KR101136887B1 - 표적 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

표적 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 검출 방법을 제공한다. 상기 표적 핵산 검출 방법은 제1 마이크로 채널 및 제2 마이크로 채널을 구비하는 챔버, 상기 챔버의 일측에 배치되어 상기 제1 마이크로 채널에 연결된 표적 핵산 주입구 및 제1 탐침 주입구, 및 상기 제1 마이크로 채널과 상기 제2 마이크로 채널 사이에 연결된 제2 탐침 주입구를 구비하는 표적 핵산 검출 장치를 제공하는 단계, 상기 표적 핵산 주입구 및 상기 제1 탐침 주입구의 각각을 통해 표적 핵산 및 제1 탐침이 주입되고, 제1 마이크로 채널에서 혼성화되어 상기 표적 핵산의 일측 단부에 제1 탐침이 결합된 제1 복합체를 형성하는 단계, 상기 제1 복합체가 상기 제2 마이크로 채널로 이동되는 단계, 및 상기 제2 탐침 주입구를 통해 제2 탐침이 주입되고, 상기 제1 마이크로 채널로부터 이동된 상기 제1 복합체와 상기 제2 탐침이 혼성화되어, 상기 표적 핵산의 타측 단부에 상기 제2 탐침이 결합되는 제2 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
표적 핵산 검출 장치, 표적 핵산 검출 방법, 탐침 DNA, QD, 폴리머 비드

Description

표적 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 검출 방법{Target nucleic acid detecting system and method for detecting of target nucleic acid using the same}
본 발명은 표적 핵산 검출 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표적 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
광학적 장치를 통해 표적 핵산을 검출하기 위해 표적 핵산을 탐침 DNA와 혼성화 반응하는 과정 중에 상기 표적 핵산의 표면에 형광 염료를 표지하여 사용하였다. 이때, 형광 염료로서 FITC 또는 Cy3와 같은 유기 염료가 주로 사용되었는데, 이러한 유기 염료는 빛에 노출되는 경우, 광표백(photobleaching) 현상에 의해 형광 지속 능력이 매우 감소되고, 형광 세기가 약해지는 문제점이 있다.
게다가, 이러한 유기 염료는 여기(excitation) 파장이 좁아서 형광물질을 여기시키기 위해 특정 파장 범위의 빛을 방출하는 광원을 필요로 하므로, 단파장의 광원으로는 복수의 유기 형광 염료가 표지된 복수의 표적 핵산을 검출하는 데에 어려움이 있을 수 있다.
또한, 표적 핵산 검출을 위한 DNA 혼성화 실험에서 사용되는 표적 핵산의 길 이는 수십, 수백, 수천 베이스로 다양할 수 있는데, 표적 핵산의 길이가 길수록, 혼성화를 위해 단일 가닥으로 변성하는 것이 어렵고, 변성 후에도 단일 가닥으로 유지하는 것이 어렵다. 그러나, 종래에는 DNA를 혼성화하는 과정 중에 가닥이 뭉치거나, 이중가닥을 형성하는 등의 문제 발생될 수 있으므로, 탐침 DNA와 혼성화되기 위한 상보적 유전자 영역을 인지하기 어렵게 만든다. 따라서, 검출된 표적 핵산의 신뢰성이 저하될 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 여기 파장이 넓고, 빛에 노출되어도 형광 지속성이 유지될 수 있는 물질을 이용하여, 복수의 표적 핵산 검출을 가능하게 하는 표적 핵산 검출 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 DNA들의 혼성화 반응시 뭉침 현상을 방지하여, 표적 핵산 검출의 신뢰성을 향상시킬 수 있는 표적 핵산 검출 장치를 제공함에 있다.
본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 이루기 위하여 본 발명의 일 측면은 표적 핵산 검출 장치를 제공한다. 상기 표적 핵산 검출 장치는 제1 마이크로 채널 및 제2 마이크로 채널을 구비하는 챔버, 상기 챔버의 일측에 배치되어 상기 제1 마이크로 채널에 연결된 표적 핵산 주입구 및 제1 탐침 주입구, 및 상기 제1 마이크로 채널과 상기 제2 마이크로 채널 사이에 연결된 제2 탐침 주입구를 포함한다.
