KR101126138B1 - 비정상적 세포 증식의 진단 및 치료에 유용한 코발아민유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 수송 단백질 트랜스코발아민 II에 대한 결합 친화력이 없거나 또는 결합 친화력이 낮고 또 (b) 비타민 B12 대체물로서 활성을 유지하며, 경우에 따라 방사능활성 금속과 같은 치료제 및/또는 진단제를 갖는 코발아민 유도체에 관한 것이다. 이들 화합물은 신생물 조직에서 축적과 비교하여 혈액 및 신장 및 간과 같은 건강한 기관에서 축적이 훨씬 감소되며, 혈액으로부터 더욱 신속하게 제거된다. 본 발명은 또한

(a) 신생물 질환 또는 감염에 영향을 받은 것으로 의심되는 포유동물을 비타민 B12-를 갖지 않는 식이에 노출시키고, 또

(b) 이어 진단제 및/또는 치료제를 갖는 본 발명의 코발아민 유도체를 적용하는 것을 포함하는 포유동물에서 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염을 진단하는 방법 및 치료방법에도 관한 것이다. 비타민 B12 대체물로 작용할 코발아민 유도체를 선택함으로써, 신생물 조직에서 내성 자손의 형성 우려를 현저히 감소시킬 수 있다.

코발아민 유도체, 비타민 B12, 신생물, 내성, 트랜스코발아민, 결합 친화력, 진단제, 치료제

Description

비정상적 세포 증식의 진단 및 치료에 유용한 코발아민 유도체{Cobalamine derivatives useful for diagnosis and treatment of abnormal cellular proliferation}

본 발명은 다세포 생물에서 바람직하지 않은 세포의 급격한 증식을 영상화하여 파괴하는 방법에 관한 것이다.

비정상적 세포 증식, 주로 과증식은 수많은 질병의 원인이며, 가장 심각한 것이 암이다. 미국에서만도 매년 약 백오십만명의 사람들이 암 진단을 받고 오십만명이 암으로 죽고 있다. 암과의 싸움은 일부 성공을 거두었지만 많은 좌절도 있었다. 항암 약물의 심각한 부작용 및 암 세포 내성 후손의 발생이 그 주요 문제인데, 이는 종양이 조기에 정확히 자리잡고 전이되기 때문이다.

다수의 암 세포와 같은 과증식성 세포는 영양분 공급 증가, 성장인자, 에너지 및 비타민에 따라 달라진다. 세포 성장에 필수적이며 흔히 그 공급이 모자라는 비타민의 공급 경로를 이용하여, 약물들을 이러한 원하지 않는 세포에 전달할 수 있다.

비타민 B12로 공지되고 시아노-코발아민(CN-Cbl), 히드록시-코발아민(HO- Cbl) 또는 아쿠오-코발아민(H₂O-Cbl)으로 존재하는 코발아민(Cbl)은 생명에 필수적이고 또 그의 생체내 농도는 아주 낮다. 사람을 비롯한 고등생물은 비타민을 음식으로부터 섭취해야한다. 코발아민의 생합성은 혐기성 세균과 같은 일부 원핵 생물에만 한정되고 있다. 코발아민은 신경계의 완전한 작용에 중요하며 또 탄수화물, 단백질 및 지방의 적합한 대사에 필요하다. 코발아민은 필수적 세포외 대사 경로에 이용된다. 메틸-코발아민(Me-Cbl)과 같이, 코발아민은 메티오닌 합성효소에 대한 보조인자로 작용한다. 5'-데옥시아데노실-코발아민(Ado-Cbl)과 같이, 코발아민은 메틸말로닐-CoA가 숙시닐-CoA로 재배열하는데 있어서 메틸말로닐-CoA 뮤타아제(mutase)와 함께 작용한다. 코발아민 결핍은 악성빈혈을 초래한다. 코발아민은 또한 리보뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드로 환원 전환되어 DNA를 생성하는데 관여한다.

포유동물에서, 코발아민의 대부분의 세포 흡수는 혈청 수송 단백질에 의해 또 세포막 수용체에 의해 조절된다. 혈장에는 2개 유형의 코발아민-결합 단백질이 존재한다: 비-글리코실화된 단백질 트랜스코발아민 II(TCII) 및 글리코실화된 단백질 트랜스코발아민 I 및 III(TCI 및 TCIII), 흔히 R-결합제 단백질 또는 하프토코린(haptocorrin)이라 불림. TCI 및 TCIII은 면역학적으로 교차반응성이며 탄수화물 조성에서만 서로 상이하다. TCI는 순환에서 발견되는 일차 R-결합제이다. 간단히 나타내기 위해 용어 TCI는 R-결합제 단백질 TCI 및 TCIII를 모두 지칭할 때 사용하기로 한다. 수송 단백질(벡터) TCI 및 TCII 유형은 포유동물 혈액에서 코발아민에 의해 부분적으로 포화(홀로) 또는 부분적으로 불포화(아포)되어 순환한다. 정상 세포에서 비교적 효율이 낮은 코발아민에 대한 벡터-부족 흡수 계는 포유동물 세포에도 존재한다 (Sennet, C., and Rosenberg, L.E., Ann. Rev. Biochem. 50, 1053-86 (1981) 참조).

TCII는 수용체 매개된 세포내이입(endocytosis)에 의해 혈장 코발아민을 모든 대사적으로 활성인 세포로 전달하는 작용을 한다. 신생물에서 가속화된 세포 증식은 수용체 매개된 세포내이입 흡수에 의한 순환으로부터 로딩된 TCII의 소비증가를 초래함이 알려져 있다. TCII 수용체의 수의 상향 조절은 악성 세포주에서 티미딘 및 메티오닌 생산의 증가된 대사 요구, DNA 합성을 위한 메틸화 반응 및 미토콘드리아 대사를 통한 세포 에너지학을 충족함이 드러났다.

일반적인 TCII 수용체는 조직에 존재하는 반면에 제2 및 메갈린(megalin)으로 불리는 기관-특이적 TCII 수용체는 신장 주변의 세관(tubule) 및 일부 다른 흡수성 상피에서 과도하게 발현된다. 세포내이입적 내재화후, TCII는 용해소체(lysosome)에서 분해되며 유리 코발아민은 세포질 및 핵막 내로 수송되며, 그곳에서 Me-Cbl 및 Ado-Cbl로 전환된다. 이들 2개 형태는 비타민 B12의 활성 보조효소로서 작용한다. TCII의 주요 역할은 TCII의 유전에 의한 선천적 결핍이 거대적혈모구 빈혈, 위험한 신경장애 및 과량의 코발아민으로 처리되지 않으면 죽음을 초래할 수 있다는 관찰에 의해 잘 확립되었다.

거의 모든 세포는 TCII를 생성할 수 있다. 간세포, 섬유아세포, 신경세포, 장세포 및 대식세포와 같은 많은 세포는 증가된 양의 TCII를 합성한다. 혈관 내피 는 TCII의 주공급원인 것으로 보인다. 약 20-30%의 순환 코발아민은 TCII에 홀로-TCII로 결합된다. 이것은 모든 조직에 코발아민이 내재화되게 하므로 대사적으로 효과적인 형태이다 (Rothenberg, E. et al., in Chemistry and Biochemistry of B12, ed. R.Banerjee, New York, NY, 1999, pp.441-473 참조).

TCI는 혈액 및 혈장 뿐만아니라 대부분의 외분비 분비물 및 기타 액체에 존재한다. 이것은 주로 앞창자 조직, 위점막, 침샘 및 눈물샘과 내귀의 분비성 상피에서 생성된다. TCII와는 달리 TCI은 코발아민을 세포 흡수에 전달하지 않으며 혈액에서 반감기가 길어서 어떤 순간에서 75% 이상의 순환 코발아민(및 코린)을 유지한다. 거의 모든 TCI는 홀로-TCI로 순환한다. 그의 역할을 완전히 알려져 있지는 않다. 이것은 모든 종류의 코발아민 및 코린을 미생물에 공급하는 것을 방지함으로써 정균제로서 작용하는 것으로 제안되어 있다. 이것은 또한 아데노실-코발아민을 안정화하고 또 광분해로부터 보호하다. 순환시 TCII보다 더 높은 농도를 갖는 TCI와 대조적으로, TCII의 양은 신입 코발아민에 반응하여 아포-TCII의 새로운(de novo) 합성에 의해 아주 신속하게 증가될 수 있다. TCI는 비교적 느리게 생성되며 어떠한 유도 효과에 대하여 실질적으로 자극될 수 없다(Alpers, D. and Russell, G., in Chemistry and Biochemistry of B12, supra, pp. 411-441 참조).

지금까지 포유동물 세포에서 벡터-부족 흡수는 코발아민 유도체를 과증식성 세포에 전달하는 대체적 경로로서 간주되지 않았다. 양성(benign) 포유동물 세포에 의한 코발아민의 흡수를 위한 생리적으로 중요한 메카니즘은 벡터 TCII 및 TCI(및 소화관에서 고유 인자)를 필요로 한다. 그러나, 생체내 및 시험관내 데이터에 의하 면 유리 코발아민은 벡터 단백질의 개입없이도 혈장막을 횡단할 수 있음을 보여준다. 유리 코발아민을 흡수하는 부가적인 능력에 대한 직접적 증거는 선천적으로 및 전적으로 TCII를 결핍한 어린이의 연구에서 얻으며, 이에 의하면 유리 코발아민을 비경구적으로 투여하면 세포외 코발아민 결핍의 임상적 및 화학적 증상을 현저히 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다 (Hall, C.E., et al, Blood, 53, 251-263 (1979) 참조). 시험관내 연구는 HeLa 세포 및 섬유아세포에서 유리 코발아민의 흡수를 보고하였다. HeLa 세포에서, 유리 코발아민의 흡수는 TCII-결합 코발아민에서 관측된 것의 1% 내지 2% 이다. 인간 섬유아세포에서, 2시간 간격 동안 유리 코발아민 축적은 TCII-결합 비타민에서 관측된 것의 약 20% 이다. 인간의 섬유아세포에서 유리 비타민 흡수계는 베르리너 및 로젠버그에 의해 자세히 연구되었다(Berliner, N. and Rosenberg, L.E., Metabolism, 30, 230-236 (1981) 참조). 유리 CN-[⁵⁷Co]=Cbl의 흡수는 2상계로서 확립되었다: 초기 흡수 성분은 신속하고 포화성이며 또 라벨링되지 않은 과량의 CN-Cbl 및 Oh-Cbl에 의해 특이적으로 억제되며 또 30분 이내에 완료된다. 제2 흡수 성분은 느리고, 시간에 비례하며 라벨링되지 않은 과량의 코발아민에 의해 억제되지 않고 또 8시간이 지나도 포화에 도달하지 않는데, 이는 비특이적 과정의 특징적 양상을 제시한다. 초기 흡수 모드는 단백질 매개 고 특이적 막 횡단 특성을 갖고; 술프히드릴 시약에 민감하고 시클로헥시미드에 의해 현저하게 억제된다(Sennet, C. and Rosenberg, L.E., Ann. Rev. Biochem. 50, 1053-86 (1981) 참조). 이들 특성은 단백질-매개된, 포유동물에서 가속된 유리 코발아민의 흡수계의 존재와 일치한다.

