KR101093787B1

KR101093787B1 - 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101093787B1
Application number: KR1020110056387A
Authority: KR
Inventors: 서혜란; 남상규; 이종선
Original assignee: (주)비씨월드제약
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2011-12-19

Abstract

본 발명은 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 생체 이용률이 우수하고, 약물의 반감기를 증가시켜 기존 약물의 단점인 짧은 반감기로 인한 고용량 투여로부터 생기는 내성을 줄일 수 있다. 이에 더하여, 경구 투여가 가능하여 복용이 편리한 장점이 있을 뿐만 아니라, 특히 체내에서 젬시타빈으로 전환되므로 항암제로서 유용하다.

Description

신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer comprising new derivatives of nucleosides}

본 발명은 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

젬시타빈 히드로클로라이드(gemcitabine HCl)는 췌장암, 유방암, 비소세포폐암(NSCLC)의 치료에 대해 승인되어 사용되고 있는 항암제로, 1000 내지 1250 mg/m²의 투여량을 30분에 걸쳐 정맥 내 주입을 하는데, 3주 동안 1주일에 1회 반복 투여 되고, 그 다음 1주는 쉬어야 하고, 본 4주 주기로 반복될 수 있다.

하기 화학식을 갖는 젬시타빈은 친수성 물질로 생체막 투과성이 제한되어 경구투여의 어려움이 있으며[Shipley LA. et. al., "Metabolism and disposition of gemcitabine, and oncolytic deoxycytidine analog, in mice, rats, and dogs". Drug Metabolism & Disposition. 20(6):849-55, 1992 참조], 위장관 독성을 일으키기 때문에 경구투여가 제한이 된다[Horton ND et. al., "Toxicity of single-dose oral gemcitabine in mice", American Association for Cancer Research, Poster Presentation, Orlando, FL, March 27-31, 2004 참조]. 한편, 마우스 연구에서 정맥 내 투여한 경우에는 치사나 위장관 독성이 나타나지 않았다.

따라서 경구 투여가 가능하고, 허용 가능한 안전성과 효능으로 젬시타빈을 병소 영역으로 전달할 수 있는 젬시타빈 전구약물의 개발이 지속적으로 요구되어 왔다.

아지드 유도체의 약물은 생체 내에서 아미노기로 전환이 되는 것으로 알려져 있으며[미국특허 제 6,271,212호 참조], 또한 아지드 유도체는 친유성의 물질이기에 생체막 투과가 모 약물보다 잘된다고 보고되고 있다[Chu CK et. al., "Synthesis, biotransformation, and pharmacokinetic studies of 9-(β-D-arabinofuranosyl)-6-azidopurine : a prodrug for Ara-A designed to Utilize the azide reduction pathway". the Journal of Medicinal Chemistry. 39(6) 5202-5207, 1996 참조].

이에 본 발명자들은 신규한 뉴클레오시드 유도체를 통해 상기 생체막 투과성의 제한 및 위장관 독성으로 젬시타빈의 경구투여가 어려웠던 문제를 해결하고자, 젬시타빈과 달리 4번 위치에 아지드기가 도입된 하기 화학식(1)로 표시되는 화합물 및 그의 유도체인 하기 화학식(2)로 표시되는 아지드-젬시타빈을 제조함으로써, 경구투여가 가능하고 허용 가능한 안정성 및 효능으로 젬시타빈을 병소 영역으로 전달할 수 있는 젬시타빈 전구 약물을 개발하기 위해 노력한 결과, 하기 화학식(1)로 표시되는 화합물 및 그의 유도체인 상기 화학식(2)로 표시되는 신규한 뉴클레오티드 유도체를 발견하게 되었다.

