KR101123976B1

KR101123976B1 - 하나 이상의 생물학적 매질의 전체 및 특이적 ｄｎａ 복구 능력의 정량적 평가 방법 및 응용

Info

Publication number: KR101123976B1
Application number: KR1020057011410A
Authority: KR
Inventors: 실비 소베조
Original assignee: 꼬미싸리아 아 레네흐지 아또미끄
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2012-03-23
Also published as: US20060147929A1; KR20050123090A; JP4562531B2; EP1576191B1; ES2276157T3; FR2849058A1; EP1576191A2; US20150031580A1; JP2006510385A; DE60309930T2; FR2849058B1; PL384058A1; DE60309930D1; CN1738913A; ATE346171T1; CN100455674C; WO2004059004A3; US9617580B2; WO2004059004A2; AU2003299364A1

Abstract

본 발명은 매질의 삭제/재합성 능력을 평가로 구성되는, 생물학적 매질의 전체 및 특이적인 DNA 복구 능력의 정량적 평가 방법 및 적용에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 다음과 같은 단계: (a) 각각의 다른 DNA 병변을 포함하는 플라스미드 세트를 제조하는 단계; (b) 플라스미드 세트로부터의 각 플라스미드 상에 존재하는 손상들을 구별하는 단계; (c) 미리 정해진(pre-established) 배열 A에 따라 상기 플라스미드 세트의 다양한 플라스미드 및 하나 이상의 손상없는 수퍼코일된 대조군(control) 플라스미드를 단일 고체의 지지체에 부착시켜서 다른 영역 A₁ 내지 A_x로 나눠진 기능을 갖춘 지지체(support)를 형성하는 단계(여기서, x는 동시에 테스트되는 생물학적 매질의 수와 대응되고, 각 영역 A₁ 내지 A_x는 상기 플라스미드 세트를 포함함); (d) 상기 단계 (c)에서 수득된 기능화된 지지체와 다른 복구 용액을 배양하는 단계; (e) 상기 기능화된 지지체를 적어도 한번 세척하는 단계; (f) 단계 (d)에서 복구 반응동안 DNA로 삽입된 표시제에 의해 발생된 신호를 직접적 또는 간접적으로 측정하는 단계; (g) 각 플라스미드 부착에 대응하는 신호를 기록하고 정량하는 단계; 및 (h) 동일하게 부착된 대조군 플라스미드에 대한 손상을 포함 하는 플라스미드의 신호 비율을 결정하는 단계를 포함한다.

생물학적 매질, 복구 능력, 수퍼코일된 분획, 지지체, 대조군

Description

하나 이상의 생물학적 매질의 전체 및 특이적 ＤＮＡ 복구 능력의 정량적 평가 방법 및 응용 {Method for the quantitative assessment of global and specific DNA repair capacities of at least one biological medium, and the applications thereof}

본 발명은 생물학적 매질의 삭제/재합성 능력을 평가함으로써 상기 매질의 전반적이고 특정한 DNA 복구(repair) 능력의 양적 평가 방법에 관한 것으로, 또한 이의 응용에도 관여한다.

DNA는 염기 또는 당 손상(lesions)의 형성을 초래하는 내인성(endogeneous) 또는 외인성의(exogeneous) 공격을 끊임없이 겪는다.

상기 손상은 하기의 것을 포함한다:

- 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 염기의 손상: 세포 대사 및 광감작(photosensitization)에 의해 유도된 산화적 손상; 다환의(polycyclic) 탄화수소와 같은 많은 유전자독성 시약의 해로운 작용으로부터 초래된, 화학적 부가물의 생성을 통한 손상; 메테노-염기(metheno-bases) 또는 에테노-염기(etheno-bases)의 형성을 통한 손상;

- DNA 이중 나선 구조의 손상: 일반적으로 자외선 조사(피리미딘 사이의 가교형성으로 이합체가 됨) 또는 상반된 가닥에 의해 운반된 염기들 사이에 안정한 공유결합을 형성하는, 시스플라틴(cisplatin) 및 삽입 시약(intercalating agents)와 같은 이작용기성 항암제에 의해 야기된 내부가닥(intrastrand, 동일한 가닥의 근접한 두개의 염기 사이) 또는 사이가닥(interstrand, 상동 가닥 상에 위치한 두개의 염기 사이) 가교(bridge)의 형성;

- DNA가 부분적으로 불안정한 분자라는 사실로 인한 자발적 손상: 자발적 탈아미노화(deamination) 또는 탈퓨린화(depurination);

- 단일-가닥 또는 이중-가닥 절단(breakage)을 통한 손상: 이온화 방사선과 같은 작용제에 의해, 그리고 자유 라디칼을 통해 생성됨;

- 당 손상: 가닥 절단(breakage)에 후속하는 손상 부위(site)에서의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합의 절단(breakage)을 초래하는 디옥시리보오스(deoxyribose)의 파괴.

유도된 손상의 다양성은 다음의 UVC 조사가 측정된 안정한 광생성물을 분석함으로써 설명된다: 사이클로부탄 고리의 형성으로 인해 피리미딘 이합체에 접하여 두개의 근접한 피리미딘 사이에 피리미딘 (6-4) 피리미돈이 형성된다. 피리미딘 이합체 및 (6-4) 생성물의 상대적인 비율은 10 내지 4의 범위이다. 또한, 자외선 조사의 치명적 효과 및 돌연변이적 효과에서 그들 각각의 유효성(effectiveness)은 다르다: 이합체는 (6-4) 생성물보다 더 커다란 세포 독성(cytotoxic) 역할을 갖는 한편, 돌연변이적 효과에 있어서는 반대이다. 유사하게, 이온화 방사선(예를 들어, 코발트 60으로부터의 γ-ray)은 단일-가닥 또는 이중-가닥 절단(breakage)(대략 9:1의 비율로), 많은 염기 부가 생성물, 염기 손실 및, 높은 도스에서 DNA와 근접한 단백질(예를 들어, 크로모좀) 사이의 가교를 동시에 생기게 한다. 평균적으로, 하나의 가닥 절단(breakage)은 변형된 염기마다 계산된다. 방사선의 세포 독성 효과에서 이중-가닥 절단(breakage)의 우세한 역할은 염기 변화(alteration)로 인한 돌연변이 효과를 수반한다.

이러한 다양한 유형의 손상은 단리된(isolated) DNA 상에서 생성될 수 있다. 예를 들어, (6-4) 광생성물-유형의 손상 및 사이클로부탄-유형의 피리미딘 이합체는 UVC 조사에 의해 유도되고(Hoeijmaker et al., Mutation Res., 1990, 236, 223-238); 산화적-유형 손상은 과산화수소 및 철 존재시 펜튼 반응(Fenton's reaction)에 의해 유도된다(Eliot et al., Free rad. Bio;. Med., 2000, 1438-1446). 변형된 DNA를 제조하는(prepairing) 또다른 방법은 분자 생물학 기술에 의해 플라스미드를 처리하는 단계(malipulating) 및 화학적 합성에 의해 얻어진 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계 및 관심있는 손상을 포함시키는 단계로 이루어진다(Biade et al., J. Biol. Chem., 1997, 273, 898-902).

모든 살아있는 유기체는 그들의 유전자(genome)의 완전성(integrity)을 유지하고자 하는 DNA 복구(repair) 시스템을 갖고 있다.

이러한 복구(repair) 시스템 중, 두가지는 DNA로부터 변형된 염기를 제거하는 기능을 가진다: 그것들은 염기 절단 복구(base excision repair, BER) 시스템 및 뉴클레오티드 절단 복구(nucleotide excision repair, NER) 시스템이다:

?BER 시스템은 보다 구체적으로 산화적 손상, 비염기성(abasic) 부위, 염기 분열(framentations), 염기 메틸화, 에테노-염기, 등과 같은 DNA에서의 작은 손상들의 복구를 위해 제공된다.

?NER 시스템은 아세틸아미노플루오린-DNA, 시스플라틴-DNA 및 프소라렌-DNA 부가물, DNA의 UVB 및 UVC 조사(irradiation)로부터 유도된 이합체, DNA 염기와 또다른 분자 사이에 형성된 공유성(covalent) 손상, 등과 같은 DNA 이중 나선의 뒤틀림을 유도하는, 광범위한(bulky) 손상들을 처리한다(Sancar et al. Annu. Rev. Genetics, 1995, 29, 69-105).

