수를 측정하여, 녹용 추출물(NFA), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물(FA) 및 양성 대조군인 초유(PC)가 MC3T3-E1 골아세포의 증식에 미치는 영향을 확인하였다(도 3).

그 결과, 초유 100 mg/mL을 첨가하여 배양시(PC) 세포 증식이 135.8%까지 증가한데 반하여, 녹용 추출물(NFA) 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물(FA)을 각각 10, 25, 50, 100 mg/mL 첨가하여 배양 시, 녹용 발효물 첨가군이 녹용추출물에 비하여 골아세포 증식이 높은 것을 알 수 있었다. 동일한 농도인 100 mg/mL에 초유(PC) 첨가군과 비교해보면 녹용 추출물(NFA)은 117.0%인 반면, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물(FA)은 137.8%로 PC와 유사한 증식율을 보였다. 녹용 추출물에 비하여 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물에 의하여 골아세포 증식율이 증가한 것은 녹용이 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효 시 세포증식에 필요한 영양성분이 골아세포가 이용하기 쉬운 형태로 전환되었기 때문으로 보인다.

<실험예 3> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 식이섭취량, 체중증가량 및 식이효율에 미치는 영향

발효녹용에 대한 성장 촉진 효과 측정을 경구 투여 시 각 식이섭취, 체중증가량 및 식이효율의 측정 결과(표 14), 식이섭취량은 양성 대조군인 효모가수분해물 300 mg 경구 투여군인 PYH-300군이 가장 높은 섭취량을 보였으며, 식이 효율 역시 섭취량이 높았던 군이 비교적 높았으나 음성 대조군(control)을 제외하고 녹용 비발효 추출물 투여군(NF), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC), 양성대조군(PF-300 및 PYH-300)군 사이에 식이효율에는 유의적인 차이가 없었다. 체중 증가량 역시 음성대조군에 비하여 녹용 발효/비발효 투여균과 양성대조군에서 체중 증가량이 높았으나, 녹용 발효/비발효 투여균과 양성대조군 사이에는 유의적인 차이가 없었다.

Group	Diet intake (g/day)	Weight gain (g/day)	FER
Control	15.1±0.00h	2.34±0.06c	0.62±0.03b
NF	18.1±0.04e	3.27±0.52b	0.72±0.08a
FC	18.0±0.00f	3.72±0.13ab	0.75±0.05a
PF-300	18.8±0.00c	3.78±0.18ab	0.71±0.06a
PYH-300	19.4±0.25a	3.87±0.35a	0.73±0.03a

녹용 비발효물 및 발효물이 SD 래트의 식이 섭취량, 체중 증가 및 식이효율에 미치는 영향

FER, food efficiency ratio = body weight (g/24 day)/food intake (g/21day).

<실험예 4> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 성장 호르몬(GF), IGF-1, ALP 및 BALP에 미치는 영향

성장 호르몬( Growth Hormone )

상기 표 13의 실험군들을 SD 래트들에 각각 경구 투여하고 ELISA법을 이용하여 혈장 내 성장 호르몬의 양을 mouse/rat growth hormone kit(Shibayagi)로 측정하였다. 그 결과, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)은 녹용 비발효 추출물 투여군(NF) 및 음성 대조군(control)에 비하여 혈중 성장 호르몬 양이 2 ~3 배 정도 증가한 것이 확인되었다(표 15).

Insulin - like growth factor -1( IGF -1)

표 13의 실험군들을 투여 후, 혈장 내 IGF-1은 ELISA법을 이용하여 mouse/rat IGF-1 kit(Shibayagi, Gunma, Japan)로 측정하였다. 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)은 녹용 비발효 추출물 투여군(NF), 양성대조군인 PYH-300군보다 혈중 IGF-1 함량이 높았으며, 양성 대조군인 PF-300군과 비슷한 수준이었다(표 15).

ALP 및 BALP

혈장 50 ㎕에 0.5% wheat germ agglutin(Sigma, St. Louis, USA) 용액 50 ㎕를 첨가한 뒤 37℃에서 30분간 반응시키고 다시 2% triton-X 용액을 5 ㎕ 첨가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 3,000 × g에서 4분간 원심 분리 한 후 상징액을 취해 상징액과 혈장내의 alkaine phosphatase(ALP)를 혈액 자동 분석기인 FUJI DRI-CHEM 3500으로 측정하였다.