많은 세균 및 모든 진핵 원생생물은 비타민 B12에 대해 영양요구주이며 포유동물 고유한 인자, TCI 및 TCII에 비하여 더 높은 친화성을 갖고 결합될 수 있다. 세균 및 원생동물 B12-결합 단백질은 다양한 코린(참 코발아민 포함)과 높은 활성으로 결합할 수 있는 벡터-결핍 작용성 세포 표면 단백질이다. 따라서, 방사능-라벨링된 코발아민 유도체를 적용한 다음 전체 체내 영상에서 세균 감염을 검출하는 것은 놀라운 것이 아니었다(Collins, D.A. et al., Mayo Clin. Proc. 75, 568-680 (2000) 참조). 포유동물 세포의 과증식성 형태의 발생은 이미 존재하는 벡터-결핍 코발아민 흡수 계의 보다 효과적인 형태의 다단계 발암생성에 의한 발생을 수반한다.

방사능활성 금속 동위원소를 비롯한 다양한 범위의 생물학적 활성제에 대한 운반체로서 코발아민을 사용하는 여러 방법이 공표되고 특허되어 있다(Collins, D.A. 미국특허 출원 2003/0144198호 참조). 방사능-라벨링된 코발아민 유도체를 사용할 때 동물 및 인간에서 얻은 결과는 종양 조직의 라벨링을 나타내지만 건강한 조직, 예컨대 신장 및 간에서 방사능활성의 강한 축적을 초래한다. 따라서, 영상화 및 방사능치료는 최적화되지 못하고 있다. 일부 건강한 인체 부분에 대한 손상의 우려는 지금까지 기재된 적용방법을 제한하고 있다.

정상 세포와 비교하여 더 높은 농도로 신속하게 증식하는 세포에 진단적 및 치료적 코발아민 유도체를 투여하기 위한 화합물, 조합물 또는 방법을 포함한다. 본 발명의 목적은 내성 세포 자손의 발생을 피하면서 비정상적 고속 증식성인 세포 에 대하여 더 높은 특이성을 갖는 코발아민 유도체를 확인, 합성, 특징화 및 적용하는 신규 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은, 코발아민 그 자체와 대조적으로, 적합하게 적용되면 수송 단백질 트랜스코발아민 II (TCII)에 대한 결합력이 없거나 현저히 감소된 결합력을 갖는 코발아민 유도체가 신생물 조직에서 축적량에 비교하여 신장 및 간과 같은 정상 기관 및 혈액에서 축적량이 훨씬 감소되며 혈액으로부터 더욱 신속하게 제거된다는 발견을 기초로 한다. 비타민 B 12 대체물로 작용하는 코발아민 유도체를 선택함으로써, 신생물 조직에서 내성 후손의 형성 우려가 훨씬 더 감소된다.

본 발명은,

(a) 트랜스코발아민 II에 대한 결합 친화력이 없거나 또는 결합 친화력이 낮고, 또

(b) 비타민 B12 대체물로서 활성을 유지하는 코발아민 유도체에 관한 것이다.

특히 본 발명은,

(a) 결합 시험에서 비변형 코발아민의 결합 친화력과 비교할 때 트랜스코발아민 II에 대하여 20% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화력을 갖고, 또

(b) 성장 분석에서 비타민 B12 대체물로서 활성을 2% 이상 유지하는 코발아민 유도체에 관한 것이다.

TCII에 대한 결합 친화력이 낮거나 없는 본 발명의 화합물의 예는 방사능활성 금속과 같은 치료적 및/또는 진단제를 갖는 특정 코발아민 유도체이다. 본 발명의 화합물은 정제된 TCII를 사용한 결합 시험 및 시험 생물로서 락토바실루스 델브루엑키스(Lactobacillus delbrueckii)를 사용한 분석 시험의 결과를 기초로 하여 선택된다.

본 발명은 또한

(a) 신생물 질환 또는 감염에 영향을 받은 것으로 의심되는 포유동물을 비타민 B12-를 갖지 않는 식이에 노출시키고, 또

(b) 이어 진단제를 갖는 본 발명의 코발아민 유도체를 적용하는 것을 포함하는, 포유동물에서 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

(a) 치료를 필요로 하는 포유동물을 비타민 B12-를 갖지 않는 식이에 노출시키고, 또

(b) 이어 치료제를 포함하는 본 발명의 코발아민 유도체를 적용하는 것을 포함하는 신생물 질환 또는 미생물에 의해 감염된 포유동물의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염의 진단 방법 및 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염에 걸린 포유동물의 치료 방법에 있어서 본 발명에 따른 코발아민 유도체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 코발아민 유도체를 포함하는 약학적 조성물, 특히 진단적 적용에 적합한 약학적 조성물 및 치료 적용에 적합한 약학적 조성물, 및 상기 진단 방법 및 치료 방법에서 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명에 따른 진단적 또는 치료적 처리에 유용한 화합물을 제조하기 위한 중간체, 특히 방사능활성 금속을 결합하기 위한 킬레이터에 의해 치환되지만 킬레이트에 결합된 금속 또는 비방사능 활성 금속은 갖지 않는 화합물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 코발아민 유도체는 암과 같은 공격적이고 신속하게 진행하는 신생물 질환의 진단 및/또는 치료 및/또는 병원성 미생물에 의한 국소적 감염을 치료하기 위해 특히 유용하다.

발명의 상세한 설명

코발아민 벡터 단백질(또는 수송 단백질) TCII에 대한 결합 친화력이 없거나 매우 낮은 코발아민 유도체는, 비타민 B12 식이에 노출된 포유동물에 적용될 때 신장 및 간과 같은 주요 기관 및 혈액에서 축적이 훨씬 감소되고 과증식성 세포에서 고흡수율을 유지하면서 신생물 질환 및 미생물에 의한 국소적 감염을 보다 정확하게 진단 및 치료한다.

TCII에 대한 낮은 결합 친화력을 갖고 비타민 B12 활성을 유지하는 본 발명의 화합물은 예컨대 하기 화학식(I)의 화합물이다:

식중에서,

R^b, R^c, R^d, R^e 및 R^R는 서로 독립적으로 스페이서-킬레이터 기, 항생물질 또는 항증식성 치료제, 4 내지 20개 탄소원자를 갖는 입체적 요구성(sterically demanding) 유기 기, 또는 수소이고;

R^R은 각기 링커 Z를 통하여 결합되어 있는 스페이서 기 또는 항생물질 또는 항증식성 치료제, 또는 수소이며;

단 잔기 R^b, R^c, R^d, R^e 및 R^R 중의 3 이상은 수소이고 또 잔기 R^b, R^c, R^d, R^e 및 R^R의 1 이상은 수소와 다르며;

X는 한자리 리간드(monodentate ligand)이며; 또

중심 코발트(Co) 원자는 경우에 따라 방사능활성 동위원소 형태임.

특별한 구체예로서 R^e 는 수소이다.

한자리 리간드 X는 예컨대 시아노; 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도와 같은 할로겐, 시아나토, 이소시아나토, 티오시아나토 또는 이소티오시아나토; 직쇄 또는 측쇄이며 1 내지 25개 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 4개 탄소원자를 갖는 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸 또는 이소부틸, 또는 n-헥실 또는 n-데실이고 또 경우에 따라 히드록시, 메톡시 또는 아미노에 의해 치환된 알킬, 예컨대 히드록시메틸, 메톡시메틸, 아미노메틸, 히드록시에틸 또는 메톡시에틸; 니트릴 R-CN, 이소니트릴 R-NC, 카르복실레이트 R-COO^- 또는 티올레이트 R-S^- 이고, 이때 R은 1 내지 15개 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 6개 탄소원자를 포함하는 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 아릴, 예컨대 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 벤조니트릴, 메틸 이소시아나이드, 페닐 이소시아나이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 벤조에이트, 메틸티올레이트, 에틸티올레이트, n-헥실티올레이트 또는 티오페놀레이트와 같은 페닐 또는 나프틸; 치환기 R은 동일하거나 상이하며 1 내지 6개 탄소원자를 갖는 알킬이거나 또는 아릴인 포스파이트 (RO)₃P, 예컨대 트리메틸포스파이트, 메틸디페닐포스파이트, 트리페닐 포스파이트 또는 트리 o-톨릴포스파이트와 같은 경우에 따라 치환된 페닐 또는 나프틸; 히드록시 또는 아쿠오; 또는 5'-데옥시아데노실 기 또는 관련 뉴클레오사이드이다.

바람직하게는, X는 시아노, 메틸, 히드록시, 아쿠오 또는 5'-데옥시아데노실 기이다. 가장 바람직한 것은 시아노이다.

치환기 R^b, R^c, R^d, R^e 또는 R^R 으로서 스페이서-킬레이터 기는 스페이서를 통하여 코발아민의 NH 또는 O 작용에 부착된 금속 원자에 대한 킬레이터로서 경우에 따라 금속 원자, 특히 방사능활성 금속 원자를 갖는다.

스페이서-킬레이터 기가 금속 원자를 갖지 않는 화학식(I)의 화합물은 본 발명에 따른 진단 및/또는 치료 처리방법에 유용한 화합물의 제조에 사용하기 위한 중간체이다.