이러한 다양한 복구 시스템은 공통된 특성, 및 특히 하기와 같은 단계를 가진다:

- 복구(repair) 시스템에 속해있는 단백질에 의한 손상의 인식,

- 손상 및 선택적으로, 근접한 뉴클레오티드의 절단,

- 매질(medium)에서 폴리머라아제(polymerase)에 의한 손실 뉴클레오티드의 재합성,

- 복구는 대체로 기존(existing) DNA 가닥과 신생된 가닥의 결찰(ligation)로써 종결된다.

모든 이러한 경우에, 본 과정은 변형된 뉴클레오티드의 제거 및, DNA 사슬내에서의 복구 매질에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드 삼인산의 교체(replacement)와 같은 삽입(incorporation)을 포함한다.

하지만, 특히 진핵세포(eukaryote)의 복구 시스템은 매우 복잡하고 이 매우 단순화된 구성(configuration)의 변이체(variants)가 존재한다(전반적인 복구, DNA 전사와 관련된 복구, DNA 복제와 관련된 복구, 등)는 점을 주시해야 한다. 몇몇 단백질은 여러개의(several) 복구 시스템에 동시에 관여하며, 다른것들은 단일 시스템에서 특이적이고, 몇몇 단백질은 세포질 또는 외부 요인들에 의해 유도될 수 있으며, 다른 것들은 편재된 일정한 발현을 가진다.

"기질(substrate)"이라 함은, 세포 추출물(extracts) 및 신장에 의한 DNA 병변(lesion, 손상)의 존재시 복구 반응이 진행될 수 있는 임의의 DNA를 가리킨다.

"생물학적 매질(biological medium)" 또는 "세포 추출물(cell extract)"이라 함은, DNA 복구에 관여하는 하나 이상의 효소 활성을 함유할 수 있는 정제되지 않은 생물학적 제제(preparation)에 의해 정제된 것을 가리킨다.

병변은 대체로 DNA에서 그것의 복구를 책임지는 특정한 단백질과 연관될 수 있다. 종(species)에 따라 차이점이 존재한다; 대장균(Escherichia coli)과 같은 원핵세포(prokaryotes)에서 효소들은 덜 특이적인 반면 인간에 있어서, 특히 BER 시스템에서는 훨씬 더 엄격한 병변-특이적 복구 효소 관련성(association)이 관찰된다. 예를 들어, Lindahl과 Wood는 상기 BER 시스템 효소가 인간에게 있어서 가장 중요하고, 또한 관련된 병변들에 있어서 중요하다고 설명한다(Science, 1999, 286, 1897-1905). 예를 들어, 인간의 상기 BER 시스템에 속하는 글리코실레이즈(glycosylase)인 OGG1 단백질은 8-옥소-2'-디옥시구아노신(8-oxo-2'-deoxyguanosine)의 복구와 관련된다. 대장균에서, 포름아미도피리미딘-DNA N-글리코실레이즈(formamidopyrimidine-DNA N-glycosylase)는 이와 동일한 병변을 복구하나, 더 일반적으로는 산화된 퓨린 염기를 복구시킨다(Seeberg et al., TIBS, 1995, 20, 391-397). 인간 단백질 ANPG는 박테리아 단백질 AlkA와 동등하다. 하지만, 이러한 효소들은 그들의 기질에 대해 동일한 친화력(affinities)을 갖는 것은 아니며 다른 절제 비율 상수를 가진다(Laval et al., Mut. res., 1998, 402, 93-102). 상기 BER 시스템에 의해 처리되는 약 40개 이상의 다른 병변들은, 만약 그것들이 복구되지 않는다면 무시할 수 없는 부정적인 생물학적 결과를 가져올 수 있다. 그들의 복구를 책임지는 효소들은 유력한 항암제 역할을 한다고 간주된다. 그들의 기질 특이성에 대한 명확한 지식은 매우 중요하게 보일 수 있다.

세포의 복구 능력 분석(assays)은 개발되어 왔고, 두개의 카테고리로 분류될 수 있다: 활성있는 세포 추출물의 사용을 요구하는 생체외 분석(in vitro assays), 및 살아있는 세포에서 수행되는 생체내(in vivo) 또는 반 생체내(semi in vivo) 시스템.

I. 삭제/재합성(excision/resynthesis) 활성 측정에 근거한 방법

A. 대부분의 생체외 분석은 복구과정의 삭제/재합성 단계를 평가하는, Wood 등(Cell, 1998, 53, 97-106 and Biochemistry, 1989, 26, 8287-8292)에 개시된 실험을 기초로 하여 전개되었다.

더 명확하게, 이 분석은 손상(UV 조사에 의한 피리미딘 이합체, 가교의 형성; DNase I의 작용을 통한 단일-가닥 제거 또는 절단(breakage))이 유도된 플라스미드 DNA의 사용을 포함하며; 이에 따라 변형된 상기 DNA는 적어도 평가될 세포 추출물, α-위치에 ³²P로 표지된 뉴클레오티드 삼인산염 및 ATP를 포함하는 복구 제제(preparation)의 존재하에서 30℃에서 배양된다. 상기 추출물에 함유된 효소들은 플라스미드 DNA를 절개하여(incise) 병변을 제거한다. DNA는 제거된 뉴클레오티드의 대체물에 의해 새로이 합성된다. 매질에 도입된 방사성의 뉴클레오티드는 합성과정동안 DNA 안으로 삽입된다. 복구된 플라스미드의 아가로우스 젤 전기영동에 의한 분리 후, 기질의 복구 비율에 비례하는, 삽입된 방사능(radioactivity) 양이 측정된다. 상기 세포 추출물을 제조하는 방법 및 상기 반응 조건들은 복구단계의 질에 영향을 미친다. 특히, 최상의 복구 수율은 생체외 전사에 사용된 유형의 전체 세포 추출물을 가지고 얻어지는 것으로 보이며, 반면에 SV40 기원(origin)으로부터 플라스미드 복제를 증진하는데 사용된 유형의 세포질의 추출물, 및 또한 다른 정제하지 않은(crude) 세포 추출물은, 복구단계의 올바른 해석을 하지 못하도록 하는 뉴클레아제(nuclease) 활성을 나타낸다.

Wood 등에 의해 정해진 조건하에서, 조사된 DNA에 관해서 반응의 특이성은 40-100mM 정도의 KCl 농도에서 더 크다. 더욱이, 복구동안 일어나는 조사된 DNA 복제는 일정한 ATP 농도가 유지되고, 이러한 농도가 보다 구체적으로는 복구의 절개 단계에 관련된다는 관점에서 볼 때, ATP의 존재 및 ATP-생성 시스템(인산크레아틴 + 크레아틴 포스포키나아제)에 고도로 의존적이다. 예를 들어, 상기 의존성은 가닥 절단(breakage) 복구의 경우에는 일어나지 않는다. 변형되지 않은 동일한 플라스미드로 이루어지는 대조군 샘플이 반응 혼합물에서 동시에 사용된다.

Wood 등의 분석은 방사성 표지의 사용을 요구하는데, 이것은 일상적인 분석에서 이러한 방법의 실행을 제한하는 한계점을 부가한다; 게다가, 이 분석은 일상적으로 사용되는데 있어서 단순성 및 실용성이 충분치 않다.

Wood 등의 상기 방법은 색소건피증(xeroderma pigmentosum)을 앓고 있는 환자로부터 확립된 세포에서 기인한 추출물을 특성화하는 분석에서 제안되어 왔다(Satoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6335-6339; Jones et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 991-995; Robins et al., EMBO J., 1991, 10, 3913-3921). 색소건피증은 다중유전(multigenic), 다중대립형질(multiallelic), 상염색체 퇴행성(autosomal recessive) 질병이다. 이 질병을 앓고 있는 환자로부터 기인된 세포들은 자외선 조사에 매우 민감하고 DNA 복구 결함을 나타낸다. 8개의 유전자가 이 질병의 다양한 상보성 그룹(complementation group)에 관여한다: XPA 내지 XPG 및 변이체(variant) 그룹 XPV. 각 그룹은 DNA 복구 및 특히 다양한 NER 서브타입(subtype)에 관한 다른 특성들을 가진다. 작은 손상 카테고리에 속하든지 광범위한 손상 카테고리에 속하든지, DNA 병변은 상보성 그룹에 따라 다르게 복구된다.

