KR101121792B1 - 웨스턴 블럿팅 및 면역침강에 이용 가능한 셀레노프로테인 ｓ의 항체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 셀레노프로테인 S(selenoprotein S)의 항체 및 그 제조방법을 제공한다. 상기한 본 발명에 의한 항체는 웨스턴 블럿팅 뿐만 아니라 면역침강에도 이용 가능하여 셀레노프로테인 S의 정량 및 정성 분석에 유용하게 활용될 수 있다.

셀레노프로테인 S, 웨스턴 블럿팅, 면역침강, 마커, 항체

Description

웨스턴 블럿팅 및 면역침강에 이용 가능한 셀레노프로테인 Ｓ의 항체 및 그 제조방법{Antibody against selenoprotein S available for western blotting and immunoprecipitation and method for preparation thereof}

본 발명은 셀레노프로테인 S(selenoprotein S)의 항체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 웨스턴 블럿팅 뿐만 아니라 면역침강에도 이용 가능하여 생체 내에서 셀레노프로테인 S의 정량 및 정성 분석에 유용하게 활용될 수 있는 셀레노프로테인 S의 항체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

셀레늄(Selenium, Se)은 생체 내 극미량 원소로 존재하며 1950년대 초반까지 인간에게 매우 유해한 독성 원소로만 알려져 왔으나, 1957년 쥐에서 vitamin E 결핍에 의해 유도되는 간의 손상이 셀레늄 공급으로 저해된다는 결과가 보고되면서 이 원소에 대한 유용성이 인식되기 시작하였다. 이후 많은 연구를 통해 다양한 셀레늄 화합물은 세포를 산화적 스트레스로부터 보호하며 바이러스 감염에 대한 면역력 증진, 간세포의 파괴 억제, 암, 당뇨병 등 세포의 산화적 파괴로 인하여 일어나는 질환의 예방과 치료에 효과가 있다고 보고되었다. 또한, 노화물질인 과산화지질의 생성을 강력하게 막아주며 혈관 내 혈소판 응고를 막아주는 프로스타글라딘이 라는 성분의 생성에도 필수적으로 관여하고 있어서 고혈압, 동맥경화 등의 혈관계 질환에서도 중요한 역할과 작용을 하는 것으로 예상하고 있다. 그러므로 생체 내에서 이렇게 중요한 역할을 하는 셀레늄(Se)을 포함하는 셀레노프로테인(selenoprotein)의 효소 활성 및 생물학적 기능 연구는 매우 중요한 의미를 가진다.

셀레늄(Se) 동위원소 또는 인실리코(in silico)에서 유전자 염기서열 비교 분석을 통해 최근까지 25 종류의 셀레노프로테인이 인간 게놈에 존재하는 것으로 보고되었다. 셀레노프로테인이 합성되는 동안 셀레노시스테인(selenocysteine)은 단백질을 형성하기 위한 아미노산 서열 중 특정 위치에 결합하게 된다.

그런데 현재까지 알려진 셀레노프로테인들 중 셀레노시스테인의 역할이 밝혀진 것은 극히 일부이다. 가장 잘 알려진 예로는 싸이오리독신 환원효소(thioredoxin reductase)가 있으며, 싸이오리독신 (thioredoxin)를 포함한 몇 가지 항산화 효소 시스템의 재생에 관여한다고 알려져 있다. 또한 셀레노프로테인 P는 혈장에서 발견되고 생체 내 셀레늄의 분배에 관여한다고 보고되어 있고, 셀레노프로테인 W는 근육에서 발견되고 근육 대사에 관여하는 것으로 추정된다.

한편, 셀레노프로테인 S(Sel S)는 당뇨병 쥐로부터 최초로 클론 되었다. 단식중인 당뇨병 동물모델(fasting diabetic animals)에서 셀레노프로테인의 발현이 감소하는 것이 관찰되었으며, 최초 Tanis라는 이름으로 명명되어졌다(1). 이후 인간의 homolog와 유사한 Tanis는 SEPS1에 의해 코딩되는 포유류 셀레노프로테인 S로 판명이 되었다. 이 단백질은 또한 SELS 및 VIMP로 불린다(2, 3). Sel S의 분자량 은 21.1 kDa이다. Sel S는 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 의하여 발현이 유도되고, Sel S는 주로 소포체막 또는 세포막 표면에 분포되어져 있다(4, 5). 나아가, 이 단백질이 염증반응에 관련하는 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(6, 7).