치환기 R^b, R^c, R^d, R^e 또는 R^R 으로서 항생물질 또는 항증식성 치료제는 겐타마이신과 같은 아미노글리코사이드 항생물질, 테트라사이클린, 셀레노메티오닌과 같은 항대사물질; 에리쓰로마이신 및 트리메토프림과 같은 마크롤리드; 5-플루오로우라실과 같은 항대사물질; 옥살리플라틴, 다카르바진, 시클로포스파미드 또는 카르보플라틴과 같은 알킬화제; 빈블라스틴 또는 도세탁셀과 같은 세포-주기 억제제; 독소루비신, 블레오마이신 또는 토포테칸과 같은 DNA 브레이커 (토포아이소머라제 억제제, 인터칼레이터, 스트랜드 브레이커); 카스파아제 활성 변성제와 같은 단일 유도 경로를 방해하는 화합물; 세포 치사 수용체의 길항물질 또는 작용물질; 및 뉴클레아제, 포스파타아제 및 키나아제의 변형제, 예컨대 이마티니브 메실레이트, 덱사메타손, 포르볼 미리스테이트 아세테이트, 시클로스포린 A, 퀘르세틴 또는 타목시펜이며, 이들은 코발아민의 NH 또는 O 작용에 직접적으로 부착되거나 또는 스페 이서를 통하여 공유결합적으로 결합된다.

스페이서는 2 내지 10개 탄소원자, 바람직하게는 2 내지 6개 탄소원자, 예컨대 2 내지 5개 탄소원자를 갖는 지방족 사슬이며, 이중 1 또는 2개 탄소원자는 질소 및/또는 산소 원자에 의해 치환될 수 있고 또 지방족 사슬은 히드록시, 옥소 또는 아미노에 의해 치환될 수 있다. 특히 2개의 인접한 탄소원자는 아미드 작용 -NH-CO- 또는 에스테르 작용 -O-CO-에 의해 치환될 수 있다.

코발아민의 NH 또는 O 작용을 킬레이트로 결합하는 특정 스페이서는 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌 또는 펜틸렌 기이거나 또는 1개 탄소가 산소 또는 질소에 의해 치환되거나 또는 1개 탄소원자가 산소 또는 질소에 의해 치환되고 또 인접 탄소원자가 옥소에 의해 치환된다.

킬레이터는 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 2, 3 또는 그 이상의 공여체 원자를 금속 원자에 결합시키도록 거리를 두고 갖는 화합물이다. 특히 킬레이터는 N, O 및/또는 S 공여체 원자를 일정 거리에 포함하는 3개의 금속 결합 부위를 가져서 금속원자의 결합을 허용하는 3자리 킬레이터이다. 공여체 원자로서 질소 원자는 지방족 아민, 방향족 아민 또는 질소-함유 방향족 헤테로사이클의 일부이다. 공여체 원자로서 산소 원자는 알코올, 에테르, 에스테르 또는 카르복시 작용이다. 공여체 원자로서 황 원자는 티오에테르 또는 티올이다. 공여체는 아미드 결합 및/또는 에테르 작용을 포함하는 지방족 탄소 사슬 또는 사슬에 의해 연결될 수 있고 또 아미노 산 유도체, 폴리에테르 등일 수 있다.

바람직한 킬레이터는 화학식(II) 내지 (IX)의 킬레이터이다. 카르복시 기는 금속 원자와 착물 형성과 동시에 분해되어 배위 카르복실레이트 기를 형성하는 에스테르로서 존재할 수 있다. 이러한 에스테르화된 킬레이트에서, 에스테르는 알킬이 직쇄 또는 측쇄이고 1 내지 25개 탄소원자를 포함하며, 경우에 따라 1 내지 5개 탄소원자가 질소 또는 산소에 의해 치환되거나 또는 1 또는 2개의 탄소원자가 황 또는 인에 의해 치환되며 또 경우에 따라 페닐, 피리딜, 히드록시, 할로겐, 시아노, 옥소 또는 아미노에 의해 치환되는 알킬 에스테르일 수 있다. 에스테르는 아릴 또는 헤테로아릴이 3 내지 10개 탄소원자를 갖고 또 0, 1 또는 2개의 산소, 0, 1, 2 또는 3개의 질소 또는 0 또는 1개의 황 원자를 가질 수 있는 아릴 또는 헤테로아릴 에스테르일 수 있다. 이러한 에스테르 잔기는 예컨대 카르복시산에 대한 보호기로서 흔히 사용되는 에스테르에 대해 기재된 바와 같은 특정 반응 조건하에서 분해될 수 있도록 적합하게 치환될 수 있다. Green, T.W. 및 Wuts, P.G.M., Protective groups in organic synthesis, Wiley 1999 참조.

예컨대 메틸, 에틸 또는 시아노에틸에 의해 에스테르화된 에스테르화된 킬레이터는 또한 바람직한 킬레이터의 정의에 포함된다.

방사능활성 금속은 ^{94 m}Tc, ^{99 m}Tc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu 및 ¹⁷⁷Lu, 특히 ^{99 m}Tc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re 및 ¹¹¹In 이다.

Co의 방사능활성 동위원소는 예컨대 ⁵⁷Co 및 ⁶⁰Co이다.

4 내지 20개 탄소원자를 갖는 입체적 요구성 유기 기는 예컨대 히드록시, 알콕시, 옥소, 아미노, 카르복시, 카르바모일 또는 알콕시카르보닐에 의해 경우에 따라 치환된, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아릴알키, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬 기이다. 아릴 기의 예는 페닐, 메틸페닐, 디메틸페닐, 히드록시페닐 또는 나프틸이다. 알킬 사슬에서, 탄소원자는 질소(또는 산소)원자에 의해 치환될 수 있고, 또 인접 탄소원자는 옥소에 의해 치환될 수 있으며, 따라서 카르복사미드(또는 에스테르 작용)을 나타낸다. 입체 요구성 유기 기의 특정 예는 이소부틸, tert-부틸, tert-펜틸, o-톨릴, o-메틸벤질 또는 2,6-디메틸벤질이다.

R^R 를 스페이서-킬레이터 기 또는 항생물질 또는 항증식성 치료제와 접속시키는 링커 Z는 1 내지 10개 탄소원자의 포스페이트, 포스포네이트, 카르복시산 에스테르 또는 알킬렌으로부터 선택된 결합 또는 링커 및 이들의 조합물이다. 이러한 링커는 경우에 따라 상기 정의한 스페이서를 포함하는 스페이서-킬레이터 기 또는 치료제를 코발아민의 산소원자에 결합시킨다.

R^R에서 유도화되며 R^b, R^c, R^d 및 R^e가 모두 수소인 화합물은 TC로 인식되며 또 여전히 효소적으로 활성이므로, 본 발명의 범위에서 제외된다.

본 발명의 화합물의 선택은 다음을 기준으로 한다:

(a) (비-변형) 코발아민의 결합과 비교할 때 TCII에 대한 결합 친화성이 없거나 아주 낮은 정도, 예컨대 20% 미만, 특히 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 2% 미만의 결합 친화성; 및

(b) (비-변형) 코발아민의 비타민 B12 활성과 비교할 때 비타민 B12 의존적 세균 또는 포유동물 세포주를 사용한 생장 시험에서 비타민 B12 대체물로서 활성, 예컨대 2% 이상의 활성, 특히 10% 이상의 활성, 바람직하게는 20% 이상의 활성.

TCII에 대한 코발아민(Cbl) 유도체의 결합 친화성을 시험하기 위하여, 토끼의 혈액으로부터 얻은 부분적으로 정제된 TCII를 사용하여 시험관내 시험을 실시하 였다. 대장균 발현계를 갖는 재조합 TCII는 또한 기질로 사용될 수 있다.

본 발명의 코발아민 유도체는 비타민 B12 대체물로서 작용을 유지해야 한다. 그 결과, 고증식율의 세포를 초래하는 내성 발생의 우려는 훨씬 감소될 것이다. 마찬가지로, TCII에 대한 결합활성이 낮거나 없는 코발아민 유도체를 더 이상 흡수할 수 없는 돌연변이 세포는 아주 효과적인 TCII 독립적 비타민 B12 흡수 메카니즘 덕분에 높은 증식율을 달성할 수 있는 선대 세포의 이점을 상실할 것이다.

코발아민 유도체의 비타민 B12 활성을 시험하기 위하여, 시아노코발아민 (CN-Cbl)에 대한 국제적으로 추천된 시험 균주인 락토바실루스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)를 이용한 시험을 실시한다. 시아노코발아민을 갖지 않는 분석 배지에 시아노코발아민을 보충하면 시아노코발아민-영양요구성 세균 균주에 대한 생장 반응을 초래하며, 이것은 정량적 고체 확산 플레이트 분석에 의해측정된다. 이 시험은 어느 정도(%)로 코발아민 유도체가 수명 지지 촉매인 시아노코발아민을 대체할 수 있는지를 결정하기 위해 이용된다.

본 발명은,

(a) 포유동물을 비타민 B12를 갖지 않는 식이에 노출시키고,

(b) 진단제 또는 치료제를 갖는 본 발명의 코발아민 유도체를 적용하는 것을 포함하는 미생물에 의한 국소적 감염 및 신생물 질환의 진단방법 및 치료방법 및 이러한 방법에서 본 발명의 코발아민 유도체의 용도에 관한 것이다.

비타민을 갖지 않는 식이에 노출된 포유동물에서 생체분포에서 TCII 비-결합성 시아노코발아민 유도체를 적용하는 양성 효과를 하기 표 1에 수록한다.

표 1: 마우스에서 방사능활성으로 라벨링된 유도체를 정맥 주사한지 24시간 후 조직 분포

실시예 5: 시아노코발아민-b-부틸-PAPAcet

실시예 6: 시아노코발아민-b-부틸-아미노카르복시메틸-His-OMe

실시예 8: 시아노코발아민-c-부틸-PAPAcet

실시예 10: 시아노코발아민-b-에틸-PAMA-OEt

실시예 11: 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt

실시예 12: 시아노코발아민-b-부틸-PAMA-OEt

실시예 14: 시아노코발아민-b-헥실-PAMA-OEt

실시예 18: 시아노코발아민-d-프로필-PAMA-OEt

실시예 20: 시아노코발아민-b-프로필-His-OMe

실시예 22: 시아노코발아민-b-에틸-트리아민

실시예 25: 시아노코발아민-5'-포스포콜아민-His-OMe

표 1에 수집된 생체분포 분석의 결과는 TCII 비결합제, 예컨대 실시예 10, 11, 12, 18 및 22에 기재된 본 발명의 화합물은 종양에서 비교적 높은 축적을 나태내고, 혈액에서 5배 이상 높고 또 임계적 기관 신장 및 간에서 발견되는 양의 1/2 이다. 실시예 5, 6, 8, 14, 20 및 25의 화합물은 TCII에 결합되기 때문에 본 발명의 화합물의 정의하에 들지 않으며, 참고 화합물로서만 기재된다.