상기 표적 핵산 검출 장치는 상기 챔버의 타측에 배치되어 상기 제2 마이크로 채널에 연결된 검출장치를 더 포함할 수 있다. 상기 검출장치는 유세포 분석기, 광학 현미경, 형광 분광기 또는 휴대용 옵틱 파이버 장치일 수 있다. 상기 챔 버는 항온 챔버일 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위하여 본 발명의 다른 측면은 표적 핵산 검출 방법을 제공한다. 상기 표적 핵산 검출 방법은 제1 마이크로 채널 및 제2 마이크로 채널을 구비하는 챔버, 상기 챔버의 일측에 배치되어 상기 제1 마이크로 채널에 연결된 표적 핵산 주입구 및 제1 탐침 주입구, 및 상기 제1 마이크로 채널과 상기 제2 마이크로 채널 사이에 연결된 제2 탐침 주입구를 구비하는 표적 핵산 검출 장치를 제공하는 단계, 상기 표적 핵산 주입구 및 상기 제1 탐침 주입구의 각각을 통해 표적 핵산 및 제1 탐침이 주입되고, 제1 마이크로 채널에서 혼성화되어 상기 표적 핵산의 일측 단부에 제1 탐침이 결합된 제1 복합체를 형성하는 단계, 상기 제1 복합체가 상기 제2 마이크로 채널로 이동되는 단계, 및 상기 제2 탐침 주입구를 통해 제2 탐침이 주입되고, 상기 제1 마이크로 채널로부터 이동된 상기 제1 복합체와 상기 제2 탐침이 혼성화되어, 상기 표적 핵산의 타측 단부에 상기 제2 탐침이 결합되는 제2 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 표적 핵산 검출 방법은 상기 제2 복합체를 형성하는 단계 이후에, 상기 제2 복합체로부터 표적 핵산을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제1 탐침의 합성방법은 5' 말단에 카르복시기로 개질된 폴리머 비드와, 말단에 아민기가 결합된 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 제공되는 단계, 및 상기 폴리머 비드의 카르복실기와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 아민기를 펩티드 결합시켜 제1 탐침을 합성시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 탐침의 합성방법은 표면에 스트렙타비딘으로 개질된 QD와 3' 말단에 바이오틴이 결합된 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 제공되는 단계, 및 상기 QD의 스트렙타비딘와 상기 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 바이오틴을 커플링시켜 제2 탐침을 합성시키는 단계를 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이 넓은 파장대의 여기 파장대를 가지고 있고, 높은 형광 지속성 가지는 무기형광물질의 QD를 사용함으로써 복수의 표적 핵산 검출을 가능하게 한다.
또한, 표적 핵산 검출 장치로서, 혼성화 반응이 수행되는 마이크로 채널을 지그재그 형상의 채널로 구성함으로써 뭉침 현상이 방지되고, 표적 핵산이 단일가닥으로 형성될 수 있게 한다. 또한, 상기 마이크로 채널들을 주입구들과 분리되도록 구성함으로써 마이크로 채널들의 직경을 변화시킬 수 있고, 이에 따라, 상기 마이크로 채널 내에서의 표적 핵산과 탐침들의 유속을 조절할 수 있다. 이에 더하여, 상기 마이크로 채널을 구비하는 챔버를 항온 챔버로 구성함으로써 온도 또한 조절될 수 있다. 따라서, 뭉침현상이 더욱 더 방지될 수 있고, 표적 핵산 검출의 신뢰성이 더욱 향상될 수 있다.
이에 더하여, 발명의 일 실시예에 따른 표적 핵산 검출 장치는 상술한 바와 같이, 표적 핵산 주입구, 제1 탐침 주입구 및 제2 탐침 주입구, 제1 마이크로 채널 및 제2 마이크로 채널을 구비하는 챔버, 및 검출기를 구비하여, 본 장치 내에서 상기 제2 복합체의 합성 및 검출이 연속적으로 이루어지므로, 분석시간이 단축되고, 분석의 신뢰성이 향상될 수 있다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면들에 있어서, 층 및 영역들의 두께는 명확성을 기하기 위하여 과장된 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 핵산 검출 장치를 나타내는 모식도이다.
도 1을 참조하면, 상기 표적 핵산 검출 장치는 반응 챔버(10)를 구비할 수 있다. 상기 반응 챔버(10)의 일측에 표적 핵산(TP) 및 제1 탐침(CP)이 각각 주입되는 표적 핵산 주입구(22a) 및 제1 탐침 주입구(22b)가 위치할 수 있으며, 이 외에도 버퍼용액(BS)이 주입되는 버퍼용액 주입구(22c)가 더 위치할 수 있다.
이때, 상기 표적 핵산(TP)은 단종의 표적 핵산 또는 이종의 표적 핵산이 주입될 수 있으며, 상기 표적 핵산(TP)의 종류에 따라 상기 표적 핵산(TP)과 상보적으로 결합되는 제1 탐침(CP)의 종류도 변화될 수 있다.
상기 표적 핵산(TP)은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 DNA일 수 있으며, 일 예로서 박테리아 내의 mRNA 또는 cDNA일 수 있다. 상기 제1 탐침(CP)은 폴리머 비드와 제 1 검출 폴리뉴클레오티드가 커플링된 물질일 수 있다. 여기서, 상기 폴리머 비드는 소정 파장의 형광을 방출하는 물질일 수 있으며, 바람직하게는 녹색 형광을 방출하는 물질일 수 있다. 일 예로서, 상기 폴리머 비드는 폴리스티렌(polystrene) 비드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 2개 내지 40개의 뉴클레오티드가 중합된 물질일 수 있다.
