JP2006510385A - 少なくとも１つの生物学的媒質の全体ｄｎａ修復能力及び特異的ｄｎａ修復能力の定量的評価方法及びその適用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、媒質の除去/再合成能力を評価することからなる生物学的媒質の全体的及び特異的DNA修復能力の定量的評価法及びその適用に関する。本発明の方法は、(ａ)各々が異なるDNA損傷を含む一連のプラスミドを調製し；(ｂ)一連のプラスミドの各プラスミドに存在する損傷を特徴付け；(ｃ)各区域A1〜Axが一連のプラスミドを含む異なる区域A1〜Ax(ｘは同時に試験すべき生物学的媒質の数に等しい整数に相当する)に分割された官能化支持体を形成するように、予め定められた形態Ａを用いて単一の固体支持体上に一連のプラスミドの異なるプラスミド及び少なくとも１つの超コイル状コントロールプラスミドを堆積させ；(ｄ)(ｃ)で得られた官能化支持体を種々の修復溶液とインキュベートし；(ｅ)官能化支持体を少なくとも１回洗浄し；(ｆ)(ｄ)の修復反応の間にDNA中に組み込まれたマーカーにより生じるシグナルを直接又は間接に測定し；(ｇ)各プラスミド堆積物に対応するシグナルを記録及び定量し；(ｈ)一緒に堆積したコントロールプラスミドに対する損傷を含むプラスミドのシグナル比を決定する工程を含む。
Description
本発明は、生物学的媒質の除去/再合成能力を評価することによって、その媒質の全体DNA修復能力及び特異的DNA修復能力を定性的に評価する方法、並びにその適用に関する。
DNAは、塩基又は糖の損傷の形成をもたらす内因性又は外因性の攻撃を絶え間なく受ける。
損傷には以下が含まれる。
− プリン又はピリミジン塩基の損傷：細胞代謝により誘導される酸化損傷及び光感作により誘導される酸化損傷；燃焼産物に含まれる多くの遺伝毒性作用因子(例えば、多環式炭化水素)の有害作用に起因する化学付加物の形成による損傷；メテノ塩基(metheno-base)又はエテノ塩基(etheno-base)の形成による損傷；
− DNA二重らせんの構造の損傷：一般には紫外線照射により又は二官能性抗腫瘍剤(例えばシスプラチン)及びインターカレート挿入剤(これは対向する鎖が有する塩基間に安定な共有結合を形成する)により引き起こされる、鎖内(同じ鎖の２つの隣接する塩基間)の橋架け又は鎖間(相同な鎖上に位置する２つの塩基間)の橋架けの形成(ピリミジン間の橋架けの形成(ピリミジンは二量体になる))；
− DNAは部分的に不安定な分子であるという事実に起因する自然発生的損傷：自然発生的脱アミノ化又は脱プリン化；
− 一本鎖切断又は二本鎖切断による損傷：電離放射線のような作用因子及び遊離基の作用により生成される；
− 糖損傷：デオキシリボースの破壊は、傷害部位のホスホジエステル結合の切断、続いて鎖切断をもたらす。
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− 糖損傷：デオキシリボースの破壊は、傷害部位のホスホジエステル結合の切断、続いて鎖切断をもたらす。
誘導される損傷の多様性は、UVC照射後に検出される安定な光産物を分析することによって例証される：シクロブタン環の生成に起因して、ピリミジン二量体と共に、ピリミジン(6-4)ピリミドンが２つの隣接するピリミジン間に生成する。ピリミジン二量体と(6-4)産物との相対比率は、10〜４対１の範囲である。紫外線照射の致死効果及び変異誘発効果におけるそれぞれの有効性もまた異なる：二量体は、(6-4)産物より大きな細胞毒的役割を有するが、変異誘発効果については逆である。同様に、電離放射線(例えば、コバルト60からのγ線)は、同時に、一本鎖切断又は二本鎖切断(およそ９：１の比で)、多くの塩基付加生成物、塩基損失を生じ、高用量では、DNAと隣接するタンパク質(例えば染色体のタンパク質)との間の橋架けを生じる。平均すると、１つの改変塩基あたり１つの鎖切断が計数される。照射の細胞毒性効果における二本鎖切断の優勢な役割は、塩基変化に起因する変異誘発効果に伴う。
これら種々の型の損傷は、単離されたDNA上に作成することができる。例えば、(6-4)光産物型損傷及びシクロブタン型ピリミジン二量体は、UVC照射によって誘導され(Hoeijmakerら, Mutation Res., 1990, 236, 223-238)；酸化型損傷は、過酸化水素及び鉄の存在下でのFenton反応により誘導される(Elliotら, Free Rad. Biol. Med., 2000, 1438-1446)。改変したDNAを調製する別の手段は、分子生物学的技法によりプラスミドを操作し、その中に、化学合成により得られ目的の損傷を含むオリゴヌクレオチドを挿入することからなる(Biadeら, J. Biol. Chem., 1997, 273, 898-902)。
全ての生物は、ゲノムの完全性を維持するためのDNA修復系を有する。
これら修復系のうち、２つがDNAから改変した塩基を排除する機能を有する。これらは、塩基除去修復(BER)系及びヌクレオチド除去修復(NER)系である：
・BER系は、DNAにおける小さな損傷(例えば、酸化傷害、無塩基部位、塩基断片化、塩基メチル化、エテノ塩基など)の修復により特異的に専従する。
・NER系は、DNA二重らせんの歪みを引き起こす大きな損傷(例えば、アセチルアミノフッ素−DNA、シスプラチン−DNA及びソラレン−DNA付加物、DNAのUVB及びUVC照射に由来する二量体、DNA塩基と別の分子との間で形成される共有結合損傷(covalent lesion)など)に対処する(Sancarら, Annu. Rev. Genetics, 1995, 29, 69-105)。
これら修復系のうち、２つがDNAから改変した塩基を排除する機能を有する。これらは、塩基除去修復(BER)系及びヌクレオチド除去修復(NER)系である：
・BER系は、DNAにおける小さな損傷(例えば、酸化傷害、無塩基部位、塩基断片化、塩基メチル化、エテノ塩基など)の修復により特異的に専従する。
・NER系は、DNA二重らせんの歪みを引き起こす大きな損傷(例えば、アセチルアミノフッ素−DNA、シスプラチン−DNA及びソラレン−DNA付加物、DNAのUVB及びUVC照射に由来する二量体、DNA塩基と別の分子との間で形成される共有結合損傷(covalent lesion)など)に対処する(Sancarら, Annu. Rev. Genetics, 1995, 29, 69-105)。
これら種々の修復系は共通の特徴を有し、特に、以下の工程を有する：
− 当該修復系に属するタンパク質による損傷の認識、
− 損傷(及び、任意に、近接するヌクレオチド)の除去
− 媒質中のポリメラーゼによる欠いているヌクレオチドの再合成
− 修復は、一般に、新たに生成した鎖と既存のDNA鎖との連結で終了する。
− 当該修復系に属するタンパク質による損傷の認識、
− 損傷(及び、任意に、近接するヌクレオチド)の除去
− 媒質中のポリメラーゼによる欠いているヌクレオチドの再合成
− 修復は、一般に、新たに生成した鎖と既存のDNA鎖との連結で終了する。
これら全ての場合で、このプロセスは、改変したヌクレオチドの排除、及びDNA鎖における置換物として、修復媒質中に存在する少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸の組み込みを含む。
しかし、修復系は、真核生物において特に、非常に複雑であり、この極端に単純化した形態の多くの変形が存在する(全体修復、DNA転写に関連する修復、DNA複製に関連する修復など)ことに留意すべきである。いくつかの修復系に同時に関与するタンパク質もあれば、１つの系に特異的なタンパク質もあり、細胞因子又は外部因子により誘導され得るものもあれば、遍在性でかつ定常的に発現するものもある。
この後の記載では、
用語「基質」は、細胞抽出物の存在下で修復反応を受け得る任意のDNAをいい、敷衍してDNA損傷をいう。
用語「生物学的媒質」又は「細胞抽出物」は、DNA修復に関係する少なくとも１つの酵素活性を含み得る精製又は非精製の生物学的調製物をいう。
用語「基質」は、細胞抽出物の存在下で修復反応を受け得る任意のDNAをいい、敷衍してDNA損傷をいう。
用語「生物学的媒質」又は「細胞抽出物」は、DNA修復に関係する少なくとも１つの酵素活性を含み得る精製又は非精製の生物学的調製物をいう。
損傷は、一般に、DNA中で、その修復を担う特異的タンパク質と関連付けることができる。種により差異が存在する；原核生物(例えば、大腸菌)では、酵素は特異性が低いが、ヒトでは、よりずっと厳格な損傷特異的な修復酵素関連性が、特にBER系で観察される。例えば、Lindahl及びWood(Science, 1999, 286, 1897-1905)は、ヒトにおいて最も重要であるBER系酵素及びそれに関連する損傷を記載している。例えば、ヒトでは、OGG1タンパク質(これはBER系に属するグリコシラーゼである)は、8−オキソ−2'デオキシグアノシンの修復に関連する。大腸菌では、ホルムアミドピリミジン−DNA Ｎ−グリコシラーゼは、この同じ損傷を修復するが、酸化プリン塩基もまたより一般的に修復する(Seebergら, TIBS, 1995, 20, 391-397)。ヒトタンパク質ANPGは、細菌タンパク質AlkAの等価物である。しかし、これら酵素は、基質に関して同じ親和性を有さず、異なる除去速度定数を有する(Lavalら, Mut. Res., 1998, 402, 93-102)。BER系により対処される約40を超える異なる損傷は、修復されない場合、相当のネガティブな生物学的な結果を有することがある。これらの修復を担う酵素は、相当な抗腫瘍的役割を有することが考えられる。基質特異性の正確な知識は非常に重要であることが理解され得る。