본 발명의 코발아민 유도체는 암과 같은 공격적이고 신속하게 진행하는 신생물 질환의 진단 및/또는 치료에 아주 유용하다. 본 발명의 화합물은 몇 개 예로서 흑색종, 섬유육종, 난소 암종, 췌장 암종, 뼈 육종 및 급성 백혈병과 같은 악성 질환에 관여된 인간 기원의 과증식성 세포의 치료에 사용될 수 있고 또 TCII 매개된 세포내이입을 피할 수 있다. 본 발명의 방법은 방사능활성 동위원소를 갖거나 및/또는 세포를 파괴하는 비-방사능활성제를 갖는 코발아민 유도체의 TCII 매개된 위험한 흡수로부터 양성 기관을 특이적으로 보호한다.

본 발명의 화합물은 암 영상화 및 암 치료에 유용할 뿐만 아니라 코발아민의 높은 및 직접적 흡수에 따라서 국소 감염의 가시화 및 치료에도 유용하다.

항증식제를 갖는 본 발명의 화합물은 불활성 형태의 상기 항증식제를 과증식성 세포로 수송하여서 세포내 아미드 분해후 작용을 발휘하게 하는데 유용하다.

신생물질 질환 및/또는 감염성 질환의 치료 방법에 있어서, 적합한 치료제를 갖는 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있거나 또는 1 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있으며, 가능한 조합 요법은 고정 조합 형태를 취할 수 있거나, 본 발명의 화합물 및 1 이상의 치료제를 엇갈리게 또는 독립적으로 투여할 수 있거나, 고정 조합물 및 1 이상의 다른 치료제를 조합 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 화학요법, 면역요법, 외과 개입 또는 이들을 조합한 방법에 의해 종양 치료를 위해 투여될 수 있다. 다른 처리 전략에서 보조제 요법에서와 마찬가지 로 장기간 요법도 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명의 코발아민 유도체를 포함하는 약제학적 조성물, 특히 진단적 적용을 위한 약제학적 조성물 및 치료적 적용에 적합한 약학적 조성물에 관한 것이다.

정맥투여, 근육내 투여 또는 피하 투여와 같은 비경구적 투여를 위한 약학적 조성물이 바람직하다. 상기 조성물은 활성성분 단독을 포함하거나 또는 약학적으로 허용되는 담체를 함께 포함할 수 있다. 활성성분의 투여량은 처리할 질환 및 처리될 환자의 종, 연령, 체중 및 개별 조건, 개별 약동학적 데이터 및 투여 형태에 따라 달라진다.

제조 방법

본 발명의 화합물은 당해 분야에 공지된 표준 방법에 의해 제조된다.

바람직하게는, 시아노코발아민, 즉 화학식(I)의 화합물(식중, R^b, R^c, R^d 및 R^e 는 수소이고 또 X는 시아노임)은 제어되는 조건하에서, 예컨대 희석 무기 산에 의해 가수분해되고 얻어진 모노-산의 혼합물(식중, 1개의 카르바모일 기 CONH₂ 가 COOH로 전환됨)을 분리한다. 유사하게 비스산을 얻을 수 있다.

시아노코발아민-b, c, d 또는 e-산, 즉 CONHR^b, CONHR^c, CONHR^d 및 CONHR^e 가 COOH에 의해 치환되고 X 가 시아노인 화학식(I)의 아민은 예컨대 펩티드 화학에서 공지된 바와 같은 아미드 형성을 위한 표준 조건하에서 상응하는 아민 R^bNH₂, R^cNH₂, R^dNH₂ 또는 R^eNH₂ 과 반응할 것이다. 아미드 형성을 방해하는 잔기 R^b, R^c, R^d 및 R^e 에서 작용기는 바람직하게는 보호된 형태이며 아미드 형성 후 표준 방법에 의해 보호해제된다. 스페이서가 아미드 작용을 포함하는 화합물을 제조하기 위하여, 시아노코발아민-b, c, d 또는 e-산을, 아미드 형성 표준 조건하에서 디아민 NH₂(CH₂)_nNH₂와 반응하며 수득한 NH₂(CH₂)-작용화된 시아노코발아민을 상응하는 카르복시산과 더 축합시켜 치환기 R^b, R^c, R^d 및 R^e 를 생성한다.

R^c가 수소가 아닌 화합물을 제조하기 위하여, 바람직한 방법은 c-락톤을 형성한 다음 브라운 등, Inorg. Chem. 1995, 3038에 따른 환원성 락톤 개환 반응한다.

R^R이 수소가 아닌 화합물을 제조하기 위하여, 시아노코발아민(또는 시아노코발아민 유도체, 이때 R^b, R^c, R^d 또는 R^e 는 수소가 아님)은 R^R-L과 반응하며, 이때 L은 에스테르 기를 형성하기 위한 적합한 활성화 이탈기, 예컨대 할로겐, 펩티드 및 핵산 합성에서 통상적인 카르복시, 포스페이트 또는 포스포네이트 에스테르 형성을 위한 통상의 활성화 잔기 또는 혼합된 무수물의 잔기이다.

이하의 실시예는 본 발명의 범위를 제한함없이 본 발명을 상세하게 설명한다.

도 1은 TCII-비결합제인 실시예 11의 방사능활성 라벨링된 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt와 수송 단백질의 상호작용을 겔 이동 분석으로 도시한 그래프이다. t = 시간, cpm = 개수/분

A) Superdex^TM 75 칼럼상에서 방사능활성 라벨링된 유도체의 겔여과 분석(1.5 kDa에서 피이크 용출)

B) TCI과 혼합된 유도체의 겔여과 분석(1.5 kDa에서 44 kDa에 이르는 피이크의 이동)

C) TCII와 혼합된 유도체의 겔여과 분석(시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt가 주로 TCII-비결합제임을 나타내는 1.5 kDa에서 피이크 용출).

도 2는 TCII-결합제인 실시예 5의 방사능 활성 라벨링된 시아노코발아민-b-부틸-PAPAcet와 수송 단백질의 상호작용을 겔 이동 분석으로 도시한 그래프이다.

t = 시간, cpm = 개수/분

A) Superdex^TM 75 칼럼 상에서 방사능 활성 라벨링된 유도체의 겔여과 분석(1.5 kDa에서 피이크 용출)

B) TCI와 혼합된 유도체의 겔여과 분석(1.5 kDa에서 44 kDa에 이르는 피이크의 이동)

C) TCII와 혼합된 유도체의 겔여과 분석(시아노코발아민-b-부틸-PAPAcet가 TCII에 결합되지 않음을 나타내는 1.5 kDa에서 60 kDa으로 피이크 이동).

도 3, 4, 5 및 6은 조직 분포를 나타내는 바 그래프이다.

y-축은 조직 그램당 주입된 방사능활성의 %

x-축은 기관 1) 혈액, 2) 심장, 3) 비장, 4) 신장, 5) 위장, 6) 장, 7) 간, 8) 근육, 9) 뼈, 10) 종양

도 3은 정상 음식을 섭취한 마우스에서 방사능활성 시아노코발아민(⁵⁷Co-CN-Cbl)의 정맥 주사후 조직 분포를 도시한다.

도 4는 비타민 B12가 결핍된 음식물을 섭취한 마우스에서 방사능활성 시아노코발아민(⁵⁷Co-CN-Cbl)의 정맥 주사 후 조직 분포를 도시한다.

도 5는 정상 음식을 섭취한 마우스에서 방사능활성 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt (실시예 11)의 정맥 주사 후 조직 분포를 도시한다.

도 6은 비타민 B12 결핍 음식을 섭취한 마우스에서 방사능활성 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt (실시예 11)의 정맥 주사 후 조직 분포를 도시한다.

시약등급 화학물질은 머크사, 디에티콘(CH), 알드리히 또는 플루카, 부흐스(CH)로부터 구입하며 정제없이 사용하였다.

BOP = 1-벤조트리아졸릴옥시 트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트

DCC = 디시클로헥실카르보디이미드

DIPEA = 디이소프로필에틸아민

EDC = 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드

Fmoc = (9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐

HOSu = N-히드록시숙신이미드

MES = 2-(4-모르폴리닐)에탄술폰산

RT = 실온

TBTU = 벤조트리아졸-1-일-N-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트

TEAP = 트리에틸암모늄 포스페이트

Teoc = 2-트리메틸실릴-에톡시카르보닐

TFA = 트리플루오로아세트산

EG&G Berthold LB 508 라디오메트릭 검출기를 구비한 Merck-Hitachi L-7000 시스템 상에서 Waters XTerra RP8 칼럼(5 ㎛ 입자 크기, 1 x 100 mm) 및 유량 1 ml/분을 이용하여 HLPC 분석을 실시하였다. 용매 a는 주로 수성 완충액이었다. 아세트산 나트륨 완충액 a는 2.9 ml 아세트산 및 4.55 ml의 수산화나트륨 2M를 900 ml 물 및 100 ml 메탄올에서 혼합함으로써 제조하였다. 트리스 완충액 a는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(605 mg)을 물에 용해시키고 HCl 2 M을 부가하여 pH8.2 에 도달시키고 1000 ml로 부피를 조정한 다음 아세토니트릴(10 ml)을 부가하였다. 용매 b는 언제나 메탄올이었다.

2개의 prostar 215 펌프 및 1개의 Prostar 320 UV/Vis 검출기를 구비한 Varian Prostar 시스템 상에서 Waters XTerra Prep RP 8 칼럼(5 ㎛ 입자 크기, 3 x 100 mm 및 30 x 100 mmm)을 이용하여 예비적 HPLC 분리를 실시하였다. 유량은 3 x 100 mm 칼럼의 경우 4 ml/분이었고 30 x 100 mm 칼럼의 경우 30 ml/분이었다.

