KR101183673B1 - 아멘토플라본의 항암제 혹은 항염제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이플라보노이드(biflavonoid)의 일종인 아멘토플라본 (8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo- 4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-chromen-4-one)의 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마 (Peroxisome proliferator activated-receptor γ, PPARγ) 활성화를 통한 항암제 혹은 항염제로서의 용도에 관한 것이다.

플라보노이드, 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마, 항암제, 항염제

Description

아멘토플라본의 항암제 혹은 항염제로서의 용도{A use of amentoflavone (8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-di-hydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-chromen-4-one) as carcinostatis substance or antiphlogistics}

본 발명은 biflavonoid의 일종인 아멘토플라본 (8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo- 4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-phenyl)-chromen-4-one)의 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마 (Peroxisome proliferator activated-receptor γ, PPARγ) 활성화를 통한 항암제 혹은 항염제로서의 용도에 관한 것이다.

1. 페록시솜 증식 촉진 수용체 (Peroxisome proliferator activated-receptor, PPAR)

페록시솜 증식 촉진 수용체 (Peroxisome proliferator activated-receptor, PPAR)는 핵수용체 (nuclear receptor) 계열에 속하는 단백질로 리간드 (ligand)에 의해 활성화 되어 전사를 조절하는 인자 (transcription factor)로 유전자 발현 및 지질의 항상성 (homeostasis)에 관여한다. PPAR은 총 α, δ, γ의 3종의 서브패밀 리가 존재한다. PPARα는 주로 간장, 신장, 심장, 소장 등에 발현하여 효소 발현 및 지질대사에 관여하며 PPARδ의 경우 다양한 조직에 보편적으로 발현하여 골격근이나 지방조직에서 지방산 대사를 조절하며 피부의 상피세포 등에서는 세포의 분화촉진을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 표적단백질인 PPARγ의 경우 대부분 지방세포에 존재하며 간, 소장 등에도 소량 발현되어 있는 것을 확인할 수 있다.

PPARγ는 지방세포에 존재하고 있으므로 지방의 대사에 관여하며 따라서 비만, 당뇨, 그리고 염증 등의 대사성 질환을 조절하는 중요한 단백질이다. 최근 보고에 의하면 PPARγ는 대장암이나 기타 암에서 종양억제인자 (tumor suppressor) 및 항염인자 (anti-inflammation factor)로 작용한다고 알려져 있다 (Sato, H. et al., Br. J. Cancer. 2000, 83, 394-400; Shimada, T. et al ., Gut. 2002, 50, 658-664;Chen, G.G. et al ., Life Sci. 2002, 70, 2631-2646; Dubuquoy, L. et al ., Gut. 2006, 55, 1341-1349; Wang, W. et al ., Mediators Inflamm. 2007, 2007, 62641-62647).

이들 PPARs은 공통적으로 DNA 결합 도메인 (DNA-binding domain, DBD)과 C-말단 부근에 리간드 결합 도메인 (Ligand binding domain, LBD)을 가지고 있으며 세 subfamily의 DBD 및 LBD는 각각 80% 및 70% 정도의 아미노산 서열 유사성을 가지고 있다(도 1).

일반적으로 PPARs의 리간드 혹은 활성촉진제 (activator)는 LBD에 결합함으로써 PPARs의 활성을 촉진한다.

2. 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마 ( PPAR γ)의 항암, 항염 효과

일반적으로 PPARγ에 활성촉진제 (activator)가 결합함으로써 파트너 단백질과의 결합력이 증가하며 이들의 결합력이 증가함으로써 종양억제유전자 (tumor suppressor gene)인 PTEN (phosphatase and tensin homolog) 단백질의 발현량을 증가 시키며 상대적으로 종양생성인자인 tumor growth factor β1 (TGFβ1)의 발현을 감소시켜 종양의 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다(도 2)(Bren-Mattison, Y. et al., Mol. Pharmacol. 2008, 73, 709-717; Keshamouni, V.G. et al ., PPAR Res. 2007, 2007, 90289-90298)

또한 PPARγ의 활성 촉진은 항암효과 이외에도 여러 가지 생리학적 대사경로 (physiologic pathway)에 관련되어 있으며 대표적인 현상이 항염효과이다.