細胞修復能力アッセイが開発されており、２つのカテゴリー、活性な細胞抽出物の使用を必要とするインビトロアッセイ及び生きた細胞で実施されるインビボ又は半インビボ系に分類することができる。
Ｉ．除去/再合成活性の測定に基づく方法
Ａ． インビトロアッセイのほとんどが、Woodら(Cell, 1988, 53, 97-106及びBiochemistry, 1989, 26, 8287-8292)により記載された、修復の除去/再合成工程を評価する実験を基礎として開発されている。
Ａ． インビトロアッセイのほとんどが、Woodら(Cell, 1988, 53, 97-106及びBiochemistry, 1989, 26, 8287-8292)により記載された、修復の除去/再合成工程を評価する実験を基礎として開発されている。
より正確には、このアッセイは、損傷(UV照射により：ピリミジン二量体、橋架けの生成；DNアーゼＩの作用により：一本鎖切断又は破損)が導入されるプラスミドDNAの使用を含み；このように改変されたDNAを、評価すべき細胞抽出物、α位置で32Ｐを用いて標識したヌクレオチド三リン酸及びATPを少なくとも含む修復調製物の存在下で30℃にてインキュベートする。抽出物中に含まれる酵素は、プラスミドDNAを切開(incise)し、損傷を排除する。排除したヌクレオチドの置換によりDNAを新規に合成する。媒質中に導入された放射活性ヌクレオチドが、合成の間に、DNA中に組み込まれる。アガロースゲル電気泳動による修復プラスミドの単離の後、組み込まれた放射活性の量(これは基質の修復速度に比例する)を測定する。細胞抽出物を調製する方法及び反応条件は、修復の質に影響する。詳細には、最良の修復収率は、インビトロ転写に使用されるタイプの全細胞抽出物を用いて得られ、SV40起源のプラスミド複製を促進するために使用されるタイプの細胞質抽出物及び他の粗製細胞抽出物は、ヌクレアーゼ活性を示し、これにより修復の正確な解説が不可能である。
Woodらにより確立された条件下では、照射されたDNAに関する反応の特異性は、40〜100mMのオーダーのKCl濃度の存在下で比較的高い。加えて、修復の間に生じる照射されたDNA複製は、ATPの存在及びATPの定常レベルの維持を目的とする(このレベルの維持は修復の切開工程とより特異的に関連付けられる)ATP再生系(ホスホクレアチン＋クレアチンホスホキナーゼ)の存在に高度に依存する。このような依存性は、例えば、鎖切断の修復の場合には遭遇しない。改変されていない同じプラスミドからなるコントロールサンプルが、反応混合物中で同時に使用される。
Woodらのアッセイは放射活性の使用を必要とする。このことは、慣用アッセイにおけるこの方法の実施を制限する制約を課す。加えて、このアッセイは、慣用的に使用するに十分な質の簡便性及び実用性を有していない。
Woodらの方法は、色素性乾皮症に罹患している患者から樹立された細胞を起源とする抽出物を特徴付けるアッセイにおいて提案された(Satohら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6335-6339；Jonesら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 991-995；Robinsら, EMBO J., 1991, 10, 3913-3921)。色素性乾皮症は、複遺伝子性、複対立遺伝子性、常染色体性劣性疾患である。この疾患に罹患している患者を起源とする細胞は、紫外線照射に対して非常に感受性であり、DNA修復欠損を示す。８遺伝子(XPA〜XPG及び変形群XPV)がこの疾患の種々の相補群に関与する。各群は、DNA修復、特に種々のNERサブタイプに関して異なる特徴を有する。DNA損傷は、小さな損傷のカテゴリーに属するか大きな損傷のカテゴリーに属するかにかかわらず、相補群に従って異なって修復される。
他の修復疾患(コケーン症候群、毛細血管拡張性運動失調)もまた、特異的な修復特徴を有し、Woodらの方法により研究されてきた。
Ｂ． 種々の刊行物で、B. Salles及びP. Calsouのチーム(Biochimie 1995, 77, 796-802；Anal. Biochem. 1995, 232, 37-42)は、マイクロプレートのウェルに付着させたプラスミド上で除去/再合成反応を実施することによりDNA損傷を検出する方法を記載している。プラスミドを、マイクロプレートウェルに吸着させ、次いで化学作用因子で後天的に改変させる。細胞抽出物を、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチド三リン酸と共にウェルに添加する。損傷除去が生じると、標識は、再合成工程の間にDNA中に組み込まれる。次いで、標識を、アルカリホスファターゼにカップリングした抗体により各ウェル中で呈示させる。アルカリホスファターゼによる脱リン酸化後に発光性になる基質を各ウェルに添加する。各ウェルで発する発光シグナルを測定する。発光シグナルは、標識の組込み速度に比例する。
この方法はまた国際出願WO 96/28571に記載されている。この発明者らもまた、B. Salles及びP. Calsouのチームに属する。この国際出願は、DNA損傷を定性的及び定量的に検出する方法を記載する。この方法では、損傷を有するDNAを固体支持体に付着し、試験すべき細胞抽出物を含み標識を有する組成物を、損傷を有するDNAと(固体支持体への付着の前又はその後に)接触させる。彼らは、その方法により多くのサンプルを同時に処理することが可能になると考える。実施例に言及すれば、細胞抽出物の存在下での修復は、150μgのタンパク質、50mMのKCl、５mMの塩化マグネシウム、DTT、ホスホクレアチン、ホスホクレアチンキナーゼ及び種々のdNTP(これらのうちの１つはジゴキシゲニンで標識される)を含む抽出物を使用して、50μlの反応媒質中で実施される。修復は、30℃にて３時間のインキュベーションの後に得られる。ウェルは、塩を有するリン酸緩衝液を含む洗浄溶液で洗浄する。これに、非イオン性界面活性剤(Tween 20)が0.05及び0.15％の比率で添加される(好ましい組成：10mM リン酸緩衝液、137mM NaCl及び0.1％ Tween 20)。アッセイ溶液の場合、検出が200又は300ngの代わりに40ngのDNAで実施される限り、このアッセイは高度に感受性であると明記されている。
B. Salles及びP. Calsouのチームによるアッセイは、基本的に、固体支持体への付着後に、プラスミドを改変することを提案している。ここで、鎖切断は、多くの化学作用因子又は物理作用因子により作り出される損傷に含まれることが公知である。ここで、これら切断は、活性な細胞抽出物によって非常に迅速かつ効果的に修復される。したがって、このアッセイでは、切断修復と他の損傷の修復とを識別することは不可能である。切断修復は、他の損傷の修復を覆い隠し、他のDNA損傷の修復に帰せられるシグナルと干渉することがある。したがって、このアッセイは、修復系により認識される損傷を同定することなく、全体効果の検出を可能にする系である。加えて、この方法の目的は、DNA修復に関与するタンパク質の活性を検出及び定量することではなく、処理されたDNA上での損傷の存在を同定することである。
II．切開/除去工程の評価に基づく方法
Woodらによる方法の変形が提案されており、これらにより、特に損傷切開活性のみを測定することが可能になる。
Ａ． Redaelliら(Terat. Carcinog. Mut., 1998, 18, 17-26)は、プラスミドがヌクレオチド三リン酸を含まない抽出物と共に直接インキュベートされる方法を記載する。超コイル状プラスミドにおける切断は、電気泳動の間のアガロースゲル中での移動速度の変化を生じる。超コイル状プラスミドは、そのコンホメーションに起因して、切開プラスミドより速く移動する。種々の形態のプラスミドに対応するバンドを定量する；切開形態の量は、抽出物に含まれるプラスミド損傷の切開活性と相関する。
Woodらによる方法の変形が提案されており、これらにより、特に損傷切開活性のみを測定することが可能になる。
Ａ． Redaelliら(Terat. Carcinog. Mut., 1998, 18, 17-26)は、プラスミドがヌクレオチド三リン酸を含まない抽出物と共に直接インキュベートされる方法を記載する。超コイル状プラスミドにおける切断は、電気泳動の間のアガロースゲル中での移動速度の変化を生じる。超コイル状プラスミドは、そのコンホメーションに起因して、切開プラスミドより速く移動する。種々の形態のプラスミドに対応するバンドを定量する；切開形態の量は、抽出物に含まれるプラスミド損傷の切開活性と相関する。