Varian Cary 50 분광광도계 상에 UV/Vis 스펙트럼을 기록하고, IR 스펙트럼은 샘플이 KBr 필(pill)에 압축된 Bio-Rad FTS-45 분광광도계 상에 기록하였다. 전기분무 이온화 질량 스펙트럼(ESI-MS)는 Merck Hitachi M-8000 분광계 상에 기록하였다. 레늄 화합물에서, ¹⁸⁷Re 동위원소의 값을 보고하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker DRX 500 MHz 분광계 상에 기록하였다. 화학적 이동은 참고용으로 잔류 용매 양성자에 대하여 보고하였다.

화합물의 수용액을 Chromafix RP18ce 카트릿지에 적용한 다음 물로 완전히 헹구는 것에 의해 코발아민 유도체(mg 정량)를 탈염시켰다. 탈염된 생성물을 메탄올로 용출시키고 용매는 진공에서 제거하며 생성물을 고압에서 건조시켰다. 양이 큰 부분(50 mg 이상)은 Meth. Enzymol. 1971, 18(3), p.43에 기재된 바와 같이 페놀 추출에 의해 탈염시켰다.

(N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산 에틸 에스테르(프로필-PAMA-OEt)는 Schibli et al. (Nucl. Med. Biol. 2033, 30, 465)에 의해 펜틸 유사체에 대해 기재된 바와 같이 제조하였다. 이 화합물은 염기성 조건하에서 고리화되기 쉽다. 따라서, Boc 보호된 중간체를 저장하고 희석 수성 HCl에서 교반하는 것에 의해 더 작용화하기 전에 Boc를 제거한다. 에틸 및 헥실 유도체는 유사한 방식으로 제조하였다.

Re([N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노]아세트산)(CO)₃은 충분히 보호기 제거된 (N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산을 (NEt₄)₂ [Re(OH₂)₃(CO)₃]와 반응시키는 것에 의해 제조하였다.

메틸 1-카르복시메틸-N-Fmoc-히스티딘 트리플루오로아세테이트는 Pak et al.(Chem. Eur J. 2003, 9, 2053-2061)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 대이온은 상기 화합물을 HCl 0.05M에서 교반한 다음 진공, 실온에서 증발시키는 것에 의해 염화물로 교환되었다.

메틸 3-아미노프로필-N-테오크-히스티딘은 Staveren et al. (Organic & Molecular Chemistry 2004, 2, 2593)에 기재된 바와 같이 제조하였다.

3-(N-2-시아노에톡시카르보닐메틸)-N-피리딘-2-일메틸-아미노)프로피온산 4-니트로페닐 에스테르는 Kunze에 기재된 바와 같이 제조하였다 (Dissertation, Universtiy of Zurich, 2004).

실시예 1: 시아노코발아민 모노카르복시산 (b, d 및 e)

비타민 B12 (1.88 g, 1.39 밀리몰)을 Pathare et al. (Bioconjugate Chem. 1996, 217)에 기재된 바와 같이 HCl 0.1M (190 ml)에 용해시켰다. 정제는 다음과 같은 방식으로 실시하였다: The Dowex 칼럼은 페놀 추출에 의한 탈염 후에 3가지 분획, 즉 d-산만을 함유하는 제1 분획, b-산 및 d-산만을 함유하는 제2 분획 및 b-산 및 e-산만을 함유하는 제3 분획의 분리를 허용한다. b-산 및 d-산의 혼합물은 예비적 HPLC (칼럼: Waters XTerra Prep RP8, 5㎛ , 30 x 100 mm; 구배 a/b 0.5% 분^-1, 100% 아세트산 완충액 a에서 시작)에 의해 분리하였다. b-산 및 e-산의 혼합물을 동일 계에서 트리스 완충액을 용매 a로 사용하여 분리하였다. 시아노코발아민 -b-산은 280.6 mg (14.9%) 수율로 분리하며, 시아노코발아민-d-산은 131.5 mg (7.0%) 수율로 분리하며 또 시아노코발아민-e-산은 94.26 mg (5.0%) 수율로 분리하였다.

실시예 2: 시아노코발아민 -b-(2- 아미노에틸 )아미드 [ 시아노코발아민 -b- 에틸아민 ]

시아노코발아민-b-(2-아미노에틸)아미드는 도데칸 유사체의 합성에 대해 Pathare et al. (Bioconjugate Chem. 1996, 217)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 에틸렌 디아민(132 mg; 0.147 ml; 2.2 밀리몰)을 DMF/H₂O 혼합물(10 ml: 1/1 v/v)에 용해시켰다. 1M HCl 부가에 의해 pH를 5로 조정하였다. 이 용액에 시아노코발아민-b-산 (60.0 mg, 44.4 μmol) 및 KCN (57 mg; 0.87 밀리몰)을 부가한 다음 pH를 5.5로 조정하였다. 이어, EDC (84.2 mg; 0.43 밀리몰) 및 HOSu (50.6 mg; 0.44 밀리몰)을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3일간 교반한 다음 여분의 EDC 및 HOSu를 24 시간 간격으로 부가하였다. 완성하기 위해 혼합물을 진공에서 증발 건조시킨 다음 예비적 HPLC 정제 처리(아세테이트 계, 구배: 0.5% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)하여 34 mg (55%)의 시아노코발아민-b-(2-아미노에틸)아미드를 수득하였다.

실시예 3: 시아노코발아민 -b-(4- 아미노부틸 )아미드 [ 시아노코발아민 -b- 부틸 아민]은 에틸 유사체의 합성에 대해 상기 기재한 바와 같이 제조하였다.

실시예 4: 시아노코발아민 -b-에틸- PAPAcet

시아노코발아민-b-에틸아민 (실시예 2; 24 mg; 17.2 μmol)을 DMF/DMSO 혼합물(5 ml; 4/1 v/v)에 용해시켰다. 이 혼합물에 3-[N-2-시아노에톡시카르보닐메틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노]-프로피온산 4-니트로페닐 에스테르 (14 mg, 34.1 μmol) 및 DIPEA (5 μl, 29 μmol)을 부가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 그 혼합물을 진공에서 증발 건조시켰다. 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 0.5% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의해 정제하여 20 mg (70%)의 시아노코발아민-b-에틸-PAPAcet 를 적색 고체로 수득하였다.

실시예 5: 시아노코발아민 -b-부틸- PAPAcet

시아노코발아민-b-부틸아민 (실시예 3; 5.5 mg; 3.9 μmol) 및 3-[N-2-시아노에톡시카르보닐메틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노]프로피온산 4-니트로페닐 에스테르 (2.5 mg, 6.1μmol)을 무수 DMSO (0.5 ml) 및 DMF(0.5 ml)의 혼합물에 용해시켰다. DIPEA(5μmol)을 부가하여 pH가 8 내지 9에 도달하게 하고, 그 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후, HPLC 분석에 의해 완전한 생성물 형성을 확인하였다. 용매는 진공하에서 부분적으로 증발시키고 에틸 에테르의 부가시 석출하는 생성물을 얻었다. 현탁액을 원심분리하고 3회 따라 내어 미세 분말을 생성하였다. 예비적 HPLC(아세테이트 계, 구배: 0.5% 분^-1 , 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 2.7 mg (41%)의 순수한 생성물을 얻었다.

실시예 6: 시아노코발아민 -b-부틸- 아미노카르복시메틸 - His - OMe

무수 DMSO (2ml) 중의 시아노코발아민-b-부틸아민 (49.6 mg; 34.8 μmol) 용액을 메틸 1-카르복시메틸-N-Fmoc-히스티네이트 히드로클로라이드 (35.5 μmol) 및 BOP(46.2 mg, 104.4 μmol)에 부가하였다. DIPEA(12μl, 70.0 μmol)를 부가하고 그 용액을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. HPLC 분석에 의해 코발아민 출발물질이 완전히 Fmoc 보호된 중간체로 전환되었음을 확인하였다. 이 중간체는 디에틸 에테르를 부가하는 것에 의해 석출되며, 현탁액을 여과하고 3회 따라내어 미세 분말을 얻었다. 중간체를 DMF (5ml)에 용해시키고 피페리딘(225 μl)를 부가하였다. 실온에서 1.5 시간 동안 교반한 후, 디에틸 에테를 부가함으로써 생성물을 석출시키고 그 현탁액을 여과하고 3회 따라내어 미세 분말을 얻었다. 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 순수한 생성물을 17.1 mg (32.1%) 수율로 얻었다.

실시예 7: 시아노코발아민 -c-(4- 아미노부틸 )-아미드[ 시클로코발아민 -c- 부틸아민 ]

시아노코발아민-c-산은 브라운 등 (Inorg. Chem. 1995, 3038)에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 1,4-디아미노부탄(0.059 ml; 0.50 밀리몰)을 DMF/H₂O 혼합물(10 ml; 1/1 v/v)에 용해시켰다. pH는 1M HCl을 부가함으로써 5.2로 조정하였다. 이 용액에 시아노코발아민-c-산 (16.0 mg, 11.8 μmol), KCN (15.3 mg; 0.236 밀리몰), EDC (9.0 mg; 47.2 μmol) 및 HOSu (5.4 mg; 47.2 μmol)을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 4일간 교반한 다음 여분의 양의 EDC 및 HOSu를 부가하였다. 하루 후, 여분의 양의 EDC 및 HOSu를 다시 부가하였다. 총 6일 후, HPLC 분석에 의해 코발아민 유도체의 완전한 전환을 확인하였다. 워크업(work-up)을 위하여, 상기 혼합물을 진공에서 증발 건조시키고 예비적 HPLC 정제 (RP C18 칼럼, 완충액 a인 HCl 1 mM, 구배: 20% 메탄올 내지 50% 메탄올 30분간)시켜 9.8 mg (58%)의 시아노코발아민-c-부틸아민을 얻었다.

실시예 8: 시아노코발아민 -c-부틸- PAPAcet

시아노코발아민-c-부틸아민 (7.0 mg, 4.9μmol) 및 3-[N-2-시아노에톡시카르보닐메틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노프로피온산 4-니트로페닐 에스테르 (3.8 mg, 9.2 μmol)를 반응시키고 시아노코발아민-b-부틸-PAPAcet (실시예 5)의 합성에서 기재된 바와 같이 정제하여 순수한 생성물을 3.8 mg (78%) 수율로 얻었다.

