KR101112703B1

KR101112703B1 - 식물의 뿌리털 발달 조절 유전자 ｒｈｓ1 및 이를 이용한 식물의 뿌리털 발달 조절 방법

Info

Publication number: KR101112703B1
Application number: KR1020090063902A
Authority: KR
Inventors: 조형택
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-07-14
Filing date: 2009-07-14
Publication date: 2012-02-15
Also published as: KR20110006323A

Abstract

본 발명은 식물의 뿌리털에서만 발현되는 식물의 뿌리털 발달 조절 유전자,이를 이용한 식물의 뿌리털 발달 조절방법 및 뿌리털 발달이 조절된 식물체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 분리된 식물의 뿌리털 발달 조절 유전자 RHS1, 상기 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 뿌리털 발달을 조절하는 방법 및 뿌리털 발달이 조절된 식물체에 관한 것이다. 본 발명에서 분리된 RHS1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 단백질은 식물의 뿌리털 발달의 조절, 뿌리털 발달과 관련된 형질의 개선, 및 타 식물체에서 뿌리털 발달 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다.

뿌리털 특이적, 시스인자, 전사체, in silico, 애기장대

Description

식물의 뿌리털 발달 조절 유전자 ＲＨＳ1 및 이를 이용한 식물의 뿌리털 발달 조절 방법{RHS1 gene controlling root hair development of plants and method for controlling root hair development of plant using the same}

본 발명은 식물의 뿌리털에서만 발현되는 식물의 뿌리털 발달을 조절하는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 RHS1 유전자 및 그 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 RHS1 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 식물 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하는 방법, 상기 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하기 위한 조성물, 및 애기장대 게놈으로부터 유전자의 뿌리털 특이 발현을 조절하는 프로모터의 RHE 컨센서스 서열(consensus sequence) 함유 유전자를 인실리코(in silico)로 스크리닝하는 단계 등을 포함하는 뿌리털 형태형성 H유전자의 분리 방법에 관한 것이다.

다세포 생물은 형태적 및 기능적으로 분화되어 있는 다양한 세포로 구성된 조직화된 구조물이다. 다세포 생물에 있어 세포분화는 시간적 및 공간적으로 고도로 상호 협동적으로 일어나며, 일차적으로는 세포형 특이적 유전자의 전사 수준에 서의 조절에 의해 통제된다. 유전자가 전사되는 양, 위치 및 시간은 유전자의 프로모터 구간에 암호화되어 있다. 이와 같은 모듈 코드(modular code)에 대한 짧은 뉴클레오티드 모티프는 시스인자(cis-element)라 불리며, 전사 활성 또는 억제에 대한 인자에 의해 인지된다 (Carroll et al., 2001, From DNA to diversity. Blackwell Science, Malden, USA). 세포형 특이적 유전자 및 해당 시스 및 트랜스 조절 인자의 동정 및 특성분석이 세포 분화의 기작 규명에 유용하게 사용될 수 있으나, 식물에서 알려진 경우는 드물다.

뿌리털은 뿌리의 표피세포가 외부로 자란 것이다. 뿌리털의 발달은 뿌리의 종축을 따라 연속적으로 근단으로부터 기부(상부) 구간에 이르기까지 세포의 특수화, 뿌리털의 개시, 및 근단의 신장에 의한 뿌리털 신장으로 진행된다 (Grierson 및 Schiefelbein, 2002, Root hairs. In CR Somerville, EM Meyerowitz eds, The Arabidopsis Book, American Society of Plant Biologists, Rockville, MD). 애기장대 뿌리에 있어 뿌리털/비뿌리털 세포의 운명은 리셉터 유사 키나아제(receptor-like kinase), WD40 단백질/bHLH(basic-helix-loop-helix) 전사인자/MYB 전사인자 복합체 및 MYB 유사 단백질의 위치 의존적 활성에 의해 결정되며, 상기 인자들은 주로 뿌리의 분열조직 및 신장대의 표피조직에서 활성을 보인다 (도 1의 운명결정 구역; Schiefelbein 및 Lee, 2006, Physiol Plant 126: 503-510). 대조적으로, 뿌리털 형태형성 과정 (뿌리털 개시 및 신장)은 상부 성숙 구간에서 일어난다 (도 1의 형태형성 구역). 많은 유전적 연구에서는 세포의 운명결정 및 털의 형태형성에 다른 유전자 세트가 관련된 것으로 보여졌다 (Parker et al., 2000, Plant Cell 12: 1961-1974; Grierson et al., 2001, J Plant Nutr Soil Sci 164: 131-140; Jones et al., 2006, Plant J 45: 83-100). 뿌리털의 형태형성은 다른 일반적인 세포의 형태형성 유전자와 협력해야 하기는 하나, 근본적으로는 모원세포 (H세포 또는 trichoblast) 특이적 유전자의 활동으로 인한 것이다.

시간적 및 공간적 발현 양상에 따라, 3 가지 형의 H세포 특이적 유전자가 제안될 수 있다: 운명결정 구역(운명결정원(determinants)이 발현되는 분열조직 및 신장대)에서, 운명결정 구역 및 형태형성 구역 (신장대 및 분화대)에서, 및 형태형성 구역(분화대)에서만 발현되는 유전자 (도 1). 예를 들면, RHD6(ROOT HAIR DEVELOPMENT 6)는 분열조직 및 신장대에서 (Menand et al., 2007, Science 316: 1477-1480), RHD2는 신장대 및 형태형성 구역에서 (Takeda et al., 2008, Science 319: 1241-1244), 그리고 PRP3 ( PROLINE RICH PROTEIN 3), LRX1 ( LEUCINE RICH REPEAT/EXTENSIN 1), LRX2, EXPA7 ( EAXPANSIN A7), 및 EXPA18은 형태형성 구역에서 (Bernhardt 및 Tierney, 2000, Plant Physiol 122: 705-714; Baumberger et al., 2003, Plant J 35: 71-81) 발현된다. 상기 유전자들은 모두 H세포 위치에서 발현되며, 정상적인 뿌리털 형성에 필요할 것이다. 상기 유전자들의 결실은 뿌리털 형성을 거의 완전히 차단하거나 (RHD6, Masucci 및 Schiefelbein, 1994, Plant Physiol 106: 1335-1346), 뿌리털 신장을 많이 감소시키거나 (RHD2 , Schiefelbein 및 Somerville, 1990, Plant Cell 2: 235-243), 또는 뿌리털 형태를 변형시킨다 (LRXs, Baumberger et al., 2003, Plant J 35: 71-81). 따라서, 분화 구역에서 발현되는 본 발명에서 형태형성 H유전자로 표기되는 H세포 특이적 유전자 (도 1)는 돌출부(bulge) 형성, 신장, 및 형태적 변형과 같은 뿌리털 형태형성을 중재하는 것으로 사료된다.