[화학식1]

[화학식2]

본 발명자들은 생체막 투과성의 제한 및 위장관 독성으로 젬시타빈의 경구투여가 어려웠던 문제를 해결하기 위하여, 경구 투여가 가능하고 허용 가능한 안정성과 효능으로 젬시타빈을 병소 영역으로 전달할 수 있는 젬시타빈 전구 약물을 개발하고자 노력한 결과, 젬시타빈과 달리 4번 위치에 아지드기가 도입된, 상기 화학식(1)로 표시되는 화합물 및 그의 유도체인 상기 화학식(2)로 표시되는 신규의 젬시타빈 전구 약물을 발견하게 되었다.

이에 더하여, 본 발명자들은 상기 본 발명의 화합물이 경구투여가 가능하고 생체 내에서 젬시타빈으로 전환되어 항암효과를 나타내는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 생체막 투과성이 향상되고, 위장관 독성문제가 없는, 젬시타빈 전구약물인 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기 화학식(2)로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 약제학적 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식2]

상기 화학식(2)에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 아실, 치환된 아실, 아실옥시알킬카르보닐, 치환된 아실옥시알킬카르보닐, 옥시카르보닐, 치환된 옥시카르보닐, 또는 기능기

이며, 상기 기능기 중, n은 1, 2, 또는 3이고; R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아실, 치환된 아실, 아실옥시알킬카르보닐, 치환된 아실옥시알킬카르보닐, 옥시카르보닐, 또는 치환된 옥시카르보닐기이며; R₅는 수소, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 암 치료용 약학적 조성물은 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함할 수 있는데, 본 발명에서 사용되는 용어 "뉴클레오시드 유도체"는 뉴클레오시드의 일부 기능기가 치환된 것을 의미하며, 이에 의해 한정되는 것은 아니지만, 하기 화학식(1)로 표시되는 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온과 화학식(2)로 표시되는 그의 유도체를 예시로 들 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학적 조성물에 포함되는 뉴클레오시드 유도체는 하기 화학식(1)의 뉴클레오시드를 포함한다.

[화학식1]

또한, 본 발명의 암 치료용 약학적 조성물에 포함되는 화학식(2)로 표시되는 화합물은, 하기 화합물들로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(4-Azido-1-((2R,4R,5R)-3,3difluoro-tetrahydro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)pyrimidine-2(1H)one);

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(L-이소류시닐옥시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(4-Azido-1((2R,4R,5R)-3,3-difluoro-tetrahydro-4-hydroxy-5-(L-isolucinyloxymethyl)furan2-yl)pyrimidine-2(1H)-one);

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(L-발리닐옥시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(4-Azido-1-((2R,4R,5R)3,3-difluoro-tetrahydro-4-hydroxy-5-(L-valinyloxymethyl)furan-2yl)pyrimidine-2(1H)-one);

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(L-페닐알라닌일옥시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(4-Azido-1((2R,4R,5R)-3,3-difluoro-tetrahydro-4-hydroxy-5-(Lphenylalaninyloxymethyl)furan-2-yl)pyrimidine-2(1H)-one); 및

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(엘라이도일)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(4-Azido-1-((2R,4R,5R)-3,3difluoro-tetrahydro-4-hydroxy-5-(elaidoyl)furan-2-yl)pyrimidine-2(1H)-one).

상기 화합물은 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.

[반응식1]

상기 반응식(1)에서 화학식(1)로 표시되는 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온은 젬시타빈 염산염(gemcitabine HCl)을 출발물질로 사용하여, 4번 위치에 있는 N4- 아미노기를 아지드기로 전환함으로써 제조되어진다. 또한 화학식(2)로 표시되는 유도체는 화학식(1)을 출발물질로 하여 제조되어진다.

반응식(1)에서, 화학식(1)을 제조함에 있어 젬시타빈 염산염의 4번 위치의 아미노기를 탈아미노화시켜 아지드기를 도입하기 위해서는 아래 반응식(2) 및 반응식(3)에 기술되어 있는 바와 같이 여러 방법이 존재한다.

[반응식2]

상기 반응식(2)에서 R은 Na 혹은 t-Bu0기이고, X는 활로겐 원자 또는 음이온이며, M은 Na, K 금속을 나타낸다. 상기 반응식(2)에서 화학식(1)을 제조하기 위해서는 젬시타빈 염산염을 출발물질로 하여 중간체(1) 및 중간체(2)를 경유하는 2가지 방법이 있으나 상기의 제조방법은 당업자에게 있어서 공지된 보편적인 방법이다.

