KR101102914B1

KR101102914B1 - 숙주에 대하여 항병성을 부여하는 신규 균주 및 균체조성물

Info

Publication number: KR101102914B1
Application number: KR1020077016857A
Authority: KR
Inventors: 다케히로 미와; 히로시 와타나베; 마모루 이시하라; 츠네오 히노; 나리토 아사누마
Original assignee: 메이지 세이카 파루마 가부시키가이샤
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2012-01-10
Also published as: JPWO2006070891A1; ATE498679T1; DE602005026452D1; CN101124318B; DK1835021T3; CN101124318A; EP1835021A4; US20080095745A1; EP1835021A1; WO2006070891A1; BRPI0519426A2; PT1835021E; US8728794B2; EP1835021B1; ES2358746T3; JP4953824B2; KR20070091212A

Abstract

본 발명은 부티르산 생성능을 갖는 부티리비브리오·피브리솔벤스의 균체, 그 배양물 또는 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 신규 균체 조성물 및 그것을 이용한 발암 억제 방법, 면역 부활화 방법, 병원균 감염의 예방·치료 방법, 염증성 장 질환의 예방·치료 방법 및 알레르기성 질환의 예방·치료 방법을 제공한다.

부티리비브리오·피브리솔벤스, 발암억제, 균체, 면역 부활화, 염증질환

Description

숙주에 대하여 항병성을 부여하는 신규 균주 및 균체 조성물{NOVEL STRAIN CONFERRING ANTI-DISEASE PROPERTIES TO HOST AND BACTERIAL CELL COMPOSITION}

본 발명은 높은 부티르산 생성능을 갖는 부티리비브리오·피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens, 이하 B. fibrisolvens로도 표시함)의 균체를 함유하는 것을 특징으로 하는 발암 억제, 면역력 향상, 병원성 감염의 예방 및 치료, 염증성 장질환의 예방 및 치료, 알레르기성 질환의 예방 및 치료에 유용한 신규 균체 조성물에 관한 것이다.

최근, 젖산 생성능이 높은 락토바실러스나 비피도박테리움 등을 이용한 프로바이오틱 제제가 보고되며(특허문헌 1), 또한 그 대부분이 제품화되어 있다. 이들 제제의 기본적인 기능은 정장 작용이며, 숙주가 이들의 제제를 섭취한 경우, 이들 제제에 함유되는 젖산 생성균이 생성한 젖산에 의해 장관 내의 pH가 저하된다. 그 때문에, 그와 같은 낮은 pH 환경에서는 생식할 수 없는 악옥균의 균수가 감소하고, 그 결과로서 정장 작용을 나타내는 것으로 되어 있다. 이와 같이 미생물 기능성에 의해, 숙주에 대하여 건강 증진이나 항병성 등의 효과를 가져오는 프로바이오틱이라는 개념은 사회적으로 널리 받아들여지고, 또한 그 효과에 대해서도 인정을 받고 있다. 본 발명에 있어서 프로바이오틱이란, 동물 및 인간의 건강에 유익한 작용을 나타내는 살아있는 미생물을 가리킨다.

또한, 최근에는 이들 유산균이 생성하는 젖산의 효과뿐만 아니라, 공급한 미생물 세포 자체에 함유되는 펩티드 글리칸이나 그 외에 단백질 등에 의한 숙주의 면역 부활 작용, 또한, 어떤 특정한 세균에 대하여 좁은 범위의 항균 활성을 나타내는 박테리오신을 갖는 것도 표시되어 있다(비특허 문헌 1).

또한, 인간이나 동물의 장 내 발효에 의해 생성되는 단쇄 지방산이 주목되고 있다. 단쇄 지방산은 장관 내의 pH를 저하시키는 기능이나 장관 운동의 촉진(비특허 문헌 2), Na 흡수의 촉진 효과 등이 표시되어 있다. 이들 단쇄 지방산 중에서도 특히 주목받고 있는 것은 부티르산이다. 그 기능으로서는 결장 상피 세포에 있어서의 에너지원으로서 중요한 것(비특허 문헌 3), 또한, 항암 작용(비특허 문헌 4)이나 장관 점막의 분화 촉진 효과 등, 숙주에 있어서 매우 유익한 효과를 가져오는 것이 표시되어 있다.

그러나, 부티르산 자체를 그대로 경구로 투여하는 것은 독특한 악취나 안전성의 면에서도 문제가 있었다. 그 때문에, 이러한 중요한 생리 활성 물질을 보다 효과적으로 숙주에 대하여 작용시키기 위해서는 직접 경구 투여하는 것보다도 소량을 장 내에서 생성하여 항시 흡수시킨 쪽이 효과적이라고 생각된다.

미생물을 이용한 장 내 부티르산 농도 상승 촉진제로서는 락토바실러스·아시드필스 및/또는 비피도박테리움·론검의 균체를 유효 성분으로 하는 것이 개시되어 있다(특허 문헌 2). 그러나, 이 특허 중에는 실제 질병에 대한 효과의 기재는 없으며, 이 균체를 투여함으로써, 항병성이 어느 정도 있는지는 불명확하다.

또한, 부티르산 생성능을 갖는 미생물로서 클로스트리디움·부티리쿰(Clostridium butyricum, 이하 C. butyricum으로도 표시함)을 이용하는 방법이 개시되어 있다(비특허 문헌 5). 이와 같이 이미 공지화되어 있는 문헌에 의하면, 부티르산 생성균으로서 이미 상품화되어 있는 클로스트리디움·부티리쿰은 정장 작용이 있다. 그러나, 전암 병변 세포의 억제 효과에 대해서는 충분한 효과를 얻기 위해서는 특수한 기질과 함께 투여해야 하여, 이 미생물 단독으로는 효과가 낮다는 문제점이 있었다(비특허 문헌 6). 또한, 마찬가지로 염증성 장 질환의 예방 효과를 검토한 결과에 있어서도 이 미생물 단독으로는 효과가 낮다는 문제점이 있었다.

또한, 이들 문헌에는 프로바이오틱으로서 부티리비브리오·피브리솔벤스를 사용하는 구체적인 방법은 명기되어 있지 않으며, 또한, 그 효과도 명백하게 되어 있지 않다.

이상의 것으로부터, 숙주에 대하여 한층 건강 증진이나 항암성이나 면역 부활 기능을 갖는 것에 의한 항병성 작용이 높고, 또한 부티르산 생성능을 갖는 균주가 강하게 요구되고 있다.

[특허 문헌 1] 일본 특허 공개 제2002-306125호 공보

[특허 문헌 2] 일본 특허 공개 평성 제10-84909호 공보

[비특허 문헌 1] Kawai Y et al., Curr. Protein. Pept. Sci., 2004, 5(5), 393-8, " The circular bacteriocins gassericin A and circulacin A"

[비특허 문헌 2] Cherbut, C. et al., American Journal of Physiology, 1998, 275, G1415-G1422, "Shor-chain fatty acids modify colonic motility through nerves and polypeptide YY release in the rat"

[비특허 문헌 3] Cummings, J.H., Gut, 1981, 22, 763-779, "Short chain fattyacids in the human colon"

[비특허 문헌 4] Hague, A. et al., Gastroenterology, 1997, 112, 1036-1040, "Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells: further fuel for the in vivo versus in vitro debate"

[비특허 문헌 5] Kanauchi O. et al., Curr Pharm Des., 2003, 9(4), 333-346, "Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease"

[비특허 문헌 6] Nakanishi S et al., Microbiol Immunol, 2003, 47(12), 951-958, "Effects of high amylose maize starch and Clostridium butyricum on metabolism in colonic microbiota and formation of azoxymethane-induced aberrant crypt foci in the rat colon"

도 1은 균체 조성물 및 디메틸히드라진의 투여 스케줄을 도시한 도면이다.