상기 버퍼 용액(BS)은 인산염을 포함할 수 있으며, 상기 버퍼 용액 내에는 촉매제가 함유될 수 있다. 상기 촉매제는 설포-N-하이드록시석신이미드 (Sulfo-N-hydroxysuccinimide) 또는 에틸렌 디클로라이드(Ethylene Dichloride)일 수 있다.
상기 주입구들(22a, 22b, 22c) 에는 각각 실린지 펌프들(32a, 32b, 32c)이 연결될 수 있다. 상기 실린지 펌프들(32a, 32b, 32c)이 위치하는 경우, 상기 주입구들(22a, 22b, 22c)을 통해 주입되는 표적 핵산(TP), 제1 탐침(CP) 및 버퍼용액(BS)의 주입량이 조절될 수 있다. 그 결과, 상기 표적 핵산(TP), 제1 탐침(CP) 및 버퍼용액(BS)의 유속이 조절될 수 있다. 상기 주입구들(22a, 22b, 22c)은 파리렉스(pyrex) 재질로 이루어질 수 있다.
상기 챔버(10)는 제1 마이크로 채널(12) 및 제2 마이크로 채널(14)을 구비할 수 있으며, 이때, 상기 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 버퍼용액 주입구(22c)는 상기 제1 마이크로 채널(12)과 연결될 수 있다.
상기 마이크로 채널들(12, 14)은 각각 지그재그 형상의 채널 즉, 수직 채널 및 수평 채널이 반복적으로 배열되어 있는 형상을 가질 수 있다. 상기 제1 마이크로 채널(12)이 지그재그의 형상을 가지는 경우, 상기 표적 핵산(TP)과 제1 탐 침(CP)이 제1 마이크로 채널(12)을 통과할 때 유속이 조절될 수 있으므로, 상기 표적 핵산(TP)과 제1 탐침(CP)은 뭉치지 않고, 단일가닥의 형상을 유지할 수 있다.
따라서, 상기 표적 핵산(TP)과 제1 탐침(CP)의 상보적 결합이 용이하게 일어날 수 있다. 또한, 제1 마이크로 채널(12)이 지그재그의 형상을 가지는 경우, 동일 부피에서 채널의 길이가 길어질 수 있으므로, 상기 표적 핵산(TP)과 상기 제1 탐침(CP)과의 충분한 반응이 이루어 질 수 있다. 상기 마이크로 채널들(12, 14)은 석영(quartz) 재질로 이루어질 수 있다.
상기 챔버(10)는 항온 챔버로 구비되어, 상기 표적 핵산(TP) 및 제1 탐침(CP)에 일정한 온도를 인가해줄 수 있다. 상기 항온챔버는 상기 챔버(10) 내부에 핫 플레이트(hot plate)를 구비하여 상기 챔버(10) 내부를 일정 온도로 유지시켜줄 수 있다.
한편, 상기 제1 마이크로 채널(12)은 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 버퍼용액 주입구(22c)와 분리될 수 있도록 구성될 수 있다. 이러한 경우, 상기 제1 마이크로 채널(12)의 교체가 용이하게 이루어질 수 있어, 상기 제1 마이크로 채널(12)의 채널 직경이 다양하게 조절될 수 있다. 그 결과, 상기 제1 마이크로 채널(12)의 채널 직경을 조절함으로써 상기 채널을 통과하는 표적 핵산(TP) 및 제1 탐침(CP)의 유속이 조절될 수 있다.
한편, 상기 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 버퍼용액 주입구(22c)와, 상기 제1 마이크로 채널(12)이 연결되는 영역에 밸브 1(V1)이 배치될 수 있다. 이때, 상기 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 버퍼용액 주입구(22c)와 상기 밸브 1(V1) 사이에는 마그네틱 스틱(MS1)이 배치될 수 있다.
상기 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 버퍼용액 주입구(22c)로부터 유입된 상기 표적 핵산(TP)과 상기 제1 탐침(CP)은 상기 밸브 1(V1)를 닫은(off) 상태에서 골고루 혼합한 후에 상기 밸브 1(V1)을 열어(on) 상기 제1 마이크로 채널(12)로 이동시켜줄 수 있다.
그 결과, 상기 제1 마이크로 채널(12)을 통과하는 상기 표적 핵산(TP)의 일부에 상기 제1 탐침(CP)의 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 상보적으로 결합되어 혼성화(hybridization)될 수 있다. 그 결과, 상기 표적 핵산(TP)과 제1 탐침(CP)이 결합된 제1 복합체(CP-TP)가 형성될 수 있다.
한편, 상기 제1 마이크로 채널(12)과 제2 마이크로 채널(14) 사이에는 상기제2 탐침(DP)이 주입되는 제2 탐침 주입구(24)가 위치할 수 있다. 이때, 상기 제2 탐침 주입구(24)의 입구에는 실리지 펌프(34)가 위치하여, 상기 제2 탐침(DP)의 농도를 조절할 수 있다.