이와 같이 셀레노프로테인들은 세포사멸 및 암 등 다양한 질환과 관련된 기능들로 인해 생체 내 중요성이 강조되고 있으나, 셀레노프로테인의 역할과 기능 분석에 관련된 연구는 미미한 실정이다. 특히 웨스턴 블럿팅 뿐만 아니라 면역침강에도 이용될 수 있어 셀레노프로테인 S의 정량 및 정성분석에 유용하게 활용될 수 있는 관련 항체에 대한 연구는 지금까지 보고된 바가 없다.

상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 첫 번째 목적은 셀레노프로테인 S의 정량 및 정성 분석을 위한 웨스턴 블럿팅과 면역침강이 가능한 셀레노프로테인 S의 항체를 제조할 수 있는 항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 항원을 이용하여 제조된 셀레노프로테인 S의 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 셀레노프로테인 S의 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩티드들을 동물에 주사하는 단계 및 상기 동물로부터 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 펩티드는 KLH 컨쥬게이션을 위해 N-말단에 시스테인이 추가되고, C-말단은 아미드화(amidation)로 변형된 펩티드인 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로 컨쥬게이트된 친화성 레진으로 상기 항체를 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 셀레노프로테인 S의 셀레노시스테인 코돈 TGA가 TGC으로 치환된 염기서열을 포함하는 셀레노프로테인 S 돌연변이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

상기 본 발명은 상기 항체로 웨스턴 블럿팅 또는 면역침강하여 셀레노프로테인 S 정량 또는 정성 분석하는 방법을 제공한다.

나아가 본 발명은 상기 항체를 이용하는 당뇨 또는 염증성 질환 진단용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 웨스턴 블럿팅과 면역침강이 가능한 셀레노프로테인 S의 항체를 제조할 수 있는 항원으로 2개의 올리고펩티드(서열번호 1 및 서열번호 2)를 제공한다.

본 발명에 의한 셀레노프로테인 S의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 1에 나 타나 있다. 셀레노시스테인 (SeCys)의 잔기는 TGA (UGA) 코돈으로 인식되며, 단백질 합성 중지신호(stop signal)로서 TGA (UGA) 코돈으로 인식하기보다는 셀레노시스테인으로 인식되어 단백질 내로 삽입하게 된다. 2개의 올리고펩티드인 아미노산 서열 ¹²⁶KSYKGNAKKPQEEDSPG¹⁴² (서열번호 1) 및 ¹⁷⁴SWRPGRRGPSSGG¹⁸⁷(서열번호 2)가 합성되었고 각각 토끼에 주사되었다. 본 발명자들은 상기 토끼에서 얻어진 셀레노프로테인 S의 혈청을 재조합 Sel S에 대한 웨스턴 블럿팅 및 올리고펩티드를 이용한 ELISA를 이용하여 분석하여 셀레노프로테인 S 항체 형성 여부를 확인하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 면역 반응 활성은 3번의 추가적인 주사 후까지 증가되었고, 3차 면역주사 후 토끼는 희생되었고 혈청이 수집되었다.

한편, 재조합 셀레노프로테인 S는 E. Coli BL21(DE3)을 이용하여 발현을 시킬 수 있는데, 상기 재조합 셀레노프로테인 S가 포함된 세포를 OD 600 값이 0.5 ~ 1.0이 될 때까지 37 ℃에서 배양한 후 1 mM IPTG(Sigma, USA)에 의해 발현을 유도하여 재조합 셀레노프로테인 S의 발현을 시간대별로 확인하였다. 그 결과 셀레노프로테인 S는 상기 IPTG에 의한 자극 후 2 시간이 지난 후 그 발현이 최고에 달한다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 발현이 유도된 Sel S는 항혈청을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 이용하여 분석되었다(도 4 참조).

본 발명에 의한 ¹²⁶KSYKGNAKKPQEEDSPG¹⁴² (서열번호 1) 및 ¹⁷⁴SWRPGRRGPSSGG¹⁸⁷(서열번호 2)에 대한 다클론 항체는 각 올리고펩티드와 결합시켜 만들어진 친화성 레진을 이용하여 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 분리 된 항체 샘플의 순도는 쿠마시 블릴리언트 블루 염색(coomasie brilliant blue staining) 및 2차 항체인 HRP 컨쥬게이트된 항-토끼 항체(HRP conjugated anti-rabbit antibody)를 이용한 웨스턴 블럿팅에 의해 확인되었다(도 5a 및 5b 참조). 정제된 항체는 -70 ℃에서 보관되었다.