동일한 시스인자 (RHE for Root Hair Element)가 모든 알려진 형태형성 H유전자 (LRX1 , LRX2 , EXPA7 , EXPA18 , PRP3, 및 orthologous 유전자 EXPA7; Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970)의 뿌리털 세포 특이적 발현을 통제한다. 핵심 RHE는 불완전한 팔린드롬 구조(palindromic structure)를 가진 16 또는 17 개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. H세포 특이성에 대한 RHE의 생물학적 기능은 애기장대 및 다른 피자식물의 알려진 뿌리털 세포 특이적 유전자에 있어 보존되어 있으므로, RHE 컨센서스(consensus) 서열은 게놈 수준에서 부가적인 뿌리털 세포 특이적 유전자에 대한 인실리코(in silico) 스크리닝에 사용될 수 있다. 전사체 분석에 있어 임의의 유전적 신호 또는 외부의 자극에 의한 공동발현 양상이 공동조절되는 유전자의 대규모 동정에 사용되어 왔으며 (Lisso et al., 2005, Nucleic Acids Res 33: 2685-2696; Brady et al., 2007, Science 318: 801-806), ABA(abscisic acid) 및 비생물적 스트레스 반응에 대한 한정된 시스인자가 목적 유전자의 탐색에 사용되어 왔다 (Zhang et al., 2005, Bioinformatics 21: 3074-3081). 그러나, 세포형 특이적 유전자의 검색 및 연이은 실험적 확인을 위해 비슷한 접근이 사용된 경우는 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 뿌리털 세포를 모델로 사용하여, 한정된 시스인자를 세포형 특이적 유전자의 전체 게놈 스크리닝에 사용할 수 있는지 알아보고자 한다. 스크리닝 과정을 개량하고 뿌리털 세포 특이성을 확인하기 위해, 뿌리털 특이적 전사체 및 유전자 프로모터 활성을 실험적으로 분석하고, 선발된 유전자에 대한 기능상실 돌연변이체 및 과발현 형질전환체의 분석으로 뿌리털 형태형성에 있어 형태형성 H유전자의 진정한 기능을 증명하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물의 뿌리털 발달을 조절하는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 RHS1 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, RHS1 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 RHS1 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RHS1 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 애기장대 게놈으로부터 RHE(Root Hair Element) 컨센서스 서열(consensus sequence) 함유 유전자를 인실리코(in silico)로 스크리닝하는 단계 등을 포함하는 뿌리털 형태형성 H유전자의 분리 방법을 제공한다.

본 발명에서 분리된 RHS1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 단백질은 식물의 뿌리털 발달과 관련된 형질의 개선 및 타 식물체에서 뿌리털의 발달을 조절하는 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자를 이용하여 식물체의 뿌리털 발달이 조절된 식물체를 창출할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 뿌리털 발달을 조절하는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 RHS1 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 RHS1 단백질의 범위는 애기장대(Arabidopsis thaliana)부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 RHS1 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 뿌리털 특이적으로 발현되는 특징이 있으며, RHS1 단백질을 암호화 하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 RHS1 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 식물 발현 벡터에서, 상기 RHS1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사 용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해 당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al., 1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른, 식물체에서 RHS1 유전자를 과발현시키는 방법으로는 RHS1 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 RHS1 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 RHS1 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 RHS1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 RHS1 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 RHS1 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 RHS1 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)이다.

본 발명의 벡터를 식물체 내로 운반하는 방법은, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질전환법, 미세주입법 (Capecchi, 1980, Cell 22: 479), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham 등, 1973, Virology 52: 456), 전기천공법 (Neumann 등, 1982, EMBO J. 1: 841), 리포좀 매개 형질감염법 (Wong 등, 1980, Gene 10: 87), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1188-1190), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9568-9572) 등에 의해 벡터를 식물체 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, RHS1 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 RHS1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 상기 RHS1 유전자는 RHS1 유전자 서열에서 특정 염기서열의 삽입, 치환, 결실된 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

애기장대 게놈으로부터 RHE(Root Hair Element) 컨센서스 서열(consensus sequence) 함유 유전자를 인실리코(in silico)로 스크리닝하는 단계;

상기 RHE 모티프 함유 유전자로부터 뿌리 특이적인 RHE 모티프 함유 유전자를 스크리닝하는 단계;

상기 뿌리 특이적인 RHE 모티프 함유 유전자로부터 형태형성 H유전자로 추정되는 유전자를 선별(filtration)하는 단계; 및

뿌리 조직에서 전사 수준이 현저히 높은 유전자를 선별하는 단계를 포함하는 뿌리털 형태형성 H유전자의 분리 방법을 제공한다.

상기 H유전자의 분리 방법에서는 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소연쇄반응, 노던 블롯 분석, 서던 블롯 분석, 효소 면역 반응 및 2-D 겔 분석 등을 포함한 다양한 방법을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 RHE 컨센서스 서열은 WHHDTGNNN(N)KCACGWH (W=A/T, H=A/T/C, D=G/T/A, K=G/T, 및 N=A/T/C/G)일 수 있으며, 바람직하게는 상기 컨센서스 서열로 애기장대 유전자를 대상으로 Patmatch 분석을 수행할 수 있다.

바람직하게는, 상기 RHE 모티프 함유 유전자로부터 뿌리 특이적인 RHE 모티프 함유 유전자를 스크리닝하기 위해서는 Genevestigator 아라비돕시스 마이크로어레이 데이터베이스를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 뿌리 특이적인 RHE 모티프 함유 유전자로부터 형태형성 H유전자로 추정되는 유전자를 선별(filtration)하기 위해서는 뿌리털 마이크로어레이 필터를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 상기 뿌리 조직에서 전사 수준이 현저히 높은 유전자를 선별 하기 위해서는 프로모터:리포터 분석을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 생장 조건

애기장대(Arabidopsis thaliana , Columbia ecotype)가 뿌리털 특이적 GFP 발현을 관찰하기 위한 프로모터:GFP (green fluorescent protein gene) 구축물의 형질전환에 사용되었다. T-DNA 삽입 돌연변이체의 종자는 아라비돕시스 생물자원 센터 (Arabidopsis Biological Resource Center)로부터 얻었다. 뿌리털 결실 rhd6 돌연변이체는 Masucci 및 Schiefelbein (1994, Plant Physiol 106: 1335-1346)에 기재되어 있다. 애기장대 종자는 저온처리 후 16/8 시간의 명/암 광주기 하에서 23℃에서 발아되었다. 애기장대 식물체는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 (pMP90)) (Bechtold 및 Pelletier, 1998, In JM Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Arabidopsis Protocols, Humana, Totowa, NJ, pp. 259-266)로 형질전환되어 형질전환체는 하이그로마이신 함유 플레이트(10 ㎍/mL)에서 선발되었다.

2. 프로모터: GFP 및 다른 외래도입유전자(transgene)의 제조

뿌리털 세포에 뿌리털 억제 유전자를 특이적으로 발현시키기 위해, EXPA7 프 로모터 (ProE7; Cho 및 Cosgrove, 2002, Plant Cell 14: 3237-3253)가 사용되었다. 바이너리 벡터 pGPTV - HYG (Becker et al., 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197)가 클로닝 벡터였다. ProE7:GFP는 Kim 등 (2006, Plant Cell 18: 2958-2970)에 기재되어 있다. ProE7:axr2 -1- GFP 해독 융합 구축물을 위해, 게놈 단편 axr2 -1은 프라이머 5'-CCC CTT CTA GAC CTT TCT TCT TCC CCT CT-3' (서열번호 47; XbaI 제한부위 포함) 및 5'-TTT ATC CCG GGT AAC AGA TCT GTT CTT GCA GTA CTT CTC CAT TG-3' (서열번호 48; XmaI 제한부위 포함), 및 주형으로서 DNA axr2 -1 돌연변이체의 게놈을 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 얻었다. PCR 산물은 GFP 유전자의 상부 XbaI-XmaI 제한부위에 클로닝되었다. ProE7:GL2 - GFP 구축물을 위해, 게놈 단편 GL2는 프라이머 5'-GCT AGC CCG GGA CAG GAT TTG TAT-3' (서열번호 49; XmaI 제한부위 포함) 및 5'-TGT GAC CCG GGT AAC GCA ATC TTC GAT TTG TAG ACT TC-3' (서열번호 50; XmaI 제한부위 포함), 및 주형으로서 야생형 애기장대 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 얻었다. PCR 산물은 GFP 유전자의 상부 XmaI 제한부위로 클로닝되었다.

프로모터:GFP 리포터 시스템을 구축하기 위해, 뿌리털 특이적인 것으로 추정되는 유전자의 프로모터를 프라이머쌍을 사용하여 애기장대(Arabidopsis , Col-0) 게놈 DNA로부터 PCR을 이용하여 얻었다. PCR로 증폭된 프로모터 구간은 pGPTV - HYG 벡터에 삽입되었으며, 상기 벡터에서는 uidA 유전자가 GFP로 대체되어 있다 (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970).

RHSs의 과발현은 ProE7 (-448): RHSs를 구축하여 수행되었으며, 상기의 구축물에서 EXPA7 프로모터는 전장을 사용하였다 (Cho 및 Cosgrove, 2002, Plant Cell 14: 3237-3253). ProE7는 pCAMBIA1300 벡터의 HindIII/SalI 제한부위에 삽입되어 있으며, 잇달아 게놈 RHS 코딩 구간이 있다.