より正確には、この論文は、無塩基部位で生じ、この無塩基部位の3'又は5'側に位置するデオキシリボースホスホジエステル結合を切断することによって、修復されるべき改変(アルキル化、加水分解性脱アミノ化、酸化、ミスマッチング)に特異的なグリコシラーゼの作用の後に得られるAP−エンドヌクレアーゼの切開作用を研究している。この論文では、AP−エンドヌクレアーゼ活性が、ヒトリンパ球の粗製抽出物について、より特異的に研究されている。抽出物(80μl)が、第１に、傷害していないプラスミド(コントロール)と共に、第二に、脱プリン化プラスミドと共にインキュベートされる。こうして、切開活性が傷害に依存し、EDTAに感受性である限り、AP−エンドヌクレアーゼの活性を定量することが可能であることが見出されている。
Ｂ． P. Calsou及びB. Sallesのチーム(Biochem. Biophys. Res. Com., 1994, 202, 788-795)は、プラスミドの損傷の切開の活性を特異的に測定するための別のアプローチを提案している。彼らは、最初の除去工程の後に正常DNAフラグメントが内因性ポリメラーゼにより再合成されることを防止するために、修復媒質に、真核生物ポリメラーゼに特異的な阻害剤、アフィディコリンを導入する。外因性原核生物ポリメラーゼは、全ての試験管に等量で反応媒質と混合される。このようにして得られる結果の差異は、損傷除去工程を反映するが、除去されたDNAフラグメントの再合成は反映しない。
Ｃ． コメットアッセイ(comet assay)(単一細胞の、アルカリ媒質における、ゲル電気泳動)の変法をベースにする別の方法によっても、切開活性を測定することが可能になる。この方法は、Collinsら(Mutagenesis, 2001, 16, 297-301)により開発された。酸化損傷は、可視光の存在下でのHeLa細胞の光感作によりゲノムDNA中に導入される。次いで、細胞を、顕微鏡スライド上に広げたアガロースゲルに組み入れ、次いで、細胞膜及びタンパク質を制御された溶解により排除する。ゲル中で単離された核様体を、最初の損傷切開工程に活性である細胞抽出物の存在下でインキュベートする。次いで、スライドをアルカリ媒質中での電気泳動に供する。切断の存在によって、全体として、核様体より迅速なDNAの移動が誘導される。次いで、DNAのボールは彗星(comet)の外見を有し、無傷のDNAが頭部に存在し、切断を含むDNAが彗星の尾部に存在する。彗星尾部中のDNAの割合は、専用ソフトウェアにより決定され、検討中の損傷に使用する抽出物中に含有される切開活性と直接相関する。このアッセイは、ヒトリンパ球に由来する抽出物中の酸化傷害の除去活性を測定するために適用されてきた。プラスミドの切断を測定するRedaelliら(1998)により記載された方法と比較して、Collinsらの方法は鎖切断を推定するためにコメット法を使用し、この変形は、第１に、有意により感受性であり(109ダルトン当たり約0.2〜２個の切断の検出)、第２に、反応混合物の容量(ゲル中に含まれるDNA)が僅か50μlであり、アッセイに十分な量の材料が10mlの血液から得られる(数回のインキュベーションを実施できる可能性)ので、経済的に有利である(使用する材料に関する節約)と認められる。
Ｄ． 国際出願WO 01/90408は、DNA損傷修復に関与するタンパク質の活性を検出及び特徴付けする方法を記載する。
より正確には、この方法は、少なくとも１つの既知の損傷を含む少なくとも１つの傷害DNAの固体支持体への付着を含む。次いで、この傷害DNAは、この傷害DNAの修復に関与する少なくとも１つのタンパク質を含むか又は含まない修復組成物の作用に曝され、先の工程の間に支持体に付着するか又は支持体から去る標識が発するシグナルの変動を測定することによる、修復に関するこのタンパク質の活性の決定に供される。
より正確には、この方法は、少なくとも１つの既知の損傷を含む少なくとも１つの傷害DNAの固体支持体への付着を含む。次いで、この傷害DNAは、この傷害DNAの修復に関与する少なくとも１つのタンパク質を含むか又は含まない修復組成物の作用に曝され、先の工程の間に支持体に付着するか又は支持体から去る標識が発するシグナルの変動を測定することによる、修復に関するこのタンパク質の活性の決定に供される。
この系は、15〜100塩基のオリゴヌクレオチド又は100〜20000塩基のポリヌクレオチドの形態である傷害DNAを用いて使用され、したがって、いくつかの基質の除去を同時にモニターできるので、この系により、他のアッセイより多くの全体情報の入手が可能になる。
しかし、この方法は、DNA損傷切開活性の証明に関する。したがって、この方法は、合成オリゴヌクレオチドへ導入され得る損傷の除去工程を特徴付けることに制限される。さらに、これは、除去活性に関する相当の情報を提供するが、DNAの除去/再合成に関する酵素活性の正確な定量化に適切でなく、また記載もされていない。
しかし、この方法は、DNA損傷切開活性の証明に関する。したがって、この方法は、合成オリゴヌクレオチドへ導入され得る損傷の除去工程を特徴付けることに制限される。さらに、これは、除去活性に関する相当の情報を提供するが、DNAの除去/再合成に関する酵素活性の正確な定量化に適切でなく、また記載もされていない。
上記で報告した各技法に特異的な短所に加えて、これら種々の方法はまた、以下の短所を有する：
− 上記の全てのアッセイは、10μlより多い量の生物学的材料、特に細胞抽出物の使用を必要とする。一般的に使用される反応容量は、約100μgのタンパク質量に対して10〜40μlの抽出物を含有する50μlである。抽出物は調製に長時間を要し、利用可能な細胞の量は少ないことが多い。このことが実施できるアッセイ数を制限している。
− 使用する検出法に関わらず、そしてアッセイが溶液で実施されるか支持体上で実施されるかに関わらず、記載したこれら全ての系は、抽出物のアリコート画分についての所与の基質に制限された一つ一つの修復に関する情報を提供する。これは、Woodらにより提案されたような修復能力を決定するアッセイでは、例えば、各アッセイが試験管中で個々に実施され、すなわち、反応が、所与のプラスミド及び所与の抽出物の存在下で起きるからである。試験すべき各抽出物について、プラスミドへの標識の組み込み速度が、同じ様式で調製された基質においてコントロール抽出物の存在下で得られた標識の組み込み速度と比較される。参照コントロール抽出物は、一般に、EBV又はSV40で形質転換された特徴付けられた細胞から調製される。上記のWoodらによる方法の他の変形のほとんどで同じことが言える。
− これらアッセイは、実施に比較的骨が折れ、大量の生物学的材料が入手できることを要するので、実験者は、使用する基質の数及び試験する生物学的抽出物の数を制限する。
− プラスミド中に導入される損傷は、測定も定量もされない。著者らは、Woodらにより開発されたアッセイを使用して、鎖切断を含むDNAを排除するために、超コイル状形態を喪失したプラスミドのみを排除する。得られる情報は、非常に部分的であり、所与の生物学的媒質の修復能力を正確に規定し特徴付けるには不十分である。
− 結果的に、出願人は、特に、コントロール修復溶液を使用することなく、迅速・正確で小型化された効果的様式で、生物学的抽出物におけるDNA修復のための除去/再合成についての酵素活性を特徴付けること及び定量することを可能にする方法を提案することによって、先行技術の短所を克服することを目的として掲げた。
− 上記の全てのアッセイは、10μlより多い量の生物学的材料、特に細胞抽出物の使用を必要とする。一般的に使用される反応容量は、約100μgのタンパク質量に対して10〜40μlの抽出物を含有する50μlである。抽出物は調製に長時間を要し、利用可能な細胞の量は少ないことが多い。このことが実施できるアッセイ数を制限している。
− 使用する検出法に関わらず、そしてアッセイが溶液で実施されるか支持体上で実施されるかに関わらず、記載したこれら全ての系は、抽出物のアリコート画分についての所与の基質に制限された一つ一つの修復に関する情報を提供する。これは、Woodらにより提案されたような修復能力を決定するアッセイでは、例えば、各アッセイが試験管中で個々に実施され、すなわち、反応が、所与のプラスミド及び所与の抽出物の存在下で起きるからである。試験すべき各抽出物について、プラスミドへの標識の組み込み速度が、同じ様式で調製された基質においてコントロール抽出物の存在下で得られた標識の組み込み速度と比較される。参照コントロール抽出物は、一般に、EBV又はSV40で形質転換された特徴付けられた細胞から調製される。上記のWoodらによる方法の他の変形のほとんどで同じことが言える。
− これらアッセイは、実施に比較的骨が折れ、大量の生物学的材料が入手できることを要するので、実験者は、使用する基質の数及び試験する生物学的抽出物の数を制限する。
− プラスミド中に導入される損傷は、測定も定量もされない。著者らは、Woodらにより開発されたアッセイを使用して、鎖切断を含むDNAを排除するために、超コイル状形態を喪失したプラスミドのみを排除する。得られる情報は、非常に部分的であり、所与の生物学的媒質の修復能力を正確に規定し特徴付けるには不十分である。
− 結果的に、出願人は、特に、コントロール修復溶液を使用することなく、迅速・正確で小型化された効果的様式で、生物学的抽出物におけるDNA修復のための除去/再合成についての酵素活性を特徴付けること及び定量することを可能にする方法を提案することによって、先行技術の短所を克服することを目的として掲げた。
本発明の主題は、少なくとも１つの生物学的媒質の全体DNA修復能力及び特異的DNA修復能力を定量的に評価する方法である。この方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