상기 제1 마이크로 채널(12)을 통과하는 제1 복합체(CP-TP)는 제2 마이크로 채널(14)로 이동하는 과정 중에 상기 제2 탐침 주입구(24)로부터 주입되는 제2 탐침(DP)과 혼합될 수 있다.
상기 제2 탐침(DP)은 QD(Quantum Dot)와 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 커플링된 물질일 수 있다. 여기서, 상기 QD는 소정 파장의 형광을 방출하는 물질일 수 있으며, 상기 폴리머 비드와의 구분을 위해 상기 폴리머 비드와 다른 파장의 형광을 방출하는 물질을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 QD는 적색, 주황색 또는 황색의 형광을 방출하는 물질을 사용하는 것이 바람직하며, 일 예로서, 상기 QD는 CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe등의 형광을 방출하는 금속 나노 입자일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 2개 내지 40개의 뉴클레오티드가 중합된 물질일 수 있다.
상기 표적 핵산 주입구(22a)를 통해 염기 서열이 다른 복수개의 표적 핵산들이 주입된 경우, 이들을 검출하기 위해 상기 제2 탐침 주입구(24)를 통해 서로 다른 종류의 제2 탐침들(DP)을 복수개 주입할 수 있다. 상기 서로 다른 종류의 제2 탐침들(DP)은 상기 서로 다른 종류의 표적 핵산들(TP)에 각각 결합하며, 서로 다른 파장의 형광을 방출할 수 있다. 이를 위해 상기 제2 탐침들(DP)의 각각은 상기 표적 핵산들(TP) 중 어느 하나와 상보적으로 결합하기 위해 적절한 염기서열을 갖는 제2 검출 폴리뉴클레오티드를 구비할 수 있다. 또한, 상기 제2 탐침들(DP)은 서로 다른 파장의 형광을 방출하는 QD들을 각각 구비할 수 있다. 이 때, 방출되는 형광의 파장은 상기 QD의 물질 종류 또는 크기를 조절하여 변화시킬 수 있다.
여기서 사용되는 상기 QD는 형광 지속성이 뛰어나고, 넓은 여기 파장대를 가지고 있다. 따라서, 서로 다른 파장에서 형광 발산(emission)되는 복수의 QD를 단파장의 광원으로 동시에 여기시킬 수 있고, 복수의 표적 핵산 검출을 가능하게 한다.
한편, 상기 제2 탐침 주입구(24)와 상기 제2 마이크로 채널(14)이 연결되는 영역에는 밸브 2(V2)가 위치될 수 있으며, 상기 제2 탐침 주입구(24)와 상기 밸브 2(V2) 사이에는 마그네틱 스틱(MS2)이 구비될 수 있다. 상기 제1 마이크로 채널(12)로부터 이동된 제1 복합체(CP-TP)와 상기 제2 탐침 주입구(24)로부터 유입된 상기 제2 탐침(DP)은 상기 밸브 2(V2)를 닫은(off) 상태에서 골고루 혼합한 후에 상기 밸브 2(V2)을 열어(on) 상기 제2 마이크로 채널(14)로 이동시켜줄 수 있다.
그 결과, 상기 제2 마이크로 채널(14)을 통과하는 상기 제1 복합체(CP-TP)와 상기 제2 탐침(DP)의 혼성화(hybridization)에 의해, 상기 제1 복합체(CP-TP)의 노출된 표적 핵산(TP)에 제2 탐침(DP)이 상보적으로 결합된 제2 복합체(CP-TP-DP)가 형성될 수 있다. 이와 같이 합성된 상기 제2 복합체(CP-TP-DP)는 표적 핵산(TP)를 기준으로 상기 제1 탐침(CP)와 상기 제2 탐침(DP)가 양 측부에 위치되어 샌드위치 형상을 가질 수 있다.
한편, 상기 챔버(10)의 타측에 상기 제2 마이크로 채널(14)과 연결된 검출장치(40)가 배치될 수 있다. 상기 검출장치(40)는 유세포 분석기, 광학 현미경, 형광 분광기(fluorescence spectrometer) 또는 휴대용 옵틱 파이버 장치(portable optic fiber)를 포함할 수 있다.
이러한 검출장치(40)는 피검출체의 형광파장을 측정하고, 특정 크기 및 특정 형광파장을 갖는 물질을 상기 제2 복합체(CP-TP-DP)로 판정할 수 있다. 이 때, 상기 폴리머 비드에 의해 나타나는 형광파장과 상기 QD에 의해 나타나는 형광파장을 모두 나타내는 피검출체는 상기 제2 복합체(CP-TP-DP)로 판정될 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 표적 핵산 검출장치는 마이크로 채널들(12, 14)을 지그재그의 형상으로 구비함으로써 마이크로 채널들(12, 14)을 통과하는 시료들이 뭉치지 않고, 단일가닥을 유지할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 항온 챔버를 사용함으로써 상기 챔버(10) 내부를 항온으로 유지할 수 있고, 더불어, 실린지 펌프를 이용한 시료의 주입량 조절과 마이크로 채널의 직경 조절을 통 시료들의 유속 조절을 더욱 세밀하게 할 수 있으므로, 상기 시료들이 뭉치는 현상이 더욱 방지될 수 있다.