모든 구축물은 뉴클레오티드 서열분석으로 확인되었으며, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 애기장대 식물체에 도입되었다. 애기장대 형질전환체로의 외래도입유전자(transgene)의 삽입은 외래도입유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 확인되었으며, 필요 시 뉴클레오티드 서열분석을 수행하였다.

3. 인실리코( in silico ) 분석

RHE 컨센서스를 포함하는 애기장대 유전자를 Patmatch 프로그램 (www.arabidopsis.org/cgi-bin/patmatch/nph-patmatch.pl)으로 검색하였다. 뿌리 특이성을 가진 RHE 함유 유전자를 Genevestigator Gene Atlas Microarray Database(www.genevestigator.com; Hruz et al., 2008, Genevestigator V3: a reference expression database for the meta-analysis of transcriptomes. Advances in Bioinformatics 2008: 420747)를 이용하여 스크리닝하였다. 본 발명에서는 뿌리 조직에서 전사 수준이 현저하게 높은 유전자를 선별하였다.

4. 뿌리털 결실 돌연변이체 및 형질전환 라인에 대한 마이크로어레이 유전자 칩 분석

총 RNA를 rhd6, ProE7 : axr2 -1- GFP, ProE7 : GL2 - GFP, 및 야생형 (형질전환체에 대해서는 Columbia [Col-0], 및 rhd6에 대해서는 Wassilewskija [WS]) 식물체의 3 일 된 실생 뿌리로부터 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 분리하였다. 총 RNA의 순도 및 함량은 각각 NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE) 및 Experion (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 점검하였다. 총 RNA 5 mg이 표식을 위해 사용되었다. 총 RNA 시료로부터의 프로브 합성, 혼성화, 검출, 및 스캐닝은 표준 아피메트릭스 유전자칩(Affymetrix GeneChip, Affymetrix, Santa Clara, CA) 프로토콜 (Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol 14: 1675-1680)에 따라 수행되었다. 표지된 시료는 애기장대 ATH1 게놈 어레이-유전자칩(ATH1 Genome Array-GeneChip, GeneChip Operating Software programs)에 혼성화되었으며, 발현 프로파일은 유전자칩 작동 소프트웨어 프로그램(GeneChip Operating Software programs, Affymetrix)을 이용하여 분석되었다.

p 값의 생성을 위해 단측 윌콕슨 부호순위 검정(One-Sided Wilcoxon's Signed Rank test)이 이용되었다. 프로브 세트는 p < 0.04에 대해 유 ('P') 및 p > 0.06에 대해 무 ('A')로 간주되었다. 검출 역치는 유전자칩 작동 소프트웨어(GeneChip Operating Software, p < 0.05)로부터 'present' call output로서 세트되었다. 유전자 발현은 Change p-value < 0.0025에 대해 증가 ('I') 및 Change p-value > 0.9975에 대해 감소 ('D')로 간주되었다. 적어도 하나의 뿌리털 결함 라인에 있어 야생형에 비해 2 배 이상의 전사물 수준의 변화를 보이는 유전자는 뿌리털 특이적 유전자로 추정되었으며, 프로모터 활성에 대해 차기 분석이 수행되었다.

5. 리포터 유전자 발현의 관찰

프로모터 활성에 대해, 실생 뿌리로부터 GFP 형광은 9 - 63 (average = 22.8) 개의 독립적 T1 또는 T2 형질전환 라인에서 관찰되었다. 꽃양배추 모자익 바이러스 35S 최소 프로모터:GFP (mPro35S : GFP) 형질전환체 (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970)가 뿌리 기부 형광 수준에 대한 대조구로 사용되었다. GFP 형광은 형광입체현미경(epi-fluorescence stereomicroscope, MZ FLIII, Leica, Heerbrugg, Switzerland)을 이용하여 관찰되었다. GFP 시그널은 488 nm 여기 필터 및 543 nm 방사 필터를 이용하여 검출되었다.

6. 뿌리털 표현형의 관찰

뿌리털의 길이는 Lee 및 Cho (2006, Plant Cell 18: 1604-1616)의 기재를 변형하여 측정되었다. 뿌리는 입체현미경(MZ FLIII, Leica, Heerbrugg, Switzerland) 하에서 40-50 배 확대하여 디지털 방식으로 촬영하였다. 뿌리의 양면으로부터 총 20 개의 모룡에 대해, 뿌리의 각 면으로부터 수직으로 돌출되는 10 개의 연속적인 모룡의 길이를 LAS 소프트웨어 V2.8.1 (Leica)를 이용하여 계산하였다. 한 유전자형의 뿌리털 길이를 평가하기 위해 총 290-3840 개의 뿌리털을 사용하였다. RHS 과발현 형질전환체의 뿌리털 표현형은 8-40 개의 (average = 19.5) 독립적인 T2 또는 T3 형질전환 라인에서 관찰되었다.

7. T- DNA 삽입 돌연변이체 및 RHSox 형질전환체의 유전자형 결정 및 RT - PCR 분석

동형접합 T-DNA 삽입 돌연변이체 라인은 유전자 특이적인 프라이머 및 LBb1 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 PCR 분석으로 선발되었다. 공돌연변이는 유전자 특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR을 수행하여, 대조구로서 Actin 1 (AT2G37620)을 함께 로딩하여 확인되었다. ProE7(-448)에 의한 RHSs (RHSox)의 과발현은 유전자 특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR을 이용하여 확인되었다. cDNA 합성을 위해, 총 RNA를 뿌리로부터 추출하였으며, M-MLV 역전사효소 (Nexgen Biotech, Chungwon, Korea), 올리고 dT₂₀ 및 RNA를 사용하여 역전사를 수행하였다. 유전자형 결정을 위한 PCR에서는 32 회의, 및 RT-PCR에서는 25-27 회의 PCR 사이클이 수행되었다.

8. 등록번호( Accession number )

본 발명상의 원문 또는 표에 기재되지 않은 한 본 발명에서 언급된 유전자 및 단백질에 대한 AGI(Arabidopsis Genome Initiative) 및 NCBI(National Center Biotechnology Information) 좌위명(locusidentifiers)은 AT3G23050 (AXR2 / IAA7), AT1G79840 (GL2), AT5G65930 (ZWI), AT1G11130 (SCM), AT5G62310 (IRE), AT2G34650 (PINOID), AT4G38430 (RopGEF1), 및 AT1G01700 (RopGEF2)이다.

실시예 1.

본 발명에서는 전체 애기장대 게놈으로부터 뿌리털 형태형성 H유전자를 분리하기 위해 4 개의 연속적인 필터링 단계를 적용하였다: 애기장대 게놈으로부터 RHE 함유 유전자의 인실리코(in silico) 스크리닝; 뿌리 특이적 유전자의 선발; 형태형성 H유전자로 추정되는 유전자의 선별(filtration) 및 뿌리털 특이성의 실험적 확인 (도 2).