(ａ) 少なくとも１つの物理及び/又は化学作用因子で種々のプラスミドを独立して処理し、プラスミドの各々の超コイル状画分を回収することによって、各々が異なるDNA損傷を含む一連のプラスミドを調製する；超コイル状画分の選択により、鎖切断を排除し、ヌクレアーゼの作用を回避することが可能になる、
(ｂ) 当該一連のプラスミドの各々に存在する損傷を特徴付ける、
(ｃ) 異なる区域A1〜Ax(ｘは、同時に試験すべき生物学的媒質の数に等しい整数に相当し、各区域A1〜Axは当該一連のプラスミドを含む)に分割された官能化支持体を形成するように、予め定められた形態Ａに従って、単一の固体支持体上に、当該一連のプラスミドの種々のプラスミド及び損傷を有さない少なくとも１つの超コイル状コントロールプラスミドを堆積させる；結果として、一連の改変されたプラスミドの種々のプラスミド調製物が、規定され正確に位置を示された部位で同じ固体支持体上に堆積される。DNA損傷を含まない超コイル状プラスミドからなる少なくとも１つのコントロールが、一緒に堆積される、
(ｄ) 工程(ｃ)で得られた官能化支持体を、各々が少なくとも１つの生物学的媒質(修復のための酵素活性、ATP、ATP-再生系、標識ヌクレオチド三リン酸及び当該生物学的媒質に存在する修復酵素の活性に必要な任意の他の成分を含み得る)を含む種々の修復溶液と共に、好ましくは30℃の温度にて、１〜５時間、好ましくは３時間インキュベートする。修復溶液の各々は、インキュベーションの前に、官能化支持体の予め定められた異なる区域A1〜Axに堆積される、
(ｅ) 官能化支持体を少なくとも１回洗浄する、
(ｆ) 工程(ｄ)の修復反応の間にDNA中に組み込まれた標識によって生じるシグナルを、予め定められた異なる区域A1〜Axの各々で直接又は間接に測定する、
(ｇ) 各区域A1〜Axにおけるプラスミドの各堆積に対応するシグナルを記録及び定量する
(ｈ) 一緒に堆積したコントロールプラスミドに対する損傷を含むプラスミドのシグナル比を決定する。
(ａ) 少なくとも１つの物理及び/又は化学作用因子で種々のプラスミドを独立して処理し、プラスミドの各々の超コイル状画分を回収することによって、各々が異なるDNA損傷を含む一連のプラスミドを調製する；超コイル状画分の選択により、鎖切断を排除し、ヌクレアーゼの作用を回避することが可能になる、
(ｂ) 当該一連のプラスミドの各々に存在する損傷を特徴付ける、
(ｃ) 異なる区域A1〜Ax(ｘは、同時に試験すべき生物学的媒質の数に等しい整数に相当し、各区域A1〜Axは当該一連のプラスミドを含む)に分割された官能化支持体を形成するように、予め定められた形態Ａに従って、単一の固体支持体上に、当該一連のプラスミドの種々のプラスミド及び損傷を有さない少なくとも１つの超コイル状コントロールプラスミドを堆積させる；結果として、一連の改変されたプラスミドの種々のプラスミド調製物が、規定され正確に位置を示された部位で同じ固体支持体上に堆積される。DNA損傷を含まない超コイル状プラスミドからなる少なくとも１つのコントロールが、一緒に堆積される、
(ｄ) 工程(ｃ)で得られた官能化支持体を、各々が少なくとも１つの生物学的媒質(修復のための酵素活性、ATP、ATP-再生系、標識ヌクレオチド三リン酸及び当該生物学的媒質に存在する修復酵素の活性に必要な任意の他の成分を含み得る)を含む種々の修復溶液と共に、好ましくは30℃の温度にて、１〜５時間、好ましくは３時間インキュベートする。修復溶液の各々は、インキュベーションの前に、官能化支持体の予め定められた異なる区域A1〜Axに堆積される、
(ｅ) 官能化支持体を少なくとも１回洗浄する、
(ｆ) 工程(ｄ)の修復反応の間にDNA中に組み込まれた標識によって生じるシグナルを、予め定められた異なる区域A1〜Axの各々で直接又は間接に測定する、
(ｇ) 各区域A1〜Axにおけるプラスミドの各堆積に対応するシグナルを記録及び定量する
(ｈ) 一緒に堆積したコントロールプラスミドに対する損傷を含むプラスミドのシグナル比を決定する。
本発明に従うこのような方法はいくらかの利点を有する：
− 本方法により、種々のタイプの損傷の修復を同時に評価できる可能性に起因して、種々の損傷を同定しつつ全体効果を検出することが可能になる。
− 本方法により、コントロールの生物学的媒質との比較に頼ることなく、生物学的抽出物の除去及び/又は除去/再合成の能力を決定することが可能になる。これは、生物学的抽出物の単一サンプルを用いて本方法を実施することによって得られる結果が、正確で定量化された損傷についての修復の有効性を抽出物に帰することに十分であるからである。
− 本方法は、種々の生物学的媒質の研究に特に適切であり、インビボの状況を良好に反映する。
− 本発明に従う方法により、DNA修復についての酵素活性に関して所与の生物学的媒質を「マッピング」することが可能になる。本方法により、得られたマップに従って生物学的抽出物を同定することが可能になる。
− 本方法により、所定の生物学的抽出物において欠損するか又は部分的に欠損する修復タンパク質を決定することが可能になり、したがって本方法は診断検査として役立つ。
− 本発明に従う方法により、DNA損傷修復に関して、種々の生物学的抽出物の性能レベル(performance level)を比較することも可能になる。
− 本方法は放射活性同位体を使用しない。
− 本方法は小型化されているので、非常に少量の生物学的材料を用いて多くの情報を入手することができる。
− 本方法は自動化することが可能である。
− 本方法により、種々のタイプの損傷の修復を同時に評価できる可能性に起因して、種々の損傷を同定しつつ全体効果を検出することが可能になる。
− 本方法により、コントロールの生物学的媒質との比較に頼ることなく、生物学的抽出物の除去及び/又は除去/再合成の能力を決定することが可能になる。これは、生物学的抽出物の単一サンプルを用いて本方法を実施することによって得られる結果が、正確で定量化された損傷についての修復の有効性を抽出物に帰することに十分であるからである。
− 本方法は、種々の生物学的媒質の研究に特に適切であり、インビボの状況を良好に反映する。
− 本発明に従う方法により、DNA修復についての酵素活性に関して所与の生物学的媒質を「マッピング」することが可能になる。本方法により、得られたマップに従って生物学的抽出物を同定することが可能になる。
− 本方法により、所定の生物学的抽出物において欠損するか又は部分的に欠損する修復タンパク質を決定することが可能になり、したがって本方法は診断検査として役立つ。
− 本発明に従う方法により、DNA損傷修復に関して、種々の生物学的抽出物の性能レベル(performance level)を比較することも可能になる。
− 本方法は放射活性同位体を使用しない。
− 本方法は小型化されているので、非常に少量の生物学的材料を用いて多くの情報を入手することができる。
− 本方法は自動化することが可能である。
本方法の有利な実施形態によれば、工程(ａ)で調製されるプラスミドは、二本鎖超コイル状形態を有するもの(pBR322, M13, pUCなど)から選択される。
コントロールプラスミドの超らせん状形態は、公知の技法、例えばQiagenプラスミド精製キットを使用する精製により得られる。他の精製工程、例えば塩化セシウム遠心分離及び/又はスクロース勾配遠心分離を実施することにより、望まないプラスミド形態の存在を制限することもまた好ましい。
コントロールプラスミドの超らせん状形態は、公知の技法、例えばQiagenプラスミド精製キットを使用する精製により得られる。他の精製工程、例えば塩化セシウム遠心分離及び/又はスクロース勾配遠心分離を実施することにより、望まないプラスミド形態の存在を制限することもまた好ましい。
本方法の工程(ａ)の別の有利な実施形態によれば、DNAの損傷を誘導し得る種々の物理的、生物学的又は化学的な作用因子は、単一損傷の生成、制限された数の損傷の生成又は同じファミリーに属する種々の損傷の生成を好ましくは誘導するものから選択される。
損傷のファミリーとして、例えば、酸化損傷、紫外線Ｂ又はＣの照射により誘導される光産物、化学付加物、エテノ塩基、無塩基部位及びDNA切断が挙げられる。
損傷のファミリーとして、例えば、酸化損傷、紫外線Ｂ又はＣの照射により誘導される光産物、化学付加物、エテノ塩基、無塩基部位及びDNA切断が挙げられる。
物理的及び化学的作用因子は、例えば、主に以下のように機能するものから選択される：
− II型光感作機構を介して：一重項酸素の主たる標的はグアニンである；この場合、生成する沢山の損傷は、８-オキソグアニンである(Ravanatら, Chem. Res. Tox., 1995, 8, 379-388)；
− Ｉ型光感作機構を介するか又はOH0基を遊離する機構を介して；この場合、得られるDNA損傷は酸化損傷である；これら損傷は、DNA中のプリン塩基及びピリミジン塩基に等しい様式で影響する。これら損傷には、８-オキソグアニン、グリコール、チミン、fapy-グアニン、fapy-アデニン、ヒドロキシメチル-ウラシル、５-ヒドロキシメチルシトシン及びホルミルウラシルが挙げられ得る(Cadetら, Rev. Physiol. Biochem. Pharm., 1997, 31, 1, 87)；
− 三重項−三重項エネルギー移動の機構を介して；この場合、生成する主な損傷は、シクロブタンピリミジン二量体である(Costalatら, Photochem, Photobiol., 1990, 51, 255-262)；
