KR101076931B1 - Ｉｌ―１７ 생성의 억제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제를 사용하여, T 세포에 의한 프로-염증성 사이토킨 인터루킨-17 (IL-17)의 생성을 억제하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 상승 수준의 IL-17이 존재하는 것을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하는데 있어서의 IL-23 길항제의 용도에 관한 것이다. IL-23 길항제에는 소단위체 또는 IL-17 또는 IL-17 수용체와 특이적으로 결합하는 항체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 부가적으로, IL-23 효능제를 사용함으로써 IL-17 생성을 유도하는 것에 관한 것이다.
인터루킨-23 (IL-23) 길항제 및 효능제, 염증 질환 치료, IL-17 생성 억제, 세균성 감염 치료, 결핵 치료

Description

ＩＬ―１７ 생성의 억제 {Inhibition of IL-17 production}
본 발명은 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제를 사용하여, T 세포에 의한 프로-염증성 (proinflammatory) 사이토킨 인터루킨-17 (IL-17)의 생성을 억제하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 상승 수준의 IL-17이 존재하는 것을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하는데 있어서의 IL-23 길항제의 용도에 관한 것이다.
IL-17은 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 자극하여 IL-6, IL-8, G-CSF 및 MCP-1을 포함한 기타 염증성 사이토킨 및 케모카인을 생성시키는, T 세포 유도된 프로-염증성 분자이다 [참조: S. Aggarwal, A. L. Gurney, J Leukoc Biol 71, 1 (2002); Z. Yao et al., Immunity 3, 811 (1995); J. Kennedy et al., J Interferon Cytokine Res 16, 611 (1996); F. Fossiez et al., J Exp Med 183, 2593 (1996); A. Linden, H. Hoshino, M. Laan, Eur Respir J 15, 973 (2000); X. Y. Cai, C. P. Gommoll, Jr., L. Justice, S. K. Narula, J. S. Fine, Immunol Lett 62, 51 (1998); D. V. Jovanovic et al., J Immunol 160, 3513 (1998); and M. Laan et al., J Immunol 162, 2347 (1999)].
IL-17은 또한, 케모카인 발현을 추가로 유도시키는, TNF-α및 IL-1β를 포함한 기타 사이토킨과 상승 작용을 일으킨다 [참조: Jovanovic et al., supra, and M. Chabaud, F. Fossiez, J. L. Taupin, P. Miossec, J Immunol 161, 409 (1998)]. IL-17의 수준은 동종 이식 거부 [참조: M. A. Antonysamy et al., Transplant Proc 31 (1999); M. A. Antonysamy et al., J Immunol 162, 577 (1999); C. C. Loong, C. Y. Lin, W. Y. Lui, Transplant Proc 32 (2000); and H. G. Hsieh, C. C. Loong, W. Y. Lui, A. Chen, C. Y. Lin, Transpl Int 14, 287 (2001)] 동안, 류마티스성 관절염 (RA) 활막에서 상당히 증가하고 [참조: S. Kotake et al., J Clin Invest 103, 1345 (1999); and M. Chabaud et al., Arthritis Rheum 42, 963 (1999)], 다발성 경화증 [참조: K. Kurasawa et al., Arthritis Rheum 43, 2455 (2000)] 및 건선 [참조: C. Albanesi et al., J Invest Dermatol 115, 81 (2000), and B. Homey et al., J Immunol 164, 6621 (2000)]을 포함한 기타 만성 염증 질환에서 상당히 증가하는 것으로 밝혀지고 있다. 활성화된 T 세포에 의해 명백히 생성되긴 하지만, 기존의 보고서는 IL-17을 Th1 및 Th2 분극 사이토킨 프로필의 범례 내에 명백히 분류하지 못하고 있다.
IL-23은 독특한 소단위체 p19와 결합하는 인터루킨-12와 p40으로 명명된 소단위체를 공유하고 있는 이종-이량체성 (hetero-dimeric) 사이토킨이다 [참조: B. Oppmann et al., Immunity 13, 715 (2000)]. IL-23은 T 세포, 특히 기억 T 세포의 증식을 증진시키는 것으로 보고되었다 [참조: D. M. Frucht, Sci STKE 2002 Jan 8; 2002(114):PE1]. 형질전환성 pl9 마우스는 현저한 전신 염증과 호중구 증가증 (neutrophilia)를 나타내는 것으로 최근에 보고되었다 [참조: M. T. Wiekowski et al., J Immunol 166, 7563 (2001)].
지금까지는, IL-17과 IL-23 사이토킨의 발현과 생물학적 역할 간의 어떠한 상관 관계도 확립되지 않았다.
발명의 요약
한 국면에서, 본 발명은 T 세포를 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제로 처리하는 단계를 포함하여, T 세포에 의한 인터루킨-17 (IL-17) 생성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 유효량의 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제를 포유류 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 이러한 포유류 개체에게서 인터루킨-17 (IL-17)의 발현 상승을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은
(a) T 세포 배양물을 후보 분자의 존재 또는 부재 하에 IL-23과 함께 항온 배양하는 단계;
(b) 이러한 배양물 중의 IL-17의 수준을 모니터하는 단계; 및
(c) IL-17의 수준이 상기 후보 화합물의 부재 하에서 보다 존재 하에서 더 낮을 경우에는, 이러한 후보 화합물을 소염제로서 동정하는 단계
를 포함하는, 소염제의 동정 방법에 관한 것이다.
추가의 국면에서, 본 발명은 IL-23 효능제를 포유류 개체에게 투여하는 단계를 포함하여, 이러한 포유류 개체에게서 IL-17 생성을 유도하는 방법에 관한 것이다.
모든 국면에 있어서, 상기 길항제 또는 효능제는 바람직하게는, 항-IL-23 또는 항-IL-23 수용체 항체 (이에는 항체 단편이 포함된다)이다. 염증 질환은 바람직하게는, 만성 염증 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염 (RA), 동종 이식 거부 반응을 유발시킬 수 있는 이식편 대 숙주 반응, 다발성 경화증 (MS) 또는 건선이다. IL-17 생성 유도는 전형적으로, 세균성 감염, 예를 들면, 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 감염된 환자에게 유용하다.
도 1: 상이한 세포 유형에서의 IL-17 생성 (A): 비장의 단일 세포 현탁물을 C57/BL-6 마우스로부터 제조하고, 밀도 구배 원심분리시킴으로써 상기와 같이 현탁된 비장 세포로부터 단핵 세포를 분리하였다. 2 x 106개 세포/ml를 미생물성 리포펩티드 LBP (100 ng/ml), LPS (100 ng/ml) 또는 LTA (100 ng/ml)의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양한 다음, 세포를 수집하고 ELISA를 사용하여 IL-17에 대해 분석하였다. (B): FACS 분류 CD90 표지된 세포를 양성 선별한 후 쥐과 (murine) 비장 세포로부터 정제된 T 세포를 수득하였다. 이들 세포를 판-결합된 항-CD3 (5㎍/ml), 또는 활성화 수지상 세포 (LPS-처리됨)로부터의 상등액의 존재 또는 부재 하에 3일 동안 배양하고 (1 x 106개 세포/ml), 배양 상등액을 수집한 다음, ELISA 키트를 사용하여 IL-17 수준에 대해 분석하였다. 대식 세포 (macrophage)를 rmGM-CSF (2 ng/ml) 및 rmIL-4 (1000 U/ml)로 4일 동안 처리하고, 세척한 다음 LPS (0.5㎍/ml)를 사용하여 재활성화시킴으로써, 대식 세포 (비장 세포 현탁물로부터 유착 성 집단으로서 수득됨)로부터 수지상 세포를 유도시켰다. 3가지 독립적인 실험으로부터의 대표적인 결과가 제시되어 있다.