표 1. 아라비돕시스( Arabidopsis )에 있어 RHE 함유 뿌리털 유전자

좌위	RHS 유전자 #	RHE 위치로 부터 ATG²	RHE 방향³	RHE 서열⁴	서열번호⁵	ATG로부터 프로모터 길이⁶	뿌리털 결실 라인에 있어 전사물의 변화⁷			뿌리털 특이적 발현⁸
							rhd6	ProE7 : axr2	ProE7: GL2
AT1G05990	RHS1	-38	F	TTCTTCCTCCACACGCA	3	-1099	-3.5	-21.1	-21.0	Yes
		-739	R	AACGTGCAACCAATAT	4
AT1G12950	RHS2	-536	F	CATATGGAGTCCACGAC	5	-1147	-4.0	-3.5	-2.8	Yes
		-566	F	TAATTGCTCCGCACGTA	6
AT1G16440	RHS3	-257	F	AACCTAATAACACGAG	7	-882	-3.0	-7.5	-4.6	Yes
		-454	R	TACGTGGAAAACAGGCC	8
		-547	R	TTCGTGATAACAAGTA	9
AT1G30850	RHS4	-111	R	AACGTGCTTACCATTTT	10	-655	-19.7	-1.6	-1.6	Yes
		-306	R	TACGTGCAAACCATTTC	11
		-975	F	ATCTTGGATCCACGAG	12
AT1G34760	RHS5	-52	R	ATCGTGACAGCAGTTT	13	-923	-2.6	-5.3	-2.3	Yes
		-559	F	TTTTTTGTTCCACGAA	14
AT1G51880	RHS6	-214	F	AATGTCGTAGACACGTA	15	-721	-59.7	-32	-34.3	Yes
		-373	R	AACGTGCCTCCATAAA	16
AT1G54970	RHS7	-212	R	ATCGTGCATAACACTAT	17	-1162	-4.6	-6.5	-5.2	Yes
AT1G63450	RHS8	-73	R	GACGTGAGTGCATGTC	18	-1408	-5.7	-1.3	-1.4	Yes
		-301	F	AACTTGGAGGCACGTT	19
AT1G69240	RHS9	-91	F	CACATGCAAGCACGAA	20	-1446	-5.7	-5.7	-3.0	Yes
		-202	R	TTCGTGAGTCTCAAGAA	21
AT1G70460	RHS10	-447	R	GACGTGCCTCCAATAA	22	-946	-5.3	-4.3	-4.6	Yes
		-636	F	GACTTACAAACACGTC	23
		-761	R	TACGTGTGTATTACAAA	24
AT2G45890	RHS11	-96	F	TTAATCTTTGTCACGTT	25	-968	-3.5	-1.9	-4.5	Yes
		-220	F	AATGTGGAAGGCACGTC	26
		-706	R	GACGTGGACTTCATCCC	27
		-877	R	CACGTGCCACCACCAC	28
AT3G10710	RHS12	-166	F	TTTGTGCCTCGCACGTA	29	-757	-7.0	-16.0	-7.0	Yes
		-1288	F	TGCTTGGTAACACGTC	30
AT4G02270	RHS13	-200	R	ACCGTGCATACACGTT	31	-697	-4.6	-22.6	-5.3	Yes
		-215	F	ACCGTGCATACACGTT	32
		-253	F	ATAATGCGACTCACGTC	33
AT4G22080	RHS14	-110	R	ATCGTGTTTACCACACC	34	-1307	-8.6	-68.6	-78.8	Yes
		-348	F	TGGATTGGTACACGTA	35
		-597	F	TCCTTGATCTCACGTA	36
AT4G25220	RHS15	-510	R	TACGTGCGGGCACAAA	37	-1111	-7.0	-59.7	-2.5	Yes
		-879	F	CAAATAAACTTCACGAG	38
		-1159	R	GTCGTGGAGAGATGAC	39
AT4G29180	RHS16	-155	R	GTCGTGAGCAGCACTTA	40	-694	-4.9	-4.3	-2.5	Yes
AT4G38390	RHS17	-591	F	TACATGTCATCACGTA	41	-1187	-4.0	-3.2	-2.8	Yes
AT5G22410	RHS18	-129	F	TCCATGAACGCACGTT	42	-892	-5.7	-21.0	-6.5	Yes
		-485	F	TTAGTAGTATCCACGTT	43
		-534	F	ATGATTTTTGCACGTT	44
AT5G67400	RHS19	-199	R	AACGTGGCTCCAAGTT	45	-965	-6.1	-27.9	-4.6	Yes
		-538	F	TTTTTGCTCTGCACGAA	46
¹WoLF PSORT 단백질 세포 내 위치 예측 프로그램 (http://wolfpsort.org/ Horton et al., 2006, Proceedings of the 4th Annual Asia Pacific Bioinformatics Conference APBC06, Taipei, Taiwan. pp. 39-48)으로 추정 ²전방향 (F) RHEs에 대해 첫 번째 뉴클레오티드 및 역방향 (R) RHEs에 대해 마지막 뉴클레오티드의 위치 ³F, 전방향; R, 역방향 ⁴Patmatch 스크리닝을 위한 RHE 콘센서스에 부가적적인 모든 기능적인 RHE 서열 (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970) ⁵서열 번호 ⁶프로모터 분석에 사용된 프로모터 길이 (bp) ⁷마이크로어레이 분석에서 야생형 수준에 비교한 폴드(fold) 감소 (-) 또는 폴드(fold) 증가 (+) ⁸Yes, 뿌리에서 뿌리털 세포 특이적 발현; No, 뿌리에 GFP 시그널이 없음

실시예 2. 애기장대 전체 게놈으로부터 RHE 함유 유전자의 스크리닝

인접 프로모터 구간에 RHE를 지니는 유전자를 동정하기 위해, RHE 컨센서스 서열로 Patmatch 분석을 하였다 (도 2A). 시스인자 서열은 일반적으로 전사인자 결합에 유연하고 (Latchman, 2004, Eukaryotic transcription factors. Elsevier, London, UK), 기능적인 RHE는 복수의 syntactic 변이체를 포함하므로 (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970), 덜 엄격한 혼합 RHE 컨센서스 WHHDTGNNN(N)KCACGWH (서열번호 51 및 52; W=A/T, H=A/T/C, D=G/T/A, K=G/T, 및 N=A/T/C/G)를 가능한 많은 뿌리털 유전자를 얻기 위해 Patmatch에 사용하였다 (도 2A). 전체 33,282 애기장대 유전자를 대상으로 Patmatch 스크리닝의 수행 시 개시 코돈 1000 bp 상부 내에 하나 또는 그 이상의 RHE를 가진 904 개의 핵 유전자가 검색되었다. 실제 RHE의 위치는 데이터베이스에 표시된 곳과 다소 달랐으므로, 수작업으로 수정되었다 (표 1).

실시예 3. RHE 함유 유전자로부터 뿌리 특이적인 것으로 추정되는 유전자의 분리

RHE 함유 유전자로부터 뿌리 특이적 유전자를 스크리닝하기 위해 유전자 발현의 조직/기관 특이성에 관한 정보를 제공하는 Genevestigator 아라비돕시스 마이크로어레이 데이터베이스 (www.genevestigator.com; Hruz et al., 2008, Genevestigator V3: a reference expression database for the meta-analysis of transcriptomes. Advances in Bioinformatics)가 사용되었다. 본 발명에서는 RHE 모티프를 함유하는 뿌리 유전자에 보다 더 집중하고, 추후 실험 단계에서 유전자 수를 줄이기 위해 뿌리 특이적 필터를 채택하였다. 904 개의 RHE 함유 유전자로부터 81 개의 뿌리 유전자를 선별하였다. 상기 유전자는 뿌리 조직에서 우세하게 발현된다. 상기 선발된 유전자에는 해당 유전자의 전사물 수준이 뿌리 조직에 있어 분명히 높을 경우 1 또는 2 개의 다른 조직에서 부가적인 발현 정점을 보이는 유전자도 포함하였다. 상기 유전자는 뿌리털 (RHE에 의한) 및 다른 세포형 (다른 세포형 시스인자에 의한) 양자에 있어 발현이 가능한 것이다. RHE 매개된, 뿌리털 발현 유전자의 수를 증가시킬 수 있으므로 본 발명에서는 부가적으로 상기 유전자들을 포함하였다. 따라서, 상기 81 개의 유전자가 주로 뿌리 특이적 및 적어도 뿌리에서는 잠재적인 RHE 함유 뿌리털 특이적 유전자이다.