− DNA塩基により直接吸収されるエネルギーの放出(例えば紫外線Ｂ又はＣ照射)による。生成される結合は、シクロブタンピリミジン二量体、(6-4)光産物及びDewar原子価異性体である(Doukiら, J. Biol. Chem., 2000, 275, 11678-11685)；
− 一重項酸素を放出することによる。これら作用因子は、例えば、エンドペルオキシダーゼファミリーに属する。この場合、生成する損傷は、８-オキソグアニンである(Ravanatら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 40601-40604)。
− II型光感作機構を介して：一重項酸素の主たる標的はグアニンである；この場合、生成する沢山の損傷は、８-オキソグアニンである(Ravanatら, Chem. Res. Tox., 1995, 8, 379-388)；
− Ｉ型光感作機構を介するか又はOH0基を遊離する機構を介して；この場合、得られるDNA損傷は酸化損傷である；これら損傷は、DNA中のプリン塩基及びピリミジン塩基に等しい様式で影響する。これら損傷には、８-オキソグアニン、グリコール、チミン、fapy-グアニン、fapy-アデニン、ヒドロキシメチル-ウラシル、５-ヒドロキシメチルシトシン及びホルミルウラシルが挙げられ得る(Cadetら, Rev. Physiol. Biochem. Pharm., 1997, 31, 1, 87)；
− 三重項−三重項エネルギー移動の機構を介して；この場合、生成する主な損傷は、シクロブタンピリミジン二量体である(Costalatら, Photochem, Photobiol., 1990, 51, 255-262)；
− DNA塩基により直接吸収されるエネルギーの放出(例えば紫外線Ｂ又はＣ照射)による。生成される結合は、シクロブタンピリミジン二量体、(6-4)光産物及びDewar原子価異性体である(Doukiら, J. Biol. Chem., 2000, 275, 11678-11685)；
− 一重項酸素を放出することによる。これら作用因子は、例えば、エンドペルオキシダーゼファミリーに属する。この場合、生成する損傷は、８-オキソグアニンである(Ravanatら, J. Biol. Chem., 2001, 276, 40601-40604)。
化学作用因子は、既知の塩基改変を誘導するもの、とりわけ、発ガン物質ファミリーに属するものから選択される。例えば、アセチルアミノフルオレン(Hessら, 1996, Nucleic Acid Res. 24, 824-828)、シスプラチン(Pashevaら, 2002, Int. J. Biochem. Cell Biol., 34, 87-92)、ベンゾピレン(Lawsら, 2001, Mut. Res.; 484, 3-18)、ソラレン(Zhangら, Mol. Cell. Biol., 2002, 22, 2388-2397)、クロロアセトアルデヒド(CAA−Wangら, 2002, 13, 1149-1157)、タモキシフェン(Dasaradhiら, 1997, Chem. Res. Tox., 10, 189-196)及びtrans, trans-2,4-デカジエナール(DDE−Carvalhoら, 1998, Chem. Res. Tox., 11, 1042-1047)を挙げることができる。
本方法の工程(ａ)のなお別の有利な実施形態によれば、種々の作用因子が、一連のプラスミドの各々のプラスミドに対して使用される。
本方法の工程(ｂ)の有利な実施形態によれば、損傷の特徴付けは、(ｉ)損傷を有する各プラスミドの画分を取得し、(ii)画分の各々を、DNAからヌクレオシドを遊離させる酵素で消化し、次いで(iii)分離技法と定量的分析技法との組合せを用いて消化の結果を分析することを含む。
この実施形態の有利な設定(arrangement)によれば、消化は、少なくとも１つの以下の酵素を使用して実施される：仔ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ、P1ヌクレアーゼ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ及びアルカリホスファターゼ (Doukiら, J. Biol. Chem., 2000, 275, 11678-11685)。
この実施形態の別の有利な設定によれば、酵素消化の結果は、以下の技法の１つにより分析される：タンデム質量分析法と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)(Doukiら, 2000, J. Biol. Chem., 275, 11678-11685；Sauvaigoら, 2001, Photochem. Photobiol., 73, 230-237；Frelonら, Chem. Res. Tox., 2000, 13, 1002-1010),ガスクロマトグラフィーと組み合わせたHPLC(Wangら, 2000, 13, 1149-1157；Pougetら, 2000, Chem. Res. Tox., 13, 541-549)或いは電気化学的検出と組み合わせたHPLC(Pougetら, 2000, Chem. Res. Tox., 13, 541-549)。
本方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ｃ)の前に、工程(ａ)で得られる超コイル状形態のプラスミドを、好ましくはスクロース勾配遠心分離及び/又は塩化セシウム勾配遠心分離によって、精製する。
本方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ｃ)の前にまた、一連のプラスミドの各々のプラスミドを、任意に塩及び非イオン性界面活性剤と組み合わされてもよい、pH6.5〜8.0の緩衝液を好ましくは含む希釈緩衝液中で、５〜100μg/mlの濃度に希釈する。この緩衝液は、好ましくは、10mMリン酸緩衝液又はSSC緩衝液であり、0.05Ｍ〜0.5Ｍ NaClを含むことができる。
種々のプラスミドは、好ましくは、マイクロアレイ作成用ロボットを使用して堆積される。堆積容量は、好ましくは、100〜1000ピコリットルである。
本方法の工程(ｃ)の有利な実施形態によれば、支持体は、DNAに対する親和性が増大するように感作されている、ガラス、ケイ素及びその誘導体、並びに合成又は非合成ポリマー(ナイロン又はニトロセルロース膜)から選択される有機又は無機材料からなる群より選択される支持体である。その表面は、任意に官能化されていてもよい。好ましくは、支持体は、DNAを吸着するポリ-L-リジンを被覆したスライドグラス又はDNAと共有結合を形成するエポキシ基で官能化されたスライドグラスからなる。
必要であれば、支持体へのDNAの付着を増大させるための処理が実施される。これら処理は、堆積したDNA中に追加の損傷を作り出してはならない。
本発明に従う、各区域が一連のプラスミド全部を含む区域A1〜Axを含む標準的な支持体は、区域の各々に、
− コントロールプラスミドの少なくとも１つの堆積、及び
− 光産物を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 酸化傷害を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− エテノ塩基を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− DNA切断を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 発ガン性因子付加物を含むプラスミドの堆積
を含む。
− コントロールプラスミドの少なくとも１つの堆積、及び
− 光産物を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 酸化傷害を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− エテノ塩基を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− DNA切断を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 発ガン性因子付加物を含むプラスミドの堆積
を含む。
本発明に従う方法の工程(ｄ)によれば、
− 生物学的抽出物は、Manleyら, 1983, Methods Enzymol. 101, 568-582の方法又はBiadeら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 898-902の方法又は修復タンパク質を含む媒質を提供し得る任意の他の方法に従って、生物学的媒質から調製することができる；
− 標識は、親和性分子、蛍光化合物、抗体又はビオチンから選択される；好ましくは、標識又は標識を可視化する作用因子は、特に、直接蛍光を伴う蛍光化合物(Cy-3又はCy-5)又は間接蛍光を伴う蛍光化合物(ビオチン又はジゴキシゲニン)からなる群より選択される；
− 次いで、支持体は、修復反応を促進する温度(好ましくは30℃)にて、１〜５時間(好ましくは３時間)インキュベートされる。