도 2: IL-23은 IL-17의 생성을 자극한다 A. 비장 세포로부터 분리된 단핵 세포를 100 U/ml 재조합 IL-2와 함께 배양하고 (2 x 106개 세포/ml), 각종 농도의 IL-23 (0.1 내지 1000 ng/ml)의 존재 또는 부재 하에 6일 동안 항온 배양하였다. 배양 상등액 내에 축적된 IL-17의 수준을 ELISA을 이용하여 측정하였다. B. IL-23 처리에 반응하는 IL-17에 대한 mRNA 수준 상의 변화를 정량적 RT-PCR에 의해 측정하였다. PCR 반응의 Ct (주기 한계치) 상의 상대적 변화를 플롯팅하였다. 각 샘플에 대한 데이터를, 각 샘플 내에 존재하는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 mRNA 수준에 대해 표준화한 다음, 자극되지 않은 제로 시간 조건시 존재하는 IL-17 mRNA 수준에 대해 샘플 간에 다시 표준화하였다. 각 Ct가 PCR 주기에 상응하기 때문에, 1개의 Ct는 mRNA 존재비 상의 2배 변화와 대략 등가이다. 5 Ct 및 10 Ct 변화에 대한 대략적인 mRNA 배수 차이는 괄호() 안에 지시하였다. 4마리 마우스로부터의 비장 세포를 사용하여 본 실험을 수행하고, 개개의 데이터 점은 x로 나타내었으며, 평균 Ct 변화는 막대 칼럼으로써 지시하였다. C. IL-23 처리에 반응하는 IL-17 계열 구성원 IL-17F의 mRNA 수준 상의 변화를 도 2B에 대한 설명에서와 같이 정량적 RT-PCR에 의해 측정하였다.
도 3: IL-23은 기억 T 세포 상에서 작용하여 IL-17 생성을 유도시킨다. 쥐과 비장 세포의 단일 세포 현탁물로부터 분리된 단핵 세포를 (a) CyC-CD4 + PE- CD44 또는 (b) CyC-CD4 + PE-CD62L로 염색시키고, 기억 표현형에 대해 CD44high/CD62Llow인 CD4+ 세포, 또는 본래의 표현형에 대해 CD44low/CD62Lhigh인 CD4+ 세포로 분류하였다. 이와 같이 분류시킨 세포를 IL-23 (또는 대조군으로서의 이의 비등 조제물), 판 결합된 항-CD3 (5 ㎍/ml) 및 항-CD28 (1 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 100U/ML 재조합 IL-2와 함께 5일 동안 배양하고, 세척한 다음, 항-CD3 항체로 24시간 더 재자극하였다. 상등액을 수집하고, ELISA를 사용하여 IL-17 수준을 측정하였다.
도 4: IL12p40 항체는 IL-23-의존성 IL-17 생성을 차단시킨다: (A) 증가 농도의 p40 항체 또는 무관한 이소형-짝지은 대조군 항체를 37℃에서 1시간 동안 IL-23 (100 ng/ml)와 함께 예비-항온 배양한 다음, 재조합 IL-2의 존재 하에 마우스 비장으로부터 분리된 단핵 세포 (2 x 106개 세포/ml)와 함께 5 내지 6일 더 항온 배양하였다. 상등액을 수거하고, ELISA를 사용하여 IL-17의 수준을 측정하였다 (좌측 패널). 최적 농도의 IL-12p40 항체 또는 무관한 이소형-짝지은 대조군 항체를 37℃에서 1시간 동안 LPS-자극된 수지상 세포의 컨디셔닝 배지 (10% v/v)과 함께 예비-항온 배양한 다음, 재조합 IL-2의 존재 하에 마우스 비장으로부터 분리된 단핵 세포 (2 x 106개 세포/ml)와 함께 5일 더 항온 배양하였다. 상등액을 수거하고, ELISA를 사용하여 IL-17의 수준을 측정하였다 (우측 패널). (B) 야생형 마우스 (C57/BL6) 또는 IL-12의 성분들 중의 하나가 결여된 마우스, 즉 IL12a-/- (p35 녹아 웃) 또는 IL12b-/- (p40 녹아웃)의 비장 세포로부터 분리된 단핵 세포를 ConA의 존재 하에 3일 동안 배양하고, ELISA를 사용하여 상등액 중의 IL-17 수준을 측정하였다.
도 5: IL-17 생성에 대한 IL-12의 효과. (A) 비장 세포 배양물로부터 분리된 단핵 세포를 정제된 IL-23 (1 nM)의 존재 하에 항온 배양하고 지시된 농도의 IL-12와 함께 5일 동안 항온 배양한 다음, 세척하고 ConA로 24시간 더 재자극하였다. ELISA 키트를 사용하여 세포 상등액 중의 IL-17 수준을 측정하였다. (B): 야생형 마우스 또는 IL-12Rβ2가 결여된 마우스 (IL-12Rβ2-/- ko)로부터의 비장 세포 배양물로부터 분리된 단핵 세포를 정제된 IL-23 (1 nM)의 존재 또는 부재 하에 5일 동안 항온 배양한 다음, 세척하고 ConA로 24시간 더 재자극하였다. ELISA 키트를 사용하여 세포 상등액 중의 IL-17 및 IFN-γ수준을 측정하였다.
도 6: IL-23pl9 유전자 자리의 표적화. A: 이중 슬래시 (//)로 지시되지 않는 한, 본래의 IL-23pl9 유전자 자리 (상부), 표적화 작제물 (중간), 및 정확하게 표적화된 유전자 자리 (하부)를 비율적으로 도시하였다. 흰색 박스는 암호화 엑손을 지시하고, 줄 무늬친 박스는 생성되는 메신저 RNA (mRNA)의 5' 및 3' 비해독 영역을 암호화하는 엑손을 나타낸다. p19 유전자의 4개의 암호화 엑손에 번호를 매긴다. 화살표를 수반한 박스는 네오마이신 (neo) 및 티미딘 키나제 (tk) 선별 카셋트에 대한 프로모터 영역을 지시하고, EGFP로 표식된 흰색 박스는 증강된 그린 형광성 단백질 리포터 (reporter) 유전자의 위치를 지시한다. 암 (arm)의 클로닝 및 분석을 위해 사용된 제한 부위는 다음과 같이 표지한다: B, BamHI; S, Sac II; E, Eco RI; Bg, Bgl II; X, XhoI. 짧은 암을 증폭시키기 위해 사용된 안티센스 프라이머의 위치는 문자 P와 화살표로써 지시된다. Bam HI 및 Eco RI로 분해시킴으로써 생성된 제한 단편의 크기는 야생형 (WT) 및 돌연변이된 (MUT) 유전자 자리에 지시되고, 서던 블롯 (southern blot)에 의해 이들 단편을 탐지하기 위해 사용된 2개의 프로브의 위치가 굵은 선으로 표시된다. B 및 C: 각각, 프로브 1로 탐침시킨 Bam HI 분해물의 서던 블롯 분석, 및 프로브 2로 탐침시킨 Eco RI 분해물의 서던 블롯 분석. DNA를 야생형 (WT) 배아 줄기 (ES) 세포, ES 클론 lc5, 및 야생형, 이형접합성 (HET) 및 녹아웃 (KO) 마우스로부터 추출하였다. 밴드의 실체가 해당 블롯의 좌측에 지시되는 반면, 이의 크기는 우측에 제시되어 있다.
도 7: IL-23pl9 -/- 마우스의 총 혈청 면역글로불린 수준. 16마리 야생형 (검은색 환) 마우스와 IL-23pl9-/- (흰색 환) 마우스 그룹으로부터 이소형 특이적 ELISA함으로써, 면역글로불린 이소형의 혈청 수준을 결정하였다. 면역글로불린 이소형은 그래프의 하부에 지시된다.
도 8: IL-23pl9 -/- 마우스에서의 체액성 면역 반응. A-G: 오브알브민 (OVA)로 1회 (1st) 및 2회 (2nd) 면역시킨 후, IgGl (A), IgG2a (B), IgG2b (C), IgG3 (D), IgE (E), 및 IgA (F)의 OVA 특이적 수준. 검은색 환, 야생형 마우스; 흰색 환, IL-23pl9-/- 마우스; 회색 환, IL-12p40-/- 마우스. 방법 및 재료 항목에 기재된 바 와 같이 임의 단위를 산정하였다. 각 그룹의 평균치가 그래프 하부에 검은색 수평 막대와 수치로써 지시된다. 별표는 0.05 미만의 통계상 유의적 P-값을 표시한다.
도 9: T-독립적 B-세포 반응은 IL-23pl9 -/- 마우스에서 정상적이다. TNP-LPS (유형 I, 좌측) 또는 TNP-Ficoll (유형 II, 우측)으로 면역시킨 마우스로부터 ELISA함으로써, TNP 특이적 IgM의 혈청 수준을 결정하였다. 검은색 환, 야생형 마우스; 흰색 환, IL-23pl9-/- 마우스.
도 10: 기억 T-세포 기능. 야생형 마우스 (검은색 환)와 IL-23pl9-/- 마우스 (흰색 환)을 0일 째에 오브알부민으로 면역시키고, 21일 째에 TNP-OVA로 챌린지하였다. 혈청을 0일, 14일 및 26일 째에 수거하고, TNP-특이적 IgGl (A) 및 IgG2a (B)의 존재를 알아보기 위해 ELISA함으로써 시험하였다. IgG1에 대해서는, 시판용 표준물을 사용하였다. IgG2a에 대해서는, 방법 및 재료 항목에 기재된 바와 같이 임의 단위를 산정하였다.