실시예 4. 뿌리털 특이적 돌연변이체 및 형질전환 식물체의 유전자 마이크로 어레이 분석에 의한 형태형성 H 추정 유전자의 필터링

81 개의 뿌리 특이적, RHE 함유 유전자로부터 형태형성 H유전자로 추정되는 유전자를 스크리닝하기 위해 뿌리털 마이크로어레이 필터가 사용되었다. 뿌리털 마이크로어레이 필터를 디자인하기 위해, rhd6 돌연변이체, 및 axr2 -1 (AUXIN RESISTANT 2의 우성 돌연변이체 ProE7 : axr2 -1) 및 GL2 (GLABRA 2; ProE7 : GL2)의 EXPA7 프로모터 (ProE7)로 추진된 과발현 형질전환 라인으로 마이크로어레이 분석을 수행하였다. rhd6 돌연변이체에서는 뿌리털 개시가 감소되었으며, 거의 뿌리털 형성이 되지 않았다 (Masucci 및 Schiefelbein, 1994, Plant Physiol 106: 1335-1346; 도 2B). 우성 axr2-1 돌연변이체에는 뿌리털 신장 및 부분적으로 뿌리털 개시에 결함이 있었으며 (Masucci 및 Schiefelbein, 1996, Plant Physiol 106: 1335-1346), 또한 그 외 다른 많은 다른 표현형도 나타났다. 우성 돌연변이 유전자 (ProE7 : axr2 -1)의 뿌리털 세포 특이적 과발현에서는 전혀 뿌리털 형성이 되지 않았으며, 다른 표현형적 효과는 없었다 (도 2B). GL2는 뿌리털 형태형성 기구를 억제한다 (Masucci 및 Schiefelbein, 1996, Plant Cell 8: 1505-1517; Ohashi et al., 2003, Science 300: 1427-1430). 따라서, 뿌리털 세포 특이적 GL2 (ProE7 : GL2)의 과발현은 뿌리털 형성 및 생장을 크게 줄인다 (도 2B).

상기 3 개 돌연변이체 및 형질전환 라인의 공통적인 특징은 다른 표현형적 효과 없이 뿌리털 발달에 있어서 특이적인 결함이다. 본 발명에서는 야생형에 비해 상기 라인에 있어 전사물의 수준 변화를 보이는 뿌리털 특이적인 유전자로 추정되는 유전자를 스크리닝하기 위해 상기 특징을 이용하였다. 마이크로어레이 분석이 야생형, rhd6, ProE7 : axr2 -1, 및 ProE7 : GL2의 뿌리로부터의 전사체로 수행되었다.

81 개의 RHE 함유 뿌리 특이적 유전자의 전사수준의 변화를 마이크로어레이 자료로부터 동정하였다. 상기 유전자 중 37 개는 3 개의 뿌리털 결함 라인 중 적어도 1 개에서 2 배 이상까지 하향 조절되었다 (표 1). 상기 37 개의 유전자 집단은 사전에 알려진 4 개의 형태형성 H유전자 LRX1 (AT1G12040) (Baumberger et al., 2003, Plant J 35: 71-81; Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970), EXPA7 (AT1G12560) 및 EXPA18 (AT1G62980) (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970), 및 PRP3 (AT3G62680) (Kim et al., 2006, Plant Cell 18: 2958-2970)를 포함하였다. 또 다른 사전에 알려진 H유전자 LRX2 (AT1G62440) (Baumberger et al., 2003, Plant J 35: 71-81)는 Patmatch 스크리닝에 사용한 것 (표 1)과는 약간 다른 RHE 구조를 가진다. 상기 유전자의 대다수가 3 개의 모든 뿌리털 결함 라인에 있어 하향 조절된다는 것은 (표 1), axr2-1 또는 GL2의 뿌리털 억제 기작 또는 RHD6의 결실이 형태형성 H유전자의 공통적인 세트를 표적으로 하여 얻을 수 있음을 나타낸다.

형태형성 H유전자로 추정되는 유전자 중 29 개 (78%)는 2 개 또는 그 이상의 RHE를 가지며, 정방향 RHE가 약간 우세하다 (58%; 80 RHE 중의 46 개). 2 및 3 개 뉴클레오티드 링커 형은 대략 동일한 빈도로 발생하였다 (표 1). 세포벽 유전자로 추정되는 유전자 또한 현저하였다 (32%, 12 개의 유전자). 29 개의 뿌리털 특이 유전자로부터 51 개 RHE를 분석한 (프로모터 분석에서 확인) 결과 대부분 (86%까지)의 RHE가 개시 코돈의 -600 bp 내에 위치하는 것으로 보였다.

실시예 5. 뿌리털 특이 유전자의 스크리닝에 있어 RHE 필터의 효율

적절하게 축퇴된(degenerated) RHE 필터로 일차적인 스크리닝에서 904 개의 RHE 함유 유전자를 선별하였으며, 상기 유전자로부터 뿌리 특이적 및 뿌리털 마이크로어레이 자료를 이용하여 부가적인 선별(filtration) 단계를 거쳐 최종적으로 형태형성 H유전자로 추정되는 37 개의 유전자를 선발하였다 (도 2C). 상기 과정으로 부가적인 시스인자 모듈에 기인하여 뿌리 외의 조직에서도 발현 가능한 RHE 함유 유전자는 배제되었다. 일차적인 스크리닝에 사용된 RHE 서열의 엄격성(stringency) 및 여러 세포 형에 있어 RHE 함유 유전자의 가능한 발현이 있다면, 기능적인 RHE 함유 유전자의 수는 본 발명의 최종 스크리닝 단계에서 얻어진 것보다 훨씬 많아야 한다. 상기 가능성은 또한 두 이전 연구에서 보인다. 셀룰로오즈 신타아제 유전자 KJK (KOJAK)/CSLD3 (CELLULOSE SYNTHASE - LIKE D3)는 다양한 어린 줄기 조직 및 뿌리 표피세포에서 발현되나, 뿌리털 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다 (Favery et al., 2001, Genes Dev 15:79-89). 키네신(kinesin) 관련 유전자 ZWI (ZWICHEL)의 프로모터는 개시 코돈으로부터 프로모터 단편 460 bp와 뿌리털 특이성을 보이나, 더 긴 프로모터 단편은 뿌리털 세포를 포함하여 다수 조직에서 발현 양상을 나타낸다 (Reddy 및 Reddy, 2004, Plant Mol Biol 54: 273-293). KJK / CSLD3 및 ZWI 프로모터 양자는 작동할 수 있으나 (RHE의 세부적인 기능 분석에 근거하여; Kim et al., 2006, Plant Cell18 : 2958-2970), 본 발명의 스크리닝 과정에 사용된 RHE 컨센서스에 속하지 않는 인접 구간 (본 발명에서 관찰)에 RHE 유사 모티프를 함유한다.

최종적인 뿌리털 특이적 유전자의 선별에 있어 RHE 필터 (RHE를 사용한 Patmatch 스크리닝)의 효율을 알기 위해, 3 단계의 인실리코(in silico) 스크리닝 과정들 간에 스크리닝 순서를 달리하여 시험하였다; RHE 필터, 뿌리 특이적 Genevestgator 마이크로어레이 (RS) 필터, 및 3 개의 뿌리털 돌연변이체 마이크로어레이 (3RHmut) 필터. 상기에 언급한 것처럼, RS 필터는 RHE로 필터된 904 개의 유전자로부터 81 개의 유전자를 생성하였으며, 3RHmut 필터로 수행된 차기의 스크리닝으로 뿌리털 특이 유전자로 추정되는 37 개의 유전자로 압축되었다. RHE로 필터된 904 개 유전자를 대상으로 3RHmut 필터로 스크리닝의 수행 시 60 개의 유전자가 생성되었는데, 이는 RHE 필터링 후 RS 필터에서 81 개의 유전자를 생성한 것과 비교된다. RHE 필터의 효과를 평가하기 위해, 3RHmut 및 RS 필터 후 최종적인 단계에서 RHE 필터를 적용하였다. 임의의 3 개의 뿌리털 결실 라인에서 2배 이상 하향 조절된 유전자의 수는 638 개였다. RS 필터로 상기 638 개 유전자의 필터링 시 247 개의 유전자가 생성되어, RS 또는 3RHmut 필터와 함께 RHE 필터의 사용 시 얻었던 81 개 및 60 개의 유전자보다 훨씬 많았다. 그러나, 상기 247 개 유전자 집단에 RHE 필터의 적용 시 유전자의 수는 37 개로 줄었으며, 이 중 22 개의 (~60%) 유전자는 프로모터:리포터 분석에서 뿌리털 특이적인 것으로 나타났다 (표 1). 상기 분석은 RHE 필터가 뿌리털 특이적 유전자를 충분히 얻는데 효과적이었음을 나타낸다.