또한, 다른 복구 질병(코케인 증후군(Cockayne syndrome), 운동실조 모세관 확장증(Ataxia Telangextasia)은 특정한 복구 특성을 가지며 Wood 등의 방법에 의해 연구되어오고 있다.

B. 여러가지 문헌에서, B. Salles와 P. Calsou(Biochimie 1995, 77, 796-802; Anal. Biochem. 1995, 232, 37-42)의 팀은 마이크로플레이트(microplates)의 웰(wells)에 부착된 플라스미드 상에서 삭제/재합성 반응을 수행함으로써 DNA 병변을 검출하는 방법을 기술하고 있다. 상기 플라스미드는 마이크로플레이트 웰에서 흡수되고 그후에 화학적 시약 포스테리오리(posteriori)를 가지고 변형된다. 세포 추출물은 디고시제닌(digoxigenin)-표지된 뉴클레오티드 삼인산염과 함께 웰에 부가된다. 재합성 단계동안 손상 절단이 일어나면 상기 표지는 DNA로 삽입된다. 그후에 상기 표지는 알카라인 포스포타제에 결합된 항체(antibody)에 의해 각 웰에서 드러난다. 알카라인 포스포타제에 의한 탈인산화(dephosphorylation)후 발광성이 되는 기질이 각 웰에 부가된다. 각 웰에서 방출된 발광 신호가 측정된다. 그것은 상기 표지의 삽입율에 비례한다.

또한, 이 방법은 국제 특허 WO 96.28571에서도 기술되며, B. Salles와 P. Calsou의 팀에 속해있는 발명자는 DNA 병변을 질적 및 양적으로 검출하는 방법을 기술하고 있는데, 여기서 손상을 가진 DNA는 고체의 지지체에 부착되고 테스트될 세포 추출물을 포함하고 표지를 함유하는 조성물(composition)은 상기 손상을 가진 DNA와 접촉된다(상기 고체의 지지체로의 부착단계에 앞서 또는 이어서). 그들은 그들의 방법이 다수의 샘플을 동시에 다룰 수 있게 한다고 간주한다; 실시예를 참고해보면, 세포 추출물에서의 복구는, 150㎍의 단백질, 50mM의 KCl, 5mM의 마그네슘 염화물, DTT, 인산크레아틴, 인산크레아틴 키나아제 및 여러가지 dNTPs, 디옥시제닌으로 표지될 dNTPs 중 하나를 포함하는 추출물을 사용하여 50㎕의 반응 매질에서 수행된다. 상기 복구는 30℃에서 3시간동안 배양후 얻어지고 웰은 비이온성 계면활성제(트윈 20)가 0.05 및 0.15%의 비율로 부가된, 염을 가진 인삼염 완충제를 포함하는 세척 용액으로 세척된다(바람직한 조성: 10mM 인산염 완충제, 137mM NaCl 및 0.1% 트윈 20). 이 분석은 분석 용액에 있어서, 200 또는 300ng 대신에 40ng의 DNA 상에서 검출이 수행된다는 면에 있어서 매우 민감하다고 상술된다.

B. Salles와 P. Calsou의 팀에 의한 분석은 반드시 고체의 지지체에 부착한 후에 플라스미드를 변형시키도록 제안한다. 많은 화학적 또는 물리적 시약에 의해 생성된 손상들중 사슬 절단(chain breakage)이 포함된다. 이러한 절단(breakage)은 활동적인 세포 추출물에 의해 매우 빠르게 그리고 효과적으로 복구된다. 그러므로, 이 분석으로 절단(breakage) 복구와 다른 손상의 복구를 구별하는 것은 불가능하다. 절단(breakage) 복구는 심지어 다른 손상의 복구를 가릴 수 있고 다른 DNA의 손상의 복구에서 기인된 신호를 방해할 수 있다. 따라서, 그것은 복구 시스템에 의해 인식된 손상들의 규명없이 전반적인 효과의 검출을 허용하는 시스템이다.; 게다가, 이 방법의 목적은 DNA 복구에 관련된 단백질의 활동을 검출 및 양을 정하기 위함이 아니라 처리된 DNA 상의 손상의 존재를 규명하기 위함이다.

II. 절개/삭제(incision/excision) 단계의 평가에 기초한 방법

Wood 등에 의한 방법의 변형이 제안되었으며, 이는 단지 손상 절개(incision) 활성만을 측정하는 것을 특히 가능하게 한다.

A. Redaelli 등(Terat. Carcinog. Mut., 1998, 18, 17-26)은 뉴클레오티드 삼인삼염이 없는 추출물을 가지고 플라스미드를 직접 배양하는 방법을 기술하고 있다. 수퍼코일된 플라스미드 내 분열은 전기영동 동안 아가로오스 겔에서의 이동률 변화를 일으킨다. 수퍼코일된 플라스미드는 그것의 형태로 인해 절개된(incised) 플라스미드보다 더 빠르게 이동한다. 여러가지 형태의 플라스미드에 상응하는 밴드들이 정량된다; 절개된 형태의 양은 추출물을 함유하는 플라스미드의 병변 절개 활성과 상호 관계를 나타낸다.

더 명확하게, 이 문헌은 비염기성 사이트의 3' 또는 5' 위치된 디옥시리보스 포스포디에스터 결합의 절단하여, (알킬화, 가수분해 탈아미노화, 산화, 미스매칭) 복구될 변형에 특이적인 글리코실레이즈의 작용 후 얻어지는, 염기성 사이트 상에서 일어나는 AP-엔도뉴클레아제의 절개 활성을 연구한다. 이 문헌에서, 상기 AP-엔도뉴클레아제 활동은 인간의 백혈구의 조추출물(crude extract) 상에서 더 명확하게 연구되었다. 먼저, 상기 추출물(80㎕)은 손상되지 않은 플라스미드(대조군)와 함께 배양되었고, 두번째, 탈퓨린화된 플라스미드와 함께 배양되었다. 따라서, 절개 활성이 손상에 의존하고 EDTA에 민감한 한, AP-엔도뉴클레아제의 작용을 양적으로 평가하는 것이 가능하다는 것을 알았다.

B. P. Calsou와 B. Salles의 팀(Biochem. Biophys. Res. Com., 1994, 202, 788-795)은 플라스미드의 병변의 절개 활성을 좀더 명확하게 측정하는 또다른 접근을 제안하고 있다. 그들은 첫 번째 삭제 단계 후, 정상적인 DNA 단편들의 내인성(endogenous) 폴리머라제에 의한 재합성을 막기 위해서, 진핵세포의 폴리머라제에 특정한 억제제(inhibitor) 아피디콜린(aphidicolin)을 복구 매질 안으로 삽입한다. 외인성(exogeneous) 원핵세포의 폴리머라제는 모든 시험관에 동등한 양으로 반응 매질와 혼합되었다. 따라서, 얻어진 결과에서의 차이점은 손상 절단 단계를 반영하고 절단된 DNA 단편들의 재합성을 반영하지는 않는다.

C. 혜성(comet) 분석법(단일 세포의 알칼리 매질에서 겔 전기영동)의 변형에 기초를 둔 또 하나의 방법은 또한 절개 활성의 측정을 가능하게 한다. 그것은 Collins 외(mutagenesis, 2001, 16, 297-301)에 의해 개발되었다. 산화적 손상은 가시 광선에서 HeLa 세포의 광감작에 의해 유전자 DNA 안으로 삽입된다. 그후에 세포들은 현미경 슬라이드 위에 퍼져있는 아가로오스 겔에 결합되고, 그후에 세포막(cell membrane) 및 단백질은 조절된 세포용해(lysis)에 의해 제거된다. 상기 겔에서 분리된 뉴클레오티드는 첫번째 손상 절개 단계에서 활성이 있는 세포 추출물에서 배양된다. 그후에 슬라이드는 알칼리 매질에서 전기영동이 행해진다. 분열(cleavage)의 존재는 대체적으로 뉴클레오티드보다 더 빠른 이동을 유도한다. 그후에 DNA의 볼(ball)은 손상되지 않은(intact) DNA는 머리부분에 분열을 함유하는 DNA는 혜성의 꼬리부분에 있는, 혜성의 생김새를 가진다. 특정화된 소프트웨어에 의해 결정된, 혜성의 꼬리부분에 있는 DNA의 비율은 고려 중(under consideration)인 손상에 사용된 추출물에 함유된 절개 활성돠 직접적으로 관련이 있다. 이 분석법은 인간의 백혈구로부터 기인된 추출물에서 산화적 손상의 절단 활동을 측정하는데 적용되어 왔다. 1998년에 Redaelli외에 의해 기술된, 플라스미드의 분열을 측정한 방법과 비교했을 때, Collins 외의 방법은 가닥 분열을 평가하는 혜성 방법을 사용하며, 이 변형은 첫째로 현저히 더 민감하고(10⁹D 마다 대략 0.2 내지 2의 검출), 두번째로 반응 혼합물(겔에서 포함된 DNA)의 부피가 단지 50㎕이고 분석될 물질의 충분한 양이 10ml의 혈액으로부터 얻어지기(몇개의 배양을 수행할 가능성)때문에 경제적으로 장점(사용된 물질에 의한 절약)을 갖는 것으로 고려된다.