도 11: 지연형 과감작 (DTH) 반응. 챌린지 직전에 측정한 수치에 비해 증가한 발바닥 두께 증가율(%)로서 항원 특이적 부종을 산정한다. 결과는 각 그룹의 6마리 마우스 모두에 대해 평균을 내었으며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 감작되지 않은 제2 야생형 그룹을, 항원 단독에 의해 유도된 부종에 대한 대조군으로서 사용한다. 별표가 내부에 표시된 부호는 상응하는 그룹과 야생형 마우스 간의 차이가 통계상 유의적 (P<0.05)이라는 것을 지시한다. WT, 야생형; pl9ko, IL- 23pl9-/- 마우스; p40ko, IL-12p40-/- 마우스.
도 12: 정상적인 T-세포 프라이밍은 IL-23pl9 -/- 항원 제시 세포에 의한 IL-17 생성 수준을 여전히 감소시켰다. A: 야생형 (검은색 막대) 또는 IL-23pl9-/- (흰색 막대) 수지상 세포와 조합한 balb/c T-세포의 시험관내 동종자극 (allostimulation) 실험. 본래의 CD4+ T-세포 및 CD8-/CDllc+/MHC-II+ 세포를 FACS에 의해 분리시키고, 세균성 리포펩티드 (BLP)의 존재 및 부재 하에 항온 배양하였다. 5일 동안 항온 배양한 후에, 상등액 중의 사이토킨 수준과 증식을 결정하였다. APC, 항원 제시 세포. B: 생체내 T-세포 반응. KLH로 면역시킨 IL-23pl9-/- 마우스 (흰색 막대) 또는 야생형 마우스 (검은색 막대)로부터의 림프절 세포 현탁물을 분리하고, 25 ㎍/ml KLH로 시험관내에서 재자극하였다. 배양한지 5일 후에, 증식과 IL-17 수준을 측정하였다.
A. 정의
달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다 [참조: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)]. 본 발명의 목적상, 다음 용어는 다음과 같이 규정된다.
용어 "길항제"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용된다. IL-23 "길항제"는 기본적 기전에 상관없이, IL-23의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 중화, 방지 또는 방해하는 분자이다. 본 발명의 목적상, 이러한 생물학적 활성은 바람직하게는, 활성화된 T 세포에서 IL-17 생성을 유도시키는 능력이다. IL-23의 길항제는 예를 들어, 활성화된(예를 들면, 기억) T 세포 집단 내에서 IL-23 매개된 IL-17 생성을 억제, 차단 또는 역전시킬 수 있는 능력에 근거하여 동정할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 T 세포 배양물을 시험용 화합물의 존재 및 부재 하에 IL-23와 함께 항온 배양할 수 있으며, 이러한 세포 배양 상등액 중에서, 예를 들어, ELISA에 의해 IL-17 수준을 모니터하였다. IL-17 수준이 시험용 화합물의 부재 하에서 보다 이의 존재 하에서 더 낮을 경우에는, 시험용 화합물이 IL-23 길항제이다. 또 다른 한편, 실시간 RT-PCR을 사용하여, 시험용 화합물로 처리하기 전 및 후에, IL-23을 발현하기도 하는 조직 내에서 IL-17 mRNA 발현을 모니터할 수 있다. 시험용 화합물의 존재 하에서 IL-17 mRNA 수준 감소는 이러한 화합물이 IL-23 길항제라는 것을 지시한다. IL-23 길항제의 예에는 본래의 서열 IL-23 폴리펩티드의 소단위체, 예를 들면, p40 소단위체에 대항한 중화 항체; 면역글로불린 불변 영역 서열과 융합된 IL-23 소단위체를 포함하는 면역부착물; 소분자; 본래의 서열 IL-23 폴리펩티드의 소단위체를 암호화하는 유전자의 해독 및/또는 전사를 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 유인물 (decoys), 예를 들면, IL-23 유전자의 유전적 유인물 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, IL-23 길항제에는 본래의 IL-23 수용체의 소단위체, 예를 들면, IL-12Rβ1 또는 IL-23R 소단위체에 대항한 중화 항체; 면역글로불린 불변 영역 서열과 융합된 IL-23 수용체 소단위체를 포함하는 면역부착물; 소분자; 본래의 서열 IL-23 수용체 폴리펩티드의 소단위체를 암호화하는 유전자의 해독 및/또는 전사를 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 유인물, 예를 들면, IL-23 수용체 유전자의 유전적 유인물 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "효능제"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용된다. IL-23 효능제는 기본적 기전에 상관없이, 본래의 서열 IL-23에 의해 매개된 생물학적 활성을 모방하는 모든 분자이다. 본 발명의 목적상, 이러한 생물학적 활성은 바람직하게는, 활성화된 T 세포에서 IL-17 생성을 유도시키는 능력이다. IL-23 효능제의 예에는 본래의 IL-23 수용체의 소단위체, 예를 들면, IL-12Rβ1 또는 IL-23R 소단위체에 대항한 효능제 항체, 펩티드 및 소 유기 분자가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드" (이들 용어는 상호 교환적으로 사용된다)는 서열-특이적 방식으로 표적 유전자의 전사 및/또는 해독을 억제할 수 있는 핵산 분자로서 규정된다. 용어 "안티센스"는 핵산이 표적 유전자의 암호화 ("센스") 유전적 서열에 상보적이라는 사실을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기-짝짓기 (Watson-Crick base-pairing)를 통하여 신생 (nascent) mRNA와 역평행 배향으로 하이브리드화한다. 표적 mRNA 주형을 결합시킴으로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암호화된 단백질의 성공적인 해독을 차단시킨다. 이러한 용어에는 구체적으로, 자연적인 자가-스플라이싱 활성을 지니고 있는 서열을 부가함으로써 표적 RNA의 촉매적 절단을 유도시키는 것으로 고안된, "리보자임 (ribozyme)"으로 불리우는 안티센스 제제가 포함된다 (참조: Warzocha and Wotowiec, "Antisense strategy: biological utility and prospects in the treatment of hematological malignancies." Leuk. Lymphoma 24: 267-281 [1997]).
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로널 항체 (길항제, 예를 들면, 중화 항체와 효능제 항체를 포함함), 폴리클로널 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들면, 이중-특이적 항체) 뿐만 아니라 항체 단편을 포괄한다. 모노클로널 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일정 부분이 특정한 종으로부터 유래한 항체 또는 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래한 항체 또는 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편이 포함되는데, 단 이들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다 (참조: U. S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]). 모노클로널 항체에는 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 "사람 적응화 (humanized)" 항체 또는 이의 단편 (예를 들면, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이 추가로 포함된다. 대부분의 경우에는, 인간화 항체가, 수용자의 CDR로부터의 잔사를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지닌 비-사람 종 (공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트 또는 래빗 (rabbit)의 CDR로부터의 잔사로 대체시킨 사람 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 사람 면역글로불린의 Fv FR 잔사를 상응하는 비-사람 잔사로 대체시킨다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 유입된 (imported) CDR 또는 골격 서열에서도 전혀 발견되지 않는 잔사를 포함할 수도 있다. 이러한 변형들은 항체 성능을 추가로 최대화하고 정련시키기 위해 사용된다. 일반적으로, 인간화 항체는, CDR 영역의 전부 또는 거의 전부가 비-사람 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고 FR 영역의 전부 또는 거의 전부가 사람 면역글로불린 서열의 FR 영역인 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로는, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일정 부분을 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 [참조: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); and Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]. 인간화 항체에는 해당 항체의 항원-결합성 영역이 짧은꼬리 원숭이 (macaque monkey)를 관심있는 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED® 항체가 포함된다.