또한, 하기 화학식(10)으로 표시되는 화합물에 NaOMe 또는 수소 이온을 가하여 화학식(2)로 표시되는 화합물을 제조할 수 있다.

[화학식10]

상기 식에서,

R'은 페닐 또는 메틸이다.

또한, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 화학식(10)으로 표시되는 화합물은, 하기 화학식(9)로 표시되는 화합물에 LiN₃를 가하여 제조할 수 있다.

[화학식9]

상기 화학식(10)을 제조하기 위해서는 아지드 리튬 또는 아지드 나트륨과 같은 아지드를 제공하는 물질과 함께 N,N-디메틸포름아미드와 같은 미반응성 극성 용매에서 60℃ 온도 조건에서 반응을 하면, 보호화된 아지드 유도체를 얻을 수 있다.

또한, 상기 화학식(9)로 표시되는 화합물은, 하기 화학식(8)로 표시되는 화합물에 트리아졸을 가하여 제조할 수 있다.

[화학식8]

상기 화학식(9)를 제조하기 위해서는 4번 위치의 카르보닐기 대신 1,2,4-트리아졸, 3-니트로-1,2,4-트리아졸, 1H-테트라졸과 같은 적절한 이탈기를 도입한다. 반응 중 생성된 상기 화학식(9)는 수분에 불안정하므로 분리하기가 어렵다. 그래서 되도록 빠르게 다음 반응을 진행하는 것이 좋다.

또한, 상기 화학식(8)로 표시되는 화합물은, 하기 화학식(7)로 표시되는 화합물과 R'COCl을 반응시켜 제조할 수 있다.

[화학식7]

상기 화학식(8)을 제조하기 위해서는 차단(protecting)하기 위해 아실화 반응을 진행하는데 반응식에 제시된 벤조일기 또는 아세틸기외에, 전형적인 보호기 및 제조방법은 익히 공지되어있다.

또한, 상기 화학식(7)로 표시되는 화합물은, 하기 화학식(11)(젬시타빈염, Gemcitabine HCl)을 탈아미노화시킴으로써 제조할 수 있다.

[화학식11]

상기 화학식(7)을 제조하기 위한 탈아미노화는 95℃에서 pH 6.0 미만의 수용액 또는 상온에서 고농도의 산성 수용액 상에서 일어난다. 여기에 사용되는 산은 물 또는 용매에서 양성자를 내는 브뢴스테드 산으로 염산, 황산, 아세트산, 구연산을 그 예로 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 암 치료용 약학적 조성물에 포함되는 화학식(1)로 표시되는 화합물은, 하기의 반응식(3)에 나타난 바와 같이, 젬시타빈염을 출발물질로 하여 화학식(7), 화학식(8a, 8b), 화학식(9a, 9b), 화학식(10a, 10b)단계를 거치는 반응으로 제조할 수 있다.

[반응식3]

목적물인 화학식(1)은 각 보호기에 맞는 조건으로 탈보호화를 하면 상기 화학식(1)과 같은 화합물을 얻을 수 있다.

각 반응 확인은 박층크로마토그래피(TLC)와 적당한 용매계를 이용하여 확인으로 하고, TLC로 측정한 결과 반응이 종결되었을 때, 생성물은 유기 용매를 사용하여 추출한 후, 적당한 용매계를 사용하여 크로마토그래피법으로 정제시킬 수 있다.

상기 반응식(1)에서 나타난 바와 같이, 화학식(2)로 표시되는 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온의 유도체를 합성하기 위해서는, 화학식(1)을 출발물질로 하여 제조된다. 위와 같이 얻은 화합물의 유도체는 화학식(2)로 나타낼 수 있다.