D. 국제 특허 WO 01/90408은 DNA 복구에 관련된 단백질의 활동을 검출 및 특성화하는 방법을 기술한다.

더 명확하게는, 이 방법은 하나 이상의 알려진 손상을 함유하는 하나 이상의 손상된 DNA의 고체 지지체로의 부착을 포함한다; 그후에 이 손상된 DNA는, 이 손상된 DNA의 복구에 관련된 하나 이상의 단백질을 함유하는 또는 함유하지 않는 복구 조성에 작용되고, 앞의 단계동안 부착되거나 지지체로부터 자신을 제거하는 표지에 의해 방출된 신호의 변동을 측정함으로써 복구를 위한 이 단백질 활성을 결정한다.

따라서, 15 내지 100개 염기의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 100 내지 20,000 염기의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 형태인 손상된 DNA를 가지고 사용된 이 시스템은, 몇개 기질의 절단이 동시에 측정될 수 있기때문에 다른 분석법보다 더 많은 전반적인 정보를 얻을 수 있게 한다.

하지만, 이 방법은 DNA 병변 절개 활동의 증명(demonstration)에 관여한다. 따라서, 합성의 올리고뉴클레오티드로 삽입될 수 있는 손상의 절단 단계를 특성화하는 것은 제한된다. 더욱이, 그것이 절단 활동에 관여하는 상당한 정보를 제공함에도 불구하고, 그것은 DNA의 삭제/재합성에 적절하지 않으며 DNA의 삭제/재합성을 위한 효소 활동의 정확한 정량적 평가를 기술하지 않는다.

상술된 각 기술에 대한 특정한 단점 외에도, 이러한 여러가지 방법들은 또한 다음과 같은 단점을 가진다:

- 상술된 모든 분석법은 다수의 생물학적 물질 및 특히 10㎕보다 더 큰 세포 추출물의 사용을 요구한다: 대체로 사용된 반응 부피는 대략 100㎍의 단백질의 양에 10 내지 40㎕의 추출물을 함유하는 50㎕이다. 상기 추출물은 준비하는데 오랜 시간이 걸리며, 사용가능한 세포의 양은 종종 적어서 이는 수행될 수 있는 분석법의 수를 제한한다.

- 사용된 방법이 무엇이든 그리고 용액 또는 지지체에서 수행되든지, 기술된 모든 이러한 시스템은 추출물의 나누어 떨어지는(aliquot) 분획에 있어서 주어진 기질에 제한되는 지점-지점(point-by-point) 복구에 관여하는 정보를 제공한다; 이것은 예를 들어, Wood 등에 의해 제안된 것과 같이, 복구 능력을 결정하는 분석법에서 각 분석법은 시험관에서 개별적으로 수행, 즉 반응은 주어진 플라스미드 및 주어진 추출물에서 일어나기 때문이다. 테스트될 각 추출물에 있어서 플라스미드로의 표지 삽입률은, 대조군 추출물에서의 동일한 방법으로 준비된 기질에서 얻어진 표지의 삽입율과 비교된다. 참고 대조군 추출물은 대체로 EBV 또는 SV40으로 형질전환된(transformed) 특성화된 세포로부터 준비된다. 상술된 Wood 등에 의한 방법의 대부분의 다른 변형들에 있어서도 동일한 것이 사실이다.

- 상기 분석법을 수행하기 위해서는 많은 노력이 필요하고, 대량의 생물학적 물질의 이용가능성을 요구하기때문에 실험자들은 사용된 기질의 수 및 테스트된 생물학적 추출물의 수를 제한한다.

- 플라스미드에 삽입된 손상들은 측정되지도 정량되지도 않는다. Wood 등에 의해 개발된 분석법을 사용하는 저자들은, 사슬 절단(breakage)을 함유하는 DNA를 제거하기 위하여 단지 그들의 수퍼코일된 형태를 잃어버린 플라스미드를 제거한다. 얻어진 정보는 주어진 생물학적 매질의 복구 능력을 정확하게 정의하고 특성화하는데 매우 부분적이고 불충분하다.

결론적으로, 본 출원인은 특히 대조군 복구 용액의 사용 없이 빠르고 정확하며 소형화된 효과적인 방법으로 생물학적 추출물에서의 DNA 복구를 위한 삭제/재합성(excision/resynthesis)을 위한 효소의 활동을 특성화하고 정량화하는 평가를 가능하게 하는 방법을 제안함으로써 종래 기술의 단점을 극복하고자 하는 목적을 제공한다.

본 발명의 목적은 하나 이상의 생물학적 매질의 전체 및 특이적인 DNA 복구 능력의 정량적인 평가를 위한 방법으로, 상기 방법은 다음과 같은 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:

(a) 하나 이상의 물리적 및/또는 화학적 시약(agent)를 이용하여 다양한 플라스미드의 개별적인 처리에 의한 뚜렷한 DNA 병변 및 상기 플라스미드의 각각의 수퍼코일된 분획(supercoiled fraction)의 복구를 포함하는 한 세트의 플라스미드(a range of plasmid)를 준비하는 단계: 수퍼코일된 분획의 선택은 가닥 절단(breakage)을 차단하고 뉴클레아제의 작용을 피하도록 해줌,

(b) 상기 플라스미드 세트의 각각의 플라스미드 상에 존재하는 손상들을 구별하는 단계,

(c) 미리 정해진(pre-established) 배열 A에 따라, 상기 플라스미드 세트의 다양한 플라스미드 및 병변 없는 하나 이상의 수퍼코일된 대조군 플라스미드를 단일 고체 지지체(solid support) 상에 부착시켜서(depositing) 다른 영역 A₁ 내지 A_x로 나눠진 기능화된 지지체(functionalized support)를 형성하는 단계(여기서, x는 동시에 테스트되는 생물학적 매질의 수에 상응하는 정수에 해당하고, 각각의 영역 A₁ 내지 A_x는 상기 플라스미드 세트를 포함함); 결과적으로, 상기 변형된 플라스미드 세트의 플라스미드의 다양한 표본은 동일한 고체의 지지체 위의 한정되고 정확하게 지정된 부위에 부착된다. DNA 병변이 없는 수퍼코일된 플라스미드를 함유하는 하나 이상의 대조군이 함께 부착되는 단계,

(d) 상기 단계 (c)에서 수득된 기능화된 지지체(support)를 다양한 복구 용액으로 배양하는 단계로서; 상기 배양에 앞서, 각 복구(repair)용액이 상기 기능화된 지지체의 서로 다른 미리 정해진 영역 A₁ 내지 A_x에서 부착시키고, 바람직하게는 1 내지 5시간 동안, 바람직하게는 3시간 동안, 30℃의 온도에서 배양하되, 상기 각각의 복구 용액은 복구를 위한 효소 활성을 포함하는 하나 이상의 생물학적 매질, ATP, ATP-재생(regenerating) 시스템, 표지된 뉴클레오티드 삼인산염 및 상기 생물학적 매질에 존재하는 복구 효소의 활성에 필요한 어떤 다른 구성 성분들을 포함함.
(e) 상기 기능화된 지지체를 적어도 한번 세척하는 단계,

삭제

(f) 각각의 상이하고 미리 정해진 영역 A₁ 내지 A_x에서, 단계 (d)에서 복구 반응동안 DNA로 삽입된(incorporated) 표지에 의해 발생된 신호를 직접적 또는 간접적으로 측정하는 단계,

(g) 각 영역 A₁ 내지 A_x에서 각각의 플라스미드 부착에 대응하는 신호를 기록하고 정량하는 단계,

(h) 함께 부착된 대조군 플라스미드에 대한 병변 포함 플라스미드의 신호 비율을 결정하는 단계.