"항체 단편"은 본래 항체의 일정 부분, 바람직하게는 본래 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디 (diabody); 선형 항체 [참조: Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "염증 질환" 또는 "염증 장애"는 전형적으로 호중구 화학주성에 의해 유발된 염증을 야기시키는 병리학적 상태를 지칭한다. 이러한 장애의 예에는 건선 (psoriasis) 및 아토피성 피부염 (atopic dermatitis)을 포함한 염증성 피부 질환; 전신성 피부 경화증 (systemic scleroderma) 및 경화증 (sclerosis); 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease)(IBD)과 연관된 반응 [예를 들면, 크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 결장염 (ulcerative colitis)]; 수술 조직 재관류 상해, 심근 허혈성 질환, 예를 들면, 심근 경색 (myocardial infarction), 심장 정지 (cardiac arrest), 심장 수술 후의 재관류 및 경피 경관 관상동맥 성형술 (percutaneous transluminal coronary angioplasty) 후의 협착증, 발작 (stroke), 및 복부 대동맥류 (abdominal aortic aneurysms)를 포함한 허혈성 재관류 장애; 발작에 이어 2차적인 뇌부종; 두개 외상 (cranial trauma), 혈액량 감소성 쇽 (hypovolemic shock); 질식 (asphyxia); 성인 호흡기 장애 증후군 (adult respiratory distress syndrome); 급성-폐 손상 (acute-lung injury); 베체트병 (Behcet's Disease); 피부근염 (dermatomyositis); 다발성근염 (polymyositis); 다발성 경화증 (MS); 피부염 (dermatitis); 수막염 (meningitis); 뇌염 (encephalitis); 포도막염 (uveitis); 골관절염 (osteoarthritis); 루푸스 신염 (lupus nephritis); 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis: RA), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 혈관염 (vasculitis); 백혈구 누출 (leukocyte diapedesis)과 관련된 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증 장애, 패혈증 (septicaemia) 또는 외상에 이어 2차적인 다발성 기관 손상 증후군; 알코올성 간염; 세균성 폐렴 (bacterial pneumonia); 사구체신염 (glomerulonephritis)을 포함한 항원-항체 복합체 매개된 질환; 패혈증 (sepsis); 사르코이드증 (sarcoidosis); 조직/기관 이식에 대한 면역병리학적 반응; 흉막염 (pleurisy), 폐포염 (alveolitis), 혈관염, 폐렴, 만성 기관지염 (chronic bronchitis), 기관지확장증 (bronchiectasis), 확산성 범세기관지염 (diffuse panbronchiolitis), 과민성 폐렴 (hypersensitivitypneumonitis), 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis: IPF) 및 낭포성 섬유증을 포함한 폐의 염증이 포함된다. 바람직한 적응증에는 염증 및 관련 장애에 관한 모든 질병 또는 장애와 함께, 만성 염증, 자가면역 당뇨병, 류마티스성 관절염 (RA), 류마티스성 척추염 (rheumatoid spondylitis), 통풍성 관절염 (gouty arthritis) 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증 (MS), 천식, 전신성 홍반성 루푸스 (systhemic lupus erythrematosus), 성인 호흡기 장애 증후군, 베체트병, 건선, 만성 폐 염증 질환, 이식편 대 숙주 반응, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환 (IBD), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 및 발열증 (pyresis)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는 바람직하지 못한 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 약화시키기 위한, 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 목적하는 임상 결과에는 탐지 가능하든 아니면 탐지 가능하지 않든 간에, 증상의 경감, 질병 정도 감소, 질병의 안정화된 상태 (즉, 더 이상 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 느리게 함, 질병 상태의 향상 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 아니면 전적이든 간에)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않는 경우에 예상되는 생존률과 비교해서 생존률을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료가 필요한 개체에는 이미 해당 질환 또는 장애가 있는 개체 뿐만 아니라 이러한 질환 또는 장애를 예방하기 위해 상기 질환 또는 장애를 나타내기 쉬운(경향이 있는) 개체가 포함된다.
"만성" 투여는 목적하는 효과를 의도한 기간 동안 유지시키도록 하기 위해, 급성 방식과는 반대로 연속적인 방식으로 해당 제제(들)를 투여하는 것을 지칭한다.
"간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 수행되는 것이 아니라, 사실상 주기적인 치료법이다.
한 가지 이상의 추가 치료제와 "조합하여" 투여하는 것에는 동시 투여와 어떠한 순서로든 연속적으로 투여하는 것이 포함된다.
"개체"는 척추 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 사람이다.
용어 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭하기 위해 본원에 사용되며, 이에는 사람, 가축 및 사육 동물, 및 동물원, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예를 들면, 양, 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본원에서의 포유류는 사람이다.
"유효량"은 유리하거나 목적하는 치료적 (예방적 포함) 결과를 가져다 주기에 충분한 양이다. 유효량을 1회 이상의 투여 횟수로 투여할 수 있다.
B. 본 발명의 실시 방식
본 발명의 실시는 달리 규정되지 않는 한, 당해 분야의 기술 수준 내에서 통상적인 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어, 다음 문헌에 보다 상세히 설명되어 있다 [참조: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4th edition (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); and "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)].
앞서 논의된 바와 같이, 본 발명은 IL-23이 활성화된 T 세포, 특히 기억 세포에서 IL-17 생성을 유도시키고, IL-23 길항제가 이러한 과정을 억제할 수 있다는 인식에 기초한 것이다. 따라서, IL-23 길항제는 IL-17 수준 상승을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하기 위한 유망한 약물 후보이다. 역으로 말하면, IL-23 효능제는 미코박테리아성 감염, 예를 들면, 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 감염을 포함한 각종 감염에 대한 보호성 면역 반응을 유도시키는데 유용하다.
1. IL-23 길항제 또는 효능제를 동정하기 위한 스크리닝 검정법
본 발명은 상승 수준의 IL-17이 존재하는 것을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하는데 유용한 IL-23 길항제를 동정하기 위한 스크리닝 검정법을 포함한다. 본 발명은 추가로, 감염, 예를 들면, 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염에 대한 보호성 면역 반응을 자극하는데 있어서 유용한 IL-23 효능제를 동정하기 위한 스크리닝 검정법을 포함한다.
길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 검정법은 IL-23 (이의 소단위체 또는 기타 단편 포함)와 결합하거나 이와 복합체를 형성하거나, IL-23 수용체 (이의 소단위체 또는 기타 단편 포함)와 복합체를 형성하거나, 또는 기타 세포성 단백질과 IL-23의 상호 작용을 방해함으로써 IL-23의 생성 또는 기능을 방해하는 화합물을 동정하기 위해 고안될 수 있다. 본원에 제공된 스크리닝 검정법에는 화학적 라이브러리의 고-처리량 스크리닝을 받을 수 있어, 소 분자 약물 후보를 동정하는데 특히 적합하게 만드는 검정법이 포함된다. 일반적으로, 결합 검정 및 활성 검정법이 제공된다.
이러한 검정법은 당해 분야에 널리 성상 확인되어 있는 단백질-단백질 결합 검정, 생화학적 스크리닝 검정, 면역검정, 및 세포-이용 검정을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 포맷으로 수행할 수 있다.
길항제 및 효능제에 대한 모든 검정법은 약물 후보와 IL-23 폴리펩티드 및/또는 IL-23 수용체 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드의 단편 (구체적으로는, IL-23 및 IL-23 수용체 소단위체를 포함함)를, 이들 두 성분들이 상호 작용하기에 충분한 시간 및 조건 하에 접촉시키는 것을 요구한다는 점에서 공통적이다. 예를 들어, 사람 IL-23 p19 소단위체는 189개 아미노산 폴리펩티드인데, 이의 서열은 승인 번호 AF301620 하에 EMBL 데이터베이스로부터 입수 가능하다 (NCBI 605580; GenBank AF301620; Oppmann et al., supra). IL-23 폴리펩티드의 소단위체 p40의 서열은 또한 공지되어 있다 (IL-12 p40 소단위체로서 공지되기도 함; NCBI 161561). IL-23과 결합하는 IL-12Rβ1의 서열은 승인 번호 NCBI 601604 하에 입수 가능하다. 이러한 폴리펩티드와 결합하는 소분자 또는 항체를 제조하는 것은 당해 기술 수준 내에 널리 알려져 있다.
결합 검정법에서는, 상호 작용이 결합이고, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 분리 또는 탐지할 수 있다. 특정 양태에서는, IL-23 또는 IL-23 수용체 폴리펩티드, 또는 약물 후보를 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고체 상, 예를 들면, 미세역가 판 상에 고정화시킨다. 비-공유 부착은 일반적으로, 고체 표면을 IL-23 또는 IL-23 수용체 폴리펩티드의 용액으로 피복시키고 건조시킴으로써 수행한다. 또 다른 한편으론, 고정화시키고자 하는 IL-23 폴리펩티드 또는 IL-23 수용체 폴리펩티드에 대해 특이적인 고정화 항체, 예를 들면, 모노클로널 항체를 사용하여, 이를 고체 표면에 정착시킬 수 있다. 상기 검정법은 탐지 가능한 표지물에 의해 표지시킬 수 있는 비-고정화 성분을 고정화 성분, 예를 들면, 정착된 성분을 함유하는 피복 표면에 부가함으로써 수행된다. 이러한 반응이 완료되면, 반응되지 않은 성분들을 예를 들어, 세척함으로써 제거하고, 고체 표면 상에 정착된 복합체를 탐지한다. 본래 고정화되지 않는 성분이 탐지 가능한 표지물을 수반하는 경우, 표면 상에 고정화된 표지물이 탐지된다는 것은 복합체 형성이 일어났다는 것을 지시한다. 본래 고정화되지 않은 성분이 표지물을 수반하지 않는 경우에도, 예를 들어, 고정화된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 복합체 형성을 탐지할 수 있다.