실시예 6. RHE 함유 유전자의 식물체( In Planta ) 프로모터 분석을 통한 아라 비돕시스( Arabidopsis )에서의 신규 뿌리털 특이 유전자의 발견

뿌리털 특이성을 실험적으로 확인하기 위해, 형태형성 H유전자로 추정되는 유전자로부터 29 개의 프로모터: GFP를 구축하였다. 이 중 5개는 이미 뿌리털 특이 유전자로 알려진 것이다 (표 1). 실험에 사용된 29 개의 형태형성 H유전자 프로모터 중, 19 개의 프로모터:GFP 구축물이 형질전환체 아라비돕시스(Arabidopsis) 뿌리의 형태형성 구역에서 H세포 특이적 GFP 시그널을 생성하였으며 (표 1; 도 3), 7 개는 뿌리털 세포를 포함하여 전체 뿌리 표피조직에서 GFP 시그널을 생성하였으며, 3 개는 대조구 (형질전환이 안 된) 수준의 시그널을 나타내었다. 일반적으로, 전체 표피조직 발현 형질전환체는 H세포 특이적인 것에 비해 비교적 약한 GFP 시그널을 보였다. AT4G37070의 시그널은 뿌리털 세포가 아닌 (N 세포) 집단보다는 뿌리털 세포 집단에서 더 강하게 나타났다. 따라서, 상기 뿌리털 유전자로 추정되는 유전자에 있어 RHE는 H세포 특이적 유전자 발현을 추진할 수 있는 것으로 생각되며, 상기 19 개의 유전자는, 프로모터:리포터 분석으로 뿌리털 특이적인 것으로 최근에 밝혀진 AT1G16440 (Zhang et al., 2009, Plant J 58: 474-484)를 제외하고는, 아라비돕시스(Arabidopsis)에 있어 신규한 형태형성 H유전자이다. 이후, RHE 함유 형태형성 H유전자를 RHS(Root Hair Specific) 유전자로 표기한다. 상기의 RHE 함유 RHS 유전자 프로모터는 모구(root hair bulge) 형성 중에 작동하기 시작한다 (Cho 및 Cosgrove, 2002, Plant Cell 14: 3237-3253).

전체 표피조직 발현 유전자 프로모터가 H세포 발현을 위한 RHE와는 다른 별개의 시스인자를 가지는지, 또는 전체 표피 세포에 특이적인 완전히 다른 제3의 인 자를 가지는지는 의문이다. 전자의 경우 H 및 N 세포에 대해 각각 하나씩 2 개의 별개의 시스인자가 있어야 한다. 본 발명에서는 2 개의 전체 표피조직 발현 유전자 (AT3G48940 및 AT4G37070)의 프로모터:GFP 구축물을 뿌리털 결함 rhd6 돌연변이체에 도입하였다. rhd6 백그라운드에서, 뿌리털 특이적 시스인자 RHE는 작동되지 않으며, RHS 유전자는 발현되지 않는다 (Cho 및 Cosgrove, 2002, Plant Cell 14: 3237-3253, 도 4A). 따라서, 표피조직 발현 유전자의 부가적인 시스인자가 rhd6 뿌리에서 H세포 발현을 위해 작동한다면, 프로모터:GFP 발현은 H세포 집단에서는 아니나, N 세포 집단에서는 보여야 한다. 그러나, 제3의 시스인자가 전체 표피조직 발현에 작용한다면, rhd6에 있어 프로모터:GFP의 발현 양상은 변하지 않아야 한다. 본 발명에서 프로모터:GFP 발현이 rhd6 뿌리의 전체 표피조직에서 보인다는 것은 (도4B, 4C), RHE 외의 다른 시스인자(들)가 상기 2 개의 전체 표피조직 발현 유전자의 프로모터에서 작용한다는 것을 제시한다.

실시예 7. RHS 유전자의 돌연변이체 표현형

RHS 유전자의 생물학적 기능을 동정하기 위해, T-DNA 삽입 돌연변이체의 뿌리털 표현형을 분석하였다. 8 개의 RHS 유전자 돌연변이체의 T-DNA 삽입을 확인하였으며, 뿌리털 표현형을 관찰하였다: AT1G05990 (SALK_027819 rhs1), AT1G12950 (SALK_126728 rhs2), AT1G30850 (SALK_007215), AT1G51880 (SALK_109605), AT1G54970 (SALK_061662), AT1G70460 (SALK_075892 rhs10), AT2G45890 (SALK_107520 rhs11), 및 AT5G67400 (SALK_093852). AT1G70460에 대해, 본 발명에 서는 SALK_075892, SALK_074904, SALK_079932C, 및 SALK_075995를 시험하였으며, SALK_075892로부터만 동형접합 식물체를 얻을 수 있었다. 상기 8 개의 유전자에 T-DNA 삽입이 해당 유전자에 대해 하나의 hit를 보였다는 것은 (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress) T-DNA 삽입이 각 유전자에 대해 1 회 일어났다는 것을 나타낸다. 그러나, 더 많은 돌연변이체 대립인자로 수행하는 차기 분석 및 유전자 상보실험은 상기 유전자의 세부적인 연구 시 유전자 기능의 완전한 이해에 도움이 될 것이다. AT1G05990 (rhs1), AT1G12950 (rhs2), AT1G70460 (rhs10), 또는 AT2G45890 (rhs11)의 결실은 뿌리털 생장에 심한 변화를 일으켰다. AT1G05990 (Ca² ⁺결합 단백질) 및 AT1G70460 (세린/트레오닌 단백질 키나아제)의 결실은 야생형보다 더 긴 뿌리털 표현형을 보였으며, AT1G12950 (MATE efflux transporter) 및 AT2G45890 (RopGEF4)의 결실은 짧은 뿌리털 (도 5)을 만들었다. 상기 돌연변이는 뿌리털 모양 또는 다른 조직에 명확한 표현형적 효과를 보이지 않았다. 하기의 기재처럼, 돌연변이체 표현형은 유전자 과발현 표현형과 일치한다. 상기 결과는 RHS 유전자가 뿌리털 생장 중에 실질적인 역할을 수행한다는 것을 제시한다.

실시예 8. RHS 의 과발현에 의한 뿌리털 표현형의 변형

T-DNA 삽입이 확인된 8 개의 유전자 중 기능상실 RHS 돌연변이체의 절반만이 표현형적 변화를 보였으며, 많은 RHS에 대한 기능상실(knock-out) 돌연변이체를 얻 을 수 없었으므로, 뿌리털 발달에 있어 그 역할을 밝히기 위해 17 개의 RHSs를 뿌리털 세포에 과발현시켰다. RHSs의 높은 뿌리털 특이적 발현을 얻기 위해, 본 발명에서는 3 개의 기능적인 RHE를 포함하는 (Kim et al., 2006, Plant Cell18 : 2958-2970) EXPA7 프로모터 (ProE7; 전사 개시부로부터 -448)를 사용하였다. ProE7로 추진된 RHS의 발현으로 야생형에 비해 해당 전사물의 수준이 상당히 증가되었음 (도 6F)은 상기 형질전환체 (RHSoxs)에 있어 RHS가 과발현되었음을 나타낸다. 대조적으로, EXPA7의 수준은 RHSoxs에 있어 많이 변하지 않았다. 17 개의 RHSox 라인 중 7 개에서 변형된 뿌리털 표현형이 나타났다. 한편 RHS3, RHS11, 또는 RHS16의 과발현은 비정상적인 뿌리털 형태 (도 6A-6C)를 초래하였으며, RHS1, RHS2, RHS10, 또는 RHS18의 과발현은 뿌리털 신장에 영향을 미쳤다 (도 6D 및 6E). RHS3 (RHS3ox)의 과발현은 나선의, 굽은, 또는 분지된 털과 같은 뿌리털 형태에 복수의 표현형적 효과를 초래하였다. RHS3ox 라인에 있어 상기의 다른 뿌리털 표현형은 동일한 뿌리에서도 보였다. RHS16ox 라인은 측면에서 분지된 뿌리털을 나타내었다. 대조적으로, RHS11ox 라인은 뿌리털 기저에서 다분지된 짧은 뿌리털을 나타내었다. RHS1ox 및 RHS18ox 라인은 대조구보다 짧은 뿌리털로 (ProE7 : GFP) (도 6E) 각각 17% 및 26% 자랐으며, 한편 RHS10ox에서는 뿌리털 신장이 크게 또는 거의 완전히 저해되었다 (도 6D). RHS2ox에서는 대조구보다 약간 긴 (13%) 뿌리털이 자랐다. 기능상실 및 과발현이 뿌리털 신장에 반대 효과를 미치는 것으로 보임으로써 RHS1ox, RHS2ox, 및 RHS10ox의 효과는 기능상실 효과와 일치한다. RHSox 라인은 뿌리털 외의 조직 또는 기관에서는 가시적인 표현형적 변화를 보이지 않았다.