본 발명에 따른 상기 방법은 몇가지 이점을 갖는다:

- 본 발명은 여러가지 유형의 손상의 복구를 동시에 평가하는 가능성으로 인해, 여러가지 손상을 규명하는 동안에 전반적인 효과를 검출하는 것이 가능하다.

- 본 발명은 대조군 생물학적 매질과의 비교에 의존하지 않고 생물학적 추출물의 절단 및/또는 삭제/재합성 능력을 결정하는 것이 가능하다. 이는 생물학적 추출물의 단일 샘플을 가지고 상기 방법을 수행함으로써 얻은 결과들이 추출물에 정확하고 정량화된 손상에 대하여 복구 효과를 부여하기에 충분하기 때문이다.

- 본 발명은 여러가지 생물학적 매질을 연구하는데 특히 적당하고 생체내 환경에 대한 좋은 반영이다.

- 본 발명에 따른 방법은 DNA 복구를 위한 그것의 효소 활동의 관점에서 주어진 생물학적 매질의 "지도작성(map)"을 가능하게 한다. 얻은 지도에 따라 생물학적 추출물을 규명하는 것이 가능하다.

- 본 발명은 주어진 생물학적 추출물에서 결핍 또는 부분적으로 결핍된 복구 단백질을 결정하는 것이 가능하며, 따라서 진단 테스트로서 제공되는 것이 가능하다.

- 또한, 본 발명에 따른 방법은 DNA 병변 복구의 관점에서 여러가지 생물학적 추출물의 성능 수준을 비교하는 것을 가능하도록 한다.

- 본 발명은 어떠한 방사성 동위원소도 사용하지 않는다.

- 본 발명은 소형화된 것이기 때문에(miniaturized), 매우 적은 양의 생물학적 재료를 사용하여 수많은 정보를 얻는 것이 가능하다.

- 본 발명은 자동화될 수 있다.

상기 방법의 바람직한 구체예에 따라, 단계 (a)에서 제조된 플라스미드는 이중-가닥의 수퍼코일된 형태를 갖는 것(pBR322, M13, pUC, 등)으로부터 선택된다.

대조군 플라스미드의 수퍼코일된 형태는 종래 기술, 예를 들어 퀴아겐 플라스미드 정제 키트를 사용한 정제에 의해 얻어진다. 또한, 그것은 다른 정제 단계, 예를 들어 세슘 클로라이드 원심분리 및/또는 수크로즈 구배 원심분리(gradient centrifugation)를 수행함으로써 원치않는 플라스미드를 제한하는데 바람직하다.

상기 방법 단계 (a)의 또다른 바람직한 구체예에 따르면, DNA 병변을 유도할 수 있는 여러가지 물리적, 생물학적 또는 화학적 시약는 바람직하게 단일 병변의 형성, 한정된 수의 병변 형성 또는 동일한 군(family)에 속하는 여러가지 병변의 형성을 유도하는 것들로부터 선택된다.

병변의 군으로서, 예를 들어 산화적 손상, 자외선 B 또는 C 조사에 의해 유도된 광생성물, 화학적 부가물, 에테노-염기, 비염기성 사이트 및 DNA 절단(breakage)이 언급될 수 있다.

물리적 및 화학적 시약은, 예를 들어 주로 다음과 같은 기능을 하는 것들로부터 선택된다.

- 광감작(photosentization) 메카니즘 II에 의한 경우: 단일체(singlet) 산소의 주된 표적은 구아닌이다; 이 경우에, 형성되는 많은 병변은 8-옥소구아닌이다(Ravanat et al., Chem. Res. Tox., 1995, 8, 379-388);

- 광감작 메카니즘 I 또는 OH⁰ 라디칼을 방출하는 메카니즘에 의한 경우; 이 경우에, 얻어진 DNA 병변은 산화적 병변이다; 이러한 병변은 DNA에서 퓨린 염기 및 피리미딘 염기에 동등한 방식으로 영향을 미친다. 이러한 병변들 중, 8-옥소구아닌, 글리콜(glycols), 티민(thymine), 파피-구아닌(fapy-guanine), 파피-아데닌(fapy-adenine), 히드록시메틸-우라실(hydroxymethyl-uracil), 5-히드록시메틸시토신(5-hydroxymethylcytosine) 및 포밀우라실(formyluracil)이 언급될 수 있다(cadet et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharm., 1997, 31, 1, 87);

- 트리플렛-트리플렛(triplet-triplet) 에너지 전환의 메카니즘에 의한 경우; 이 경우에, 형성되는 주된 손상은 사이클로부탄 피리미딘 이합체이다(Costalat et al., Photochem, Photobiol., 1990, 51, 255-262);

- 자외선 B 또는 C 조사와 같은 DNA 염기에 의해 직접 흡수된 에너지를 방출의 경우. 형성된 결합은 사이클로부탄 피리미딘 이합체, (6-4) 광생성물 및 듀어 원자가 이성체(Dewar valence isomer)이다(Douki et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 11678-11685);

- 단일체 산소 방출의 경우. 예를 들어, 이러한 시약은 엔도퍼록시드 군에 속한다. 이 경우에, 형성된 병변은 8-옥소구아닌이다(Ravanat et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 40601-40604).

화학적 시약은 알려진 염기 변형을 유도하는 일명 발암성물질 군에 속하는 것들로부터 선택된다. 예를 들어, 아세트아미노플루오렌(Hess et al., 1996, Nucleic Acid Res. 24, 824-828), 시스플라틴(Phsheva et al., 2002, Int. J. Biochem. Cell Biol., 34, 87-92), 벤조파이렌(benzopyrene)(Laws et al., 2001, Mut. Res.,484, 3-18), 프소라렌(psoralen)(Zhang et al., Mol. Cell. Biol., 2002, 22, 2388-2397), 클로로아세트알데히드(chloroactaldehyde)(CAA-Wang et al., 2002, 13, 1149-1157), 타목스펜(tamoxfen)(Dasaradhi et al., 1997, Chem. Res. Tox., 10, 189-196) 및 트란스, 트란스-2,4-데카디에날(trans, trans-2,4-decadienal)(DDE-Carvalho et al., 1998, Chem. Res. Tox., 11, 1042-1047)이 언급될 수 있다.

상기 방법의 단계 (a)의 또다른 바람직한 구체예에 따라, 여러가지 시약은 상기 플라스미드 세트의 각 플라스미드 상에서 사용된다.

상기 방법의 단계 (b)의 바람직한 구체예에 따라, 손상의 특성은 i) 손상을 가진 각 플라스미드의 분획을 수득하는 단계, (ii) DNA로부터 뉴클레오시드(nucleoside)를 방출하는 효소로 상기 분획의 각각을 소화시키는 단계(digesting), 및 그 후에 (iii) 정량적인 분석용 기술과 결합된 독립적인 기술의 조합을 이용하여 분해의 결과의 분석하는 단계를 포함한다.

본 구체예의 바람직한 배열(arrangement)에 따라, 상기 분해는 다음의 효소: 송아지 비장 포스포다이에스터라제(calf spleen phosphodiesterase), P1 뉴클레아제(P1 nuclease), 뱀 독 포스포다이에스터라제(snake venom phosphodiesterase), 및 알카라인 포스파타제(alkaline phosphotase) 중 적어도 하나를 사용하여 수행된다(Douki et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 11678-11685).

본 구체예의 또다른 바람직한 배합에 따라, 상기 효소 분해의 결과는 다음의 기술: 탠덤질량분광계(tandem mass spectrometry)와 결합된 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Douki et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 11678-11685; Sauvaigo et al., 2001, Photochem. Photobiol., 73, 230-237; Frelon et al., Chem. Res. Tox., 2000, 13, 1002-1010), 기체크로마토그래피와 결합된 HPLC(Wang et al., 2000, 13, 1149-1157; Pouget et al., 2000, Chem. Res. Tox., 13, 541-549) 또는 전기화학검출(electrochemical detection)와 결합된 HPLC(Pouget et al., 2000, Chem. Res. Tox., 13, 541-549) 중 하나에 의해 분석된다.