[화학식2]

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 아실, 치환된 아실, 아실옥시알킬카르보닐, 치환된 아실옥시알킬카르보닐, 옥시카르보닐, 치환된 옥시카르보닐, 및

의 기능기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다. 상기 기능기에서, n은 1, 2, 또는 3이고; R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아실, 치환된 아실, 아실옥시알킬카르보닐, 치환된 아실옥시알킬카르보닐, 옥시카르보닐, 및 치환된 옥시카르보닐기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며; R₅는 수소, 알킬, 및 치환된 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다. 또한, 상기 치환된 알킬, 치환된 아실, 치환된 아실옥시알킬카르보닐, 및 치환된 옥시카르보닐은, C₁-C₂₂ 알킬, C₅-C₂₂ 사이클로알킬, C₆-C₂₂ 아릴로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

일반적으로 단일 치환된 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온의 아미노산 에스테르 유도체는 반응식(4)에 따라 합성할 수 있다.

[반응식 4]

보호화된 아미노산은 잘 알려진 커플링제를 이용하여, 5′위치에 에스테르화 한다. 에스테르화한 화합물은 탈보호화 반응을 통해 자유아미노기를 만들어 단일 치환된 유도체를 얻을 수 있다.

더욱 상세하게는 반응식(5)에 나와 있듯이 5′위치에 있는 특정 아미노산 반응을 예를 들 수 있어나 보호화할 수 있는 아미노산 기는 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

[반응식 5]

또한, 5′위치에 단일 치환된 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘2(1H)-온의 아실 유도체는 반응식(6)에 따라 합성할 수 있다.

[반응식6]

적당한 염화아실을 이용하여 에스테르화 반응을 하면 단일 치환된 유도체를 얻을 수 있다. 각 반응 확인은 박층크로마토그래피(TLC)와 적당한 용매계를 이용하여 확인으로 하고, TLC로 측정한 결과 반응이 종결되었을 때, 생성물은 유기 용매를 사용하여 추출한 후, 적당한 용매계를 사용하여 크로마토그래피법으로 정제시킬 수 있다.

본 발명은 화학식(2)로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 약제학적 유효량 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 췌장암, 유방암, 비소세포암, 난소암, 및 방광암 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 경구 투여가 가능하고, 생체 내에서 젬시타빈으로 전환되며, 위장관 전체의 pH범위에서 안정할 뿐만 아니라, 혈장 내에서도 기존의 젬시타빈에 비하여 안정도가 매우 높다.

본 발명의 화합물의 약제학적 투여 형태는 이들의 약제학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약제학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용 가능한 염이 바람직하며, 본 발명에 따른 화합물에 무기염기, 유기염기, 무기산, 유기산, 염기성, 또는 산성 아미노산을 첨가하는 것과 같은 현재 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 화합물은 국소 적용을 위해서 연고나 크림으로 제형화 할 수 있고, 일반적인 식염수, 5% 덱스트로스와 같은 수용성 용매, 또는 식물성 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 에스테르, 또는 프로필렌글리콜과 같은 비수용성 용매에 화합물을 용해시키거나, 현탁시키거나, 또는 유화시켜 주사제로 제형화할 수 있다. 본 발명의 제형은 용해제, 등장화제(isotonic agents), 현탁화제, 유화제, 안정화제, 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 “약제학적 유효량”은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 본 발명의 화합물을 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러 번 나누어 투여할 수 있다. 약학 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 신규한 뉴클레오시드 유도체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 생체 이용률이 우수하고, 약물의 반감기를 증가시켜 기존 약물의 단점인 짧은 반감기로 인한 고용량 투여로부터 생기는 내성을 줄이며, 경구 투여가 가능하여 복용의 편리성이 있을 것으로 기대된다. 특히 본 발명에 포함되는 화합물은 젬시타빈의 전구 약물로서, 체내에서 젬시타빈으로 전환되므로 항암제로서 유용하다.