후보 화합물이 IL-23 또는 IL-23 수용체와 상호 작용은 하지만 이와 결합하지 않는 폴리펩티드인 경우에는, 당해 분야에 널리 공지된 단백질-단백질 상호 작용의 탐지 방법에 의해, 각각의 폴리펩티드와 상기 후보 화합물과의 상호 작용을 검정할 수 있다. 이러한 검정법에는 전통적인 접근법, 예를 들면, 가교 결합, 공동-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호 작용은 다음 문헌에 기재된 효모-이용 유전적 시스템을 사용함으로써 모니터할 수 있다 [참조: Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991), and Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991)]. 많은 전사 활성인자, 예를 들면, 효모 GAL4는 물리적으로 별개인 2가지 모듈라 도메인 (modular domain)으로 이루어지는데, 이중 하나의 도메인은 DNA-결합성 도메인으로서 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로서 작용한다. 전술된 공개문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "2-하이브리드 시스템"으로서 지칭됨)은 이러한 유리한 특성을 지니고 있고, 2개의 하이브리드 단백질을 이용하는데, 이중 하나에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합성 도메인과 융합되고, 다른 하나에서는 후보 활성화 단백질이 상기 활성화 도메인과 융합된다. GAL4-활성화 프로모터의 제어 하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자를 발현시키는 것은 단백질-단백질 상호 작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라서 결정된다. β-갈락토시다제에 대한 발색 (chromogenic) 기질을 이용하여, 상호 작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니를 탐지한다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 2개의 특이적 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용을 동정하기 위한 완전 키트 (MATCHMAKER™)는 Clontech으로부터 시판되고 있다. 이러한 시스템은 특이적 단백질 상호 작용에 관여하는 단백질 도메인을 지도화할 뿐만 아니라 이들 상호 작용에 결정적인 아미노산 잔사의 위치를 정확히 나타내기 위해 그 활용 범위를 연장할 수 있다.
IL-23과 기타 세포내 또는 세포외 성분, 특히 IL-17의 상호 작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다. 통상적으로, IL-23과 세포내 또는 세포외 성분 (예를 들면, IL-17)을 함유하는 반응 혼합물을, 이들 두 생성물의 상호 작용을 허용해 주는 시간 및 조건 하에 제조한다. IL-23과 IL-17의 상호 작용을 억제할 수 있는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험용 화합물의 부재 및 존재 하에 수행한다. 또한, 위약 (placebo)을 제3 반응 혼합물에 가하여, 이를 양성 대조군으로서 제공할 수 있다. IL-23은 IL-17 생성을 유도시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, IL-23/IL-17 상호 작용을 억제할 수 있는 시험용 화합물의 능력은, 예를 들어, 이러한 시험용 화합물의 부재 및 존재 하에서 IL-17의 양을 측정함으로써 시험할 수 있다. 이와 같이 측정된 IL-17 양이 후보 화합물의 존재 하에서 보다 부재 하에서 더 낮을 경우에는, 후보 화합물이 본 발명의 규정에 의해 IL-23 길항제이다.
IL-23에 의한 IL-17 생성 유도를 억제시킬 수 있는 능력에 기초하여 동정된 IL-23 길항제는 상승 수준의 IL-17이 존재하는 것을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하기 위한 약물 후보이다.
IL-23에 의한 IL-17 생성 유도를 증진시킬 수 있는 능력에 기초하여 동정된 IL-23 효능제는 감염, 예를 들면, 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염에 대한 보호성 면역 반응을 유발 또는 지지함으로써, 결핵과 같은 감염성 질환을 치료하기 위한 약물 후보이다.
본원에 구체적으로 논의된 스크리닝 검정은 단지 예시일 뿐이다. 스크리닝된 길항제 후보들 유형 (예를 들면, 폴리펩티드, 펩티드, 비-펩티드 유기 소분자, 핵산 등)에 따라서 선택될 수 있는 각종 기타 검정법이 당업자에게 널리 공지되어 있고, 본 발명의 목적상 동등하게 적합하다.
2. 항-IL-23 및 항-IL-23 수용체 항체
특정 양태에서는, IL-23 길항제 또는 효능제가 IL-23 (예를 들면, IL-23의 소단위체)에 대한 모노클로널 항체 (항체 단편 포함)이다. 또 다른 특정한 양태에서, IL-23 길항제 및 효능제에는 IL-23 수용체 (예를 들면, IL-23 수용체의 소단위체)에 대한 모노클로널 항체가 포함된다. 이의 소단위체를 포함한 IL-23은 앞서 논의되었다. IL-23에 대한 수용체는 2개의 소단위체, 즉 IL-12Rβ1과, 보다 최근에 밝혀진 소단위체 IL-23R로 구성된다 [참조: Parham et al., J. Immunol. 168:5699-5798 (2002)]. 어느 한 소단위체에 대한 항체가 구체적으로 본 발명의 범위 내에 속한다. 길항제의 경우에는, IL-23R 소단위체와 특이적으로 결합하는 항체가 특히 바람직한데, 이는 이들이 IL-23에 의해 매개된 생물학적 활성을 특이적으로 차단시키기 때문이다.
모노클로널 항체의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 모노클로널 항체는 문헌 [참조: Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스, 햄스터 또는 기타 적당한 숙주 동물을 면역제로 전형적으로 면역시켜, 이러한 면역제와 특이적으로 결합하게 될 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 또 다른 한편으론, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다.
면역제에는 전형적으로, IL-23 또는 IL-23 수용체 폴리펩티드 또는 이의 융합 단백질이 포함될 것이다. 일반적으로, 사람 기원 세포가 요망되는 경우에는 말초혈 림프구 ("PBLs")를 사용하거나, 또는 비-사람 포유류 공급원이 요망되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 상기 림프구를 적합한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주를 이용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 한 가지 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)이 결여된 경우, 상기 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지하는 물질인, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되어, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 발현 수준을 높게 유지시켜 주는 것이며, 이는 HAT 배지과 같은 배지에 민감하다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어, 공급원 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia]으로부터 수득할 수 있는 쥐과 골수종 세포주이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 세포주가 또한, 사람 모노클로널 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 [참조: Kozbor, J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63].
이어서, 하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지를 대상으로 하여, IL-23 또는 IL-23 수용체에 대항한 모노클로널 항체가 존재하는지를 알아보기 위해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로널 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들면, 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정한다. 이러한 기술 및 검정법은 당해 분야에 공지되어 있다. 모노클로널 항체의 결합 특이성은, 예를 들어, 문헌 [참조: Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스카챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 과정에 의해 클론을 아클로닝한 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [Goding, 상기 참조]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어, 둘벡코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또 다른 한편, 하이브리도마 세포를 포유류에서 복수 (ascite)로서 생체내 성장시킬 수 있다.
아클론에 의해 분비된 모노클로널 항체를 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리 또는 정제할 수 있다.
모노클로널 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 방법에 의해 만들 수도 있다. 본 발명의 모노클로널 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 및 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내에 놓아둔 다음, 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로널 항체를 합성시킬 수 있다. 이러한 DNA는 또한, 암호화 서열을 상동성 쥐과 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인으로 대체시킴으로써 [미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 참조] 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열 전부 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신할 수 있거나 또는 키메라 2가 항체를 창출하기 위해 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대신할 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, 중쇄 가교 결합을 방지하기 위해 Fc 영역 내의 어떠한 지점에서도 절단시킬 수 있다. 또 다른 한편, 관련 시스테인 잔사를 또 다른 아미노산 잔사로 치환시키거나 또는 가교 결합을 방지하도록 결실시킨다. 시험관내 방법 역시 1가 항체를 제조하는데 적합하다.