또한, 발명의 일 실시예에 따른 표적 핵산 검출 장치는 상술한 바와 같이, 표적 핵산 주입구(22a), 제1 탐침 주입구(22b) 및 제2 탐침 주입구(24), 제1 마이크로 채널(12) 및 제2 마이크로 채널(14)을 구비하는 챔버(10), 및 검출기(40)를 구비하여, 본 장치 내에서 상기 제2 복합체(CP-TP-DP)의 합성 및 검출이 연속적으로 이루어지므로, 분석시간이 단축되고, 분석의 신뢰성이 향상될 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 탐침 합성방법을 나타내는 개략도이다.
도 2를 참조하면, 상기 제1 탐침(CP)은 폴리머 비드(Polymer Bead)와 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 커플링된 물질을 사용할 수 있다. 이때, 상기 폴리머 비드의 표면은 카르복실기(-COOH)에 의해 개질될 수 있다.
한편, 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 제1 검출 폴리뉴클레오티드는 말단 예를 들어 5' 말단에 아민기(-NH2)가 결합될 수 있다.
그 결과, 상기 폴리머 비드와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 혼합되는 경우, 상기 폴리머 비드의 카르복실기와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 아민기가 펩티드 결합을 형성하여 제1 탐침(CP)을 형성할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 탐침 합성방법을 나타내는 개략도이다.
도 3을 참조하면, 상기 제2 탐침(DP)은 QD(Quantum Dot)와 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 커플링된 물질을 사용할 수 있다. 이때, 상기 QD의 표면은 스트렙타비딘(streptaividin)에 의해 개질될 수 있다.
또한, 상기 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 말단 예를 들어, 3' 말단에 제1 검출 폴리뉴클레오티드바이오틴(Biotin)이 결합될 수 있다. 이 경우, 상기 QD와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 혼합되는 경우, 상기 QD의 스트렙타비딘와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 바이오틴이 커플링 반응하여 제2 탐침(DP)를 형성할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실험예(example)를 제시한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예 : 표적 핵산 검출 실험
1. 표적 핵산, 제1 검출 폴리뉴클레오티드 및 제1 검출 폴리뉴클레오티드 준비
부산 지역 해수에서 바실러스 균주를 분리하고, 16S rRNA 유전자 서열을 통해 분리한 균주를 동정(identification)하였다. 이와 같은 결과를 유전자은행(GenBank)에 등록하고, FJ869033의 고유번호를 획득하였다. 이와 같이 1264bp 길이로 등록한 이 균주의 16S rRNA 유전자 서열정보는 다음과 같다.
1 aactccggga aaccggggct aataccggat aatatctatt tatacatata attagattga
61 aagatggttc tgctatcact tacagatggg cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta
121 acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac
181 tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa
241 agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt
301 tagggaagaa caagtatcgg agtaactgcc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc
361 acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt
421 attgggcgta aagcgcgcgc aggcggttcc ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa
481 ccgtggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccaa
541 gtgtagcggt gaaatgcgta gagatttgga ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg
601 tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta
661 gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag
721 caaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt
781 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct
841 taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga ctttcccctt cgggggacag
901 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg
961 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcatttagt tgggcactct aaggtgactg
1021 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg
1081 ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca aagggctgca agaccgcgag gtttagccaa
1141 tcccataaaa ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagccggaa
1201 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc
1261 gccc
상기 바실러스 균주를 대상으로 spo0A 유전자 일부를 표적으로 하는 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 통해서, spo0A 유전자 일부를 증폭하여 서열 분석을 했다. 총 240bp길이의 spo0A 유전자 중에서 자체 헤어핀구조를 만들지 않는 부분을 표적 핵산으로 선정하였으며, 상기 표적 핵산과 상보적으로 결합될 수 있도록 제1 검출 폴리뉴클레오티드 및 제2 검출 폴리뉴클레오티드를 선정하였다. 이때, 상기 제1 및 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 물질 각각에 배열된 (C6) 및 (A5)는 상보적 결합을 용이하게 하기 위한 브리지를 제공하므로, 생략될 수도 있다.
표적 핵산: 5' AAG TGA GTG GTA AGA AAA CAA 3'
제1 검출 폴리뉴클레오티드: 5' (NH2) (C6) TTG TTT TCT 3'
제2 검출 폴리뉴클레오티드: 5' TAC CAC TCA CTT (A5) (Biotin) 3'
2. 제1 탐침의 혼합비 결정
제1 탐침을 합성하기 전에 제1 탐침의 혼합비를 결정하였다. 만약, 혼합비가 결정되지 않는 경우, 시료의 손실이 발생되거나, 과첨가에 의해 생성된 불순물들이 반응을 방해할 수 있으므로, 제1 탐침 혼합비의 결정이 중요하다.