나아가 세포 내 Sel S의 발현도 확인되었다. 세포에서 Sel S의 발현은 정제된 각 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅으로 측정되었다. 도 6a 내지 6c에 도시된 바와 같이, Sel S의 발현은 HepG2, HEK293T, Raw264.7, NIH3T3 세포주에서 확인되었다.

본 발명에 의한 각 항체의 면역침강 이용가능성도 확인되었다. 구체적으로 살펴보면 mock 및 pEGFPN1-Sel S로 과발현된 HEK293T 세포 추출물은 정제된 항체들과 면역침강되었다. 도 7a 내지 도 8b에 도시된 바와 같이, 세포 내에 존재하는 Sel S 그리고 pEGFP 융합된 Sel S 단백질은 각 항체들에 의해 세포 추출물로부터 면역 침강(immunoprecipitation)이 잘 되었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 올리고펩티드 항원들을 이용하면 웨스턴 블럿팅 및 면역침강이 가능한 셀레노프로테인 S 항체를 제조할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

나아가 본 발명에 의한 셀레노프로테인 S 항체를 이용하면 생체 내에서 셀레노프로테인 S의 정량 및 정성 분석이 가능하여, 셀레노프로테인 S의 효소 활성 및 생리학적 기능 분석을 용이하게 할 수 있는 효과도 도모할 수 있다. 특히 당뇨, 염증성 질환 등의 다양한 질환의 원인 규명 및 치료와 예방을 위해 필요한 표적 유전자 및 단백질로서 셀레노프로테인 S의 분석이 가능하게 된다. 또한 세포 사멸 억제 과정 또는 새로운 단백질 합성 및 교정 과정에서 셀레노프로테인 S의 역할과 기능 분석도 가능하게 된다. 나아가 본 발명에 의하면 셀레노프로테인 S와 상호 작용 또는 결합하는 단백질 분석을 가능하게 하는 효과도 도모할 수 있다.

따라서 본 발명은 셀레노프로테인의 역할과 기능 분석 분야에 크게 기여할 수 있어 매우 유용한 발명이라 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 셀레노프로테인 S 특이적 항체의 제조

1) 세포(Cells)

37 ℃에서 5 % CO₂가 포함된 배양기에서 HEK293T, HepG2 세포들은 10 % fetal bovine serum (FBS; GIPCO)이 첨가된 DMEM(Invitrogen) 배지에서 배양되었 고, NIH3T3 세포는 10 % bovine serum (CS; invitrogen)이 첨가된 DMEM에서, Raw264.7 세포는 10 % FBS 및 항생제(1 % penicillin and 0.5 mg per 1 ml G418)가 첨가된 DMEM에서 배양되었다.

2) 셀레노프로테인 S 특이적 항체(Selenoprotein S specific antibodies)

다클론 항혈청은 토끼에서 생산되었다. 도 1은 분석된 인간 셀레노프로테인 S(Sel S; GenBank assession No. BC005840)의 서열을 나타내었다. 본 발명자들은 상기 분석된 서열상에서 항원성이 좋은 2개의 아미노산 서열(서열번호 1 및 서열번호 2)을 선택하였다. 2개의 펩티드는 펩트론(Peptron, Korea)에 의뢰하여 제조되었다.

2개의 펩티드는 동시에 아미노산 C-¹²⁶KSYKGNAKKPQEEDSPG¹⁴²-NH₂ 및 C-¹⁷⁴SWRPGRRGPSSGG¹⁸⁷-NH₂를 포함하는 KLH-컨쥬게이티드 펩티드(KLH-conjugated peptide)로 면역시켰다. KLH 컨쥬게이션을 위해 시스테인이 N-말단에 추가되었다. 폴리펩티드의 C-말단은, 단백질 내부 서열이므로 다음 서열과 아미드 결합으로 연결되어 있는 구조를 모방하기 위해 아미드화(amidation)로 블럭킹되도록 변형되었다. 항체형성을 높이기 위하여, 토끼는 2 주일 간격으로 3회 변형된 폴리펩티드의 조합으로 접종되었다. 주사 후 일주일 뒤에 면역된 토끼의 혈청을 채취한 후, 웨스턴 블럿팅 및 ELISA을 이용하여 항체형성을 확인하였다.