도 2는 DSS 및 부티리비브리오·피브리솔벤스 투여 마우스에 있어서의 DAI를 도시한 도면이다.

도 3은 3-MC 유발 섬유 육종 형성에 미치는 균체 조성물 투여의 효과를 도시한 도면이다.

도 4는 3-MC 및 균체 조성물의 투여가 체중 증가에 부여하는 영향을 도시한 도면이다.

[발명의 개시]

[발명이 해결하고자 하는 과제]

본 발명의 목적은 발암 억제 효과, 면역 부활 효과, 병원균 감염 예방·치료 효과, 염증성 장 질환 예방·치료 효과 및 알레르기성 질환 예방·치료 효과를 갖는 신규로 단리된 부티리비브리오·피브리솔벤스의 균체를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 균은 높은 부티르산 생성능을 가지며, 프로바이오틱으로서 이용할 수 있고, 나아가서는 그것을 이용한 발암 억제 방법, 면역 부활화 방법, 병원균의 예방·치료 방법, 염증성 장 질환의 예방·치료 방법 및 알레르기성 질환 예방·치료 방법을 제공하는 것에 있다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자들은 인간이나 동물 등의 한층 높은 건강 증진이나 항암성이나 면역 부활 기능 등을 갖고, 또한, 장 내에서의 부티르산 생성능을 갖는 안전하고 저렴하게 제공할 수 있는 프로바이오틱 제제를 구하여 예의 연구를 진행시킨 바, 부티리비브리오·피브리솔벤스에 이러한 기능이 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다.

즉, 본 발명을 이하에 나타낸다.

(1) 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁 번호 FERM BP-10463으로서 기탁된 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주 및 그 변이주.

상기 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주 또는 변이주는 프로바이오틱으로서 적합하고, 부티르산 생성능이 높다.

(2) 적어도 1 종류의 부티리비브리오속(Butyrivibrio)에 속하는 미생물의 균체, 그 배양물 또는 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 균체 조성물.

(3) 부티리비브리오속에 속하는 미생물이 부티리비브리오·피브리솔벤스인 상기 (2)에 기재한 균체 조성물.

(4) 부티리비브리오·피브리솔벤스가 부티리비브리오·피브리솔벤스 타입 I(부티르산 생성능이 높은 타입)에 속하는 균주인 상기 (3)에 기재한 균체 조성물.

(5) 부티리비브리오·피브리솔벤스가 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁 번호 FERM BP-10463으로서 기탁된 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주 및 그 변이주인 상기 (3)에 기재한 균체 조성물.

(6) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약품.

(7) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 사료 첨가물.

(8) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 발암을 억제하는 치료제.

(9) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 인간 또는 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 발암을 억제하는 방법.

(10) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 면역 부활화제.

(11) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 인간 또는 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 면역 부활화의 방법.

(12) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 병원균의 감염 예방 및/또는 치료제.

(13) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 인간 또는 척추동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 병원균의 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법.

(14) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 염증성 장 질환에 대한 예방 및/또는 치료제.

(15) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 인간 또는 척추동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 염증성 장 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.

(16) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 알레르기성 질환에 대한 예방 및/또는 치료제.

(17) 상기 (2)∼(5) 중 어느 한 항에 기재한 균체 조성물을 인간 또는 척추동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 알레르기성 질환에 대한 예방 및/또는 치료 방법.

[발명의 효과]

본 발명의 균체 조성물은 항암 작용, 면역 부활 효과, 염증성 장 질환 예방·치료 효과, 병원균 감염 예방 효과 및 알레르기성 질환 예방·치료 효과 등을 갖는다.

[발명의 실시를 위한 구체적인 내용]

이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서에 있어서, 부티리비브리오·피브리솔벤스의 「타입 I」이란, 이 세균 발효능의 차이에 의한 분류의 1종이다(Shane BS et al., J. Gen. Microbiol., 1969, 55, 445-457, "Cellulolytic bacteria occurring in the rumen of sheep contained to low-protein teff hay"). 타입 I은 부티르산 생성에 발효 경로가 치우쳐 있으며, 세균의 발효에 의해 생성되는 젖산의 비율은 타입 Ⅱb에 비해 적고, 부티르산을 많이 생성한다.

표에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MDT-1 주는 부티르산 생성량이 많은 타입 I의 균주 중에서 세포 외 pH의 저하에 대한 내성이 가장 높기 때문에, 산성의 장관 내에서도 유리하게 증식할 것으로 기대된다.

B. 피브리솔벤스의 증식가능 최저 pH

균주	타입	증식가능 최저 pH
TH-1	Ⅱb	5.2
MDT-1	I	5.3
51255	Ⅱb	5.5
A38	I	5.8
OB156	Ⅱb	6.0

본 명세서에 있어서, 「발암을 억제하는 방법」이란, 예컨대 대장관 점막의 전암 병변인 이상 음와병소(陰窩病巢) 등의 형성을 예방하는 방법이다. 즉, 미리 발암 가능성이 전혀 없는 평상시, 또는 발암 가능성이 있는 경우에, 사전에 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 발암을 완전히 방어할 수 있거나 또는 그 리스크(risk)를 저감시킬 수 있다. 또한, 마찬가지로 이미 발암하고 있을 가능성이 있는 경우에도, 즉각 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 암의 진행을 막거나 또는 저감시킬 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「면역 부활화의 방법」이란, 예컨대 인간이나 동물의 체내에 병원균이나 바이러스 등이 침입한 경우에, 재빠르게 항병성을 나타내기 위한 NK 세포수의 증가, IgG 생성 등 액성 면역의 응답 속도나 효율화, 장관 면역계의 응답 속도나 효율화 등에 의해 면역력을 한층 증강시키는 방법이다. 즉, 미리 병원균이나 바이러스 등 감염의 가능성이 전혀 없는 평상시, 또는 병원균이나 바이러스 등에 감염될 가능성이 있는 경우에, 사전에 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 전술한 체내에 침입한 병원균이나 바이러스 등의 감염을 완전히 방어할 수 있거나 또는 저감시킬 수 있다. 또한, 마찬가지로 이미 병원균이나 바이러스 등이 체내에 침입한 가능성이 있는 경우에도 즉각 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 전술한 병원균이나 바이러스 등의 감염에 의한 발증·발병을 완전히 방어할 수 있거나 또는 저감시킬 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「병원균의 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법」이란, 예컨대 살모넬라 속이나 캠피로백터 속 등으로 대표되는 병원균이 인간이나 동물의 소화관 내 또는 호흡 기관 내에 침입한 경우, 그 병원균의 감염이나 이들의 감염에 의한 발증·발병을 예방하는 방법이다. 즉, 미리 감염의 가능성이 전혀 없는 평상시 또는 감염될 가능성이 있는 경우에, 사전에 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 전술한 병원균의 감염을 완전히 방어할 수 있거나 또는 저감시킬 수 있다. 또한, 마찬가지로 이미 병원균에 감염된 가능성이 있는 경우에도 즉각 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 전술한 병원균의 감염에 의한 발증·발병을 완전히 방어할 수 있거나 또는 저감시킬 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「염증성 장 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법」이란, 예컨대 궤양성 대장염이나 크론병으로서 알려져 있는 난병성 질병의 발증·발병을 예방 및/또는 치료하는 방법이다. 즉, 전술한 질병을 이미 앓고 있는 인간이나 동물에게 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 투여함으로써, 전술한 질병을 완전히 치료할 수 있거나 또는 증상을 저감시킬 수 있다. 또한, 마찬가지로, 전술한 질병을 앓을 가능성이 전혀 없는 평상시 또는 전술한 질병을 앓을 가능성이 있는 경우에 사전에 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 전술한 질병을 완전히 방어할 수 있거나 또는 저감시킬 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「알레르기성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법」이란, 예컨대 면역 세포인 헬퍼 T 세포의 Th1/Th2 밸런스를 Th1로 기울어지게 함으로써, 알레르기성 질환의 증상을 개선 및/또는 치료하는 효과이다. 알레르기성 질환이란, 구체적으로는 아토피성 피부염이나 화분증, 식품 유래의 성분을 원인으로 하는 설사 등의 증상을 나타낸다. 즉, 미리 알레르기 증상의 가능성이 전혀 없는 평상시 또는 알레르기 증상이 발증할 가능성이 있는 경우에, 사전에 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 알레르기 증상의 발증을 완전히 방어할 수 있거나 또는 그 리스크를 저감시킬 수 있다. 또한, 마찬가지로 이미 알레르기 증상이 발증하고 있는 가능성이 있는 경우에도 즉각 본 발명의 균체 또는 균체 조성물 및 이들을 함유하는 제제를 인간이나 동물에게 투여함으로써, 알레르기 증상의 진행을 막거나 또는 저감시킬 수 있다.