최근 E. coli 독소에서 추출된 Lipopolysaccharide (LPS), 염증반응에 대표적인 사이토카인인 tumor-necrosis factor (TNF) 및 interleukin 등은 macrophage, fibroblast, dendritic cell, lymphocyte 등의 세포의 핵에서 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성화를 유도하여 각종 염증성 cytokine의 분비를 촉진하게 되며 이때 PPARα 및 PPARγ는 NF-κB 대사경로를 저지하여 항염증작용을 나타나게 된다. 또한 대식세포 (macrophage)의 지질 대사산물인 oxidized linoleic acid, HODE 등과 같은 다른 부산물들이 PPARγ 등의 활성을 유도함으로써 항염증작용을 일으키기도 한다고 알려져 있다 (Sung, B. et al ., Exp. Gerontol. 2006, 41, 590-599; audszus, A. et al ., J. Nutr. 2008, 138, 1336-1342).

2002년 미국 매사추세츠 주의 Dana-Farber Cancer Institute의 Fuchs 박사그룹은 기존 PPARγ 활성촉진제이며 당뇨병 및 항염증 치료제로 알려진 Troglitazone이 전이된 결장암의 활성을 저해하여 항암효과를 나타냄을 발견하였다 (Cancer J. 2002, 8, 395-399). 2004년 Yoshikawa 그룹은 PPARγ의 활성촉진제로서의 당뇨병 치료제인 Thiazolidinediones 류의 물질들은 당뇨조절 효과 뿐 아니라 항염효과를 가져 NF-κB의 활성을 저해하여 항염증 반응을 나타낸다는 사실을 밝혔으며 이를 Drugs of Today에 개제하였다 ( Drugs of Today, 2004, 40, 423).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 항생제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아멘토플라본(8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4- hydroxy-phenyl)-chromen-4-one)을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 아멘토플라본 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사 용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 암 관련 질환은 전립선암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 위암, 간암, 폐암 등의 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 염증질환에 관련해서는 발병 원인의 구분상 변질성 염증, 삼출성 염증 (장액성 염증, 섬유소성 염증, 화농성 염증, 출혈성 염증, 부패성 염증, 카타르성 염증), 증식성 염증, 특이성 염증 (결핵증, 매독, 나병, 방선균증, 비저(鼻疽)) 등의 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 화합물은 천연 물질로부터 분리하거나 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있으며,

본 발명의 일 구체예에서는 실시예 1에 기재된 것과 같이 데이터베이스에서 컴퓨터를 이용하여 가상신약탐색을 수행한 후 해당업체에서 구입하였다.

본 발명의 약학 조성물은 안정하고 효과적인 조성물을 만들기 위해 당업자에 의해 사용되는 통상적인 절차에 따라 제조된다. 그러한 방법은, 혼합, 교반, 현탁, 분산, 유화, 용해 등에 의한, 약학 보조제, 예컨대 담체, 희석제, 용매 또는 부형제가 있거나 내에 있는 활성 화합물 및 비경구, 경구, 비내, 협측 또는 직장 투여 등을 위해 약학적으로 적당한 형태로 성분을 처리하는 단계를 포함한다. 고체, 액체, 비경구 제형에 있어서, 활성 화합물 또는 활성 성분의 유효량은 목적하는 결과를 도출하는 임의의 양이다.

제형은 당 업계에 인식된 임의의 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 화합물과 나머지 성분들을 혼합하여 조제될 것이다. 고체 경구용 제형을 제조하는데 사용되는 나머지 성분들은 통상적으로 불활성인 성분들, 예컨대 미정질 셀룰로스, 메틸 셀룰로스 등, 필요하다면 이의 적당한 감미료, 착색제 및/또는 착향료, 및 보존제를 포함할 것이다. 현탁액의 제조에 적당한 상기 고체 경구용 제형 또는 건식 조제물은 이들이 본 발명의 화합물의 효과적인 투여량을 함유하도록 조제될 것이다. 통상적으로는, 본 발명의 화합물 100 mg ～ 1500 mg을 함유하는 고체 제형을 고려한다. 경구 현탁액에 적당한 제제는 유사한 투여량을 함유해야한다.

본 발명의 약학 조성물은, 예를 들어 정제 바인더, 충진제, 보존제, 정제 붕해제, 유동성 조절제, 가소제, 습윤제, 분산제, 유화제, 용매, pH 변화 첨가제, 착향제 등과 같은 약학에 통상 사용되는 보조제 및 첨가제와 함께 조제될 수 있다.