3) 항체의 정제(Purification of antibodies)

2개의 항원 폴리펩티드 C-¹²⁶KSYKGNAKKPQEEDSPG¹⁴²-NH₂ 및 C-¹⁷⁴SWRPGRRGPSSGG¹⁸⁷-NH₂에 특이적인 다클론 항체가 각각의 폴리펩티드로 컨쥬케이트된 친화성 레진 컬럼(affinity resin column)을 이용하여 정제되었다. 친화성 레진은 펩트론(Korea)에 의뢰하여 제조되었다. 펩티드 친화성 레진은 프로테아제에 의해 쉽게 파괴되므로, 프로테아제 저해제 100 uM PMSF가 항혈청에 첨가되었다. 친화성 레진은 10배 부피의 인삼염식염수(phosphate buffered salin, PBS)로 세척되고 5배 부피의 10 mM Tris (pH 7.5)를 흘려보내 레진(resin)의 평형상태를 유지하였다. 혈청은 컬럼에 로딩되기 전에 10 mM Tris (pH 7.5)로 일대일로 희석되었다. 혼합된 항혈청은 컬럼에 천천히 흘려주었다. 컬럼이 레진의 10배 부피의 1 M NaCl로 세척된 후, 혈청이 100 mM 글리신(pH 2.5)으로 분리되었다. 1 ml의 분리된 샘플은 pH를 7.0 ~ 8.0로 맞추기 위해 150 ul의 1 M Tris (pH 8.0)가 들어있는 튜브에 수집된다. 상기 정제된 항체 샘플의 순도는 웨스턴 블럿팅 및 쿠마시 블릴리언트 블루 염색(coomassie brilliant blue staining)에 의해 확인되었다.

실시예 2. E. coli 에서 재조합 Sel S의 과발현 및 정제(Overexpression and purification of recombinant Sel S in E.coli )

1) PCR

프라이머는 인간 Sel S에 관하여 보고된 염기서열에 기초하여 제조하였다. 즉, N-말단 프라이머(N-terminal primer)는 포워드(forward) 5'-ATACTCGAGGAACGCCAAGAGGAGTCTCTGTCCG(서열번호 3) 및 리버스(reverse) 5'- AATGGATCCTTAGCCGCATCCGCCAGATGACGGG(서열번호 4)가 사용되었다.

N-말단 및 C-말단 프라이머는 각각 Xho1 및 BamH I 제한부위(restriction site)가 포함되도록 제조되었다. 셀레노시스테인(Selenocystein, SeCys) 코돈 TGA는 TGC로 변경되어 cystein (Cys)이 합성되었다. 셀레노프로테인 돌연변이를 코딩하는 cDNA는 PCR 위치 지정 돌연변이생성(PCR site directed mutagenesis)에 의해 생성되었다. PCR은 200 ng의 cDNA를 이용하여 수행되었다. 이러한 변이 유전자의 증폭은 바이오니아사의 Accupower HL PCR PreMix를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였으며 베네비오로부터 구입한 cDNA 클론을 템플릿(template)으로 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94 ℃에서 5분간 초기 변성하고, 94 ℃에서 30 초, 58 ℃ 에서 30 초 어닐링(annealing)한 후, 68 ℃에서 1 분간 신장(extension)을 실시하였으며 15회 반복하여 증폭하였다.

2) E. coli 에서 재조합 Sel S의 과발현 및 정제(Overexpression and purification of recombinant Sel S in E.coli )

재조합 단백질을 제조하기 위해, 상기 PCR을 이용하여 만들어진 Sel S 돌연변이 산물은 클로닝 제조사의 프로토콜(Takara ligation mixture)에 따라 리게이션 에 의해 6 x His가 태깅된 발현벡터인 pET-14b vector (Novagen) 내로 클론되어 재조합 플라스미드가 제조되었다(도 3 참조).

E.coli DH5 a Competent 세포에 상기 플라스미드를 형질전환하여 삽입한 후 얻어진 재조합 플라스미드 5ng을 단백질 발현 균주인 E.coli BL21(DE3)에 다시 형질전환시켰다.