본 발명의 균체 조성물에 있어서의 균체는 지금까지 설명한 각종 특질을 나타내는 한, 그 기원은 특별히 한정되는 것은 아니고, 그 유래로서는 부티리비브리오 속에 속하는 미생물이며, 부티리비브리오·피브리솔벤스가 보다 바람직하고, 부티리비브리오·피브리솔벤스의 타입 I로 분류되는 균이 보다 바람직하며, 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주(FERM BP-10463 균주)가 특히 바람직하다. 본 발명의 MDT-1 주의 변이주로서는 본 발명의 효과를 얻을 수 없는 한 한정되지 않지만, MDT-1 주의 계대 배양주, 인공 변이주 및 자연 변이주, 유전자 재조립주 등을 들 수 있다. MDT-1 주의 균학적 성장은 이하와 같다.

MDT -1 주의 균학적 성장

부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주는 그램 음성의 간균이다. 본 균은 편성 염기성균이며, 증식에는 높은 혐기도를 필요로 한다. 본 균의 당 이용성을 하기의 표에 나타내었다.

B. 피브리오솔벤스 MTD-1 주의 당질 이용성¹ ⁾

균	당질² ⁾
	Glu	Mal	Fru	Gal	Lac	Ara	Xyl	Cel	Sta	Avi
단리균	++	+	++	++	+	+	++	++	++	-
B. 피브리솔벤스	++	+	++	++	+	+	++	++	++	-

¹⁾ 당질 이용성에 대해서는 24시간 배양 후의 잔존량을 측정하고, 소비량을 기초로 구분하였다: ＋＋는 20 mM 이상의 소비, ＋는 5 mM 이상의 소비, －는 5 mM 미만의 소비를 나타낸다.

²⁾ Glu＝글루코오스, Mal＝만노오스, Fru＝과당, Gal＝갈락토오스, Lac＝락토오스, Ara＝아라비노오스, Xyl＝크실로오스, Cel＝셀로비오스, Sta＝옥수수 전분, Avi＝아비셀(미결정 셀룰로오스).

또한, 본 균의 증식시에 생성되는 발효 산물은 하기와 같다.

B. 피브리솔벤스 MTD-1 주의 증식시 발효 산물¹ ⁾

균	발효산물² ⁾
	젖산	포름산	초산	부티르산	총량
단리균	11.8	9.9	10.3	11.3	43.3
B. 피브리솔벤스	12.2	9.7	9.8	11.5	43.2

¹⁾글루코오스 및 셀로비오스(각 2 g/L)를 기질로 하여, 24시간 배양한 후의 발효 산물.

²⁾ 양균에 있어서, 단백질과 프로피온산은 검출되지 않았다.

또한, 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(수신자: 우편 305-8566 일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1 쵸우메 1 반치 1 츄오우 제6)에 FERM P-20293으로서 2004년 11월 9일에 기탁되어 있다(또한, 이 MDT-1 주는 2005년 12월 5일자로 FERM BP-10463으로서 국제기탁에 이관됨).

이하, MDT-1 균주의 배양 방법에 대해서 설명한다.

본 발명에 있어서, 부티리비브리오·피브리솔벤스를 배양하기 위해서는 중성 pH 부근에서 완충능을 나타내는 성분을 갖고 있으면 통상의 영양 배지를 사용할 수 있고, 탄소원, 질소원, 금속류, 단쇄 지방산, 비타민류, 아미노산류를 충분히 함유하는 것이면, 천연 배지, 합성 배지 모두 이용할 수 있다.

배지 중 탄소원으로서는 글루코오스, 과당, 슈크로오스, 말토스, 만노오스, 전분 등을 사용할 수 있다. 또한, 질소원으로서는 펩톤, 이스트, 육 엑기스 등을 사용할 수 있다. 또한, 무기 염류로서는, 인산수소이칼륨, 인산이수소칼륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 초산칼륨 등을 이용할 수 있다.

배양법으로서는 탄산 가스나 질소 가스 등에 의한 치환에 의해 높은 혐기도를 유지하여, 10℃∼70℃, 바람직하게는 25℃∼60℃, 보다 바람직하게는 30∼45℃이며, 2∼96시간, 바람직하게는 3∼48시간 보다 바람직하게는 5∼24시간 교반 배양함으로써, 부티리비브리오·피브리솔벤스를 배양할 수 있다.

본 발명의 균체 조성물에 있어서는 상기 부티리비브리오 속에 속하는 미생물의 균체, 그 배양물 혹은 추출물을 함유한다. 그 배양물로서는 상기한 바와 같이 이 균을 배양하여 얻어진 배양 상층액 등을 들 수 있고, 추출물로서는 이 균체를 용균시켜 얻어지는 용균액으로부터 유효 성분을 추출하여 얻어지는 추출물을 들 수 있다. 본 발명의 균체 조성물에 있어서는 본 발명의 효과를 보다 유효하게 발현할 수 있기 때문에, 상기 부티리비브리오 속에 속하는 미생물의 균체를 함유하는 것이 바람직하다.

이하에, 본 발명의 균체 조성물이 상기 부티리비브리오 속에 속하는 미생물의 균체를 함유하는 경우를 예로서, 본 발명의 균체 조성물에 대해서 설명한다.

얻어진 배양액을 원심분리기로 처리함으로써, 균체를 함유하는 침전물을 얻는다. 또한, 균체를 등장액 등의 용액에 부유시켜 균체 조성물을 얻을 수도 있다. 등장액 등의 용액으로서는 염화나트륨 용액 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 부티르산 생성능을 갖는 미생물을 함유하는 균체 조성물을 취득하기 위해서는 그 미생물에 적합한 상기에 기재된 바와 같은 조건으로 배양을 행하고, 본 발명의 미생물을 함유하는 균체를 회수하며, 필요에 따라 임의 성분(용액, 이 균체 이외의 균체, 담체 및 희석액 등)을 첨가함으로써, 본 발명의 균체 조성물을 조제할 수 있다.