두번째로 바람직한 방법은 비경구적인 근육 내, 정맥 내 또는 피하 투여이 다.

본 발명의 약학 조성물이 주사가능한 제제로 조제되는 경우, 용액 또는 현탁액의 형태로 약학 조성물을 조제할 때, 시중에 사용되는 모든 희석제를 사용할 수 있다. 적당한 희석제의 예로는 물, 에틸 알콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르가 있다. 염화나트륨, 포도당 또는 글리세롤은 치료제로 혼입될 수 있다. 주사가능한 제제 중 활성 성분의 농도는 0.1 mg/㎖ ～100 mg/㎖의 범위인 것이 바람직하다.

상기 제시된 일반적인 제형 이외에도, 본 발명의 화합물은 또한 제어된 방출 수단 및/또는 전달 장치 등은 미국 특허 번호 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123 및 4,008,719에 기술된 것에 의해 투여될 수 있다.

총 1일 투여량의 범위는 통상 약 10 mg～약 5000 mg의 본 발명의 화합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 약 100 mg～ 약 3000 mg(총 1일 투여량 범위)이다. 하지만, 투여량은 환자의 요구 및 병태에 따라 많아지거나 적어질 수 있다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 신규한 화합물 및 그 화합물의 용도에 관한 것으로 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진함으로써 항암 및 항염제로 개발한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 전사인자인 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진함으로써 종양억제인자의 발현 촉진 및 염증촉진인자의 발현억제기작을 통해 항암 및 항염증 효과를 유도하기 위하여 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하고 항암 및 항염증 활성을 가지는 물질을 찾기 위해 천연물인 플라보노이드 라이브러리를 구축하고 가상신약탐색을 수행하였으며 형광실험과 항암, 항염증 활성 측정을 통해 효과적인 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과 아멘토플라본 (amentoflavone, 8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4- hydroxy-phenyl)-chromen-4-one)이 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성 촉진을 통해 항암 및 항염증활성을 나타내는 것을 확인하였으며 이로써 이 발명을 완성하였다.

상기에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성촉진제이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 궁극적으로 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성을 촉진하는 플라보노이드를 이용하여 종양억제인자의 발현 및 염증촉진인자 억제제로 활용하는 것이다.

이하 본 발명을 하기한 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정하는 것은 아니다.

제조예: 아멘토플라본, 8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy- phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4- hydroxy - phenyl )- chromen -4- one )의 제조

본 발명의 아멘토플라본 화합물은 씨그마알드리치코리아(유)에서 구입하였다.

실시예 1: 단백질-기반 활성골격을 이용한 가상신약탐색의 효율성

활성골격 (Pharmacophore)라는 것은 약물 (리간드)이 표적 질병 혹은 표적 단백질에 대해 효능을 나타내기 위해 필수적으로 가져야 할 화학적 그룹 (혹은 특징)의 3차원 배열이다. 특히, 어떤 화합물이 단백질과 잘 결합하여 그 단백질의 활성을 증가 혹은 저해시키기 위해서는 활성골격의 정의가 매우 중요하다. 활성골격은 수소결합 주개 (HBA), 수소결합 받개 (HBD), 그리고 소수성 자리 (Lipo)라는 일종의 요소 (feature)로 구성되며 이들을 적절하게 조합하여 하나의 지도 (map) 형태로 표현된다.

페록시솜 증식 촉진 수용체 감마에 대한 단백질-기반 활성골격을 이용한 가상신약탐색 (receptor-oriented pharmacophore based in silico screening)은 알려진 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 3차원 구조에서 리간드가 결합하는 활성자리 (active site)를 찾아내고 활성자리 중심에서 9Å 주변을 정의하였다. 특이적으로 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 allosteric site를 표적으로 하여 가상신약탐색을 수행하였으며 이 영역에 대해 활성골격 지도를 완성하는데 이때, 하나의 지도에는 3-4개의 요소들이 포함되도록 하였다. 이 활성골격 지도를 이용하여 구축해 놓은 화합물 라이브러리를 검색하여 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마 촉진제로서 가능성이 있는 물질을 선정하였다. 가상신약탐색을 위한 라이브러리는 Accelrys 사 의 Catalyst/CatDB 의 형태로 구성하였으며 화합물은 3차원 구조의 multiple conformmation을 찾아내어 화학적으로 가능한 모든 conformer를 포함할 수 있도록 parameter를 잘 조절하였다. 현재 약 200만개의 화합물 라이브러리를 구축하였다.