상기 방법의 또다른 바람직한 구체예에 따라, 단계 (c)전에, 단계 (a)에서 얻어진 수퍼코일된 형태의 플라스미드는 슈크로즈 구배 원심분리기 및/또는 세슘 클로라이드 구배 원심분리기에 의해 정제된다.

상기 방법의 또다른 바람직한 구체예에 따라, 단계 (c)전에 또한 상기 플라스미드 세트의 각 플라스미드가 염 및 비이온성 계면활성제(sulfactant)와 선택적으로 결합된 6.5 내지 8.0의 pH에서 완충제를 바람직하게 포함하는 희석 완충제에서 5 내지 100㎍/ml의 농도로 희석된다; 바람직하게는, 상기 완충제는 0.05M 내지 0.5M NaCl을 함유할 수 있는 10mM의 인산염 완충제 또는 SSC 완충제이다.

여러가지 플라스미드는 마이크로분석법의 생산을 위해 의도된 로봇을 사용하여 부착되는 것이 바람직하다. 즉, 상기 플라스미드 세트의 부착(deposits)의 부피는 100 내지 1000pl(picoliter)가 바람직하다.

상기 방법의 단계 (c)의 바람직한 구체예에 따라, 상기 지지체는 유리, 실리콘 및 이의 유도체로부터 선택된 유기 또는 무기 물질, 합성 또는 비합성 폴리머 및 선택적으로 기능화된 표면(surface)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로서, DNA에 대한 친화력을 증가시키기 위하여 감작된 지지체이다. 바람직하게는, 상기 지지체는 DNA를 흡수하는 폴리-L-리신으로 코팅된 유리 슬라이드, 또는 DNA와 공유결합을 형성하는 에폭시기로 기능화된 유리 슬라이드로 이루어진다.

필요하다면, 기능화된 그것의 지지체에 대한 DNA의 부착을 증가시키기 위한 처리가 실행된다. 이러한 처리들은 부착된 DNA에서 부가적인 손상을 생성해서는 안된다.

각 영역이 전체 플라스미드 세트를 포함하는 A₁ 내지 A_x영역을 포함하는 본 발명에 따른 표준 지지체는 상기 영역들의 각각은 다음을 포함한다:

- 하나 이상의 대조군 플라스미드 부착(deposit) 및

- 광생성물(photoproducts)을 함유하는 플라스미드의 부착 및/또는

- 산화적 손상을 함유하는 플라스미드의 부착 및/또는

- 에테노-염기(etheno-bases)를 함유하는 플라스미드의 부착 및/또는

- DNA 파손을 함유하는 플라스미드의 부착 및/또는

- 발암제 부가물을 함유하는 플라스미드의 부착.

본 발명에 따른 방법의 단계 (d)에 따라,

- 생물학적 추출물은 Manley 외(Methods Enzymol., 1983 101, 568-582)의 방법에 따라, 또는 Biade 외(J. Biol. Chem., 1998, 273, 898-902), 또는 복구 단백질을 함유하는 매질을 제공할 수 있는 어떤 다른 방법에 따라 준비될 수 있으며;

- 표지는 친화력 분자, 형광성 화합물, 항체 또는 비오틴으로부터 선택됨; 바람직하게는, 상기 표지를 시각화하기 위한 표지 또는 시약은 직접적 형광성(Cy-3 또는 Cy-5) 또는 간접적인 형광(비오틴 또는 디고시제닌)을 가진 형광성 화합물로 이루어진 군으로부터 특히 선택되고;

- 그후에 지지체는 복구 반응을 촉진하는 온도, 바람직하게는 30℃에서, 1 내지 5시간 사이의 기간, 바람직하게는 3시간동안 배양된다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (e)의 바람직한 구체예에 따라, 지지체는 비이온성 계면활성제를 함유하는 염수, 특히 트윈 20(Tween 20)을 함유하는 10mM 인산 완충제로 적어도 한번 세척한 후, 이어서 물로 적어도 한번 헹궈낸다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (f)에 따라, 신호는 표지에 적합한 방법에 의해 측정된다; 예를 들어, 표지가 형광성 물질이면, 지지체 상에 여러가지 침전물에 의해 방출된 형광성 신호의 직접적인 측정이 수행된다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (g)의 바람직한 구체예에 따라, 상기 신호는 표지, 바람직하게는 형광성 물질을 자극하고, 자극에 의해 방출된 신호를 측정할 수 있는 디바이스를 사용하여 양이 측정된다.

상기 신호는 지지체 및 사용된 표지에 적절한 기구에 의해 측정된다. 스캐너가 형광성 이미지 분석에 사용될 수 있고, 바람직하게는 사용된 표지에 특정한 파장에서 레이저 자극이 병행된다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (h)의 바람직한 구체예에 따라, 동일한 지지체에 위치된 대조군 플라스미드로 얻어진 신호에 대한 손상을 함유하는 플라스미드로부터 얻어진 신호의 수적 비율이 확정된다.

본 발명에 따라, 주어진 생물학적 매질의 복구 프로파일이 얻어진다.

매질의 전체 및 특정한 복구 능력의 결정하기 위해, 복구-관련 질병의 진단하기 위해, 또는 주어진 매질의 복구 능력에 대한 물리적 또는 화학적 처리(예를 들어, 유전자 독성 생성물)의 영향을 평가하기 위해 이 복구 프로파일이 사용될 수 있다.

결과적으로, 본 발명의 목적은 상기 정의된 방법의 사용에 있다:

- 생물학적 매질의 복구 프로파일의 확정,

- 복구-관련 질병을 진단,

- 주어진 생물학적 매질의 복구 능력에 대한 물리적 또는 화학적 처리의 영향 평가,

- 생물학적 매질의 복구 시스템을 조정할 수 있는 물질을 선별(screening).

전술한 배합(arrangement)외에도, 본 발명은 또한 다른 다음의 기술로부터 안출되는 다른 배합들을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 기술이란 본 발명의 목적인 방법 수행의 실시예 및 첨부된 도면을 언급한다:

- 도 1은 고체의 지지체 배열 예를 도시한다; 9개 영역에서의 부착(deposition)의 면(plan)이 관찰되며;

- 도 2는 각 영역의 부착면을 나타내고; 그리고

- 도 3은 복구 도표 - 복구 반응에 사용된 추출물을 준비하기 위해 사용된 각 세포주와 관련된 복구 지도작성을 나타낸다.

하지만, 이러한 실시예들은 단지 본 발명의 목적의 설명의 수단으로 주어지며, 어떠한 방법으로든 이에 한정되는 것은 아니라는 것은 명확히 이해되어야 한다.

실시예 1: 한 세트의 플라스미드 제조 및 병변의 분석

플라스미드 pBluescript II는 스트라타진(Stratagene)에 의해 제공된 프로토콜(protocol)에 따라, 스트라타진 유래의 XL1-Blue MRF 우세한(supercompetent) 세포들의 형질전환(transformation)에 의해 생성된다.

그후에 상기 플라스미드는 추천된 프로토콜에 따라, Quiagen 플라스미드 미디 키트를 사용하여 정제된다.

상기 플라스미드의 추가적 정제

상기 플라스미드를 25mM 트리스 염산 완충제(Tris HCl buffer), pH 7.5; 1M NaCl; 5mM EDTA에서 5-20% 수크로즈 구배(gradient)의 10ml에 로딩하고, SW-41 로터를 사용하는 베크만 초원심분리기(Beckman Ultracentrifuge)에서 4℃에서 그리고 25000rpm에서 18시간 동안 원심분리한다. 그후에 1ml 분획(fraction)이 조심스럽게 취해지고 아가로오스 겔 상에서 분석된다. 상기 플라스미드의 적어도 90%를 코일 형태로 함유하는 분획만이 유지된다. 상기 플라스미드는 에탄올로 침전되고 PBS에서 용해된다.

플라스미드 변형

- UVC 조사 - 사이클로부탄 피리미딘 이합체(CPDs) 및 (6-4) 광생성물의 형성

PBS에서 20㎍/ml로 희석된 플라스미드는 두개의 15-와트 네온이 구비된 생물차단 살균성 램프(Bioblock germcidal lamp)를 사용하여 조사된다. 세개의 플라스미드 플레이트는 각각 0.06; 0.12 및 0.2 J/㎠에서 조사된다.