균체 조성물 중 균체 함량은 그 사용 목적에 따라, 전술한 바와 같은 충분한 기능성을 발휘할 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 균체 조성물 전체중량에 대하여 0.01∼99 질량%, 바람직하게는 0.1∼80 질량%의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명의 균체 조성물은 본 발명의 균체에 덧붙여, 또한, 본 발명 균체 이외의 균체, 예컨대 락토바실러스 속이나 비피도박테리움 속 또는 클로스트리디움 속 중 적어도 하나를 함유할 수 있다. 본 발명의 균체 외의 균체를 병용함으로써, 본 발명의 균체를 단독으로 함유하는 균체 조성물에 비해서, 프로바이오틱으로서의 효과를 한층 향상시킬 것으로 기대된다.

본 발명의 균체 조성물은 유효 성분인 본 발명의 균체를 단독으로 함유할 수도 있거나 혹은 유효 성분인 본 발명의 균체와 함께 적당한 담체 및/또는 희석제를 함유할 수도 있다. 상기 담체 또는 희석제로서는 유효 성분인 본 발명의 균체의 발암 억제 효과, 면역 부활 효과, 병원균 감염 예방·치료 효과, 염증성 장 질환 예방·치료 효과 및 알레르기성 질환 예방·치료 효과를 억제 또는 저해하는 일이 없는 한, 균체 조성물의 담체 또는 희석제로서 일반적으로 이용되고 있는 담체 또는 희석제, 예컨대 부형제(예를 들어, 젖당, 염화나트륨 또는 소르비톨 등), 계면활성제 또는 방부제를 이용할 수 있다.

본 발명의 균체 또는 균체 조성물을 그 단독으로 혹은 전술한 바와 같은 제제의 형태로 이용함으로써, 인간 또는 숙주 동물의 암의 발생, 면역력 향상, 병원균의 감염 예방, 염증성 장 질환 예방 및 알레르기성 질환 예방을 할 수 있다. 또한 혹은 이미 발암된 경우, 면역력이 저하된 경우, 병원균에 감염될 가능성이 있는 경우, 염증성 장 질환에 걸릴 가능성이 있는 경우 또는 알레르기성 질환에 걸릴 가능성이 있는 경우의 인간 또는 숙주 동물에 대해서도 본 발명의 균체 또는 균체 조성물을 투여함으로써, 각각의 증상을 치료 혹은 경감할 수 있다.

본 발명에 있어서의 대상 생물로서는 본 발명의 효과를 유효하게 발현할 수 있는 생물이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 인간 혹은 동물을 들 수 있다. 그 동물로서는 애완 동물 및 가축 동물을 들 수 있고, 특히 어류, 양서류, 담충류, 조류, 포유류 등의 척추 동물을 들 수 있다. 이들의 구체예로서는 양식 혹은 애완되고 있는 어류, 양서류 및 담충류, 애완되고 있는 조류, 개, 고양이, 설치류 등의 애완 포유류, 소, 돼지 등의 가축 포유류 및 가금(家禽)을 들 수 있다.

본 발명의 균체 또는 균체 조성물의 투여로서는 소화관 내에 균체 또는 균체 조성물이 도달할 수 있는 형태가 바람직하고, 장에 도달하는 형태가 더욱 바람직하다. 예컨대, 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 세립제, 산제 또는 경구 용액제 등에 의한 경구 투여 혹은 좌제를 이용한 비경구 투여를 들 수 있다.

본 발명의 의약품, 사료 첨가물, 발암 억제 치료제, 면역 부활화제, 병원균 감염 예방·치료제, 염증성 장 질환 예방·치료제 및 알레르기성 질환 예방·치료제에 있어서의 유효 성분으로서의 상기 균체 조성물의 함유량으로는 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 균체의 양으로 나타내면, 10³∼10¹⁴ cfu/g가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10⁵∼10¹³ cfu/g가 보다 바람직하며, 특히 바람직하게는 10⁶∼10¹² cfu/g이다.

본 발명의 의약품, 사료 첨가물, 발암 억제 치료제, 면역 부활화제, 병원균 감염 예방·치료제, 염증성 장 질환 예방·치료제, 알레르기성 질환 예방·치료제 및 본 발명의 방법에 있어서, 유효 성분인 상기 균체 조성물의 투여법(투여량, 투여 회수, 투여 기간)은 상기 균체가 장에 도달하여, 장에서 생육할 수 있고, 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 대상 동물, 목적, 균체의 생육 상황을 고려하여 적절하게 설정할 수 있다.

그 투여량으로서는 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 1회 투여당 균체의 양으로 나타내면, 대상 동물 1 kg 당 10³∼10¹⁵ cfu가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10⁶∼10¹⁴ cfu가 보다 바람직하며, 특히 바람직하게는 10⁸∼10¹² cfu이다.

상기 범위의 투여량을, 예컨대 단회 투여하여도 좋고, 일정한 기간에 걸쳐 계속하여 투여하여도 좋다. 계속하여 투여하는 경우, 투여 기간으로서는, 예컨대 2일∼6개월 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3일∼6개월 이상, 특히 바람직하게는 7일∼6개월 이상이다. 본 발명에 있어서는 보다 장기간에 걸쳐 투여를 계속함으로써, 본 발명의 효과를 보다 발현할 수 있다.

계속하여 투여하는 경우, 그 투여 빈도로서는, 예컨대 1개월에 1회 이상의 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2주간에 1회 이상의 투여이며, 특히 바람직하게는 일주일에 1회∼매일 투여이다.

투여 방법으로서는 하루 투여량을 상기 범위로 하여, 하루 1회 전량을 투여하여도 좋고, 하루 2회에서 3회로 분할하여 투여하여도 좋다. 혹은 하루의 투여량을 상기 범위가 되도록 사료 등에 혼합하여 투여하여도 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니고, 여기에 나타내지 않은 변법 혹은 수식 수단 전부를 포괄한다.