− 生物学的抽出物は、Manleyら, 1983, Methods Enzymol. 101, 568-582の方法又はBiadeら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 898-902の方法又は修復タンパク質を含む媒質を提供し得る任意の他の方法に従って、生物学的媒質から調製することができる；
− 標識は、親和性分子、蛍光化合物、抗体又はビオチンから選択される；好ましくは、標識又は標識を可視化する作用因子は、特に、直接蛍光を伴う蛍光化合物(Cy-3又はCy-5)又は間接蛍光を伴う蛍光化合物(ビオチン又はジゴキシゲニン)からなる群より選択される；
− 次いで、支持体は、修復反応を促進する温度(好ましくは30℃)にて、１〜５時間(好ましくは３時間)インキュベートされる。
本発明に従う方法の工程(ｅ)の有利な実施形態によれば、支持体は、少なくとも１回、非イオン性界面活性剤を含む生理食塩水溶液(特に、Tween 20を含む10mMリン酸緩衝液)で洗浄され、次いで少なくとも１回水で濯がれる。
本発明に従う方法の工程(ｆ)によれば、シグナルは標識に適切な方法により測定される；例えば、標識が蛍光体である場合、支持体上の種々の堆積物が発する蛍光シグナルの直接測定を実施する。
本発明に従う方法の工程(ｇ)の有利な実施形態によれば、シグナルは、標識(好ましくは蛍光体)を励起し得、励起後に発するシグナルを測定し得るデバイスを用いて定量化される。
シグナルは、支持体及び使用する標識に適切な装置により測定される。蛍光画像分析のために、好ましくは使用する標識に特異的な波長でレーザ励起と共に、スキャナを使用してもよい。
シグナルは、支持体及び使用する標識に適切な装置により測定される。蛍光画像分析のために、好ましくは使用する標識に特異的な波長でレーザ励起と共に、スキャナを使用してもよい。
本発明に従う方法の工程(ｈ)の有利な実施形態によれば、損傷を含むプラスミドで得られたシグナルと、同じ支持体上に位置するコントロールプラスミドで得られるシグナルとの数値比が求められる。
本発明によれば、所与の生物学的媒質の修復プロフィールはこのように得られる。
この修復プロフィールは、媒質の全体修復能力及び特異的修復能力を決定するため、修復関連疾患を診断するため、又は所与の媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理(例えば、遺伝子毒性産物)の影響を評価するために使用することができる。
この修復プロフィールは、媒質の全体修復能力及び特異的修復能力を決定するため、修復関連疾患を診断するため、又は所与の媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理(例えば、遺伝子毒性産物)の影響を評価するために使用することができる。
したがって、本発明の主題は、
− 生物学的媒質の修復プロフィールを確立するための
− 修復関連疾患を診断するための
− 所与の生物学的媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理の影響を評価するための
− 生物学的媒質の修復系を調節し得る物質をスクリーニングするための
上記のような方法の使用である。
− 生物学的媒質の修復プロフィールを確立するための
− 修復関連疾患を診断するための
− 所与の生物学的媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理の影響を評価するための
− 生物学的媒質の修復系を調節し得る物質をスクリーニングするための
上記のような方法の使用である。
上記の設定に加えて、本発明はまた、本発明の主題である方法の実施例及び添付図面を参照する以下の記載から明らかになる他の設定も包含する。
添付図面において、
− 図１は、固体支持体の形態の一例を示す。９区域の堆積計画が見られる。
− 図２は、各区域の堆積計画を示す。
− 図３は、修復の図解−修復反応に使用した抽出物を調製するために使用した各細胞株に関連付けた修復マッピングを表す。
添付図面において、
− 図１は、固体支持体の形態の一例を示す。９区域の堆積計画が見られる。
− 図２は、各区域の堆積計画を示す。
− 図３は、修復の図解−修復反応に使用した抽出物を調製するために使用した各細胞株に関連付けた修復マッピングを表す。
しかし、これらの例が、本発明の主題を説明するためにのみ示され、いかなる意味においても本発明の限定を構成するものではないことは明確に理解されるべきである。
実施例１：一連のプラスミドの調製及び損傷の評価
プラスミドpBluescript IIを、Stratageneから提供されたプロトコルに従って、StratageneのXL1-Blue MRF超コンピテント細胞(supercompetent cell)を形質転換することにより作成する。
次いで、プラスミドを、推奨されるプロトコルに従ってQiagen plasmid midiキットを用いて精製する。
プラスミドpBluescript IIを、Stratageneから提供されたプロトコルに従って、StratageneのXL1-Blue MRF超コンピテント細胞(supercompetent cell)を形質転換することにより作成する。
次いで、プラスミドを、推奨されるプロトコルに従ってQiagen plasmid midiキットを用いて精製する。
プラスミドの更なる精製
プラスミドを、25mM Tris HCl緩衝液(pH 7.5；１Ｍ NaCl；５mM EDTA)中５〜20％スクロース勾配10mlにロードし、SW-41ローターを用いるBeckman超遠心分離機で４℃及び25000rpmにて18時間遠心分離する。次いで、１mlの画分を注意深く採取し、アガロースゲル上で分析する。少なくとも90％のコイル状形態のプラスミドを含む画分のみを維持する。プラスミドをエタノールで沈降させ、PBS中に溶解させる。
プラスミドを、25mM Tris HCl緩衝液(pH 7.5；１Ｍ NaCl；５mM EDTA)中５〜20％スクロース勾配10mlにロードし、SW-41ローターを用いるBeckman超遠心分離機で４℃及び25000rpmにて18時間遠心分離する。次いで、１mlの画分を注意深く採取し、アガロースゲル上で分析する。少なくとも90％のコイル状形態のプラスミドを含む画分のみを維持する。プラスミドをエタノールで沈降させ、PBS中に溶解させる。
プラスミド改変
−UVC照射− シクロブタンピリミジン二量体(CPD)及び(6-4)光産物の生成
PBS中に20μg/mlに希釈したプラスミドに、２つの15ワットネオンを備えるBioblock殺菌ランプを用いて照射する。３つのプラスミド調製物に、それぞれ0.06、0.12及び0.2J/cm2で照射する。
−クロロアセトアルデヒド(CCA-Signa)での処理− マロンジアルデヒド−デオキシグアニン(MDA-dG)の生成
プラスミドをPBS中で１mg/mlに調製し、等量のCAA(H2O中50％)を添加する。この溶液を37℃にて一晩インキュベートする。プラスミドを沈降により回収し、スクロース勾配で精製する。
−trans, trans-2,4-デカジエナール(DDE Sigma)での処理− エテノグアノシン及びエテノアデノシンの生成
200μlの0.2Ｍ炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.2)及び等量のTHFを、水において１mg/ml調製した200μlのプラスミドに添加する。次いで、４μlのDDE及び12μlの30％H2O2を添加する。この溶液を２時間50℃にて暗所でインキュベートする。ジクロロメタンでの２回の抽出によりDDEを排除する。DNAを沈降させ、次いでスクロース勾配で精製する。
−エンドペルオキシドDHPNO2での処理− 8-オキソ-2'-デオキシグアノシン(8-oxo-dG)の生成
J. Biol. Chem., 2000, 275, 40601-40604に記載のプロトコルに従って調製した、20μlのエンドペルオキシド((N,N’-ジ(2,3-ジヒドロキシプロピル)-1,4-ナフタレンジプロパンアミド-1,4-エンドペルオキシド)の溶液を、PBS中１mg/mlに希釈した200μlのプラスミド中で、２時間37℃にてインキュベートする。次いで、プラスミドを沈降させ、スクロース勾配で精製する。
−UVC照射− シクロブタンピリミジン二量体(CPD)及び(6-4)光産物の生成
PBS中に20μg/mlに希釈したプラスミドに、２つの15ワットネオンを備えるBioblock殺菌ランプを用いて照射する。３つのプラスミド調製物に、それぞれ0.06、0.12及び0.2J/cm2で照射する。
−クロロアセトアルデヒド(CCA-Signa)での処理− マロンジアルデヒド−デオキシグアニン(MDA-dG)の生成
プラスミドをPBS中で１mg/mlに調製し、等量のCAA(H2O中50％)を添加する。この溶液を37℃にて一晩インキュベートする。プラスミドを沈降により回収し、スクロース勾配で精製する。
−trans, trans-2,4-デカジエナール(DDE Sigma)での処理− エテノグアノシン及びエテノアデノシンの生成
200μlの0.2Ｍ炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.2)及び等量のTHFを、水において１mg/ml調製した200μlのプラスミドに添加する。次いで、４μlのDDE及び12μlの30％H2O2を添加する。この溶液を２時間50℃にて暗所でインキュベートする。ジクロロメタンでの２回の抽出によりDDEを排除する。DNAを沈降させ、次いでスクロース勾配で精製する。