재조합 Sel S를 포함하는 E.coli strain BL21(DE3) 세포는 암피실린이 포함된 LB 배양액에서 진탕 배양되었다. 세포는 600 nm의 흡광도에서 0.6 ~ 1.0 이 될 때까지 배양되었고, 그런 다음 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG; Sigma, USA)의 처리에 의해 pET-14b vector에 삽입된 셀레노프로테인 S의 발현이 2시간 동안 유도되었다. 상기 세포는 수집되었고 사용 전 -70 ℃에서 보관되었다.

정제를 위하여 냉동된 세포는 해동되었고 차가운 인산염식염수(PBS)로 세척되었고, 프로테아제 저해제 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)를 포함하는 용해버퍼(50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40)로 용해되었다. 원심분리 후, 정제를 위해 상층액이 세포 추출액으로서 사용되었다. 재조합 Sel S는 제조자의 프로토콜에 따라 Ni-NTA agarose (QIAGEN, USA) 또는 Talon metal affinity resin(Invitrogen, USA)을 이용하여 정제되었다. 정제된 단백질은 사용할 때까지 -70 ℃에서 보관되었다.

실시예 3. 웨스턴 블럿팅(Western Blotting)

전체 세포 추출물에서 12 % SDS 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 단백질이 분리되었고, 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane, GE Healthcare, Germany)으로 옮겨졌다. 단백질이 옮겨진 막에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1시간 동안 흔들면서 5 % 스킨 밀크(skin milk)와 반응되었다. 1차 항체(primary antibodies)를 1: 4,000의 비율로 5% 스킨 밀크로 희석하여 3시간 동안 상온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 막은 TBST (20 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 및 0.01% Tween 20)로 세척되었고, 다시 5% 스킨 밀크로 2차 항체(anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-conjugated antibodies, GE healthcare, UK)를 1:4000으로 희석한 후 상온에서 1 시간 동안 배양되었다. 그런 다음 막은 TBST 버퍼로 다시 세척되었다. 면역반응 단백질은 제조자의 프로토콜에 따라 GE Armersham 또는 PIERCE (USA)의 개선된 화학발광 검출 시스템(chemiluminescence detection system)을 이용하여 발색반응을 일으킨 후 검출하였다.

실시예 4. 면역침강(Immunoprecipitation)

HEK293T 세포를 수집한 후에, 차가운 인산염식염수(PBS)로 세척되었고 1 mM PMSF을 포함하는 용해버퍼 (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40)안에서 30 분 동안 얼음 위에서 용해되었다. 그런 다음 원심분리를 통하여 상층액만을 모아서 새로운 튜브에 옮겼다. 수집된 세포 추출물은 프로테인 G 아가로즈 비드(Protein G agarose beads, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 전세 척(preclear) 되었다. 전세척된 세포 추출물(Precleared cell lysates)은 밤새도록 4 ℃에서 각각 정제된 anti- Sel S (항체 1 ug 당 1 mg 단백질의 비율)로 면역침강되었다. 그런 다음 프로테인 G 아가로즈 비드가 샘플에 첨가되었고 2시간 동안 4 ℃에서 배양되었다. 면역 복합체(immune complex)를 수득하기 위해, 샘플은 5000 rpm에서 10 분 동안 원심분리되었다. 비드는 추출버퍼로 3회 세척되었다. 면역블럿팅 분석을 위해, 비드는 100mM β-mercaptoethanol을 포함하는 SDS 샘플 버퍼에서 다시 현탁되었고 95 ℃에서 5 분 동안 가열되었다. 그런 다음, 원심분리 후 상층액은 12 % SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동되었다.

정제된 항체가 면역침강 실험에 이용될 수 있는가를 확인하기 위하여, pEGFP-N1 발현 벡터에 Sel S 유전자를 도입시킨 후 HEK293T 세포에서 발현시켜 제조한 단백질 추출물로부터 면역침강 실험을 실시하였고, GFP 항체를 이용하여 면역 블럿팅하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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도 1은 셀레노프로테인 S의 염기서열 및 그에 의해 추론된 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 셀레노시스테인(SeCys)은 TGA(UGA) 코돈에 의해 코딩되고, 본 발명에 의한 ¹²⁶KSYKGNAKKPQEEDSPG¹⁴² (서열번호 1) 및 ¹⁷⁴SWRPGRRGPSSGG¹⁸⁷ (서열번호 2) 2개의 이탤릭체 올리고펩티드가 토끼에서 다클론 항체를 제조하기 위해 사용되었다.