<<실시예 1·균체 조성물의 조제>>

본 발명의 균체 조성물을 얻기 위해, 인산수소이칼륨(와코준야쿠고교샤제) 0.9 g, 인산이수소칼륨(와코준야쿠고교샤제) 0.9 g, 염화나트륨(와코준야쿠고교샤제) 1.8 g, 황산암모늄(와코준야쿠고교샤제) 1.8 g, 염화칼슘·2수화물(와코준야쿠고교샤제) 0.24 g, 황산마그네슘·7수화물(와코준야쿠고교샤제) 0.375 g, 초산칼륨(와코준야쿠고교샤제) 1 g, 프로피온산나트륨(와코준야쿠고교샤제) 0.5 g, n-부티르산나트륨(와코준야쿠고교샤제) 0.3 g, 발레르산(와코준야쿠고교샤제) 0.1 g, 이소부티르산(와코준야쿠고교샤제) 0.1 g, 이소발레르산(와코준야쿠고교샤제) O.1 g, 2-메틸부티르산(와코준야쿠고교샤제) O.1 g, 구연산철암모늄(와코준야쿠고교샤제) 10 mg, 염화망간(와코준야쿠고교샤제) 6 mg, 황산 코발트(와코준야쿠고교샤제) 2 mg, 염화니켈(와코준야쿠고교샤제) 0.4 mg, 몰리브덴산암모늄(와코준야쿠고교샤제) 0.4 mg, 15% 황산동(와코준야쿠고교샤제) 1 mg, 황산칼륨알루미늄(와코준야쿠고교샤제) 0.3 mg, 붕산(와코준야쿠고교샤제) 0.3 mg, 황산아연(와코준야쿠고교샤제) 2 mg, 인산피리독살(와코준야쿠고교샤제) 2 mg, p-아미노안식향산(와코준야쿠고교샤제) 0.5 mg, 비오틴(와코준야쿠고교샤제) 0.2 mg, 페닐프로피온산(칸토카가쿠샤제) 2 mg, L-아르기닌(와코준야쿠고교샤제) 2 mg, 팜비탄(다케다야쿠힝고교샤 제) 100 mg, 비타민 K₁(SIGMA사제) 0.03 ㎕, 글루코오스(와코준야쿠고교샤제) 3 g, 이스트엑스트랙트(디프코샤제) 3 g, 트립톤헵톤(Becton dickinson사제) 1.5 g, 트립티케이스(Bectondickinson사제) 1.5 g, 시스테인염산염(와코준야쿠고교샤제) 1 g(pH 7.0)으로 이루어지는 배지(이하, 배지 A라고 칭함)를 CO₂ 치환한 후 마개를 밀폐하고, 가열 멸균한 후, 배지 A(40 mL)에 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 균주(FERM BP-10463)를 접종하여, 37℃에서 교반하면서 5시간 배양하였다. 얻어진 배양액을 원심 분리기로써 원심 분리(3000 G, 30분간)하여, 균체를 함유하는 침전물을 얻었다. 다음에, 균체를 0.8% NaCl 용액에 균체수가 10¹⁰ cfu/mL가 되도록 부유하여, 균체 조성물을 얻었다.

<<실시예 2·ACF 형성의 억제 효과>>

마우스 DMH(디메틸히드라진; Aldrich제) 유발 이상선와소(ACF)의 형성을 억제 능력에 대해서, 본 발명의 균체 조성물을 이용하여 평가를 행하였다. 또한, 부티르산균으로서 이미 시판되고 있는 클로스트리디움·부티리쿰에 대해서도 동일하게 시험을 행하여, 그 억제 효과를 비교하였다.

공시 동물로서, 생후 4주된 수컷 Jcl: CR 마우스(일본 구레아)를 이용하여, 시험은 1 구 10 마리로, 하기의 표와 같이 시험구를 설정하였다.

실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 균체 조성물을 위존데(胃 sonde)를 이용하여 마우스에게 강제 경구 투여하였다. 대조구에는 0.8% NaCl 용액을, 투여구에는 균체 조성물을 각각 0.1 mL(10⁹ cfu)씩 투여하였다. 균체 조성물 및 디메틸히드라진(DMH; Aldrich제)의 투여 스케줄은 도 1과 같이 하였다.

시험 개시로부터 31일 후에 대장관 점막의 전암 병변인 이상 음와병소(ACF: Aberrant Crypt Foci)를 측정하였다. 마우스를 안락사시킨 후, 마우스 장관의 맹장 아래부터 항문까지를 취출하고, 중앙을 절개하여 개방하여 10% 포르말린(준세이카가쿠샤제)으로 고정하였다. 그 후, 메틸렌블루(칸토카가쿠샤제)로 염색하고, 광학현미경을 이용하여 ACF를 세었다.

시험구

군	동물수	DMH 투여	균체투여
DMH 및 균체 비투여	10	0.8% NaCl	0.8% NaCl
DMH 투여, 균체 비투여	10	DMH 50㎎/㎏ 체중	0.8% NaCl
DMH 및 B. 피브리솔벤스 투여	10	DMH 50㎎/㎏ 체중	10⁹ cfu 3회/주
DMH 및 C. 부티리쿰 투여	10	DMH 50㎎/㎏ 체중	10⁹ cfu 3회/주

체중 변화 및 장기의 상태

DMH 투여에 의해 체중 증가량이 감소하지만, 본 발명의 균체 조성물을 경구 투여함으로써 개선되었다(표 5). C. butyricum의 경구 투여에는 그와 같은 효과가 보이지 않았다. 시험 종료시의 간장 질량에 유의차는 보이지 않았지만(표 6), 체중 당 간장의 질량은 DMH 투여에 의해 감소하고, 본 발명의 균체 조성물에 의해 DMH 비투여구와 동정도까지 개선되었다. 비장의 질량은 DMH 투여에 의해 증가하고, 본 발명의 균체 조성물에 의해 어느 정도 개선되었다. 이들에 대해서도 C. butyricum에는 효과가 보이지 않았다.

체중의 추이

군	마우스 체중 (g)
군	3일	10일	17일	24일	31일
DMH 및 균체 비투여	27.8±0.2	28.9±0.3	35.9±0.5	38.4±0.5	40.5±0.7^a
DMH 투여, 균체 비투여	27.8±0.3	27.7±0.5	32.8±0.9	35.4±0.7	34.6±1.0^b
DMH 및 B. 피브리솔벤스 투여	27.7±0.4	30.1±0.7	33.2±0.7	36.1±0.8	37.9±0.7^c
DMH 및 C. 부티리쿰 투여	27.8±0.2	28.8±0.2	31.5±1.0	35.4±0.6	34.9±0.7^b

^a-c 다른 부호간에는 유의차가 있는 것을 나타낸다 (P<0.05)

장기 중량

군	장기 중량 (g)
	간장 (체중비%)	비장 (체중비%)
DMH 및 균체 비투여	2.23±0.10 (5.5±0.3)^a	0.105±0.004 (0.260±0.007)^a
DMH 투여, 균체 비투여	2.48±0.09 (7.2±0.2)^b	0.496±0.014 (1.441±0.053)^b
DMH 및 B. 피브리솔벤스 투여	2.26±0.08 (5.8±0.1)^a	0.301±0.030 (0.771±0.069)^c
DMH 및 C. 부티리쿰 투여	2.47±0.11 (7.1±0.4)^b	0.514±0.024 (1.481±0.086)^b

^a-c 다른 부호간에는 유의차가 있는 것을 나타낸다 (P<0.05)

장관의 상태 및 ACF

결장부터 직장까지의 길이는 DMH 투여에 의해 짧아지며, 본 발명의 균체 조성물에 의해 어느 정도 개선되었다. 또한, 맹장의 질량 및 결장 직장의 질량은 DMH 투여에 의해 감소하고, 본 발명의 균체 조성물에 의해 어느 정도 개선되었다. 맹장내용물 및 결장 내용물의 pH에는 차이가 보이지 않았다. 또한, 본 발명의 균체 조성물을 경구 투여함으로써, ACF의 형성수가 약 반으로 억제되었다. 이것에 대해서도 C. butyricum에는 효과가 보이지 않았다.