본 발명의 항-IL-23 및 항-IL-23 수용체 항체는 추가로, 인간화 항체 또는 사람 항체일 수 있다. 비-사람 (예: 쥐과) 항체의 사람 적응화 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예를 들면, Fv, Fab, Fab', F (ab')2, 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 인간화 항체에는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔사를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지닌 비-사람 종 (공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트 또는 래빗트의 CDR로부터의 잔사로 대체시킨 사람 면역글로불린 (수용자 항체)가 포함된다. 몇몇 경우에는, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 잔사를 상응하는 비-사람 잔사로 대체시킨다. 인간화 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 또한 유입된 CDR 또는 골격 서열에서도 전혀 발견되지 않는 잔사를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역의 전부 또는 거의 전부가 비-사람 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 거의 전부가 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역인 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 항체는 최적으로는, 면역글로불린 불변 영역, 전형적으로는 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일정 부분을 포함할 것이다 [참조: Jones et al., Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)].
비-사람 항체를 사람 적응화시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-사람 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔사를 갖는다. 이들 비-사람 아미노산 잔사는 종종 "유입 (import)" 잔사로서 지칭되는데, 이들은 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 사람 적응화 과정은 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 대체시킴으로써, 필수적으로 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참조: Winter and co-workers, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "사람 적응화" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)인데, 여기서는 본래 보다 훨씬 덜한 사람 가변 도메인을 비-사람 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시켰다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 CDR 잔사와 가능하게는 몇몇 FR 잔사를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔사에 의해 치환시킨 사람 항체이다.
사람 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display libraries)를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 이용하여 생성시킬 수도 있다 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. 사람 모노클로널 항체를 제조하기 위한 다음 문헌의 기술들을 이용할 수 있다 [참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. 유사하게, 사람 항체는 내인성 면역글로불린 유전자를 부분적 또는 완전히 불활성화시킨 형질전환성 동물, 예를 들면, 마우스 내로 사람 면역글로불린 유전자 자리를 도입함으로써 제조할 수 있다. 챌린지시, 유전자 재배열, 어셈블리, 및 항체 레퍼토리 (repertoire)를 포함한 모든 국면에 있어서 사람에게서 관찰된 것과 근접하게 유사한 사람 항체 생성이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참조: U. S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 과학 공보: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)].
멘데츠 (Mendez) 등은 상기 기술을 추가로 개선시켰으며, 항원으로의 챌린지시 고 친화성의 완전한 사람 항체를 생성시키는 "크세노마우스 (Xenomouse) II"로 명칭된 형질전환성 마우스 주를 생성시켰다 [참조: Nature Genetics 15: 146-156 (1997)]. 이는, 상기 언급된 바와 같이 내인성 JH 세그먼트 내로의 결실을 수반한 마우스 내로 메가-염기 (megabase) 사람 중쇄 및 경쇄 유전자 자리를 생식 계열 통합함으로써 달성하였다. 상기 크세노마우스 II는 대략 66 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 영역, 및 3가지 상이한 불변 영역 (μ, δ 및 χ)을 함유하는 1,020 kb의 사람 중쇄 유전자 자리를 수용하고, 또한 32 Vκ 유전자, Jκ 세그먼트 및 Cκ 유전자를 함유하는 800 kb의 사람 κ유전자 자리를 수용한다. 이들 마우스에서 생성된 항체는 유전자 재배열, 어셈블리 및 레퍼토리를 포함한 모든 국면에 있어서 사람에게 관찰된 것과 근접하게 유사하다. 사람 항체는 내인성 항체에 비해 우선적으로 발현되는데, 이는 쥐과 유전자 자리에서의 유전자 재배열을 방지시켜 주는 내인성 JH 세그먼트 내에서의 결실에 기인한 것이다.
또 다른 한편, 파지 디스플레이 기술 [참조: McCafferty et al., Nature 348, 552-553 (1990)]을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 사람 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 동일 프레임 내에서 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면, M13 또는 fd의 다수 또는 소수 외피 (coat) 단백질 유전자 내로 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에서 기능성 항체 단편으로서 표시하였다. 상기 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 일본쇄 (single-stranded) DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초하여 선별하면, 이러한 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성들 중의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있으며, 이들에 대한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다 [참조: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993)]. V-유전자 세그먼트의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [참조: Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)]에서는 면역시킨 마우스 비장으로부터 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이 (array)를 분리하였다. 면역시키지 않은 사람 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 작제할 수 있고, 다음 문헌에 기재된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 항원(자가-항원 포함) 어레이에 대한 항체를 분리할 수 있다 [참조: Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993)]. 천연 면역 반응에서는, 항체 유전자가 돌연변이를 고속으로 축적시킨다 (체세포 초변이). 도입된 변화들 중의 일부는 보다 높은 친화성을 부여해줄 것이고, 고친화성 표면 면역글로불린을 표시하는 B 세포가 후속 항원 챌린지 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. 이러한 천연 과정은 "연쇄 셔플링 (chain shuffling)"으로서 공지된 기술을 이용함으로써 모의할 수 있다 [참조: Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)]. 이러한 방법에서는, 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를, 면역시키지 않은 공여자로부터 수득한 V 도메인 유전자의 천연 변이체 레퍼토리로 순차적으로 대체시킴으로써, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 사람 항체의 친화성을 개선시킬 수 있다. 이러한 기술을 이용하여, nM 범위의 친화성을 지닌 항체 및 항체 단편을 생성할 수 있다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리를 제조하기 위한 전략이 문헌 [참조: Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)]에 보고되었다.
항체 단편을 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래 항체의 단백질 분해적 절단을 통하여 유도되었다 [참조: 예를 들면, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229: 81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 본 발명에 따라서 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성시킬 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [참조: Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. 또 다른 양태에서는, 루이신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')2를 형성시켜 F(ab')2 분자의 어셈블리를 증진시킨다. 또 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리할 수 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술이 당업자에게 명백할 것이다.
공유적으로 연결된 2개의 항체로 구성된 이종-접합체 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역 시스템 세포가 바람직하지 못한 세포를 표적으로 하도록 제안되었으며(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료하는 것으로 제안되었다 (PCT 공개특허공보 WO 91/00360 및 WO 92/200373). 이종-접합체 항체는 널리 공지되어 있고 시판중인 가교 결합제를 사용하여, 통상적인 가교 결합법을 이용하여 제조할 수 있다.
모노클로널 항체의 생성에 관한 추가의 정보에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 [참조: Goding, J. W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, Inc., London, San Diego, 1996; Liddell and Weeks: Antibody Technology: A Comprehensive Overview, Bios Scientific Publishers: Oxford, UK, 1995; Breitling and Dubel: Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York, 1999; and Phage Display: A Laboratory Manual, Barbas et al., editors, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2001].
3. 표적 질환
IL-17은 류마티스성 관절염 (RA)을 포함한 각종 염증 질환과 밀접한 관계가 있어 왔다. RA의 기본적인 특징들 중의 하나는 관절 주위 뼈의 침식이다. 파골 세포 (osteoclast)는 뼈 흡수에 있어 중요한 역할을 하지만, 전구 세포로부터 파골 세포가 형성되는 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 최근에, 인터루킨 17 (IL-17)이 마우스 조혈 세포와 1차 조골 세포 (osteoblast)의 공동-배양물에서 파골 세포-유사 세포의 형성을 유도할 수 있었다고 문헌 [참조: Kotake et al., J. Clin. Invest. 103: 1345 (1999)]에 보고되었다. 이와 같이 IL-17 유도된 파골세포 형성이 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)의 선택적인 억제제인 인도메타신 (indomethacin)에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. RA 환자로부터의 활액은 골관절염 (OA) 환자에 비해 상당히 높은 수준의 IL-17을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 면역염색법을 이용하여, IL-17-양성 단핵 세포를 RA 환자의 활막 조직에서 탐지하였지만, OA 환자로부터의 조직에서는 탐지하지 못하였다. 이러한 발견은 IL-17이 RA에서 뼈 침식과 관절 손상의 원인이 될 수 있다는 사실을 지시해주므로, 이들이 억제시키고자 하는 표적일 수 있다.
베체트병은 건강한 개체에 비해 IL-17의 혈청 수준이 현저하게 상승된 것으로 밝혀졌다 [참조: Hamzaoui et al., Scand. J. Rheumatol. 31(4): 205-10 (2002)].
상승 수준의 IL-17은 천식 환자의 기도 내에서 발견되었으며, 이는 IL-17이 기타 프로-염증성 매개인자, 예를 들면, 알파-케모카인의 방출을 통하여 염증 반응을 증폭시킬 수 있다는 것을 제안하였다 [참조: Molet et al., J. Allergy Clin. Immunol. 108 (3): 430-8 (2001); and Wong et al., Clin. Exp. Immunol. 125 (2): 177-83 (2001)].