도 1은 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(화학식(1))의 H¹ NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 2는 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온(화학식(1))의 질량분석(Mass)스펙트럼을 나타낸 것이며,
도 3은 염산젬시타빈과 화학식(1)로 표시되는 화합물의 혈장 안정도를 HPLC로 분석한 결과를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 참조예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 참조예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 참조예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[참조예]

참조예 1. 4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온의 제조 (화학식(1))

참조예 1-1. 1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리딘-2,4(1H,3H)디온의 제조 (화학식(7))

젬시타빈 히드로클로라이드(Gemcitabine HCl) (5g, 16.7mmol, 1.0당량)을 2N 아세트산 수용액(350ml)에 녹인 후, 아질산나트륨(16.7g, 14.5당량)을 천천히 가한 후, 실온에서 48시간 방치하였다. 2N 수산화나트륨 수용액으로 pH 6 ~ 7로 조절한 후 감압농축을 하였다. 감압농축 후 메탄올/초산에틸(1:5, 360ml)을 가하여, 녹지 않는 염을 제거하였다. 이런 과정을 여러 번 반복하여 염을 모두 제거하고 감압농축을 하여, 연한 갈색 투명 오일의 화학식(7)을(4.22g)을 95% 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 11.5(s, 1H), 7.79(d, J=8Hz, 1H), 6.39(br, OH), 6.05(t, J=7Hz, 1H), 5.73(d, J=8Hz, 1H), 5.35(m, 1H), 4.19(m, OH), 3.79(m, 3H)

참조예 1-2. 1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-아세톡시-5-(아세톡시메틸)퓨란-2-일)피리딘-2,4(1H,3H)디온의 제조 (화학식(8a))

화학식(7) (0.61g, 2.31mmol, 1당량)과 4-디메틸아미노피리딘(0.14g, 0.5당량), 4-메틸모르포린(1.78ml, 7당량)을 테트라하이드로퓨란(12ml)에 녹인 후 0℃로 냉각을 하였다. 그리고 벤조일 클로라이드(0.67ml, 2.5당량)를 천천히 가한 후, 5℃ 이하에서 8시간동안 교반을 하였다. 박층크로마토그래피로 화학식(7)의 잔류여부를 확인한 후, 감압농축을 하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액(10ml)과 브라인(7ml), 메틸렌 클로라이드(30ml)로 묽힌 후 유기층만 분리하였다. 분리된 유기층은 무수황산나트륨으로 수분을 제거한 후 감압농축을 하였다. 감압농축 후 컬럼크로마토그래피(초산에틸 : 헥산 =1:1)로 분리하면 하얀색의 고체인 화합물 화학식(8a)(0.79g)를 72%의 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 11.6(s, 1H), 8.06(d, J=7Hz, 2H), 7.96(d, J=7Hz, 2H), 7.74(t, J=7Hz, 2H), 7.63(m, 4H), 7.49(m, 2H), 6.37(m, 1H), 5.82(1H), 5.74(m, 1H), 4.80(m, 1H), 4.73(m, 1H)

참조예 1-3. 1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-아세톡시-5-(아세톡시메틸)퓨란-2-일)피리딘-2,4(1H,3H)디온의 제조 (화학식(8b))

화학식(7) (4.22g, 15.9mmol, 1당량)을 피리딘(63ml)에 녹인 후 0℃로 냉각을 하였다. 무수아세트산(4.50ml, 3당량)을 천천히 가한 후, 5℃ 이하에서 16시간동안 교반을 하였다. 박층크로마토그래피로 화합물(7)의 잔류여부를 확인한 후, 감압농축을 하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액(30ml)과 브라인(30ml), 초산에틸(60ml)로 묽힌 후 유기층만 분리하고 무수황산나트륨으로 수분을 제거하고 감압농축을 하여, 짙은 갈색의 오일인 화학식(8b) (4.51g)를 81%의 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ 11.5(s, 1H), 7.60(d, J=8Hz, 1H), 6.27(t, J=8Hz, 1H), 5.84(d, J=8Hz, 1H), 5.42(m, 1H), 4.37(m, 3H), 2.16(s, 3H), 2.06(s, 3H)