결장 직장의 길이, 맹장 직장 중량 및 맹장 결장 내용물의 pH

군	결장직장의 길이 (㎝)	장기중량 (g)		pH
군	결장직장의 길이 (㎝)	맹장	결장직장	맹장 내용물	결장직장 내용물
DMH 및 균체 비투여	10.9±0.3^a	0.207±0.012^a	0.426±0.017^a	6.5±0.0	6.7±0.0
DMH 투여, 균체 비투여	8.4±0.2^b	0.111±0.012^b	0.264±0.015^b	6.5±0.0	6.7±0.0
DMH 및 B. 피브리솔벤스 투여	9.3±0.4^c	0.163±0.018^c	0.336±0.024^c	6.5±0.0	6.7±0.0
DMH 및 C. 부티리쿰 투여	8.5±0.3^b	0.115±0.007^b	0.258±0.012^b	6.5±0.0	6.7±0.0

^a-c 다른 부호간에는 유의차가 있는 것을 나타낸다 (P<0.05)

ACF의 형성수

군	ACF의 형성수
DMH 및 균체 비투여	0 ± 0.0^a
DMH 투여, 균체 비투여	14.7 ±1.2^b
DMH 및 B. 피브리솔벤스 투여	7.4 ± 0.8^c
DMH 및 C. 부티리쿰 투여	15.7 ± 1.2^b

^a-c 다른 부호간에는 유의차가 있는 것을 나타낸다 (P<0.05)

<<실시예 3·면역 부활 효과>>

체내에 침입한 병원균이나 바이러스 등의 이물에 대하여, 우선 최초에 공격을 행하게 하는 것으로 되어 있는 NK 세포를 측정함으로써, 어느 정도 숙주의 면역력이 부활화되어 있는지를 검토하였다.

공시 동물로서 생후 8주된 수컷 Jcl:ICR 마우스(일본 구레아)를 이용하여, 시험은 1 구 3 마리로 행하였다.

실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 균체 조성물을 위존데를 이용하여 마우스에게 강제 경구 투여하였다. 대조구에는 0.8% NaCl 용액을, 투여구에는 균체 조성물을 각각 0.1 mL(10⁹ cfu)씩 투여하였다. 투여는 3일간 연속으로 행하고, 최초의 투여로부터 일주일간 후에, 마우스를 도살하였다.

경추 탈구에 의해 도살된 마우스로부터 비장을 적출하여, 비세포를 취출하였다. 적혈구를 용해한 후에, 세포를 2회 세정하여 10⁷ cells/mL가 되도록 PBBS(완충액; 표 참조)에 현탁하였다. 조제한 비장 림프구 현탁액 100 μL에 각각 후술하는 항체를 10 μL 첨가하여, 빙상에서 30분간 방치하였다. 그 후, PBBS로 2회 세정하고, 측정에 이용하였다. 세포 측정에는 FACSCalibur(BectonDickinson)을 이용하였다. 세포의 표식에는 FITC 표식항 CD3 항체(BECKMAN COULTER사제), PE 표식항 CD19 항체(BECKMAN COULTER사제) 및 PE 표식항 NK1.1 항체(BECKMAN COULTER사제)를 이용하였다.

균체 조성물의 경구 투여에 의해, 림프구 중 T 세포와 B 세포의 비율이 감소하고, NK 세포와 NKT(내추럴 킬러 T) 세포의 비율이 증가하였다(표 10). 세포수로 환산한 경우에는 T 세포와 B 세포의 수에는 균체 조성물의 경구 투여에 의한 영향은 보이지 않았다(표 11). 그러나, NK 세포수는 3.5배로, NKT 세포수는 3.8배로 증가하였다. 그 때문에, 마우스로의 균체 조성물의 경구 투여는 면역 작용을 앙진시킨다.

PBBS(인산염 완충 식염수)(0.1% BSA 첨가)

NaCl	7.20 g
KCl	0.32 g
Na₂HPO₄	1.15 g
KH₂PO₄	0.20 g
CaCl₂	0.14 g
MgCl₂·6H₂O	0.20 g
MgSO₄·7H₂O	0.20 g
글루코오스	1.00 g
BSA	1.00 g
H₂O	1 ℓ가 되는 양

BSA(와코준야쿠샤제) 이외는 칸토카가쿠샤제

림프구의 존재 비율

군	T 세포(%)	B 세포(%)	NK 세포(%)	NKT 세포(%)	그외(%)
대조구	17.2	53.4	4.6	0.8	24.1
시험구	16.5	42.3	14.4	2.5	24.4

림프구 수

군	T 세포	B 세포	NK 세포	NKT 세포	그외
대조구	8.9×10⁶	2.8×10⁷	2.4×10⁶	3.9×10⁵	8.0×10⁷
시험구	9.5×10⁶	2.5×10⁷	8.4×10⁶	1.5×10⁶	7.1×10⁷

<<실시예 4·병원균 감염 예방 효과>>

캄필로박터(Campylobacter)는 식중독 원인균이며, 분이나 오염된 음식물로부터 경구적으로 섭취되어 장관에 정착한다. 여기서, 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주에 감염 예방 효과가 있는지 여부를 검토하였다.

공시 동물로서 생후 5주된 수컷 Jcl: ICR 마우스(일본 구레아)를 이용하고, 시험은 1구 10마리로 행하였다.

실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 균체 조성물을 위존데를 이용하여 마우스에게 강제 경구 투여하였다. 대조구에는 0.8% NaCl 용액을, 투여구에는 균체 조성물을 각각 0.2 mL(10⁹ CFU/mL)씩 투여하였다. 투여는 감염 4일전부터 3일간 연속하고, 그 2일 후에 캄필로박터·콜리(Campylobactercoli) 11580-3 주(닭 유래)를 0.2 mL(10⁷ CFU/mL)씩 경구 접종하였다. 감염 다음날부터 4일간 연속, 감염 전과 동일하게 균체 조성물을 투여하였다. 감염 후 5일째에 도살, 해부하여, 맹장변을 채취하였다. 이것을 0.8% NaCl로써 10배 계열로 희석하고, 캄필로박터 10% 양(sheep) 혈액 한천 배지(니혼 벡톤·디킨슨)에 도포하였다. 혐기 배양기로 42℃에서 48시간 배양한 후에 생균수(콜로니)를 측정하여, 맹장변 1 g 당 캄필로박터 수(log CFU/g)를 산출하였다.

대조구 및 균체 조성물구 모두 사망예는 확인되지 않았다.

표 12에 나타낸 바와 같이, 맹장변 중 캄필로박터 수는 대조구에서 평균 8.27 logCFU/g(7.88∼8.82 logCFU/g), 균체 조성물구는 평균 6.96 logCFU/g(4.79∼8.69 logCFU/g)였다. 대조구에 비하여, 균체 조성물구 쪽이 1.31 logCFU/g 유의적으로 감소하였다.

이상의 결과로부터 균체 조성물을 투여하면, 캄필로박터의 감염이 경감하였다. 즉, 본 균체 조성물 섭취를 계속함으로써, 감염을 예방 또는 경감할 수 있다는 것이 명백해졌다.

캄필로박터에 대한 감염 예방 효과

맹장 중의 C. 콜리 수 (log CFU/g)
	평균±S.D.
대조구	8.27±0.30
균체조성물구	6.96±1.47*

* 유의차 있음: P<0.05

<<실시예 5·염증성 장 질환 예방 효과>>

궤양성 대장염 및 크론병 등의 염증성 장 질환(IBD)은 치료가 어려운 질병이다. 그래서 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주에도 동일한 효과가 있는지 여부를 검토하였다.

공시 동물로서 생후 4주된 수컷 Jcl:ICR 마우스(일본 구레아)를 이용하여, 시험은 1구 6 마리로 행하였다.

실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 균체 조성물을 위존데를 이용하여 마우스에게 강제 경구 투여하였다. 대조구에는 0.8% NaCl 용액을, 투여구에는 균체 조성물을 각각 0.1 mL(10⁹ cfu)씩 투여하였다. 투여는 3일간 연속하여 행하였다.