이를 위해, 폴리머 비드와 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 커플링된 물질이 사용될 수 있으나, 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경을 통해 쉽게 관측하기 위해, 상기 제1 검출 폴리튜클레오티드에 상기 폴리머 비드 외에 QD를 더 표지시켜 제1 탐침을 합성하였다.
구체적으로, 폴리머 비드로서, 녹색 형광을 나타내는 직경 5.6㎛의 폴리스티렌(Bio-Plex COOH Bead 24, Bio-rad사, USA)을 사용하였으며, 이때, 상기 폴리머 비드의 표면은 카르복실기에 의해 개질된 것을 사용하였다. 또한, 상기 QD로서, CdSe를 사용하였으며, 이때, 상기 QD의 표면은 스트렙타비딘에 의해 개질된 것을 사용하였다. 한편, 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 및 3' 말단은 각각 아민기 및 바이오틴이 결합된 것을 사용하여, 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드를 펩티드 결합을 통해 상기 폴리머 비드에 결합시키고, 또한, 스트렙타비딘-바이오틴 결 합을 통해 상기 QD에 결합시켰다.
이때, 제1 탐침의 혼합비를 결정하기 위해, 상기 폴리머 비드의 농도는 변화시키지 않고, 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도를 변화시켰다. 구체적으로, 폴리머 비드 1M에 대해 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도를 0.94, 1.87, 3.76, 5.61, 7.50 및 9.35μM로 변화시켜, 제1 탐침을 합성하였다
도 4는 본 발명에 따라 합성된 제1 탐침의 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 분석 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4를 참조하면, 상기 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경을 통해, 655nm 파장 영역에서 적색의 형광이 방출되었음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, QD를 표지함으로서, 제1 탐침의 검출이 용이하게 이루어질 수 있음을 확인할 수 있다.
도 5a 본 발명에 따라 합성된 제1 탐침의 유세포분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a를 참조하면, X축의 (+), (-)는 폴리머 비드의 검출 유무를 나타내고, Y축의 (+), (-)는 QD의 검출 유무를 나타낸다. 이를 통해, 상기 도 5a에서 영역 1은 X축 방향으로 (+)에 있으나, Y축 방향으로 (-)에 있으므로, 폴리머 비드는 검출되었으나, QD가 검출되지 않았음을 알 수 있다. 이를 통해, 영역 1은 제1 검출 폴리뉴클레오티드와 결합을 하지 못한 폴리머 비드임을 알 수 있다.
또한, 영역 2는 X축 방향으로 (+)영역에 포함되면서, QD의 신호가 확인되는 Y축 방향으로도 (+)영역에도 포함되므로, 이 영역은 폴리머 비드에 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 결합된 제1 탐침 영역임을 알 수 있다.
도 5b는 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도 변화에 따른 제1 복합체의 농도를 표시한 그래프이다.
도 5b를 참조하면, 폴리머 비드에 결합하는 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도를 0.94, 1.87, 3.76, 5.61, 7.50, 9.35μM로 변화시켰을 때, 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도가 5.61μM인 경우, 폴리머 비드 및 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 결합된 제1 탐침이 가장 많이 검출되었다. 따라서, 상기 DNA는 폴리머 비드 1M에 대해 0.94 내지 9.35MμM로 첨가되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5.61μM로 첨가되는 것이 바람직하다.
3. 제1 탐침 준비
상기와 같이 결정된 혼합비 즉, 폴리머 비드 1M에 대해 제1 검출 폴리튜클레오티드를 5.61μM로 첨가하여 제1 탐침을 합성하였다. 이때, 상기 폴리머 비드로서, 녹색 형광을 나타내는 직경 5.6㎛의 표면이 카르복실기에 의해 개질된 폴리스티렌(Bio-Plex COOH Bead 24, Bio-rad사, USA)을 사용하였다. 또한, 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 아민기가 결합된 것(Bio-PlexTM Amine coupling kit, Bio-rad사, USA)을 사용하였다.
4. 제2 탐침의 혼합비 결정
제2 탐침을 합성하기 전에 제2 탐침의 혼합비를 결정하였다. 이를 위해, QD로서 CdSe를 사용하였으며, 이때, CdSe의 표면은 스트렙타비딘에 의해 개질된 QD585(Q10111MP, invitrogen사, USA)을 사용하였다. 한편, 제2 검출 폴리뉴클레오티드는 3' 말단에 바이오틴이 결합된 것을 사용하였다.
상기와 같이 준비된 QD 및 제2 검출 폴리뉴클레오티드를 혼합하여, 상기 QD 표면의 스트렙타비딘과 상기 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 바이오틴을 커플링 반응시켜 제2 탐침을 합성하였다.