실시예 9: 시아노코발아민 -b-부틸- PAPA - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-부틸아민 (실시예 3; 24.6 mg; 17.2 μmol) 및 Re(CO)₃(3-[N-카르복시메틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노]프로피온산) (9.1 mg, 17.2 μmol)을 DMSO에 용해시켰다. BOP (22.9 mg, 51.7 μmol) 및 DIPEA(2.94 ㎕, 17.2 μmol)를 부가하고, 그 혼합물을 실온에서 교반하였다. DIPEA 및 BOP를 매일 4시간 동안 부가하였다. HPLC 분석에 의해 2개 생성물 형성을 확인하였다. 이들은 에틸 에테르 부가시 석출되었다. 현탁액을 원심분리시키고 3회 따라내어 미세 분말을 얻었다. 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 0.5% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 2.3 mg (7.0%)의 주요 생성물 피이크 분리 분리를 얻었다.

실시예 10: 시아노코발아민 -b-에틸- PAMA - OEt

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 (N-2-아미노에틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산 에틸 에스테르 (에틸-PAMA-OEt) 히드로클로라이드 (무수 EtOH/2M HCl 혼합물(7.5 ml 4/1 v/v) 에서 철야로 교반함으로써 Boc-보호된 유도체를 분해한 다음 진공에서 휘발물질을 제거하는 것에 의해 제조)를 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매 를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 12 mg (51%)의 시아노코발아민-b-에틸-PAMA-OEt를 적색 고체로 수득하였다.

실시예 11: 시아노코발아민 -b-프로필- PAMA - OEt

새롭게 제조된 (N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산 에틸 에스테르 (361 μmol)이 물(1 ml)에 용해된 용액을 시아노코발아민-b-산(65.0 mg, 48.1 μmol)에 부가하였다. EDC (46.1 mg, 240 μmol)를 부가하고, NaOH 0.1M을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 실온에서 15시간 동안 교반한 후, HPLC 분석(아세트산 나트륨 완충액)은 약 50%의 생성물 형성을 나타낸다. EDC (46.1 mg, 240μmol)을 다시 부가하지만, 실온에서 지속된 교반은 더 이상의 생성물 형성을 초래하지 않는다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 예비적 HPLC (구배 a/b 0.5% 분^-1 , 100% 완충액 a에서 시작)에 의해 정제하였다. 주요 분획을 수집하고, 용매를 진공에서 제거하며, 생성물을 탈염시켜 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt를 25.8 mg (16.2 μmol, 33.3%) 수율로 수득하였다.

실시예 12: 시아노코발아민 -b-부틸- PAMA - OEt

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 (N-4-아미노부틸-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산 에틸 에스테르 (부틸-PAMA-OEt) 히드로클로라이드 (무수 EtOH/2M HCl 혼합물(7.5 ml 4/1 v/v) 에서 철야로 교반함으로써 Boc-보호된 유도체를 분해한 다음 진공에서 휘발물질을 제거하는 것에 의해 제조)를 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 15 mg (63%)의 시아노코발아민-b-부틸-PAMA-OEt를 적색 고체로 수득하였다.

실시예 13: 시아노코발아민 -b-부틸- PAMA - OH

브로모아세트산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르를 무수 THF중, 0℃ 에서 브로모아세틸 브로마이드 및 9H-플루오레닐메탄올로부터 제조하였다. Boc-부틸-PAMa-OFm ([(4-tert-부톡시카르보닐아미노-부틸)-피리딘-2-일메틸-아미노]-아세트산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르)는 Boc-NH-(CH₂)₄NH₂, 피리딘-2-알데히드 및 브로모아세트산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르로부터 Schibli et al. (Nucl. Med. Biol. 2003, 30, 465)에 의해 Boc-펜틸-PAMA-OMe의 합성에 대해 사용된 방법에 따라 제조하였다.

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg, 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 [(4-아미노-부틸)-피리딘-2-일메틸-아미노]-아세트산 9H-플루오렌-9-일메틸 에스테르 (부틸-PAMA-OFm)(트리플루오로아세트산/CH₂Cl₂ 혼합물 (4 ml 1/2 v/v)에서 1시간 동안 교반하는 것에 의해 Boc-보호된 유도체를 절단한 다음 진공에서 휘발물질을 제거)을 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 15 mg의 시아노코발아민-b-부틸-PAMA-OFm을 적색 고체로 수득하였다.

시아노코발아민-b-부틸-PAMA-OFm (15 mg)을 3 ml의 HNEt₂/DMF 혼합물 (2/1 v/v)에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고 그 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1 출발 100% 완충액 a)에 의한 정제로 9 mg의 시아노코발아민-b-부틸-PAMA-OH를 적색 고체로 수득하였다.

실시예 14: 시아노코발아민 -b- 헥실 - PAMA - OEt

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg, 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 [(N-6-아미노헥실)-N-피리딘-2-일메틸-아미노]-아세트산 에틸 에스테르 (헥실-PAMA-OEt) 히드로클로라이드 (무수 EtOH/2M HCl 혼합물 (7.5 ml 4/1 v/v)에서 철 야로 교반함으로써 Boc-보호된 유도체를 절단한 다음 진공에서 휘발물질을 제거)를 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 10 mg (41%)의 시아노코발아민-b-헥실-PAMA-OEt를 적색 고체로 수득하였다.

실시예 15: 시아노코발아민 -b-에틸- PAMA - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-에틸-PAMA-OEt (실시예 10, 11 mg; 7.0 μmol)을 4 ml의 2M NaHCO₃ 용액에 용해시켰다. 1.5 ml MeOH에 11 mg의 (NEt₄)₂[ReBr₃(CO)] (14.2 μmol)이 용해된 용액을 부가하였다. 그 혼합물을 85℃ 에서 1시간 동안 가열하였다. 그 혼합물을 실온으로 만든 후, 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 2.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의해 정제하였다. 수율: 11 mg (86%)

실시예 16: 시아노코발아민 -b-프로필- PAMA - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-산 (26.7 mg, 19.8 μmol), Re([N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸아미노]아세트산)(CO)₃ (29.2 mg, 60 μmol), EDC (11.5 mg, 60 μmol) 및 HOSu (6.9 mg, 60 μmol)을 물 (5 ml) 및 DMSO (0.5 ml)의 혼합물에 용해시키 고, 희석 HCl 및 NaOH를 사용하여 pH를 5.5 로 조정하였다. 실온에서 5 시간 동안 교반한 후, HPLC 분석(아세테이트 완충액)에 의해 약 33% 생성물 형성을 확인하였다. EDC 및 HOSu를 다시 부가하였다. 그 혼합물을 실온에서 3일간 교반하고 24시간 간격으로 EDC 및 HOSu를 부가하였다. 진공에서 물을 제거하고 디에틸 에테르를 부가함으로써 생성물을 석출시켰다. 오일상 현탁액을 농축시키고 따라 내었다. 디에틸 에테르로 세척을 2회 반복하여 미세 석출물 형태를 얻었다. 조 생성물을 고진공에서 건조시키고, 예비적 HPLC (구배 a/b 1% 분^-1, 100% 아세테이트 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 9.1 mg (23%)의 시아노코발아민-b-프로필-Re(CO)₃을 생성하였다.

실시예 17: 시아노코발아민 -b- 헥실 - PAMA - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 [Re(N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노]아세트산)(CO)₃]?CF₃COOH (CH₂Cl₂ 및 TFA-(2/1 v/v)에서 0℃ 에서 1시간 동안 보호된 복합체의 Boc 분해에 이어 진공하 실온에서 휘발성 물질을 제거함으로써 제조)를 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하 였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 11 mg (40%)의 시아노코발아민-b-헥실-PAMA-Re(CO)₃ 를 수득하였다.

실시예 18: 시아노코발아민 -d-프로필- PAMA - OEt

시아노코발아민-d-산 (9.3 mg, 6.9μmol)을 시아노코발아민-b-프로필-PAMA-OEt (실시예 11)의 합성에 기재된 바와 같이 (N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노)아세트산 에틸 에스테르 (7 μmol) 및 EDC (6.6 mg, 34 μmol)와 반응시켰다. 생성물을 3.6 mg (33%) 수율로 분리하였다.

실시예 19: 시아노코발아민 -d-프로필- PAMA - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-d-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (1.5 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 [Re(N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노]아세트산)(CO)₃를 DMF/NEt₃ 혼합물 에 용해시켰다. 그 혼합물을 함께 부가하고, TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 그 혼합물을 실온에서 45분간 교반한 후, 진공에서 용매를 증발 건조시켰다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 20 mg(73%)의 시아노코발아민-d-프로필-PAMA-Re(CO)₃ 를 수득하였 다.

실시예 20: 시아노코발아민 -b-프로필- His - OMe

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (1.5 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 4 당량의 메틸 3-아미노프로필-N-Teoc-히스티티디네이트를 DMF에 용해시켰다. 그 혼합물을 함께 부가하고, TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 그 혼합물을 45분간 교반한 후, 진공에서 용매를 증발 건조시켰다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 16 mg을 적색 고체로 수득하였다. (67%)

상기 Teoc-보호된 화합물의 19 mg 샘플을 TFA/CH₂Cl₂ 혼합물(4/1 vv)에 0℃ 에서 용해시켰다. 상기 온도에서 4시간 동안 교반한 후, 분석 HPLC에 의해 출발 물질의 완전한 전환을 나타내었다. 실온의 진공하에서 용매를 제거하였다. 그 잔류물에 무수 Et₂O를 부가한 다음 진공에서 용매를 제거하였다. 이 단계를 총 3회 실시하여 미량의 TFA를 제거하였다. 예비적 HPLC (아세테이트 계; 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 11 mg을 표제 화합물을 얻었다.