−エンドペルオキシドDHPNO2での処理− 8-オキソ-2'-デオキシグアノシン(8-oxo-dG)の生成
J. Biol. Chem., 2000, 275, 40601-40604に記載のプロトコルに従って調製した、20μlのエンドペルオキシド((N,N’-ジ(2,3-ジヒドロキシプロピル)-1,4-ナフタレンジプロパンアミド-1,4-エンドペルオキシド)の溶液を、PBS中１mg/mlに希釈した200μlのプラスミド中で、２時間37℃にてインキュベートする。次いで、プラスミドを沈降させ、スクロース勾配で精製する。
プラスミド中の損傷の評価
同じ条件下で処理したプラスミドDNAの画分又は仔ウシ胸腺DNAの画分を、改変した塩基組成の分析のために採取する。
Doukiら, J. Biol. Chem., 275, 11678-11685により記載されたようにDNAを消化し、次いでHPLC-タンデム質量分析により分析を実施する。
同じ条件下で処理したプラスミドDNAの画分又は仔ウシ胸腺DNAの画分を、改変した塩基組成の分析のために採取する。
Doukiら, J. Biol. Chem., 275, 11678-11685により記載されたようにDNAを消化し、次いでHPLC-タンデム質量分析により分析を実施する。
104の正常塩基当たり以下の量の損傷を得る：
これら処理は非常に異なる比率で損傷の生成を生じさせることに留意すべきである。
− UVC照射は、シクロブタンピリミジン二量体(CPD)を非常に大きな程度で引き起こし、(6-4)光産物の生成を小さな程度で引き起こす。
− DDEは、エテノ-デオキシグアノシンの優勢な生成を引き起こす。
− エンドペルオキシドは、8-オキソ-2'-デオキシグアノシンの非常に優勢な生成を引き起こす。
− UVC照射は、シクロブタンピリミジン二量体(CPD)を非常に大きな程度で引き起こし、(6-4)光産物の生成を小さな程度で引き起こす。
− DDEは、エテノ-デオキシグアノシンの優勢な生成を引き起こす。
− エンドペルオキシドは、8-オキソ-2'-デオキシグアノシンの非常に優勢な生成を引き起こす。
これらの作用因子により、修復酵素の正確なファミリーを標的する特異的な損傷の優勢な生成を誘導することが可能になることが理解される。
実施例２：実施例１で調製した一連のプラスミドを用いる本発明に従う方法の実施
支持体へのプラスミドの堆積
プラスミドをPBS中で20μg/mlに希釈する。500ピコリットルの堆積物を、GESIMロボットを使用して、市販のポリ-L-リジン被覆スライドグラス(VWR)上に作成する。スライドを４℃にて保存する。
支持体へのプラスミドの堆積
プラスミドをPBS中で20μg/mlに希釈する。500ピコリットルの堆積物を、GESIMロボットを使用して、市販のポリ-L-リジン被覆スライドグラス(VWR)上に作成する。スライドを４℃にて保存する。
各スライド(支持体Ｓ)は、図１の形態Ａに従って配置された９つの全く相等しい区域(A1〜A9)を含む。
各区域において、一連のプラスミドは、例えば区域A1を例示する図２に従って堆積される。
各区域が、異なる生物学的媒質を試験することを可能にする。
各区域において、一連のプラスミドは、例えば区域A1を例示する図２に従って堆積される。
各区域が、異なる生物学的媒質を試験することを可能にする。
修復反応
試験すべき生物学的媒質又は抽出物を含む溶液を調製する；溶液５μlについて、組成は以下のとおりである：
− 抽出物 0.5μl
− ５×修復緩衝液 １μl
− CY5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech)
(0.1nmol/μl) 0.2μl
− ２Ｍ KCl 0.2μl
− ATP (Roche - 100mM) 0.1μl
容量はH2Oで５μlにする。
試験すべき生物学的媒質又は抽出物を含む溶液を調製する；溶液５μlについて、組成は以下のとおりである：
− 抽出物 0.5μl
− ５×修復緩衝液 １μl
− CY5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech)
(0.1nmol/μl) 0.2μl
− ２Ｍ KCl 0.2μl
− ATP (Roche - 100mM) 0.1μl
容量はH2Oで５μlにする。
５×修復緩衝液の組成：
Hepes/KOH，200mM，pH7.8；35mM MgCl2；2.5mM DTT；２μM dATP，２μM dGTP；２μM dCTP；50mMホスホクレアチン；250μg/mlクレアチンホスホキナーゼ；0.5mg/ml BSA；17％グリセロール。
Hepes/KOH，200mM，pH7.8；35mM MgCl2；2.5mM DTT；２μM dATP，２μM dGTP；２μM dCTP；50mMホスホクレアチン；250μg/mlクレアチンホスホキナーゼ；0.5mg/ml BSA；17％グリセロール。
使用する細胞株
本実施例は、異なる細胞株に由来する３つの異なる抽出物で実施する：
・ 株１：これらはHeLa細胞である。抽出物は市販の核抽出物であり、4C Biotech (Belgium)という会社製である。これらは、Dignamら(Nucl. Ac. Res., 1983, 11, 1475-1489)の方法により調製された。そのタンパク質含量は24mg/mlである。
・ 株２：これは、色素性乾皮症(相補群Ｄ)に罹患した患者から樹立されたAS203細胞の株である。抽出物は、Manleyらのプロトコルに従って調製された。マイクロBCAキット(micro BCA kit)を用いるタンパク質のアッセイにより、44mg/mlのタンパク質量を評価することが可能になる。
・ 株３：これらはXP12RO細胞である。この株は、色素性乾皮症(相補群Ａ)に罹患した患者から樹立された。抽出物は、Manleyら(Methods Enzymol., 1983, 101, 568-582)のプロトコルに従って調製された。得られる抽出物は、36mg/mlのタンパク質を含む(マイクロBCAアッセイキット、Interchim)。
本実施例は、異なる細胞株に由来する３つの異なる抽出物で実施する：
・ 株１：これらはHeLa細胞である。抽出物は市販の核抽出物であり、4C Biotech (Belgium)という会社製である。これらは、Dignamら(Nucl. Ac. Res., 1983, 11, 1475-1489)の方法により調製された。そのタンパク質含量は24mg/mlである。
・ 株２：これは、色素性乾皮症(相補群Ｄ)に罹患した患者から樹立されたAS203細胞の株である。抽出物は、Manleyらのプロトコルに従って調製された。マイクロBCAキット(micro BCA kit)を用いるタンパク質のアッセイにより、44mg/mlのタンパク質量を評価することが可能になる。
・ 株３：これらはXP12RO細胞である。この株は、色素性乾皮症(相補群Ａ)に罹患した患者から樹立された。抽出物は、Manleyら(Methods Enzymol., 1983, 101, 568-582)のプロトコルに従って調製された。得られる抽出物は、36mg/mlのタンパク質を含む(マイクロBCAアッセイキット、Interchim)。
３μlの各修復溶液を、スライドの単一区域の全ての堆積物上に堆積させる。スライドを湿潤条件下30℃にて３時間インキュベートする。スライドを、0.1％のTween20を含むPBS緩衝液中で10分間３回洗浄する。次いで、スライドを15分間H2O中で洗浄する。乾燥後、蛍光を読み取る。
修復シグナルの分析
修復反応後、各区域の種々の堆積物の蛍光を、635nmでのAxonスキャナ及びGenePix Pro分析ソフトウェアにより分析する。次いで、３つの同一点の平均を決定する。各タイプの改変についてこのようにして値を得る。各細胞株についてグラフをプロットする。このグラフは、支持体上又はチップ上に存在する損傷に関連する修復系のマッピングに対応し、使用した抽出物に対して特異的である。得られる結果を図３に示す。蛍光レベルを任意単位(AU)で与える。
各グラフは、使用した細胞抽出物を調製するために使用した細胞株について独特かつ特異的であることが観察される。したがって、グラフは、所与の細胞抽出物の全体修復活性を正確に特徴付け、標的する系の機能性を明らかにするために使用することができる。
修復反応後、各区域の種々の堆積物の蛍光を、635nmでのAxonスキャナ及びGenePix Pro分析ソフトウェアにより分析する。次いで、３つの同一点の平均を決定する。各タイプの改変についてこのようにして値を得る。各細胞株についてグラフをプロットする。このグラフは、支持体上又はチップ上に存在する損傷に関連する修復系のマッピングに対応し、使用した抽出物に対して特異的である。得られる結果を図３に示す。蛍光レベルを任意単位(AU)で与える。
各グラフは、使用した細胞抽出物を調製するために使用した細胞株について独特かつ特異的であることが観察される。したがって、グラフは、所与の細胞抽出物の全体修復活性を正確に特徴付け、標的する系の機能性を明らかにするために使用することができる。
HeLa株は、UV照射よって誘導された損傷(優勢にはCPD及び(6-4))を修復する場合より二倍効果的にDDEによって誘導された損傷(優勢にはエテノ-dG)を修復することが観察される。酸化傷害(優勢には8-oxo-dG)は、よりはるかに弱く修復されることが観察される。