이때, 제2 탐침의 혼합비를 결정하기 위해, 상기 QD의 농도는 변화시키지 않고, 제2 검출 폴리튜클레오티드의 농도를 변화시켰다. 구체적으로, QD 1M에 대해 제1 검출 폴리뉴클레오티드를 60, 30, 20, 10 및 4M로 변화시켜, 제2 탐침을 합성하였다. 이때, 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 크기는 3~5nm인 것을 사용하였으며, QD 및 제2 탐침의 크기는 약 25nm인 것을 사용하였다.
이와 같이 합성된 제2 탐침은 Flow-FFF(HRFFF 10.000 Series, Postnova, Germany)를 사용하여 결과를 분석하였다.
도 6은 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 농도 변화에 따른 QD와의 결합 정도를 나타내는 Flow-FFF 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6을 참조하면, 상기 Flow-FFF(Flow Field Flow Fractionation)는 시료의 크기에 따른 검출방법을 사용하는 검출장치로서, 상대적으로 크기가 작은 것은 디 텍터(detector)에 의해 빨리 감지되고, 상대적으로 크기가 큰 것은 늦게 검출되는 특징이 있다.
본 실험에서 Flow-FFF에 통과시킨 시료 중 가장 작은 크기를 가지는 것은 제2 검출 폴리뉴클레오티드임을 안다. 따라서, 초기에 검출된 영역은 가장 작은 크기를 가지는 제2 검출 폴리뉴클레오티드임을 예측할 수 있다.
이를 통해, 제2 검출 폴리뉴클레오티드와 QD의 결합 농도 비율을 60:1, 30:1, 및 20:1인 경우, 초기 영역에서 검출 피크가 나타난 것으로 보아, QD와 결합하지 못한 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 남아 있는 상태라는 것을 예측할 수 있다. 그러나, 제2 검출 폴리뉴클레오티드와 QD의 결합 농도 비율이 10:1 및 4:1인 경우, 초기 영역의 검출 피크가 나타나지 않은 것으로 보아, 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 QD와 모두 결합되어, 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 검출되지 않았음을 예측할 수 있다.
따라서, 이와 같은 결과를 통해 제2 탐침을 합성하기 위해서는 QD 1M에 대해 상기 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 1 내지 10M로 첨가되는 것이 바람직하다.
5. 제2 탐침 준비
상기와 같이 결정된 혼합비 즉, QD 1M에 대해 제2 검출 폴리튜클레오티드를 10M로 첨가하여 제2 탐침을 합성하였다. 이를 위해, QD로서 Ce의 표면에 스트렙타비딘에 의해 개질된 CdSe 즉, QD585(Q10111MP, invitrogen사, USA)를 사용하였으며, 제2 검출 폴리뉴클레오티드는 3' 말단에 바이오틴이 결합된 것을 사용하였다.
6. 표적 핵산의 혼성화 및 검출
표적 핵산의 혼성화를 위해 표적 핵산 검출 장치를 사용하였다. 이때, 상기 표적 핵산 검출 장치에 구비된 챔버는 항온 챔버를 사용하였으며, 상기 항온 챔버 내에 서로 이격되어 배치된 마이크로 채널들은 지그재그 형상의 채널로 구성된 석영 마이크로 채널을 사용하였다. 이때, 각 마이크로 채널의 직경은 2±0.5mm인 것을 사용하였다.
상기 제1 마이크로 채널의 일 측부에 파리렉스 재질의 3-way 밸브를 부착하여 표적 핵산 주입구, 제1 탐침 주입구 및 버퍼용액 주입구를 구성하였다. 또한, 상기 제1 마이크로 채널과 제2 마이크로 채널 사이에는 제2 탐침 주입구를 배치시켰다. 이때, 주입구들은 파리렉스 재질로 이루어진 것을 사용하였으며, 각각의 주입구들 입구에는 실린지 펌프들을 배치시켜 시료들의 주입량 및 유속을 조절할 수 있게 하였다.
이와 같이 준비된 표적 핵산 검출 장치의 3 way 밸브 내에 표적 핵산, 제1 탐침 및 버퍼용액을 주입하고, 제1 마이크로 채널 내에서 46℃의 온도로 30분간 혼성화 반응을 진행시켜, 제1 복합체를 합성시키고, 제2 탐침 주입구에 제2 탐침을 주입하고, 제2 마이크로 채널 내에서 46℃의 온도로 20분간 혼성화 반응을 진행시켜, 최종의 제2 복합체를 합성하였다. 이때, 별도의 세척 과정은 수행하지 않았다.
도 7은 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 장치에서의 민감도(Sensitivity)를 나타내는 그래프이다. 이는 상기 표적 핵산 검출 장치에서 감지할 수 있는 표적 핵산 농도의 범위(Detection limit)를 통해 확인할 수 있다.