도 1은 뿌리털 발달 및 H세포 특이 유전자의 발현 양상을 보여준다. 뿌리 구역은 3 개의 시간적 및 공간적 뿌리발달 단계를 나타내며, 뿌리털 구역은 뿌리털/비뿌리털 세포의 운명결정 및 뿌리털 형태형성을 위한 두 단계를 나타낸다. 운명결정 구역은 운명결정원(determinants) (WER, CPC, GL3/EGL3, 및 GL2)이 발현되는 뿌리 구간에 거의 미친다. H유전자는 운명결정 및 형태형성 구역 양자의 뿌리털 형성 H세포 (모원세포 집단, trichoblast cell file)에서 특이적으로 발현되는 유전자를 나타낸다. 뿌리는 ProEXPA7:GUS의 발현 양상을 청색으로 보여주는 그림이다. 우측은 운명결정원(determinants)으로부터 형태형성 유전자 쪽으로 시그널의 흐름을 나타낸다. RHSs (Root Hair-Specific genes)는 RHE (Root Hair cis-Element) 함유 유전자이며, RHF는 RHE에 결합하는 것으로 추정되는 전사인자이다. 호르몬적/환경적 신호는 RHD6의 하부 형태형성 유전자에 작용할 것이다. SCM (SCRAMBLED), 리셉터 유사 키나아제; MYB, MYB 전사인자 (WEREWOLF [WER] 및 CAPRICE [CPC]); bHLH (basic helix-loop helix 전사인자) (GLABRA3의 GLABRA3/ENHANCER, GL3/EGL3); WD40, WD40 도메인 단백질 (TRANSPARENT TESTA GLABRA, TTG); GL2 (GLABRA2), 호메오도메인(homeodomain) 전사인자; RHD6 (ROOT HAIR DEVELOPMENT 6), bHLH 전사인자.

도 2는 뿌리털 특이적 아라비돕시스(Arabidopsis) 유전자를 스크리닝하는 방법이다. (A)는 뿌리털 시스인자 (RHE) 컨센서스이다. 최상위 서열은 피자식물의 뿌리털 유전자의 RHE에 있어 가장 빈번한 뉴클레오티드를 나타낸다. 서열 하부의 뉴 클레오티드는 그 다음의 빈도로 출연하는 뉴클레오티드이다. 중괄호 내의 최하부 서열은 상부 서열로부터의 복수 뉴클레오티드 컨센서스 서열이며, 아라비돕시스(Arabidopsis ) 게놈으로부터 RHE 함유 유전자를 찾아내기 위해 PatMatch에서 사용된 것이다. (B)는 뿌리털 특이성에 대한 3 중 마이크로어레이 필터를 만들기 위해 사용된 뿌리털 결실 아라비돕시스(Arabidopsis) 돌연변이체 및 형질전환 라인이다. 뿌리털 억제 유전자, axr2-1 및 GL2는 뿌리털 특이적 EXPA7 프로모터 (ProE7)를 이용하여 뿌리털에 특이적으로 발현된다. 뿌리털 결함 rhd6 돌연변이체 또는 형질전환 라인에서 하향 조절되는 유전자는 뿌리털에서 발현 가능한 RNA의 마이크로어레이 분석으로 동정되었다. WT, 야생형. Bar=0.1 mm. (C)는 아라비돕시스(Arabidopsis ) 전체 게놈으로부터 뿌리털 특이적 유전자의 필터링을 보여준다. 뿌리털 특이적 유전자를 정제하기 위해 4 단계의 필터링이 사용되었다: 1, RHE 함유 유전자를 필터하기 위한 PatMatch; 2, 뿌리 특이성을 가진 RHE 함유 유전자를 필터하기 위한 Genevestigator Gene Atlas Microarray Database; 3, 뿌리털 특이적인 것으로 추정되는 유전자를 필터하기 위한, 뿌리털 결함 돌연변이체 및 형질전환 라인으로부터의 마이크로어레이 자료; 4, 뿌리털 특이성을 확인하기 위한, 뿌리털 특이적인 것으로 추정되는 34 개 유전자의 실험적 프로모터 분석으로, 24 개의 뿌리털 특이 유전자를 찾았으며, 이 중 5 개는 이전에 동정된 것이다.

도 3은 아라비돕시스(Arabidopsis) 뿌리에서 뿌리 특이적 RHE 함유 유전자의 발현 양상을 보여준다. Col-0 백그라운드로 수행한 프로모터:GFP 형질전환체의 대표적인 형광 입체현미경 이미지: (A)는 뿌리털 특이적 발현, (B)는 전체 표피조직 발현, 및 (C)는 대조구 수준의 발현을 보여준다. 바(Scale bar)는 50 μm.

도 4는 rhd6 돌연변이체의 뿌리에서 전체 표피조직 특이적 RHE 함유 유전자의 발현 양상을 보여준다. rhd6 백그라운드로 수행한 뿌리털 특이적 (대조구로서 AT4G38390[A]) 및 전체 표피조직 발현 (뿌리털 특이적이 아닌; AT3G48940 [B] 및 AT4G37070 [C]) RHE 함유 유전자의 프로모터:GFP 형질전환체의 대표적인 형광 입체현미경 이미지를 보여준다. 바(Scale bar)는 50 μm.

도 5는 기능 상실 T-DNA 삽입 RHS 돌연변이체의 뿌리털 표현형을 보여준다. (A)는 야생형 (WT) 및 돌연변이체 식물의 뿌리털 길이를 비교한 것이다: 돌연변이체 라인: SALK_027819 (rhs1 AT1G05990), SALK_126728 (rhs2 AT1G12950), SALK_075892 (rhs10 AT1G70460), 및 SALK_107520 (rhs11 AT2G45890). 650 (WT), 290 (rhs1), 670 (rhs2), 1666 (rhs10), 또는 3840 (rhs11) 뿌리털의 평균 ± 표준편차. (B)는 3일된 WT 및 돌연변이체 라인의 뿌리 이미지를 보여준다. 바(Scale bar)는 100 μm. (C)는 목적 유전자에 있어 T-DNA 삽입을 PCR로 확인한 것을 보여준다. 1, 돌연변이체의 게놈 DNA를 주형으로 LBb1 및 유전자 특이적 프라이머에 의한 PCR; 2, 분자 크기 마커; 3, WT의 게놈 DNA를 주형으로 양 유전자 특이적 프라이머에 의한 PCR; 4, 돌연변이체의 게놈 DNA를 주형으로 양 유전자 특이적 프라이머에 의한 PCR. (D)는 RT-PCR에 의한 돌연변이체의 공돌연변이를 확인한 것을 보여준다 1, WT의 뿌리 RNA를 주형으로 유전자 특이적 프라이머에 의한 RT-PCR; 2, 분자 크기 마커; 3, 돌연변이체의 뿌리 RNA를 주형으로 유전자 특이적 프라이머에 의한 RT-PCR. Actin1 유전자 특이적 프라이머가 로딩 대조구로 사용되었다.