BALP의 측정은 Rosalki와 Foo(1984)의 방법을 이용하여 실시하였으며, 앞서 FUJI DRI-CHEM 3500으로 측정한 혈장 내 ALP 값에서, 상징액의 ALP 값을 뺀 값을 BALP로 하였다.

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)은 녹용 비발효 추출물 투여군(NF) 및 음성 대조군(control)보다 혈중 ALP 함량 및 BALP 함량이 높았다. 그러므로 녹용을 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효함으로써, 혈중 ALP, BALP 증가 활성이 향상되는 것으로 판단되었다(표 15).

Group	GH (ng/ml)	IGF (ng/mLl)	ALP (U/L)	BALP (U/L)
Control	14.2±4.5	360.0±22.0	577.5±127.7	458.3±159.9
NF	7.6±3.5	464.0±29.1	683.8±30.8	575.8±27.5
FC	24.1±8.0	535.2±58.8	832.2±123.3	678.3±107.4
PF-300	23.6±7.8	532.7±75.4	1149.3±352.2	884.7±218
PYH-300	23.9±7.6	510.3±75.1	763.8±198.7	624.8±174.8

<실험예 5> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여 시 경골 길이 및 성장판 증식 검토

실험 전과 실험 종료 직후의 경골 및 경골 성장판의 길이(도 4)는 ethyl ether로 마취시켜 X-ray mammography system(GE Senographe 500t, GE Medical Systems, France)로 증감지(minR-2, Kodak, USA)와 필름(CM-H for mammography, Konica, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 촬영시 관전압은 32 kVp, 관전류는 32 mAs으로 하였으며 plateform과의 거리는 25 cm였고 15초간 노출하여 촬영하였다. 촬영된 필름은 현상기(QX-130Ⅱ, Konica)로 현상액 31°C, 정착액 29°C에서 현상하고 필름을 Vidar VXR-12 film digitizer(Vidar Systems Co., USA; Resolution 570 dpi, Depth 12)로 스캔하였다. 스캔된 영상은 Image J 프로그램(National Institute of Health, MD, USA)을 이용하여 경골과 경골 성장판의 중앙, 좌, 우 세 부위의 profile curve를 구하고 반치폭의 픽셀수로부터 길이를 계산하였다.

표 13의 실험군들을 SD 래트에 경구투여한 후 성장판의 길이와 경골의 길이를 측정하였다. 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(FC)은 음성대조군, 비발효 녹용 추출물 투여군 및 양성대조군(PF-300, PYH-300) 모두에 비하여 성장판 증가량이 상당히 높았다. 한편, 경골 길이의 경우, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군은 음성대조군 및 비발효 녹용추출물보다 경골이 다소 길어진 것으로 확인되었다.

Group	Increase of tibia length (mm)	Increase growth plate length (mm)
Control	7.78±0.11	0.57±0.02
NF	7.81±0.22	0.68±0.11
FC	8.25±0.32	0.75±0.22
PF-300	7.64±0.72	0.62±0.16
PYH-300	8.10±0.40	0.71±0.09

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조성물은 라디칼 소거능 등 항산화 활성 및 성장촉진 효과가 뛰어난바, 이를 포함하는 식품 조성물, 화장품, 의약은 노화 등 항산화 관련 현상, 질환 등에 유용하며, 성장기 어린이의 성장촉진에도 유용하다.

한국생명공학연구원 KCTC11455 20090116

Claims (6)

1. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장촉진용 식품 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 식품은 건강기능식품, 건강 보조식품, 기능성식품 또는 영양제인 것을 특징으로 하는 성장촉진용 식품 조성물.
   
3. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장촉진용 약학적 조성물.
   
4. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
   상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 성장촉진용 식품 조성물의 제조방법.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 식품은 건강기능식품, 건강 보조식품, 기능성식품 또는 영양제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
6. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
   상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 성장촉진용 약학적 조성물의 제조방법.
   

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