도 7을 참조하면, 표적 핵산의 농도가 커질수록, 혼성화 결과물인 형광 세기도 일반적으로 증가한다. 본 실시 예에서는 3.9nM~1000nM(R2=0.9777)의 표적 핵산 농도 범위에서는 증가 경향을 보였고 3.9nM 이하, 1000nM 이상에서는 표적 핵산 농도에 따른 형광 세기의 증가 경향을 볼 수 없었다. 또한 검출 한계는 0.02nM이었다.
따라서, 감지 DNA 농도의 검출 범위는 3.9nM~1000nM인 것으로 하는 것이 바람직하다.
이외에도 표적 핵산 검출 장치를 이용하여 다양한 형태의 그래프를 확보할 수 있는데, 도 8는 본 발명에 따른 제2 복합체의 유세포 분석기를 이용한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8를 참조하면, Side scatter(A)와 electronic volume(B)은 폴리머 비드의 크기를 이용하여 폴리머 비드가 아닌 영역과 폴리머 비드인 영역을 구분해 낼 수 있고, FL1 fluorescence(C)는 폴리머 비드가 원천적으로 가지고 있는 녹색 형광 성질을 이용하여, 폴리머 비드가 아닌 영역과 폴리머 비드인 영역을 구분할 수 있다. 또한, FL3 fluorescence(D)는 QD가 나타내는 신호가 아닌 영역과 QD가 나태내는 신호 영역을 구분할 수 있다.
이와 같이 나타난 결과들을 바탕으로, A+D, B+D, C+D와 같이 두 개의 파라미터들을 폴리머 비드 신호와 QD 신호를 조합하여 나타낸 그래프를 보면, 파란색 원안의 점들이 포지티브 폴리머 비드 신호와 포지티브 QD 신호를 갖는 군집으로, 3개의 DNA 즉, 제1 탐침, 표적 핵산, 제2 탐침 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 샌드위치 형태로 혼성화 된 부분이라는 것을 확인할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 표적 핵산 검출 장치를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 탐침 합성방법을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 탐침 합성방법을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명에 따라 합성된 제1 탐침의 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 분석 결과를 나타내는 이미지이다.
도 5a 본 발명에 따라 합성된 제1 탐침의 유세포분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도 변화에 따른 제1 복합체의 농도를 표시한 그래프이다.
도 6은 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 농도 변화에 따른 QD와의 결합 정도를 나타내는 Flow-FFF 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 장치에서의 민감도(Sensitivity)를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 제2 복합체의 유세포 분석기를 이용한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1 마이크로 채널, 제2 마이크로 채널 및 핫 플레이트를 구비하는 챔버, 상기 챔버의 일측에 배치되어 상기 제1 마이크로 채널에 연결된 표적 핵산 주입구 및 제1 탐침 주입구, 및 상기 제1 마이크로 채널과 상기 제2 마이크로 채널 사이에 연결된 제2 탐침 주입구를 구비하는 표적 핵산 검출 장치를 제공하는 단계;
    상기 표적 핵산 주입구 및 상기 제1 탐침 주입구의 각각을 통해 표적 핵산, 및 폴리머 비드와 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 결합된 제1 탐침이 주입되고, 제1 마이크로 채널에서 상기 표적 핵산과 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 혼성화되어 상기 표적 핵산의 일 측 단부에 제1 탐침이 결합된 제1 복합체를 형성하는 단계;
    상기 제1 복합체가 상기 제2 마이크로 채널로 이동되는 단계; 및
    상기 제2 탐침 주입구를 통해, QD와 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 결합된 제2 탐침이 주입되고, 상기 제1 마이크로 채널로부터 이동된 상기 제1 복합체의 표적 핵산과 상기 제2 탐침의 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 혼성화되어, 상기 표적 핵산의 타측 단부에 상기 제2 탐침이 결합된 제2 복합체를 형성하는 단계를 포함하고,
    별도의 세척 과정을 포함하지 않는 표적 핵산 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 복합체를 형성하는 단계 이후에,
    상기 제2 복합체로부터 표적 핵산을 검출하는 단계를 더 포함하는 표적 핵산 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제1 탐침의 합성방법은 5' 말단에 카르복시기로 개질된 폴리머 비드와, 말단에 아민기가 결합된 제1 검출 폴리뉴클레오티드가 제공되는 단계; 및
    상기 폴리머 비드의 카르복실기와 상기 제1 검출 폴리뉴클레오티드의 아민기를 펩티드 결합시켜 제1 탐침을 합성시키는 단계를 포함하는 표적 핵산 검출 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제2 탐침의 합성방법은 표면에 스트렙타비딘으로 개질된 QD와 3' 말단에 바이오틴이 결합된 제2 검출 폴리뉴클레오티드가 제공되는 단계; 및
    상기 QD의 스트렙타비딘와 상기 제2 검출 폴리뉴클레오티드의 바이오틴을 커플링시켜 제2 탐침을 합성시키는 단계를 포함하는 표적 핵산 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20080005269A (ko) * 2006-03-24 2008-01-10 가부시끼가이샤 도시바 핵산 검출 카세트 및 핵산 검출 장치

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