IBD를 유발하기 위해, 덱스트란황산나트륨(DSS; MP Biomedicals제)을 3%(w/v)가 되도록 식수에 용해하여, 마우스에게 자유 섭취시켰다. DSS는 균체 조성물의 3일간 연속 투여 다음날부터 7일간 투여하였다. 8일째에 도살, 해부하여, 장관의 길이 및 질량을 측정하였다.

질병 활성 지수(Disease Activity Index; DAI)의 산출은 이하와 같이 실시하였다. 즉, 체중의 감소, 분의 형상(설사변의 정도) 및 잠혈의 각각을 0에서 4까지의 5 단계로 평가하였다. 이 경우, 증상이 무거운 것일수록 높은 수치로 평가하였다. 이들 3가지 측정 항목의 합계수를 3으로 나눈 값을 DAI로 하였다.

미에로퍼옥시다아제(myeloperoxidase; MP0) 활성의 측정법은 이하와 같이 실시하였다. 즉, 대장 말단의 6 cm 부위를 5 ㎖/L(v/v)의 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물(HTAB; 계면활성제)(와코준야쿠고교샤제)을 함유하는 20 mmol/L 인산 완충액(pH＝6.0)으로 현탁하여, 초음파 파쇄하였다. 원심 후(15,000 rpm, 15분)의 상청 0.1 mL를, 20 mM 구아야콜(SIGMA제)(guaiacol)과 5 ㎖/L 과산화수소(칸토카가쿠샤제)를 함유하는 20 mM 인산 완충액(pH＝6.0) 2.9 mL 혼합하고, 파장 460 nm에서의 흡광도 변화를 측정하여 MP0 활성으로 하였다.

표 6에 나타낸 바와 같이, DSS 투여에 의해 체중은 감소하였지만, 균체 조성물을 경구 투여하고 있었던 마우스에서는 감소의 정도가 경감하였다.

DSS 및 B. 피브리솔벤스 투여에 의한 마우스의 체중변화

DSS 투여	B. 피브리-솔벤스 투여	마우스 체중 (g)(n=6)
		DSS 투여 일수
		투여 전	1	2	3	4	5	6	7
-	-	28.1^a	29.4^a	29.7^a	30.0^a	31.3^b	31.8^a	32.5^a	33.7^a
+	-	28.1^a	29.0^a	29.3^a	29.5^a	29.7^b	29.5^c	28.2^c	26.5^c
+	+	28.0^a	29.0^a	29.4^a	29.8^a	29.9^b	30.2^b	29.9^b	30.2^b

^a-c 다른 부호간에는 유의차가 있는 것을 나타낸다 (P<0.05, n = 6).

DSS를 투여함으로써 비장의 증대, 간장의 축소 및 대장의 단축이 관찰되었지만, 균체 조성물을 투여함으로써 이들 변화의 정도가 경감하였다(표 14).

DSS 및 B. 피브리솔벤스 투여 마우스에 있어서의 비장과 간장의 중량 및 장관 길이

DSS 투여	B. 피브리솔벤스 투여	장기 중량 (g)		장관 길이 (결장~직장) (㎝)
DSS 투여	B. 피브리솔벤스 투여	비장	간장	장관 길이 (결장~직장) (㎝)
-	-	0.11^a	2.35^a	11.2^a
+	-	0.24^c	1.56^c	7.2^c
+	+	0.17^b	1.99^b	8.9^b

체중의 감소, 분의 형상 및 잠혈의 각각을 수치화한 DAI 값으로부터도 균체 조성물 투여에 의해 병상이 경감되는 것으로 생각되었다(도 2). 또한, 균체 조성물을 투여한 마우스에 있어서 장관 조직의 MPO 활성은 DSS만을 투여한 마우스의 약 40%로 저하하였다(표 15). 이 결과로부터, 균체 조성물을 투여한 마우스의 장관 조직에서는 호중구가 적고, 염증의 정도가 낮은 것으로 생각된다.

DSS 및 B. 피브리솔벤스 투여 마우스의 장관에 있어서의 MPO 활성

DSS 투여	B. 피브리솔벤스 투여	MPO 활성비
-	-	20^c
+	-	100^a
+	+	43^b

이상의 결과로부터 균체 조성물의 경구 투여는 IBD의 증상을 경감한다. 즉, 본 균체 조성물을 섭취를 계속함으로써, 염증성 장염을 예방할 수 있는 것이 명백해졌다.

<<실시예 6·항알레르기 작용>>

마우스에의 부티리비브리오·피브리솔벤스의 경구 투여에 의해, 비장에 있어서의 NK(내츄럴 킬러) 세포수가 증가하였다. NK 세포는 사이토카인 IFN-γ을 생성한다. IFN-γ는 헬퍼 T 세포의 Th1/Th2 밸런스를 Th1 우위로 하는 능력을 갖는다． Th1/Th2 밸런스는 알레르기에 영향을 미치는 지표이다. 그래서, 부티리비브리오·피브리솔벤스가 알레르기성 질환에도 효과가 있는지 여부를 사이토카인을 측정함으로써 검토하였다.

부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주를 20 ㎖의 합성 배지로 대수 증식 기 중기까지 배양하였다. 균체를 PBS(완충액)로 한번 세정한 후에 원침에 의해 회수하고, 균체수가 2×10⁷ cfu/㎖가 되도록 10% 소혈청(JRH Bioscience사제)을 함유하는 RPMI-1640 배지(코진바이오사제)로 현탁하였다.

마우스로부터 비장을 적출하여, 비세포를 취출하였다. 적혈구를 용해한 후에, 세포를 2회 세정하여 4×10⁷ cells/㎖가 되도록 10% 소혈청(JRH Bioscience사제)을 포함하는 RPMI-1640 배지(코진바이오사제)에 현탁하였다. 비세포 현탁액 0.5 ㎖를 샬레에 첨가하고, 또한, 균액 혹은 배지 0.5 ㎖를 첨가하여, 5% CO₂ 배양기 안에서 72시간 배양하였다.

사이토카인의 정량은 이하와 같이 실시하였다. 즉, 세포 배양액을 원침하고, 그 상청을 샘플로 하여, IFN-γ와 IL-4의 정량은 ELISA 키트(Amersham Biosciences)를 이용하여 첨부 설명서에 따라 측정하였다.

그 결과, 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주를 첨가함으로써, IFN-γ의 생산량이 증가하였다. 한편, Th1/Th2 밸런스를 Th2 우위로 하는 능력을 갖는 IL-4의 생산량은 저하하였다(표 16). 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주의 존재에 의해, Th1/Th2 밸런스는 Th1측으로 기울어진다고 생각된다. 따라서, 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주의 경구 투여는 알레르기성 질환에도 효과가 있다.

마우스 비장 세포에 있어서의 사이토카인 IFN-γ 및 IL-4의 상대량

B. 피브리솔벤스 (cfu)	상대량 (%)
B. 피브리솔벤스 (cfu)	IFN-γ	IL-4
0	100	100
1×10⁷	596	15

<<실시예 7·육종 형성에 미치는 영향>>

대장 이외의 부위에 형성되는 암에 대한 억제 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해, 3-메틸콜란트렌(3-MC)의 피하 투여에 의해 유발한 마우스의 섬유 육종 형성에 대한 영향을 조사하였다.