도 2a 및 도 2b는 서열번호 1(도 2a) 및 서열번호 2(도 2b)의 펩티드로 면역된 토끼의 혈청의 면역반응활성을 측정한 ELISA 결과를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명에 의한 재조합 셀레노프로테인 S를 합성하기 위한 벡터 맵을 나타내는 도면이다.

도 4는 재조합 셀레노프로테인 S의 웨스턴 블럿팅 분석 결과를 나타내는 도면이다. 인간 셀레노프로테인 S를 E. coli에서 발현시킨 다음 Sel S의 항체를 함유하는 혈청을 이용하여 검출하였다. 유도 후 수집된 샘플들은 12 % SDS PAGE에 로딩되었다. (lane 1, mock BL21 cell lysate; lane2, mock BL21 cell lysate treated with IPTG; lane 3, Sel S transformed BL21 cell lysate non-treated with IPTG; lane 4, Sel S transformed BL21 cell lysate treated with IPTG)

도 5a 및 도 5b는 토끼 혈청의 다클론 항체의 정제한 결과를 나타내는 도면이다. 친화성 컬럼에서 분리액(eluent) 및 플루-스루 부분(flow-through fractions)이 12 % SDS-PAGE 상에서 분리되었다. 각 부분들은 각 10 ul (western blotting) 또는 30 ul (Coomassie Brilliant blue R-250 staining) 샘플이 로딩되었다.

도 6a 내지 도 6c는 세포주에서 셀레노프로테인 S의 발현을 나타내는 도면이다. 60 ug 세포 추출물이 12 % SDS-PAGE 상에 로딩되었다. 웨스턴 블럿팅으로 서열번호 1 (도 6a) 및 서열번호 2 (도 6b)에 대한 정제된 항체가 검출되고 블릴리언트 블루(Brilliant Blue)로 염색되었다(도 6c).

도 7a 및 도 7b는 mock HEK293T 세포에서 셀레노프로테인 S의 면역침강을 나타내는 도면이다. 세포 추출물은 전-혈청 및 서열번호 1(도 7a) 및 서열번호 2(도 7b)에 대한 각 항체로 면역침강되었다. (1 : 2000 (도 7a) 및 1 : 4000 (도 7b)로 희석된).

도 8a 및 도 8b는 HEK293T 세포에서 발현한 GFP-Sel S의 면역침강을 나타내는 도면이다. 세포 용해물은 전-혈청 및 서열번호 1(도 8a) 및 서열번호 2(도 8b)에 대한 각 항체로 면역침강되었다. 면역침강한 샘플을 분리한 세포막은 모노클로날 GFP-항체로 면역블럿팅되었다(1:3000으로 희석된).

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Antibody against selenoprotein S available for western blotting and immunoprecipitation and method for preparation thereof <130> P11-081202-01 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Ser Tyr Lys Gly Asn Ala Lys Lys Pro Gln Glu Glu Asp Ser Pro 1 5 10 15 Gly <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Trp Arg Pro Gly Arg Arg Gly Pro Ser Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 atactcgagg aacgccaaga ggagtctctg tccg 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 aatggatcct tagccgcatc cgccagatga cggg 34

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 분리된 펩티드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 분리된 펩티드를 인간을 제외한 동물에 주사하는 단계; 및

   상기 동물로부터 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 펩티드는 KLH 컨쥬게이션을 위해 N-말단에 시스테인이 추가되고, C-말단은 아미드화(amidation)로 변형된 펩티드인 것을 특징으로 하는 항체를 제조하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 분리된 펩티드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 분리된 펩티드로 컨쥬게이트된 친화성 레진으로 정제되는 단계를 포함하는 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체로 웨스턴 블럿팅 및 면역침강하여 셀레노프로테인 S를 정량 또는 정성 분석하는 방법.
10. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하는 항체를 웨스턴 블럿팅 및 면역침강 분석에 이용하여 세포 또는 생체 시료의 셀레노프로테인 S를 분석하는 방법.
11. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 셀레노프로테인 S에 특이적으로 결합하고, 웨스턴 블럿팅 및 면역침강에 이용 가능한 셀레노프로테인 S의 항체를 포함하는 당뇨 및 염증성 질환 진단용 키트.

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