실시예 21: 시아노코발아민 -b-프로필- His - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-산 (20.0 mg; 14.8 μmol)을 DMSO (0.8 ml)에 용해시켰다. 이어 DMF(2 ml) 및 NEt₃ (0.1 ml)를 부가하였다. 다른 플라스크에서 약 5 당량의 [Re(N-3-아미노프로필-N-피리딘-2-일메틸-아미노]아세트산)(CO)₃?CF₃COOH (CH₂Cl₂ 및 TFA-(2/1 v/v)에서 0℃ 에서 1시간 동안 보호된 복합체의 Boc 분해에 이어 진공하 실온에서 휘발성 물질을 제거함으로써 제조)를 DMF/NEt₃ 혼합물(4.5 ml; 8/1 v/v)에 용해시켰다. 2개 용액을 혼합한 다음 TBTU (32.1 mg, 0.1 밀리몰)을 부가하였다. 실온에서 45분간 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 예비적 HPLC (아세테이트 계, 구배: 1.0% 분^-1, 100% 완충액 a에서 시작)에 의한 정제로 7 mg (73%)의 시아노코발아민-b-프로필-His-Re(CO)₃ 를 수득하였다.

실시예 22: 시아노코발아민 -b-에틸- 트리아민

트리에틸렌테트라아민(55.4 ㎕, 369 μmol)을 DMF(2.5 ml) 및 물(2.5 ml)의 혼합물에 용해시켰다. KCN(9.6 mg, 147 μmol)을 부가하고, 수성 HCl을 부가함으로써 pH를 6으로 조정하였다. 시아노코발아민-b-산 (10.0 mg, 7.4 μmol), EDC(5.7 mg, 29 μmol) 및 HOSu (3.4 mg, 29 μmol)를 부가하였다. 동량의 EDC 및 HOSu를 6시간, 24시간, 48시간 및 120시간 후에 부가하였다. HPLC 분석(아세테이트 완충 액)은 느린 생성물 형성을 나타내며, 48시간 후에도 75% 전환율을 보이는데 이는 장시간 교반하여도 초과되지 않았다. 144시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 제거하고 그 생성물을 수성 TFA 0.1%를 완충액 a로 또 메탄올을 용매 b로 사용하는 예비적 HPLC에 의해 정제하여 80% 완충액 a로부터 구배 1% 분^{- 1} 으로 정제하였다. 생성물을 시아노코발아민-b-에틸-트리아민 x 3 TFA로서 7.5 mg (55%) 수율로 분리하였다.

실시예 23: 시아노코발아민 -b-에틸- 트리아민 - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-b-에틸-트리아민 (5 mg; 2.7 μmol) 및 (Et₄N)₂[ReBr₃(CO)₃] (2.2 mg, 2.9 μmol)을 포스페이트 완충액, pH 7.4 (0.1M, 0.33 ml)에 50℃ 에서 교반하였다. 1시간 후, HPLC 분석은 출발물질이 1개 생성물로 완전히 전환되었음을 나타낸다. 4시간 후, 반응 혼합물을 탈염시켜, HPLC 분석에 따르면, 2개의 입체이성질체의 약 2/1 비율의 혼합물인, 생성물을 얻었다. 2개의 입체 이성질체의 동일 패턴은 시아노코발아민-b-에틸-트리아민과 ^{99 m}Tc의 라벨링을 기초로하여 확인하였다.

실시예 24: 시아노코발아민 -5'- 포스포콜아민

시아노코발아민 (30 mg, 22.14 μmol), DCC (457 mg, 2.214 밀리몰) 및 N-Fmoc-포스포콜아민 (78.9 mg, 217.2 μmol)가 무수 DMF (2ml) 및 무수 피리딘(1 ml)에 용해된 용액을, N₂ 분위기하, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 2 ml의 물을 부가한 후 석출된 디시클로헥실우레아를 여과하고, 물 및 피리딘을 감압하 60℃ 에서 증발시켰다. 잔류물 용액을 DMF에 5% 피리딘이 용해된 용액을 사용하여 8 ml 부피로 희석시키고 실온에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 그 생성물을 디에틸 에테르를 사용하여 석출시키고, 원심분리시키며 몇회 세척하였다. 조 생성물을 에비적 HPLC (구배: 100% → 20% a, 0% → 80% MeOH , 30분; a = 0.1% AcOH, 물중의 10% 아세토니트릴; 유량 10 ml/분; 칼럼: M&N VP 250/21 Nucleosil 100-7C (18). 수율: 적색 고체로 82%.

실시예 25: 시아노코발아민 -5'- 포스포콜아민 - His - OMe

무수 DMSO (4 ml)에 시아노코발아민-5'-포스포콜아민 (50 mg, 33.8 μmol) 및 메틸 1-(카르복시메틸)-N-Fmoc-히스티네이트 히드로클로라이드 (25 mg, 50.7 μmol)을 용해시키고, 24 μl의 DIPEA를 사용하여 pH를 6-7로 조정하였다. BOP (45 mg, 101.5 μmol)를 고체로 상기 용액에 부가하고 실온에서 교반하였다. 1시간 후, 반응 혼합물의 pH는 산성으로 되며 이를 다시 중성으로 조정하였다. 5 시간 후, 분HPLC 분석에 의하면 출발물질은 전혀 검출되지 않았다. 디에틸 에테르를 사용한 석 출 후, 조 생성물을 DMF 및 피페리딘 (10 ml) 1:1 혼합물로 1.5 시간 동안 보호해제처리하였다. 시아노코발아민-5'-포스포콜아민 (실시예 24)에 기재된 바와 같은 예비적 HPLC에 의해 재석출 및 정제시킨 후, 생성물을 46% 수율로 얻었다.

실시예 26: 시아노코발아민 -5'- 포스포콜아민 - His - Re ( CO ) ₃

시아노코발아민-5'-포스포콜아민-His-OMe (실시예 25)에 기재된 바와 동일한 과정을 이용하고, 메틸 1-(카르복시메틸)-N-Fmoc-히스티네이트 히드로클로라이드 대신 1-(카르복시메틸)-히스티네이트의 Re(CO)₃ 복합체를 사용하였다. 순수한 생성물의 수율은 37% 이었다.

표 2: 하기 실시예의 화학식(I)의 코발아민 유도체의 구조 (X = CN)

실시예 27: 일반적 라벨링 과정

[^{99 m}TcO₄]^{- 1} 로부터 알베르토 등 (J. Am. Chem. Soc. 123, 3135-3136)에 의해 기재된 바와 같은 보라노카보네이트 키트를 이용하여 전구체 [^{99 m}Tc(OH₂)₃(CO)₃]⁺ 를 제조하였다. 고무 마개를 구비한 10 ml 유리 바이얼을 N₂ 로 세척하였다. 20 ㎕의 시아노코발아민 유도체 (물 중의 0.01M), 20㎕의 MES 완충액 (1.0M) 및 200 ㎕의 [^99mTc(OH₂)₃(CO)₃]⁺ 용액을 부가하고 그 반응 혼합물을 75℃ 에서 1 내지 2시간 동안 유지시켰다. γ-검출을 이용한 HPLC 분석을 실시하여 ^{99 m}Tc 종의 완전한 전환을 확인하였다. 이들 조건하에서, 킬레이터 중의 에스테르 보호 기를 절단하여 카르복실라토 착물을 생성하였다.

생체내 연구를 위해 또 수송 벡터에 대한 결합 연구를 위해, 고도의 특이적 활성이 요구된다. 따라서, 100 ㎕ 의 라벨링된 용액을 분석적 HPLC 계에 주입하여 뜨거운 비타민 유도체를 냉각 비타민 유도체로부터 분리하였다. 가장 높은 감마 활성을 갖는 용출액 분획(약 300 ㎕)은 정상 염수를 이용하여 정맥 주사하기 전에 동물당 10 μCi 농도로 희석시켰다. 분리 조건은 다음과 같았다: 아세테이트 완충액, b- 및 d-유도체에 대하여 XTerra RP8 칼럼, 구배: 0% 메탄올 (0분), 30% 메탄올 (15분), 100% 메탄올 (25 분), 다른 성분의 경우 Schibli 등 (Bioconjugate Chem. 2000, 343-351)에 의해 기재된 바와 같은 TEAP 계.

실시예 28: 토끼 전혈로부터 트랜스코발아민 II ( TcII )의 제조

TcII를 시아노코발아민-아가로오스 매트릭스 (시그마)상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 겔(5 ml)를 먼저 200 ml 50mM 트리스/1M NaCl, pH 8.0으로 세척한 다음 200 ml 0.1M 글리신/0.1M 글루코오스/1M NaCl pH 10으로 세척한 다음 다시 200 ml 50 mM 트리스 /1M NaCl로 세척하였다. 200 ml의 2회 원심분리된 전체 혈액(처음 5000 rpm 15분, 두번째 20'000 rpm 20분, 4℃)을 친화성 칼럼에 부가하고 칼럼을 앞에서와 같이 순차적으로 세척하였다. 결합된 TC II를 20 ml 4.0 M 구아니딘 HCl/50 mM 트리스 pH 8.0 으로 용출시킨 다음 두번째 단계에서는 4M 구아니딘 HCl/50 mM 트리스 pH 8.0으로 용출시켰다. 결합된 Tc II의 대부분은 4M 구아니딘 HCl에 의해 용출되었다. 프로브를 H₂O에 대해 4에서 2일간 투석시켰다. 전형적인 수율은 5-30 nmol 이며, 이것은 토끼당 TC II 7.5-10 ㎍에 상당하였다(MW: 50 kDa).

실시예 29: 세균으로부터 트랜스코발아민 II ( TcII )의 재조합 제조

trxB 및 gor 유전자에서 이중 녹-아웃(knock-out)된 K12 유도체인 대장균 균주 FA113에서 트랜스코발아민 II cDNA를 발현시킴으로써 세포질은 산화 환경을 형성하여 디술피드 형성을 허용한다. 트랜스코발아민 II 단백질은 PreSCission 프로테아제 부위에 이어 N-말단 히스티딘 태그를 함유한다. 단백질은 니켈 키레이팅 세파로오스를 이용하여 대장균 추출물의 가용성 분획으로부터 분리하였다. 코발아민을 킬레이팅 칼럼에 결합된 트랜스코발아민 II로부터 8M 우레아를 이용하여 제거하 고, 또 트랜스코발아민 II는 이미다졸을 방출하였다. 일부 제제에서, His-tag를 특정 프로테아제에 의해 제거한다.