시험은 3-MC 비투여/균체 조성물 비투여구(10 마리), 3-MC 투여/균체 조성물 비투여구(13 마리) 및 3-MC 투여/균체 조성물 투여구(11 마리)의 3구에서 행하였다. 실시예 1에 기재한 방법으로 얻은 균체 조성물을 각각 0.1 mL(10⁹ cfu)씩, 생후 4주 된 Jcl: ICR 마우스(일본 구레아)에 주 3회의 빈도로 강제 경구 투여하였다. 최초의 투여로부터 일주일 후에 20 mg의 3-MC(시그마 제품)를 2.0 mL의 올리브 오일에 용해하고, 마우스의 우측 옆구리에 0.1 mL(3-MC, 1 mg)를 피하 투여하였다. 대조구에는 동량의 올리브 오일을 투여하였다. 피하 투여 일주일 후에 1번 촉진(觸診)하고, 직경 3 mm 이상의 응어리를 종양으로 하였다. 촉진은 15주간 행하였다. 또한, 각 구 3 마리씩을 투여 5주간 후에 도살하여, 림프구 조성(NK 세포)을 측정하였다.

도살한 마우스의 비장을 적출하고, 0.1% BSA를 첨가한 PBS(BSA/PBS)에 비세포를 현탁하여, 원침 세정을 행하였다. 저장액(14 mmol/L NH₄Cl, 17 mmol/L Tris, pH 7.6)을 이용하여 적혈구를 제거한 후, BSA/PBS로 2회 세정하였다. 이 세포 현탁액에 T 세포의 형광 표지 항체[FITC 표식항 CD3 항체, PE 표식항 CD19 항체, PE 표식항 NK1.1 항체, FITC 표식항 CD4 항체, PE 표식항 CD8 항체(플로리다주 하이얼리 소재의 Beckman Coulter)]를 덧붙여 표식하였다. 표식된 림프구의 수는 유동세포 분석기(FACSCalibur, Becton Dickinson사 제품)를 이용하여 측정하였다.

3-MC 유발 섬유 육종 형성에 대한 영향

도 3에 도시한 바와 같이, 올리브 오일을 피하 투여한 마우스에서는 종양의 형성은 볼 수 없었다. 3-MC만을 투여한 시험구에서는 3-MC 투여 후 5주째부터 종양이 나타나기 시작하고, 이 시점에서의 종양 형성률은 20%였다. 그 후에도 형성률은 계속해서 증가하고, 3-MC 투여 후 9주째에 모든 마우스에 종양이 형성되었다. 한편, 균체 조성물 투여구에서는 5주째에는 0%, 9주째에는 50%의 종양 형성률이었다. 그리고, 15주 후 조차도 형성률은 75%였다. 이 결과로부터, 균체 조성물의 경구 투여는 3-MC로 유발한 마우스의 종양 형성을 지연·억제하는 효과가 확인되었다. 또한, 3-MC 처리 및 균체 조성물의 투여는 마우스의 체중 증가에는 영향을 부여하지 않았다(도 4).

비장 림프구 조성에 대한 영향

균체 조성물에 의한 종양 형성의 지연·억제 효과에 NK 세포가 관여하고 있는지 여부를 조사하기 위해, 비장 중의 림프구 조성을 측정하였다. 균체 조성물의 영향이 크게 생기기 위해서는 어느 정도의 시간이 필요하다고 생각되었기 때문에, 종양이 형성되기 시작하기 직전, 즉 3-MC 투여 4주간 후에 림프구의 측정을 행하였다. 4주간 후의 체중, 간장, 비장의 중량 및 음식물 섭취량에서 시험구 사이의 유의차는 보이지 않았다(표 17). 그러나, NK 세포와 NKT 세포의 비율은 균체 조성물의 투여에 의해 유의적으로 증가하였다(표 18).

체중, 간장, 비장의 중량 및 음식물 섭취량

3-MC	균체 조성물	중량 (g)			음식물 섭취량 (g/마우스/일)
3-MC	균체 조성물	체중	간장	비장	음식물 섭취량 (g/마우스/일)
비투여	비투여	35.1±0.79	2.2±0.1	0.101±0.009	3.3
투여	비투여	36.5±0.67	2.2±0.1	0.109±0.036	3.1
투여	투여	35.4±0.96	2.2±0.1	0.098±0.025	3.3

3-MC 및 균체 조성물의 투여가 비장 림프구 조성에 주는 영향

3-MC	균체 조성물	비장 림프구의 비율(%)
3-MC	균체 조성물	T 세포	CD4	CD8	B 세포	NK 세포	NKT 세포
비투여	비투여	41.6±5.1	33.0±5.3	7.9±0.5	51.0±4.5	3.1±0.8	0.03±0.02
투여	비투여	40.2±5.8	25.7±2.9	7.3±0.6	51.5±4.1	5.0±0.4	0.33±0.21
투여	투여	39.8±5.3	26.9±3.1	7.9±1.3	50.9±3.2	8.0±0.7	0.66±0.14

발암 초기에는 NK 세포가 중요한 역할을 갖는다고 생각되고 있으며, NK 세포의 세포 상해 활성이 증가함으로써, 발암을 억제할 가능성이 보고되어 있다. 또한, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 본 균체 조성물을 경구 투여함으로써, 비장 중의 Th1/Th2 밸런스가 Th1측으로 기우는 것이 확인되어 있다. Th1 사이토카인인 IFN-α는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 것이 알려져 있기 때문에, 그 결과로서, NK 세포가 증가하여 암의 형성이 지연·억제된다고 생각된다.

이상의 결과로부터, 본 균체 조성물을 경구 투여함으로써, 대장 이외의 부위에 있어서의 암도 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

본 발명을 상세하게, 또한, 특정한 실시형태를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 개념을 벗어나지 않는 한, 여러 가지 변경이나 변형을 덧붙일 수 있는 것은 당업자에게 있어서 명백하다.

본 출원은 2004년 12월 28일 출원된 일본 특허 출원(특허 출원 2004-379693)에 기초하는 것이며, 그 내용은 여기에 참조로서 받아들여진다.

본 발명은 항암 작용, 면역 부활 효과, 염증성 장 질환 예방·치료 효과, 병원균 감염 예방 효과 및 알레르기성 질환 예방·치료 효과 등을 갖는 균체 조성물을 제공한다.

Claims

독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁 번호 FERM BP-10463으로서 기탁된 부티리비브리오·피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens) MDT-1 주.
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적어도 1 종류의 부티리비브리오·피브리솔벤스의 균체, 그 배양물 또는 추출물을 함유하는 균체 조성물로서, 상기 부티리비브리오·피브리솔벤스가 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁 번호 FERM BP-10463으로서 기탁된 부티리비브리오·피브리솔벤스 MDT-1 주인 균체 조성물.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약품.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 사료 첨가물.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 발암을 억제하는 치료제.
제5항에 기재한 균체 조성물을 인간을 제외한 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 발암을 억제하는 방법.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 면역 부활화제.
제5항에 기재한 균체 조성물을 인간을 제외한 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는 면역 부활화 방법.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 병원균의 감염 예방제, 치료제, 또는 예방 및 치료제.
제5항에 기재한 균체 조성물을 인간을 제외한 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 병원균의 감염을 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 염증성 장 질환에 대한 예방제, 치료제, 또는 예방 및 치료제.
제5항에 기재한 균체 조성물을 인간을 제외한 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 예방, 치료, 또는 예방 및 치료하는 방법.
제5항에 기재한 균체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 알레르기성 질환에 대한 예방제, 치료제, 또는 예방 및 치료제.
제5항에 기재한 균체 조성물을 인간을 제외한 척추 동물에게 유효량 투여하는 것을 포함하는, 알레르기성 질환에 대한 예방, 치료, 또는 예방 및 치료방법.