참조예 1-4. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 벤조일옥시 -5-( 벤조일옥시 ) 퓨란 -2-일)피리딘-2,4(1H,3H) 디온의 제조 (화학식(10a))

화합물(8a)(0.42g, 0.889mmol, 1당량)와 1,2,4-트리아졸(0.15g, 1.5당량)을 아세토니트릴(16ml)에 가한 후, 상온에서 서서히 교반을 하였다. 이 반응 혼합물에 트리에틸아민(1.24ml, 10당량)을 넣고 상온에서 15분가량 교반을 하였다. 그리고 온도를 5℃이하로 낮추고, 염화포스포릴(0.83ml, 10당량)을 15분간 천천히 가하였다. 그리고 온도를 서서히 상온으로 올리면서 교반을 하였다. 8시간 후 박층크로마토그래피로 새로운 물질이 형성되는 것을 확인하고 트리에틸아민과 염화포스포릴을 각각 10당량을 추가로 가하였다. 다시 8시간 후 박층크로마토그래피로 화학식(8a)의 잔류 여부에 따라 트리에틸아민과 염화포스포릴을 각각 10당량을 추가로 가하고 반응을 진행하였다. 화합물(8b)가 모두 사라지는 것을 박층크로마토그래피로 확인한 후 감압농축을 하고, 브라인(7ml), 포화 탄산수소나트륨(10ml), 초산에틸(30ml)로 묽히고, 유기층만 분리하였다. 분리한 유기층은 무수황산나트륨으로 수분제거 후 감압농축하여 화학식(9a)의 혼합물을 얻었다. 이 화합식(9a)의 혼합물을 N,N-디메틸포름아미드(8ml)에 녹이고, 아지드 리튬(1.25ml, 4당량)을 가한 후, 60℃에서 6시간동안 교반을 하였다. 박층크로마토그래피로 화학식(9a)의 잔류여부를 확인한 후, 감압농축을 하였다. 감압농축한 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(초산에틸: 헥산 =1:1)로 분리하여 하얀색의 고체인 화학식(10a)(0.24g)를 54%의 수율로 얻을 수 있었다.

화합물(9a) : 1H-NMR(DMSO-d6) δ 9.48(s, 1H), 8.44(s, 1H), 8.08(d, J=7Hz, 2H), 7.97(m, 3H), 7.75(m, 1H), 7.61(m, 3H), 7.48(t, J=7Hz, 2H), 7.10(d, J=7Hz, 1H), 6.57(t, J=8Hz, 1H), 5.87(m, 1H), 4.94(m, 1H), 4.80(m, 2H);

화합물(10a) : 1H-NMR(DMSO-d6) δ 8.10(d, J=7Hz, 2H), 7.99(m, 3H), 7.75(m, 1H), 7.62(m, 3H), 7.50(m, 2H), 6.75(t, J=8Hz, 1H), 5.89(m, 1H), 4.96(m, 1H), 4.81(m, 2H)

참조예 1-5. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 하이드록시 -5-( 하이드록시메틸 ) 퓨란 -2-일)피리미딘-2(1H)-온의 제조 (화학식(1))

화학식(10a) (0.24g, 0.482mmol, 1당량)를 메틸알콜(4ml)에 녹이고, 나트륨메톡시드(0.10g, 4당량)을 가하여 상온에서 16시간 동안 교반을 하였다. 박층크로마토그래피로 화합물 (10a)의 잔류여부를 확인한 후, 2N 아세트산으로 pH 4이하로 조절을 하고, 감압농축을 하였다. 농축하여 얻은 혼합물은 컬럼크로마토그래피(초산에틸=1)로 분리하여 하얀색의 고체인 화학식(1) (0.10g)을 75%의 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(DMSO-d6) δ 8.20(d, J = 7Hz, 1H), 7.27(d, J = 7Hz, 1H), 6.31(m, 1H), 4.87(m, OH), 4.35(m, 1H), 3.97(m, OH), 3.81(m, 1H), 3.73(m, 2H) (도 1 참조) :