도 6은 RHS 과발현 라인의 뿌리털 표현형을 보여준다. ProEXPA7 : RHSs가 야생형 아라비돕시스( Arabidopsis ) 식물체에 도입되었다. (A)-(D)는 RHSox 라인의 입체현미경 이미지이다. 바(Scale bar)는 50 μm (A-C) 및 100 μm (D). (E)는 RHSox 라인의 뿌리털 길이를 보여준다. 694 (Cont), 470 (RHS18ox), 1704 (RHS2ox), 또는 1750 (RHS1ox) 뿌리털로부터의 평균 ± 표준편차. 대조구(Cont), ProEXPA7 : GFP . (F)는 RHSox 라인의 RT-PCR 분석을 보여준다. 총 RNA는 야생형 (WT) 및 2 개의 각 외래도입유전자(transgene)에 대한 ProE7로 추진된 과발현 라인 (ox1 및 ox2)으로부터 분리되었다. RHS, EXPA7, 및 Actin에 대한 전사물의 수준은 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 반 정량적 RT-PCR로 평가되었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> RHS1 gene controlling plant root hair development and a method to control plant root hair development using the gene <130> PN09092 <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 453 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana RHS1 <400> 1 atggatccga cagagctaaa acgcgtgttc caaatgttcg acaagaacgg ggacgggacg 60 atcacgggga aagagctgag cgagacacta cgaagcctag ggatttacat cccggacaag 120 gagttgactc aaatgatcga gaagatcgac gtgaatggtg atgggtgcgt ggacatagac 180 gagtttggtg agctatacaa gacgataatg gacgaggaag acgaagaaga agaggacatg 240 aaagaagctt tcaatgtgtt tgatcagaat ggagatgggt ttataacggt ggatgaattg 300 aaggcggttt tgtcttcctt ggggctcaaa caaggtaaga ccttggacga ttgtaagaag 360 atgataaaga aagtggatgt tgatggtgat ggtagggtta actacaaaga gtttagacaa 420 atgatgaaag gcggtggttt taattctttg tag 453 <210> 2 <211> 150 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana RHS1 <400> 2 Met Asp Pro Thr Glu Leu Lys Arg Val Phe Gln Met Phe Asp Lys Asn 1 5 10 15 Gly Asp Gly Thr Ile Thr Gly Lys Glu Leu Ser Glu Thr Leu Arg Ser 20 25 30 Leu Gly Ile Tyr Ile Pro Asp Lys Glu Leu Thr Gln Met Ile Glu Lys 35 40 45 Ile Asp Val Asn Gly Asp Gly Cys Val Asp Ile Asp Glu Phe Gly Glu 50 55 60 Leu Tyr Lys Thr Ile Met Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Met 65 70 75 80 Lys Glu Ala Phe Asn Val Phe Asp Gln Asn Gly Asp Gly Phe Ile Thr 85 90 95 Val Asp Glu Leu Lys Ala Val Leu Ser Ser Leu Gly Leu Lys Gln Gly 100 105 110 Lys Thr Leu Asp Asp Cys Lys Lys Met Ile Lys Lys Val Asp Val Asp 115 120 125 Gly Asp Gly Arg Val Asn Tyr Lys Glu Phe Arg Gln Met Met Lys Gly 130 135 140 Gly Gly Phe Asn Ser Leu 145 150 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> RHS1-F-RHE <400> 3 ttcttcctcc acacgca 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> RHS1-R-RHE <400> 4 aacgtgcaac caatat 16 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> RHS2-F1-RHE <400> 5 catatggagt ccacgac 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> RHS2-F2-RHE <400> 6 taattgctcc gcacgta 17 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> RHS3-F-RHE <400> 7 aacctaataa cacgag 16 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> RHS3-R1-RHE <400> 8 tacgtggaaa acaggcc 17 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> RHS3-R2-RHE <400> 9 ttcgtgataa caagta 16 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> RHS4-R1-RHE <400> 10 aacgtgctta ccatttt 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> RHS4-R2-RHE <400> 11 tacgtgcaaa ccatttc 17 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> RHS4-F-RHE <400> 12 atcttggatc cacgag 16 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> RHS5-R-RHE <400> 13 atcgtgacag cagttt 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> RHS5-F-RHE <400> 14 ttttttgttc cacgaa 16 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> RHS6-F-RHE <400> 15 aatgtcgtag acacgta 17 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> RHS6-R-RHE <400> 16 aacgtgcctc cataaa 16 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> RHS7-R-RHE <400> 17 atcgtgcata acactat 17 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> RHS8-R-RHE <400> 18 gacgtgagtg catgtc 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> RHS8-F-RHE <400> 19 aacttggagg cacgtt 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> RHS9-F-RHE <400> 20 cacatgcaag cacgaa 16 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> RHS9-R-RHE <400> 21 ttcgtgagtc tcaagaa 17 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> RHS10-R-RHE <400> 22 gacgtgcctc caataa 16 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> RHS10-F-RHE <400> 23 gacttacaaa cacgtc 16 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> RHS10-R-RHE <400> 24 tacgtgtgta ttacaaa 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> RHS11-F1-RHE <400> 25 ttaatctttg tcacgtt 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> RHS11-F2-RHE <400> 26 aatgtggaag gcacgtc 17 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> RHS11-R1-RHE <400> 27 gacgtggact tcatccc 17 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> RHS11-R2-RHE <400> 28 cacgtgccac caccac 16 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> RHS12-F1-RHE <400> 29 tttgtgcctc gcacgta 17 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> RHS12-F2-RHE <400> 30 tgcttggtaa cacgtc 16 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> RHS13-R-RHE <400> 31 accgtgcata cacgtt 16 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> RHS13-F1-RHE <400> 32 accgtgcata cacgtt 16 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> RHS13-F2-RHE <400> 33 ataatgcgac tcacgtc 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> RHS14-R-RHE <400> 34 atcgtgttta ccacacc 17 <210> 35 <211> 16 <212> DNA <213> RHS14-F1-RHE <400> 35 tggattggta cacgta 16 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> RHS14-F2-RHE <400> 36 tccttgatct cacgta 16 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> RHS15-R1-RHE <400> 37 tacgtgcggg cacaaa 16 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> RHS15-F-RHE <400> 38 caaataaact tcacgag 17 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> RHS15-R2-RHE <400> 39 gtcgtggaga gatgac 16 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> RHS16-R-RHE <400> 40 gtcgtgagca gcactta 17 <210> 41 <211> 16 <212> DNA <213> RHS17-F-RHE <400> 41 tacatgtcat cacgta 16 <210> 42 <211> 16 <212> DNA <213> RHS18-F1-RHE <400> 42 tccatgaacg cacgtt 16 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> RHS18-F2-RHE <400> 43 ttagtagtat ccacgtt 17 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> RHS18-F3-RHE <400> 44 atgatttttg cacgtt 16 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> RHS19-R-RHE <400> 45 aacgtggctc caagtt 16 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> RHS19-F4-RHE <400> 46 tttttgctct gcacgaa 17 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> axr2-1a primer <400> 47 ccccttctag acctttcttc ttcccctct 29 <210> 48 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> axr2-1b primer <400> 48 tttatcccgg gtaacagatc tgttcttgca gtacttctcc attg 44 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GL2a primer <400> 49 gctagcccgg gacaggattt gtat 24 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GL2b primer <400> 50 tgtgacccgg gtaacgcaat cttcgatttg tagacttc 38 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> RHE consensus 1 <400> 51 whhdtgnnnn kcacgwh 17 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> RHE consensus 2 <400> 52 whhdtgnnnk cacgwh 16

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 RHS(Root Hair-Specific)1 단백질.
제1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
삭제
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
제5항의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
제5항의 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하는 방법.
제2항의 유전자를 포함하는 식물체의 뿌리털 발달을 조절하기 위한 조성물.
삭제