AS203株では、(低くはあるが)最高レベルの修復がUV誘導損傷について観察される。
XP12RO株に関して、DDE誘導損傷(優勢にはエテノ-dG)が最も効果的に修復され、UVC照射の場合より３倍高いシグナルを与えることが観察される。XPA株はCPDを修復せず、したがってUVC照射DNAで得られるシグナルは、(6-4)光産物の修復に帰することができることが知られている。
AS203株では、(低くはあるが)最高レベルの修復がUV誘導損傷について観察される。
XP12RO株に関して、DDE誘導損傷(優勢にはエテノ-dG)が最も効果的に修復され、UVC照射の場合より３倍高いシグナルを与えることが観察される。XPA株はCPDを修復せず、したがってUVC照射DNAで得られるシグナルは、(6-4)光産物の修復に帰することができることが知られている。
本発明の予測不可能な利点は、タンパク質の量が抽出物ごとに異なっても、所与の抽出物に対して、損傷を含むDNAのシグナル対コントロールDNAのシグナルについて得られる比は、種々の抽出物の修復能力を互いに比較するために使用することができることである。
Claims (21)
- 以下の工程：
(ａ) 各々が異なるDNA損傷を含む一連のプラスミドを、少なくとも１つの物理及び/又は化学作用因子で該種々のプラスミドを独立して処理し、該プラスミドの各々の超コイル状画分を回収することにより調製する工程、
(ｂ) 該一連のプラスミドの各プラスミドに存在する損傷を特徴付ける工程、
(ｃ) 各区域A1〜Ax(ｘは同時に試験すべき生物学的媒質の数に等しい整数に相当する)が該一連のプラスミドを含む異なる区域A1〜Axに分割された官能化支持体を形成するように、予め定められた形態Ａに従って、単一の固体支持体上に、該一連のプラスミドの種々のプラスミド及び損傷を有さない少なくとも１つの超コイル状コントロールプラスミドを堆積させる工程、
(ｄ) 各々が修復についての酵素活性とATPとATP再生系と標識ヌクレオチド三リン酸と生物学的媒質中に存在する修復酵素の活性に必要な他の任意の成分とを含み得る少なくとも１つの生物学的媒質を含む種々の修復溶液と共に、好ましくは30℃の温度にて１〜５時間、好ましくは３時間、工程(ｃ)で得られた官能化支持体をインキュベートする工程であって、該修復溶液の各々が、インキュベーションの前に、官能化支持体の予め定められた異なる区域A1〜Axの各々に堆積される工程、
(ｅ) 該官能化支持体を少なくとも１回洗浄する工程、
(ｆ) 予め定められた異なる区域A1〜Axの各々で、工程(ｄ)の修復反応の間にDNA中に組み込まれた標識により生じるシグナルを直接又は間接に測定する工程、
(ｇ) 各区域A1〜Axにおけるプラスミドの各堆積物に対応するシグナルを記録及び定量する工程、及び
(ｈ) 一緒に堆積したコントロールプラスミドに対する損傷を有するプラスミドのシグナル比を決定する工程
を包含することを特徴とする、少なくとも１つの生物学的媒質の全体DNA修復能力及び特異的DNA修復能力の定量的評価方法。 - 工程(ａ)のプラスミドが二本鎖超コイル状形態を有するものから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 工程(ａ)において、DNAの損傷を誘導し得る種々の物理又は化学作用因子が、単一損傷の生成、制限された数の損傷の生成又は同じファミリーに属する種々の損傷の生成を好ましくは誘導するものから選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
- 工程(ａ)において、種々の作用因子が、一連のプラスミドの各プラスミドに対して使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ｂ)において、損傷の特徴付けが、(ｉ)損傷を有する各プラスミドの画分を取得し、(ii)画分の各々を、DNAからヌクレオシドを遊離させる酵素で消化し、次いで(iii)分離技法と定量的分析技法の組合せを用いて、消化の結果を分析することを包含することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 消化が、以下の酵素：仔ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ、P1ヌクレアーゼ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ及びアルカリホスファターゼのうちの少なくとも１つを使用して実施されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 酵素消化の結果が、以下の技法：タンデム質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィーと組み合わせたHPLC又は電気化学的検出と組み合わせたHPLCのうちの１つにより分析されることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
- 工程(ｃ)の前に、工程(ａ)で得られた超コイル状形態のプラスミドが、スクロース勾配遠心分離及び/又は塩化セシウム勾配遠心分離により精製されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ｃ)の前に、一連のプラスミドの各プラスミドが、任意に塩及び非イオン性界面活性剤と組み合わされてもよい、好ましくはpH6.5〜8.0の緩衝液を含む希釈緩衝液中で、５〜100μg/mlの濃度に希釈されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ｃ)において、一連のプラスミドの堆積物の容量が、好ましくは100〜1000ピコリットルの間であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ｃ)において、支持体が、DNAについての親和性を増大させるために感作された、ガラス、ケイ素及びその誘導体並びに合成又は非合成のポリマーから選択される有機又は無機材料からなる群から選択される支持体であり、その表面は任意に官能化されていてもよいことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 支持体が、DNAを吸着するポリ-L-リジンで被覆されたスライドグラス又はDNAと共有結合を形成するエポキシ基で官能化されたスライドグラスからなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
- 支持体が異なる区域A1〜Axを含み、区域の各々が、
− コントロールプラスミドの少なくとも１つの堆積、及び
− 光産物を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 酸化傷害を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− エテノ塩基を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− DNA切断を含むプラスミドの堆積、及び/又は
− 発ガン性物質付加物を含むプラスミドの堆積
を含むことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。 - 請求項１に記載の方法の工程(ｅ)において、支持体が、非イオン性界面活性剤を含む生理食塩水溶液、特にはTween 20を含む10mMリン酸緩衝液で少なくとも１回洗浄され、その後水で少なくとも１回濯がれることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法の工程(ｆ)において、シグナルが、標識に適切な方法により測定されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法の工程(ｇ)において、シグナルが、標識を励起し得、励起後に発せられるシグナルを測定し得るデバイスを使用して定量されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 工程(ｈ)において、同じ支持体に位置する損傷を含むプラスミドで得られるシグナルとコントロールプラスミドで得られるシグナルとの数値比が定立されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 所与の生物学的媒質の修復プロフィールを定立するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
- 修復関連疾患を診断するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
- 所与の媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理の影響を評価するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
- 生物学的媒質の修復系を調節し得る物質をスクリーニングするための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
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