MS(EI) :ｍ/z 289 =〔M〕⁺(도 2 참조)

참조예 2. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 하이드록시 -5-(L- 이소류시닐옥시메틸 ) 퓨란 -2-일)피리미딘-2(1H)-온의 제조 (화학식(3))

화학식(1) (0.13g, 0.450mmol, 1당량)을 N,N-디메틸포름아미드(5ml)에 녹이고, 디메틸아미노피리딘(5.5mg, 0.1당량), 디사이클로헥실카보다이이미드(0.20g, 2.2당량), 보호기가 있는 L-이소류신(0.23g, 2.2당량)을 가하였다. 상온에서 9시간동안 교반한 후, 생성된 고체는 여과하여 제거하고, 감압농축을 하였다. 감압농축 후, 컬럼크로마토그래피(초산에틸=1)로 분리하여 하얀색의 고체 화합물 화학식 (3a)(66mg)를 37%의 수율로 얻을 수 있었다. 얻어진 화학식(3a)를 트리플루오로아세트산과 메틸알콜(1:1, 4ml)의 혼합용매에 넣고 교반을 3시간동안한 후, 감압농축을 하였다. 오일상태의 혼합물을 컬럼크로마토그래피(초산에틸=1)로 분리하여 흰색 고체 화학식(3) (20mg)을 37%의 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(MeOD-d4) δ 8.20(d, J = 7Hz, 1H), 7.05(d, J = 7Hz, 1H),

6.42(m, 1H), 4.41(m, 1H), 4.02(m, 2H), 3.82(m, 2H), 2.03(m, 1H), 1.76(m, 1H), 1.43(m,1H), 0.96(m,3H), 0.87(m,3H)

참조예 3. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 하이드록시 -5-(L- 발리닐옥시메틸 ) 퓨란 -2-일)피리미딘-2(1H)-온 제조 (화학식(4))

보호기가 있는 L-발린(0.16g, 2.2당량)을 사용한 것을 제외하고는, 참조예 2와 동일한 방법으로 제조한 결과 화학식(4)가 42% 수율로 얻어졌다.

1H-NMR(MeOD-d4) δ 8.20(d, J = 7Hz, 1H), 7.05(d, J = 7Hz, 1H), 6.42(m, 1H), 5.62(m, 1H), 4.41(m, 1H), 4.16(m, 1H), 4.02(m, 1H), 3.82(m, 1H), 2.37(m,1H), 1.19(d,J=7Hz,6H)

참조예 4. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 하이드록시 -5-(L- 페닐알라닌일옥시메틸 ) 퓨란 -2-일)피리미딘-2(1H)-온 제조 (화학식 5)

보호기가 있는 L-페닐알라닌(0.20g, 2.2당량)을 사용한 것을 제외하고는, 참조예 2와 동일한 방법으로 제조한 결과 화학식(5)가 42% 수율로 얻어졌다.

1H-NMR(MeOD-d4) δ 8.20(d, J = 7Hz, 1H), 7.37(m, 5H), 7.05(d, J = 7Hz, 1H), 6.42(m, 1H), 6.11(m, 1H), 5.50(m, 1H), 4.57(m, 1H), 4.02(m, 1H), 3.82(m,1H), 3.30(m,2H)

참조예 5. 4- 아지도 -1-((2R,4R,5R)-3,3- 디플루오로 - 테트라하이드로 -4- 하이드록시 -5-( 엘라이도일 ) 퓨란 -2-일)피리미딘-2(1H)-온 제조 (화학식(6))

화학식(1) (0.1g, 0.346mmol, 1당량)을 N,N-디메틸포름아미드(5ml)에 녹이고, 염화 엘라이도일(0.11g, 1.0당량)을 N,N-디메틸포름아미드(2ml)에 녹여서 가하였다. 상온에서 12시간 교반을 하였다. 박층크로마토그래피로 화합물 (1)의 잔류여부를 확인한 후, 감압농축하여 용매를 제거하였다. 감압농축 후, 컬럼크로마토그래피(염화메틸렌 : 메탄올 = 12:1)로 분리하여 연한 노란색 오일인 화학식(6)(45mg)을 23%의 수율로 얻을 수 있었다.