상승 수준의 IL-17은 전신성 홍반성 루프스 환자에 대해서도 보고되었다 [참조: Wong et al., Lupus 9 (8): 589-93 (2000)].
IL-17은 건선에 있어 일정 역할을 하는 것으로 보고되었다 [참조: Homey et al., J. Immunol. 164 (12): 6621-32 (2000)].
IL-17 mRNA는 다발성 경화증의 CSF 단핵 세포와 혈액 중에서 증가된다 [참조: Matusevicius et al., Mult. Scler. 5 (2): 101-4 (1999)].
이들 및 유사한 수 많은 보고서에 따르면, IL-17 생성을 유도시킬 수 있는 IL-23의 능력을 억제시킴으로써 IL-17 수준을 저하시키는 IL-23 길항제가 각종 (만성) 염증 질환 및 질병을 치료하는데 있어 유용한 후보물이다. 이러한 질환과 질병의 예에는 만성 염증, 자가 면역 당뇨병, 류마티스성 관절염 (RA), 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증 (MS), 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 성인 호흡기 장애 증후군, 베체트병, 건선, 만성 폐 염증 질환, 이식편 대 숙주 반응, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환 (IBD), 알츠하이머병 및 발열증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
IL-17은 IFN-γ 생성을 증진시킴으로써 세포-매개된 면역 반응을 유도시킴으로써 결핵과 같은 특정의 감염성 질환에 대한 보호 반응을 생성시키는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, IL-23 효능제 (효능제 항체 포함)는 각종 감염, 예를 들면, 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 유발된 결핵에 대한 세포-매개된 면역 반응을 유도시키는데 유용하므로, 매년 전세계적으로 3백만 이상의 사상자를 내는 상기 감염성 질환을 치료하는데 있어 가장 유망한 약물 후보이다.
4. 제약 조성물
IL-23 또는 IL-23 수용체 뿐만 아니라 전술된 스크리닝 검정법에 의해 동정된 기타 IL-23 길항제 또는 효능제 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 제약 조성물 형태로, 각종 장애, 특히 염증 질환 또는 세포 매개된 면역 반응을 유도함으로써 치료되는 질환을 치료하기 위해 투여할 수 있다.
항체 단편을 사용하는 경우에는, 표적 단백질의 결합성 도메인과 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성할 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 [참조: Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)].
활성 성분을, 예를 들어, 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 반응에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자, 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀션 중에 포착 (entrap) 시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, supra]에 기재되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용될 제형은 반드시 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 해당 항체를 함유하는 고형의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 조형품 (shaped article) 형태, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔 [예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리악티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체와 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있게 하지만, 특정의 하이드로겔은 보다 단시간 동안 단백질을 방출시킨다. 피포성 항체가 체내에 장시간 잔존하는 경우에는, 이들 항체가 37℃ 하에 수분 노출됨에 따라 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성을 상실하고 면역원성 변화가 유발될 수도 있다. 관련 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적인 전략이 강구될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에는, 설프하이드릴 잔사를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며, 특정의 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성할 수 있다.
본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 필요한 대로 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있는데, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성제들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도하는 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재하거나, 또는 별도로 제형화하여 동시에 투여하거나 또는 어떠한 순서로든 연속해서 투여할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 IL-23 길항제는 표적 질병과 질환의 치료를 위해 사용하는데 있어서 소염제와 기타 활성 화합물과 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 화합물에는 코르티코스테로이드; 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAIDs), 예를 들면, 아스피린, 이부프로펜 및 COX-2 억제제, 예를 들어, Celebrex® 및 Vioxx®; 질병 완화 항류마티스약 (DMARDs), 예를 들면, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 아자티오프린, 사이클로스포린, 하이드록시클로로퀸, 및 D-페니실라민; 및 생체 반응 조정물질 (BRMs), 예를 들어, TNF 및 IL-1 억제제가 포함된다.
다음 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공된 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참조 문헌은 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
실시예 1
인터루킨-23 (IL-23)은 인터루킨-17 (IL-17) 생성을 특징적으로 나타내는 별개의 CD4 T 세포 활성화 상태를 증진시킨다
활성화된 T 세포에 의해 명백히 생성되긴 하지만, 기존의 보고서는 IL-17을 Th1 및 Th2 분극 사이토킨 프로필의 범례 내에 명백히 분류하지 못하였다. 본 실시예에 기재된 초기 실험의 목적은 IL-17이 Thl 또는 Th2 반응과 연관된 것과는 별개의 시그널에 반응하여 발현될 가능성이 있는지를 검사하는 것이다.
실험 과정
세포 배양 - C57/BL-6 마우스로부터 비장의 단일 세포 현탁물을 제조하고, 이와 같이 현탁된 비장 세포로부터 밀도 구배 원심분리시킴으로써 단핵 세포를 분리하였다. 2 x 106개 세포/ml를 각종 자극의 존재 또는 부재 하에 IL-2 (100 단위/ml)와 함께 배양한 후(해당 도면의 주석에 지시된 시간 동안 배양함), 세포를 수집하고, ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 IL-17에 대해 분석하였다. 대식세포를 rGM-CSF (2 ng/ml) 및 rIL-4 (1000 단위/ml)로 4일 동안 처리하고, 세척한 다음 LPS (0.5 ㎍/ml)을 사용하여 재활성화시킴으로써, 대식세포 (비장 세포 현탁물로부터 유착 집단으로서 수득함)로부터 수지상 세포를 유도하였다. 쥐과 비장 세포의 단일 세포 현탁물로부터 분리된 단핵 세포를 CyC-CD4 + PE-CD44 또는 CyC-CD4 + PE-CD62L로 염색시키고, 기억 표현형에 대해서는 CD44high/CD62Llow인 CD4+ 세포 또는 본래의 표현형에 대해서는 CD44low/CD62high인 CD4+ 세포로 분류함으로써, 기억 및 본래의 T 세포를 분리하였다.
T 세포 분화의 시험관내 유도 - 항-CD4 자기 비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여 야생형 C57/BL6 마우스의 비장으로부터 CD4+ 세포를 정제하였다. 정제된 T 세포 (2 x 106개 세포/ml)를, 5 ㎍/ml 항-CD3 및 1 g/ml 항-CD28 항체로 피복시킨 판 상에 도말함으로써 3일 동안 활성화시켰다. 배양물을 IL-2로 보충하고 IL-12 (20 mM) + 항-IL4 (0.5 ㎍/ml)로 처리하거나 (Thl 분화의 경우), 또는 IL-23 (10 nM)로 처리하였다 (IL-17 생성의 경우). 초기 활성화를 수행한 후, 세포 배양물을 광범위하게 세척하고, 항-CD3 (1 ㎍/ml)으로 24시간 더 재자극한 다음, 세포 상등액을 대상으로 하여 ELISA를 사용하여 분비된 각종 사이토킨에 대해 분석하였다.
IL-17 유도의 IL-12p40 항체 억제 - 항-IL-12 항체 (R & D Systems, cat. no. AF-419-NA) 또는 무관한 대조군 항체 (항-FGF-8b (R & D Systems, cat. no. AF-423-NA))를 IL-23 (100 ng/ml) 또는 LPS-자극된 수지상 세포 (10% v/v)의 컨디셔닝된 배지와 함께 37℃에서 1시간 동안 예비-배양한 다음, 마우스 비장으로부터 분리된 단핵 세포 (2 x 106개 세포/ml)와 함께 5 내지 6일 더 항온 배양하였다. 상등액을 수집하고 ELISA를 사용하여 IL-17 수준을 측정하였다.
IL-23 - 쥐과 IL-23의 정제 - 카복실-말단 His-태그된 pl9와 플래그-태그된 p40을 사람 배아 신장 세포 (293 세포)에서 동시 발현시킴으로써 IL-23 성분을 생성시키고, 분비된 단백질을 닉켈 친화성 수지에 의해 정제하였다. 내독소 수준은 0.2 내독소 단위/㎍ 미만 하에서는 탐지 불가능하였다.
결과
첫째, IL-17의 생성을 자극할 수 있는 각종 미생물성 생성물의 능력을 검사하였다. 라임병 유발균 스피로헤타 (spirochete), 비. 부르그도페리 (B. burgdoferi)로부터의 미생물성 리포펩티드에 반응하여 증가된 IL-17이 최근에 관찰되어 다음 문헌에 보고되었다 [참조: Infante-Duarte et. al., J Immunol 165, 6107 (2000)]. LPS (그람-음성 세균), LTA (그람 양성 세균) 또는 LBP (세균성 리포펩티드)를 포함한 각종 미생물성 펩티드의 존재 하에 비장 세포를 배양하면, IL- 17이 생성되었다 (도 1). 정제된 T 세포 단독으로는 IL-17를 생성시키지 못할 뿐만 아니라 정제된 대식 세포 자체도 IL-17를 생성시키지 못하였다. 정제된 T 세포를, 판-결합된 항-CD3을 이용하여 수용체 가교 결합시키고 활성화된 대식 세포/수지상 세포로부터의 상등액으로 처리하면, 증가 수준의 IL-17이 생성되었는데, 이는 IL-17 생성을 증진시키기 위해 T 세포 상에서 작용하는 상기 세포에 의해 방출된 동정되지 않은 인자(들)이 존재한다는 것을 지시해준다.