실시예 30: 트랜스코발아민 I ( TCI ; 하프토코린 )의 제조

트랜스코발아민 I의 공급원으로서, 채식주의 인간 검체의 타액을 사용하였다. 타액을 20'000 rpm 20분으로 4℃ 에서 원심분리하고, PBS와 1:1 혼합한 다음 멸균 여과하였다. 트랜스코발아민 I의 결합능은 통상 10 ng/ml이었다.

실시예 31: 시아노코발아민 유도체와 수송 단백질 TC I 및 TC II 의 상호작용 (도 1 및 도 2)

방사능라벨링된 (⁵⁷Co, ^{99 m}Tc, ¹⁸⁸Re, ¹¹¹In) 시아노코발아민 유도체의 상호작용은 겔-이동 분석으로 측정하였다. 방사능라벨링된 시아노코발아민 (0.05 ng 내지 1 ng)을 과량의 수송 단백질과 실온에서 15분간 반응시켰다. 이 혼합물을 흐르는 완충액 PBS 및 0.1% Tween 20이 든 겔-여과 칼럼(Superdex75, Amersham Biosciences)에 부가하였다. 수송 단백질에 결합되는 생물학적 활성 시아노코발아민은 수송 단백질에 따라서 약 1.4 kDa 내지 40-70 kDa 분자량으로 이동하였다. 수송 단백질의 결합능의 적정은 ⁵⁷Co-시아노코발아민 (ICN Biomedicals GmbH, 독일; 10 μCi/50 ng)을 사용하여 실시하였다.

실시예 32: ¹⁸⁸ Re - 트리카르보닐을 사용한 시아노코발아민 유도체의 라벨링

^`188Re-트리카르보닐의 제조 및 시아노코발아민의 라벨링은 1회 포트 반응으 로 실시하였다. 7.5 mg BH₃NH₃ 을 20 mg 아스코르브산 나트륨, 100 ㎕ 의 시아노코발아민 유도체 (10^-3 M), 900㎕ [¹⁸⁸ReO₄]^- 발생제 용출물 (0.9% 염수; 40 mCi 내지 270 mCi), 20 mg H₃PO₄ (85%)과 혼합하고 일산화탄소(CO) 로 20분간 가스처리하였다. 이 혼합물을 60℃ 에서 1/2 내지 2시간 동안 가열하고 또 90℃ 에서 1/2 내지 2 시간 동안 가열하였다. 라벨링된 시아노코발아민을 역상 HPLC 칼럼 (Waters Xterra RP8) 상에서 포스페이트 완충액을 사용하여 선형 메탄올 구배를 이용하여 라벨링되지 않은 것으로부터 분리하였다 활성 분획을 정맥 주사하기 전에 정상 염수를 사용하여 희석시켜 영상화를 위해서는 동물당 10 μCi 농도로 희석시키고 또 치료 처리를 위해서는 2 mCi로 희석시켰다.

실시예 33: 이온화 방사능에 대한 종양 세포 구형체(spheroid)에 대한 민감성

방사성생물학에서, 구형체 및 종양 이종이식편을 갖는 마우스 사이의 방사능 반응의 유사성은 구형체를 생체내 조사연구에 대한 중요한 대체 모델로 만든다. 다세포 종양 구형체를 스피너 플라스크에서 37℃에서 연속적으로 교반하면서 400 ㎛ 평균 직경으로 성장시켰다. 구형체를 수집하고, 신선한 배지에서 세척한 다음 24웰 플랫 저부 조직배양판에서 냉각 또는 ¹⁸⁸Re-라벨링된 시아노코발아민 유도체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 투여량 범위는 웰당 1μCi 내지 20 μCi 이다. 세포 독성은 형광 생존 마커에 의해, 전체 구형체의 직경의 측정에 의해 및 반고형 한천에서 분산된 구형체의 클론원성클론 분석에 의해 평가하였다.

실시예 34: 마우스에서 방사능라벨링된 시아노코발아민 유도체의 생체분포 (도 3, 4, 5, 6)

⁵⁷Co-시아노코발아민을 사용한 생체분포 연구에 있어서, 0.2 μCi /1 ng의 방사능라벨링된 시아노코발아민을 180 ㎕ 정상 염수와 혼합하고 종양 함유 balb/c 마우스 (동계 마우스 흑색종 B16-F10)에 정맥주사하였다. 소정 시간(5분 내지 24시간)후, 동물을 죽이고, 기관의 중량을 측량하고 감마 카운터를 계수하였다. ^99mTc-라벨링된 시아노코발아민을 사용한 생체분포 연구에 있어서, 10μCi/0.5 ng의 방사능라벨링된 시아노코발아민을 정상 염수와 혼합하고 전과 같이 사용하였다. ¹¹¹In-라벨링된 시아노코발아민을 생체분포 연구에 있어서, 2 μCi/5 ng의 방사능라벨링된 시아노코발아민을 정상 염수와 혼합하고 전과 같이 사용하였다. 비타민 B12 결핍 식품의 효과를 연구하기 위해, 정상 식품을 취한 마우스에서 라벨링된 시아노코발아민 생체분포를 비타민 B12 결핍 식품을 취한 마우스에서 생체분포와 2주 동안 비교하였다.

실시예 35: 종양을 갖는 마우스에서 ¹⁸⁸ Re - 라벨링된 시아노코발아민 유도체를 사용한 치료 연구

치료 연구를 위해, 동계 흑색종 종양을 balb/c 마우스에서 약 200 mg (칼리버로 측정) 크기까지 생장시켰다. 증가량(0.1 내지 2 mCi)의 방사능라벨링된 시아 노코발아민 작성물 및 냉각 작성물을 정맥 주사하였다. 종양 부피는 칼리버로 측정함으로써 평가하였다. 종양이 800 mg 크기에 도달하면, 동물을 죽였다. 일련의 실험에서, 동물을 분할 구획 처리하였다: 방사능라벨링된 시아노코발아민은 1주간 3회 처리하였다. 종양이 재생장하는지 60일간 동물을 관찰하였다.

Claims (25)

1. (a) 결합 시험에서 비변형 코발아민의 결합 친화력과 비교할 때 트랜스코발아민 II에 대하여 0 내지 20%의 결합 친화력을 갖고, 또

   (b) 성장 분석에서 비타민 B12 대체물로서의 활성을 2% 내지 100% 유지하는,

   하기 화학식(I)의 코발아민 유도체:

   

   (I)

   식중에서,

   R^b, R^c 및 R^d 중의 하나는 스페이서-킬레이터 기, 항생물질 또는 항증식성 치료제이고, 나머지 치환기 R^b, R^c 및 R^d 는 수소이며;

   R^e 및 R^R 는 수소이고;

   X는 시아노, 메틸, 히드록시, 아쿠오 또는 5'-데옥시아데노실 기이며; 또

   중심 코발트 원자는 비방사능활성 또는 방사능활성 동위원소 ⁵⁷Co 및 ⁶⁰Co이고, 이때

   상기 스페이서-킬레이터 기는 하기 화학식(II) 내지 (IX)의 킬레이터로부터 선택되는 킬레이터를 갖는 2 내지 6개 탄소원자의 지방족 사슬로 이루어지며,

   

   화학식(II) 내지 (IX) 중의 카르복실 기는 알킬 에스테르일 수 있거나, 또는 화학식(II) 내지 (IX)의 킬레이터는 금속 원자에 착화될 수 있음;

   상기 항생물질 또는 항증식성 치료제는 아미노글리코사이드 항생물질, 테트라사이클린, 항대사물질, 마크롤리드, 트리메토프림, 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴, 다카르바진, 시클로포스파미드, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 도세탁셀, 독소루비신, 블레오마이신, 토포테칸, 이마티니브 메실레이트, 덱사메타손, 포르볼 미리스테이트 아세테이트, 시클로스포린 A, 퀘르세틴 또는 타목시펜이며, 이들은 코발아민의 NH 또는 O 작용에 직접적으로 부착되거나 또는 2 내지 6개 탄소원자의 지방족 사슬을 통하여 공유결합적으로 결합된다.
2. 제1항에 있어서, 화학식(II) 내지 (IX)의 킬레이트에 착화된 금속원자는 방사능활성 금속 원자인 코발아민 유도체.
3. 제2항에 있어서, 화학식(II) 내지 (IX)의 킬레이트에 착화된 금속원자는 ^94mTc, ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu 또는 ¹⁷⁷Lu 인 코발아민 유도체.
4. 제1항에 있어서, X가 시아노인 코발아민 유도체.
5. 제 1항에 있어서, R^b는 스페이서-킬레이터 기이고, 스페이서는 2 내지 4개 탄소원자의 지방족 사슬이며 또 킬레이터는 화학식(II)이며, 카르복실 기는 알킬 에스테르 형태로 존재할 수 있거나, 또는 킬레이터는 금속 원자에 착화될 수 있으며; 또 X가 시아노인 코발아민 유도체.
6. 제1항에 있어서, R^b는 스페이서-킬레이터 기이고, 스페이서는 4개 탄소원자의 지방족 사슬이며 또 킬레이터는 화학식(II)이며, 카르복실 기는 에틸 에스테르 형태일 수 있거나, 또는 킬레이터는 금속 원자에 착화될 수 있으며; R^c, R^d, R^e 및 R^R 가 모두 수소이며; 또 X가 시아노인 코발아민 유도체.
7. 제1항에 있어서, R^b는 스페이서-킬레이터 기이고, 스페이서는 3개 탄소원자의 지방족 사슬이며 또 킬레이터는 화학식(II)이며, 카르복실 기는 알킬 에스테르 형태일 수 있거나, 킬레이터는 금속 원자에 착화될 수 있고; R^c, R^d, R^e 및 R^R가 모두 수소이며; 또 X가 시아노인 코발아민 유도체.
8. 제1항에 있어서, R^b는 스페이서-킬레이터 기이고, 스페이서는 2개 탄소원자의 지방족 사슬이며 또 킬레이터는 화학식(III)이며 또 금속 원자에 착화될 수 있고; R^c, R^d, R^e 및 R^R가 수소이며; 또 X가 시아노인 코발아민 유도체.
9. 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염을 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 코발아민 유도체를 포함하는 약학적 조성물.
10. 신생물 질환 또는 미생물에 의한 감염을 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 코발아민 유도체를 포함하는 진단용 조성물.
11. 제10항에 있어서, 암 영상화를 위한 진단용 조성물.
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