1H-NMR(DMSO-d6) δ 8.20(d, J = 7Hz, 1H), 7.05(d, J = 7Hz, 1H), 6.45(m, 1H), 6.17(m, 1H), 5.35(m, 2H), 4.4(m ,3H), 3.95(m, 1H), 2.35(m, 2H), 1.95(m,4H), 1.55(m,2H), 1.25(m,20H), 0.85(m,3H)

[실험예] 생물학적 효능 검사

실험예 1. 아지드 환원 실험

사람의 간 마이크로솜 1.5mg을 0.5ml의 0.1M PBS(pH 7.4, 50mM 염화마그네슘, 6.0mM NADPH, 1.0mM 화학식(1)의 물질을 포함)용액에 첨가하여 37℃에 지정된 시간동안 배양 후 원심 분리하여 상층액만 분리하고 100℃에서 30초 동안 끓인 후, HPLC로 분석 하였다.

실험결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 시간이 경과함에 따라 화학식(1)의 농도는 감소하는 반면, 젬시타빈의 농도는 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 화학식1로 표시되는 화합물은 생체 내에서 젬시타빈으로 전환됨을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

[표 1]

실험예 2. pH 안정도 분석

화학식(1)의 물질을 위장관 전체의 pH 범위(pH 2 ~ 8)를 나타내는 4개의 완충용액 중에 1,000ppm의 농도가 되도록 제조하였다. 시료를 상온에서 HPLC 오토샘플러로 로딩하였고, 1시간 간격으로 HPLC에 반복 주입하였다. 화학식(1)의 피크 면적을 시간에 따른 UV 검출에 의해 모니터링하고 초기 피크 면적과 비교하여 안정성을 측정하였다.

실험결과 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 화학식(1)은 4시간 후에도 pH 2 내지 8에서 매우 안정한 것을 확인할 수 있었다(표 2참조).

[표 2]

실험예 3. 혈장 안정도 시험

염산젬시타빈과 화학식(1)을 3차 증류수에 녹인 후, 농도가 0.01mg/ml이 되도록 각각의 1ml의 혈장에 희석시켰다. 지정된 시간(0, 017, 0.5, 1, 2h)에 100㎕씩 채취하여, 테트라히드로유리딘(THU, 10mg/ml) 2.5㎕을 가해 추가 대사를 저해한 다음 전처리를 하여 HPLC로 분석하였다.

실험결과 하기 도 3에서 나타난 바와 같이, 화학식(1)의 물질은 혈장 내에서 안정하나, 젬시타빈은 30분후에 급격히 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 4. 세포독성 시험

한국인에게 많이 유발되는 6개 암종(간암, 유방암, 폐암, 대장암, 위암, 백혈병)의 세포주(한국 세포주 은행)를 대상으로 화학식(1) 및 염산젬시타빈의 항암 활성을 비교 확인하기 위해 72시간동안 약물을 연속 처리한 후 세포독성을 평가 하였다. SRB 분석방법으로 세포수를 측정하고, 각 종양 세포주의 IC50값(단위, μM), 즉 대조군에 비해 성장을 50% 억제시키는 화합물 농도로서 성장 억제율(%)을 계산하였다.

실험결과 하기 표 3에 나타난 바와 같이 화학식(1)은 염산 젬시타빈에 비해 세포독성이 매우 적은 것으로 확인이 되었다.

[표 3]

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 참조예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

4-아지도-1-((2R,4R,5R)-3,3-디플루오로-테트라하이드로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)퓨란-2-일)피리미딘-2(1H)-온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 약제학적 유효량 포함하는 경구투여용 암 치료용 약학적 조성물.
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제1 항에 있어서,
상기 암은 췌장암, 유방암, 비소세포암, 난소암, 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
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