- 클로로아세트알데히드(CCA-Signa)로 처리 - 말론디알데히드-디옥시구아닌(MDA-dG)의 형성

상기 플라스미드는 PBS에서 1mg/ml에서 준비되고, 당량(equivalent) 부피의 CAA(물의 50%)가 부가된다. 이 용액은 37℃에서 밤새(overnight) 배양된다. 상기 플라스미드는 침전(precipitation)에 의해 회수되고 수크로즈 구배 상에서 정제된다.

- 트란스, 트란스-2-4-데카디에날(DDE-Sigma)로 처리 - 에테노-구아노신 및 에테노-아데노신의 형성

0.2M 탄산염/중탄산염 완충제 200㎕, pH 9.2 및 당량 부피의 THF가 1mg/ml로 물에 준비된 200㎕의 플라스미드에 부가된다. 그후에 4㎕의 DDE 및 12㎕의 30% H₂O₂가 첨가된다. 상기 용액은 암실에서 50℃로 2시간동안 배양된다. DDE는 디클로로메탄(dichloromethane)을 이용한 두번의 추출에 의해 제거된다. DNA는 침전되고 그후에 수크로즈 구배 상에서 정제된다.

- 엔도퍼록시드 DHPNO ₂ 로 처리 - 8-옥소-2'-디옥시구아노신(8-oxo-dG)의 형성

J. Biol. Chem., 2000, 275, 40601-40604에서 기술된 프로토콜에 따라 준비된 엔도퍼록시드(N,N'-di(2,3-dihydroxypropyl)-1,4-naphthalenedipropanamide 1,4-endoperoxide)의 용액 20㎕는 PBS에서 1mg/ml로 희석된 200㎕의 플라스미드에서, 37℃로 2시간동안 배양된다. 상기 플라스미드는 그후에 침전되고 수크로즈 구배 정제된다.

플라스미드 내 병변의 분석

동일한 조건하에서 처리된 플라스미드 DNA의 분획 또는 송아지 흉선(calf thymus) DNA는 변형된 염기 조성(composition)의 분석을 위해 채택되었다.

상기 DNA는 Douki 외(J. Biol. Chem., 275, 11678-11685)에 의해 기술된대로 분해되고, 그후에 상기 분석은 HPLC-탠덤 질량 분광기에 의해 수행된다.

10⁴ 정상적인 염기마다 다음과 같은 양의 손상이 얻어졌다:

처리	Etheno Da	Etheno Dg	MDA- Dg	8-oxo-Dg	피리미딘 이합체	(6-4) 광-생성물
대조군 DNA	0.11	0.00	0.00	0.61
엔도퍼록시드	0.01	0.00	0.02	6.15
DDE	1.42	9.04	0.24	2.89
UVC 0.06J/㎠				0.12	5.03	0.45
UVC 0.12				0.18	11.08	0.93
UVC 0.2J/㎠				0.21	18.14	1.57

상기 처리는 매우 다른 비율로 손상의 형성을 일으킨다는 것을 주시해야 한다.

- 상기 UVC 조사는 매우 광범위하게 사이클로부탄 피리미딘 이합체(CPDs) 및 작은 범위의 (6-4) 광생성물의 형성을 일으키며,

- 상기 DDE는 에테노-디옥시구아노신의 우세한 형성을 일으키며,

- 상기 엔도퍼록시드는 8-옥소-2'-디옥시구아노신의 매우 우세한 형성을 일으킨다.

이러한 시약이 정확한 복구 효소군들을 표적화하는 특이적인 손상의 우세한 형성을 유도하는 것을 가능하게 하는 것으로 보인다.

실시예 2: 실시예 1에서 준비된 한 세트의 플라스미드를 이용한 본 발명에 따른 방법의 실행

지지체 위에 플라스미드의 부착(deposition)

상기 플라스미드는 PBS에서 20㎍/ml로 희석된다. 상업적인 폴리-L-리신-코팅된 유리 슬라이드(VWR) 상에서, GESIM robot을 사용하여 500pl 부착(deposit)이 형성된다. 상기 슬라이드는 4℃에서 보존된다.

각 슬라이드(지지체 S)는 도 1의 배열 A에 따라 배열된 9개의 동일한 영역(A1 내지 A9)을 포함한다.

각 영역에서, 예를 들어 영역 A1을 도해한 도 2에 따라서 한 세트의 플라스미드가 부착된다.

각 영역은 다른 생물학적 매질을 테스트하는 것을 가능하게 한다.

복구(repair) 반응

테스트될 생물학적 매질 및 추출물을 함유하는 용액이 준비된다; 5㎕의 용액에 있어서, 조성은 다음과 같다:

- 추출물 0.5㎕

- 5x 복구 완충제 1㎕

- CY5-dUTP(Amersham Pharmacia Biotech)(0.1 nmol/㎕) 0.2㎕

- 2M KCl 0.2㎕

- ATP(Roche - 100mM) 0.1㎕

상기 부피는 물을 가지고 5㎕로 보충된다.

5x 복구 완충제의 조성:

pH 7.8, 200mM Hepes/KOH); 35mM MgCl₂; 2.5mM DTT; 2㎛ dATP, 2㎛ dGTP, 2㎛ dCTP; 50mM 포스포크레아틴; 250㎍/ml 크레아틴 포스포키나아제; 0.5mg/ml BSA; 17% 글리세롤.

사용된 세포주(cell lines)

상기 실시예는 다른 세포주로부터 기인된 세개의 다른 추출물로 수행된다:

?세포주 1: 이것들은 HeLa 세포들이다. 추출물은 상업적인 핵 추출물이고 제조회사는 4C 바이오테크(벨기에)이다. 그것들은 Dignam 외(Nucl. Ac. Res., 1983, 11, 1475-1489)의 방법에 의해 준비되었다. 그것들의 단백질 함량은 24mg/ml이다.

?세포주 2: 이것은 색소성건피증(xeroderma pigmentosum)(complementation gruop D)을 앓고 있는 환자, 상보성 D군으로부터 확립된 AS203 세포주이다. 추출물은 Manley 외의 프로토콜에 따라 준비되었다. 마이크로 BCA 키트를 사용한 단백질의 분석은 44mg/ml 양의 단백질 평가를 가능하게 한다.

?세포주 3: 이것들은 XP12RO 세포들이다. 이 세포주는 색소성건피증(xeroderma pigmentosum)(complementation group A)을 앓고 있는 환자, 상보성 A군으로부터 확립되었다. 추출물은 Manley 외(Methods Enzymol., 1983, 101, 568-582)의 프로토콜에 따라 준비되었다. 얻어진 상기 추출물은 36mg/ml의 단백질을 함유한다(마이크로 BCA 분석 키트, interchim).

각 복구 용액의 3㎕는 상기 슬라이드 단일 영역의 모든 침전물 상에 부착된다. 상기 슬라이드를 수분이 있는 조건하에서 3시간동안 30℃에서 배양한다. 상기 슬라이드를 0.1%의 트윈 20(Tween 20)을 함유하는 PBS 완충제에서 10분동안 3차례 세척한다. 그후에 그것을 15분간 물로 세척한다. 건조후, 형광을 읽는다.

복구 신호의 분석

복구 반응 후, 각 영역의 다양한 침전물의 형광은 635nm에서 액손 스캐너(Axon scanner) 및 진픽스 프로(GenePix Pro) 분석용 소프트웨어에 의해 분석된다. 그후 세개의 동일한 지점의 평균(mean)이 결정된다. 수치는 각 유형의 변형의 결과로 얻어진 것이다. 도표는 각 세포주에 있어서 작성된다. 이 도표는 지지체 또는 칩 상에 존재하는 손상들에 관련된 복구 시스템의 지도작성에 대응하고, 사용된 추출물에 대하여는 특이적이다. 얻어진 결과는 도 3에서 주어진다. 형광의 농도는 임의의 단위(arbitrary units, AU)로 주어진다.

각 도표는, 사용된 추출물을 준비하기 위해 사용되었던 세포주에 따라 고유하고 특이적이라는 것이 관찰되었다. 그러므로, 도표는 주어진 세포 추출물의 전반적인 복구 활성을 정확하게 특성화하는데 사용될 수 있으며, 대상이 된 시스템의 기능을 밝힐 수 있다.