본 발명의 Accelrys 사의 Cerius2/SBF 모듈을 이용하여 진행하였으며 하나의 지도를 이용하여 최종적으로 후보물질 2종을 선정하였다 (도 4).

실시예 2: 형광분광법을 이용한 해리상수의 계산

5μM의 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마를 10mM Tris, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10mM 베타-mercapto-ethanol에 녹이고 단백질과 저해제의 농도의 최종 농도가 1:10이 될 때까지 저해제를 소량씩 첨가하면서 농도와 형광세기를 기록하였다. 다음과 같은 식을 이용하여 해리상수 K_d를 계산하였다.

상기 식에서 F₀와 F는 각각 저해제가 있을 때와 없을 때 330nm에서 검출된 형광신호의 세기이고 n은 단백질에서의 저해제 수이다.

실시결과 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마에 대한 아멘토플라본의 해리상수는 13 nM이다. 실험결과는 도 5에 나타내었다. 대조화합물로 대표적인 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마 활성촉진제인 indomethacin을 사용하였으며 indomethacin의 해리상수는 82.8μM이다.

실시예 3: 아멘토플라본의 독성

인간의 상피세포 (keratinocyte)에서 추출한 HacaT 세포에 대한 MTT assay에 의한 아멘토플라본의 세포증식억제활성 (growth inhibition activity)을 측정하여 아멘토플라본의 독성을 검증하였다.

실시예 4: 여러 가지 암세포에서의 항암활성 규명

세포의 농도가 균일한 조건에서 항암물질이 들어있지 않은 대조군 상태의 플레이트와 항생물질이 첨가된 플레이트에서 세포의 성장 정도를 판별하는 것으로 측정가능 하며 최소한 3번의 반복실험을 통해 결과를 종합하였다.

실험에 사용한 세포군은 대표적인 유방암세포 (MCF-7, MDA-MB-231), 전립선 암세포 (PC3), 폐암세포 (A549), 자궁암세포 (Hela)에 대해서도 조사하였다. 결과 대조를 위해 indomethacin을 대조물질로 이용하였다.

항암활성 측정 결과 아멘토플라본은은 유방암 세포군인 MCF-7에서 IC₅₀이 25μM, 자궁암 세포군인 Hela cell에서 IC₅₀ 25μM의 항암효과를 나타냈다. 실험결과는 도 6에 나타내었다.

실시예 5: 아멘토플라본의 항염활성 규명

Pro-inflammatory cytokine인 TNF-알파(tumor necrosis factor-α)와 IL-1 β(interleukin-1β)등의 유전자 발현 억제활성을 sandwich-ELISA를 이용하여 항염활성을 측정하였다. 이들 실험에서 대조군으로서 항염활성을 가지는 것으로 잘 알려진 펩타이드 LL-37을 사용하여 아멘토플라본의 항염활성 정도를 비교하였으며 이를 도 7에 나타내었다.(Frohm, M. et al ., J. Biol. Chem. 1997, 272, 15258-15263; Yu, J. et al., J. Immunol. 2007, 179, 7684-7691)

도 1은 PPARs의 구조를 나타낸 그림;

도 2는 PPARγ의 항암 작용에 대한 모식도를 나타낸 것;

도 3은 Troglitazone과 Thiazolidinediones 류의 물질의 구조를 나타낸 그림;

도 4은 가상신약탐색에서 선정된 이용된 2종의 후보물질군 구조이며;

도 5은 형광분광법을 이용한 해리상수를 계산한 것으로, 아멘토플라본의 해리상수 K _d = 13 nM이었다.;

도 6은 다양한 암세포에서의 항암효과 측정 결과를 나타낸 그림이다. 그림에서 indomethacin은 대조화합물로 사용하였다.

도 7은 TNF-알파의 유전자 발현 억제를 통한 항염활성을 sandwich-ELISA를 이용하여 측정한 결과이다. 대조화합물로는 LL-37을 사용하였다.

Claims (9)

1. 아멘토플라본(8-[5-(5,7-Dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-2-hydroxy-phenyl]-5,7-dihydroxy-2-(4- hydroxy-phenyl)-chromen-4-one) 화합물을 인 비트로에서 페록시솜 증식 촉진 수용체 감마의 활성 촉진물질로 사용하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

Images