상기 HeLa 세포주는, UV 조사에 의해 유도된 손상(두드러진 CPD 및 (6-4))을 복구하는 것보다 DDE에 의해 유도된 손상(두드러진 etheno-dG)을 두배 더 효과적으로 복구한다는 것이 관찰되었다. 산화적 손상(두드러진 8-oxo-dG)는 훨씬 더 약하게 복구된다는 것이 관찰되었다.

AS203 세포주에 있어서, 비록 낮을지라도 가장 높은 정도의 복구는 UV-유도 손상에서 관찰되었다.

XP12RO 세포주에 있어서, UVC 조사의 경우보다 3배 더 높은 신호를 주는, DDE-유도 손상(두드러진 etheno-dG)이 더 효과적으로 복구된다는 것이 관찰되었다. XPA 세포주는 CPDs를 복구하지 않는다는 것이 알려져 있다; 따라서, UVC-조사된 DNA로 얻어진 신호는 (6-4) 광생성물의 복구의 탓으로 돌릴 수 있다.

본 발명의 예상치 못한 이점은, 단백질의 양이 서로 다를지라도 대조군 DNA의 신호에 대한 손상을 포함하는 DNAs의 신호에서 얻어진 비율이 서로 관련된 다양한 추출물의 복구 능력을 비교하는데 사용될 수 있다는 것이다.

Claims

하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 생물학적 매질(medium)의 전체 및 특정 DNA 복구(repair) 능력의 정량적 평가 방법:

(a) 하나 이상의 물리적 시약, 하나 이상의 화학적 시약, 또는 이들의 혼합물로 다양한 플라스미드를 개별적으로 처리하고 각 플라스미드의 수퍼코일된 분획(supercoiled fraction)을 복구함에 의하여, 각 플라스미드가 뚜렷한 DNA 병변을 포함하는, 플라스미드 세트를 제조하는 단계,

(b) 상기 플라스미드 세트의 각 플라스미드에 존재하는 병변들을 특성화하는 단계,

(c) 미리 정해진(pre-established) 배열 A에 따라, 상기 플라스미드 세트의 다양한 플라스미드 및 병변 없는 하나 이상의 수퍼코일된 대조군 플라스미드를 단일 고체 지지체(solid support) 상에 부착시켜서 다른 영역 A₁ 내지 A_x로 나눠진 기능화된 지지체(functionalized support)를 형성하는 단계(여기서, x는 동시에 테스트되는 생물학적 매질의 수에 상응하는 정수에 해당하고, 각각의 영역 A₁ 내지 A_x는 상기 플라스미드 세트를 포함함),

(d) 단계 (c)에서 얻어진 상기 기능화된 지지체를 다양한 복구 용액으로 1 내지 5시간 동안 30℃의 온도에서 배양하는 단계, 상기 각 복구 용액은 복구를 위한 효소 활성을 가질 수 있는 하나 이상의 생물학적 매질, ATP, ATP-재생(regenerating) 시스템, 표지된 뉴클레오티드 삼인산염 및 상기 생물학적 매질에 존재하는 복구 효소의 활성에 필요한 다른 구성 성분들을 포함하고, 상기 배양에 앞서, 각 복구 용액이 상기 기능화된 지지체의 서로 다른 미리 정해진 영역 A₁ 내지 A_x에 적용됨,

(e) 상기 기능화된 지지체를 적어도 한번 세척하는 단계,

(f) 상기 다른 미리 정해진 영역 A₁ 내지 A_x 각각에서, 단계 (d)에서 복구 반응 동안 DNA로 삽입된(incorporated) 표지에 의해 발생된 신호를 직접적 또는 간접적으로 측정하는 단계,

(g) 각 영역 A₁ 내지 A_x에서 각각의 플라스미드 부착에 대응하는 신호를 기록하고 정량화하는 단계, 및

(h) 함께 부착된 대조군 플라스미드에 대한 병변을 포함하는 플라스미드의 신호 비율을 결정하는 단계.
제1항에 있어서, 단계 (a)에 따른 상기 플라스미드는 이중-가닥의 수퍼코일된 형태를 갖는 것들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (a)에서 DNA의 병변을 유도할 수 있는 다양한 물리적 또는 화학적 시약은: 단일 병변의 형성, 한정된 수의 병변의 형성 또는 동일 군(same family)에 속하는 다양한 병변의 형성을 유도하는 것들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (a)에서 다양한 시약은 상기 플라스미드 세트의 각 플라스미드에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (b)에서 병변의 특성화는 (i) 병변을 갖는 각 플라스미드의 분획을 수득하고, (ii) DNA로부터 뉴클레오시드(nucleosides)를 방출하는 효소로 상기 분획의 각각을 소화시키고, 그리고 그 다음 (iii) 정량적 분석 기술과 결합된 별도 기술의 조합을 이용하여 소화 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 소화는 다음의 효소: 송아지 비장 포스포다이에스터라제(calf spleen phosphodiesterase), P1 nuclease(P1 뉴클레아제), 뱀 독 포스포다이에스터라제(snake venom phosphodiesterase), 및 알카리성 포스파타제(alkaline phosphotase) 중 하나 이상을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 효소 소화의 결과는 다음의 기술: 탠덤 질량분광계(tandem mass spectrometry)와 결합된 고성능액체크로마토그래피(HPLC), 기체크로마토그래피와 결합된 HPLC, 또는 전기화학검출(electrochemical detection)와 결합된 HPLC 중 하나에 의해 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)전에, 단계 (a)에서 얻어진 수퍼코일된 형태의 플라스미드는 슈크로즈 구배(sucrose gradient) 원심분리기, 세슘 클로라이드 구배 원심분리기, 또는 이들의 조합에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)전에 또한 상기 플라스미드 세트의 각 플라스미드가 염 및 비이온성 계면활성제와 함께, 5 내지 100㎍/ml의 농도로 희석되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (c)에서, 상기 플라스미드 세트의 부착(deposits) 부피는 100 내지 1000pl(picoliter)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (c)에서, 상기 지지체는 DNA에 대한 친화력을 증가시키기 위해 감작된 것으로서, 유리, 실리콘 및 이의 유도체로부터 선택된 유기 또는 무기 물질, 및 합성 또는 비합성 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 지지체는 DNA를 흡수하는 폴리-L-리신으로 코팅된 유리 슬라이드 또는 DNA와 공유결합을 형성하는 에폭시기로 기능화된 유리 슬라이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 지지체는 다른 영역 A₁ 내지 A_x를 포함하며, 상기 각 영역은:

- 하나 이상의 대조군 플라스미드 부착(deposit), 및

- 광생성물(photoproducts)을 함유하는 플라스미드의 부착, 산화적 손상을 포함하는 플라스미드의 부착, 에테노-염기(etheno-bases)를 포함하는 플라스미드의 부착, DNA 절단(breakage)을 포함하는 플라스미드의 부착, 및 발암제 부가물을 포함하는 플라스미드의 부착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 플라스미드 부착:

을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (e)에서, 지지체는 비이온성 계면활성제를 함유하는 염수 용액으로 적어도 한번 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 지지체는 트윈 20(Tween 20)을 함유하는 10mM 인산 완충제에서 세척되고, 이어서 물로 적어도 한번 헹궈지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (g)에서 상기 신호는 표지를 여기시키고(exciting), 여기(excitation)에 따라 방출된 신호를 측정할 수 있는 디바이스를 사용하여 정량되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 단계 (h)에서 동일한 지지체에 배치된 대조군 플라스미드로 얻어진 신호에 대한 병변을 포함하는 플라스미드에서 얻어진 신호의 수적 비율(numerical ratio)이 확정되는 것을 특징으로 하는 방법.
주어진 생물학적 매질의 복구 프로파일(repair profile)을 확립하기 위하여 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 사용하는 방법.
복구-관련 질병을 진단하기 위하여 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 사용하는 방법.
주어진 매질의 복구 능력에 대한 물리적 또는 화학적 처리의 영향을 평가하기 위하여 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 사용하는 방법.
생물학적 매질의 복구 시스템을 조정할 수 있는 물질을 선별(screening)하기 위하여 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 방법을 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 플라스미드 각각이 6.5 내지 8.0의 pH를 갖는 완충액에 희석되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 선택된 지지체의 표면이 기능화되는 것인 방법.