이러한 IL-17 증진 활성에 대해 책임이 있을 수도 있는 후보 분자의 발현을 프로필하는데 있어서, IL-23 (참조: B. Oppmann et al., Immunity 13, 715 (2000)) 성분 pl9 및 p40의 100 내지 1000배 증가된 mRNA 발현이 활성화된 수지상 세포 내에서 실시간 RT-PCR (제시되지 않음)의 의해 관찰되었으므로, IL-23의 효과를 검사하였다.
카복실-말단 His-태그된 pl9와 플래그-태그된 p40을 사람 배아 신장 세포 (293 세포)에서 동시 발현시킴으로써 쥐과 IL-23 성분을 생성시키고, 분비된 단백질을 닉켈 친화성 수지에 의해 정제하였다. 내독소 수준은 0.2 EU/㎍ 미만 하에서는 탐지 불가능하였다. 비장 세포 배양물을 Thl-유도성 조건 (IL-12+ 항-IL-4), Th2-유도성 조건 (IL-4+항-IFN-γ), 또는 정제된 IL-23 (100 ng/ml) 하에 3 내지 4일 동안 IL-2 (lOO U/ml) 및 ConA (2.5 ㎍/ml)의 존재 하에 항온 배양한 다음, 배양물을 세척하고, ConA로 24시간 더 재자극하였다. ELISA를 사용하여 각종 사이토킨 수준을 측정하였다. ELISA 키트의 표준 곡선 범위의 가장 낮은 희석률 미만의 수준을 '탐지 가능하지 않음 (N. D.)'로 기록하였다. 다음 결과는 독립적으로 수 행된 3가지 실험을 나타낸 것이다.
IL-12-자극된 Thl-유도성 조건 하에 배양된 비장 세포는 IL-17을 최저 수준으로 생성시킨 반면, Th2-유도성 조건 하에서는 IL-17 생성이 대조군에 비해 증가하지 않았다. 이 결과가 다음 표 1에 제시되어 있다:
Figure 112005022589375-pct00001
배양물 내에 IL-23이 존재하면, IL-17이 용량-의존적 방식으로 높은 수준으로 생성되었다 (도 2). IL-23은 또한, Thl-유도성 조건 하에 관찰된 것 보다 높은 수준의 GM-CSF를 생성시켰다. 이와는 대조적으로, IFN-γ 수준은 Thl-유도성 조건 하에 수득된 것 보다 상당히 더 낮았다. TNF-α 수준은 Thl 조건과 유사하였다. IL-12p40 단독으로는 IL-17를 전혀 생성시키지 못하였다 (데이터는 제시되지 않음). IL-23는 상승 수준의 IL-17 mRNA를 증진시켰다 (도 2B). IL-17 mRNA 수준은 IL-23 노출 6시간 내에 수 백배 증가하였고, IL-23이 지속적으로 존재하면 이러한 상승 수준을 유지하였다. 이러한 효과는 IL-17에 대항한 항체가 존재하여도 전혀 억제되지 않았는데, 이는 IL-17 그 자체가 이러한 과정에 대한 원인을 제공하지 않았다는 것을 제시해준다 (도시되지 않음). 또한, 최근에 동정된 IL-17 계열 구성원인 IL-17F에 대한 mRNA가 IL-23에 반응하여 상향 조절되었다는 사실이 밝혀졌다 (도 2C).
IL-23이 기억 T 세포 증식은 증진시키지만 본래 T 세포 증식은 증진시키지 않는 것으로 보고되었다 [참조: D. M. Frucht, supra]. 따라서, 본래 T 세포 집단으로부터의 IL-17 생성에 대한 IL-23 효과 대 기억 T 세포 집단으로부터의 IL-17 생성에 대한 IL-23 효과를 검사하였다. 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)에 의해 비장 세포로부터 정제된 CD4+ T 세포를 분리하였다. 기억 세포 집단은 CD4+CD44high (참조: R. C. Budd et al., J Immunol 138, 3120 (1987)), 또는 CD4+CD62Llow (참조: T. M. Jung, W. M. Gallatin, I. L. Weissman, M.O. Dailey, J Immunol 141, 4110 (1988))로서 선별되었으며, 본래 세포 집단은 CD4+CD44low 또는 CD4+CD62Lhigh로서 선별되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, IL-23은 기억 세포 집단 (CD44high 및 CD62Llow)에서만 IL-17 생성을 자극하였으며, 본래 세포 (CD44low 또는 CD62Lhigh)에서는 자극하지 않았다.
IL-23-매개된 IL-17 생성은 IL-23와 공유된 p40 소단위체와 상호 작용하는 중화 IL-12 항체의 존재 하에서 완전히 차단되었다 (도 4A, 좌측 패널). 이러한 효과는 무관한 항체의 존재 하에서는 IL-17 생성 변화가 전혀 없기 때문에 항원 제시 세포 상에서의 Fc 수용체의 연결에 기인한 것이 아니다. 상기 항체는 또한, LPS 자극된 수지상 세포로부터의 컨디셔닝 배지에 반응하여 관찰된 IL-17 생성 유도를 >50% 억제하였다 (도 4A, 우측 패널). 야생형 마우스 또는 IL-12p35 성분이 결여된 마우스 (균주: B6.129S1-IL12atm1Jm)와 비교해서, IL-12p40 성분이 결여된 마우스 (균주: B6.129Sl-IL12btmlJm)의 비장 세포 배양물로부터의 ConA 자극에 반응하여 IL-17 생성이 현저히 저하되긴 하였지만 완전히 없어지진 않은 것으로 관찰되었다 (도 4B).
IL-17 생성에 있어서의 IL-12 역할을 검사하기 위해, 증가량 (0.001 내지 1nM)의 쥐과 IL-12를 IL-23 (lnM) 함유 배양물에 부가하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, IL- 12는 IL-17 수준을 용량 의존적 방식으로 감소시켰다.
부가적으로, IL-12의 특이적 수용체 성분 (참조: A.O. Chua, V. L. Wilkinson, D. H. Presky, U. Gubler, J Immunol 155, 4286 (1995))인 IL-12 수용체 베타 쇄 2 (IL-12Rβ2)가 결여된 마우스로부터의 비장 세포 (참조: Wu et al., J Immunol 165, 6221 (2000))를 정제된 IL-23로 처리하였다. IL-12Rβ2-/- 마우스로부터의 비장 세포는 IFN-γ 수준에 전혀 영향을 미치지 않으면서 자극되지 않은 대조군에 비해 IL-17 생성을 증가시킴으로써 IL-23 자극에 반응하였다 (도 5B). 놀랍게도, 이들 마우스에서의 IL-17의 배경 수준은 야생형 마우스와 비교해서 10배 이상이었는데, 이는 IL-23-유도된 IL-17 생성이 IL-12에 의해 음성적으로 조절될 가능성이 있다는 것을 제시해준다. 그러나, IL-12Rβ2 녹아웃 마우스와는 달리, 본 발명자들은 IL-12p35 녹아웃 마우스로부터의 비장 배양물에서 IL-17 생성 증가를 관찰하지 못하였다. 이러한 차이에 대한 이유는 공지되지 않았지만, p35의 부재 하에서의 IL-12p40 기능 상의 변화, 또는 유전적 배경 차이 또는 병원체 노출과 관련이 있을 수 있다.
토의
이들 데이터를 취합해 보면, 효과인자 사이토킨으로서 IL-17를 발현하는 별개의 T 세포 활성화 상태 증진에 있어 IL-23이 일정 역할을 한다는 사실을 제시해준다. Thl 및 Th2 범례는 세포 매개된 면역 반응 대 체액성 면역 반응을 증진시키는 것으로 보고되었다. 이들 반응은 세포내 병원체와 세포외 병원체 각각에 대한 중요한 방어를 제공해주고, 이들 반응 중의 어느 한 결함도 특이적 병원체에 대한 감수성 증가와 연관이 있다. 이와는 달리, IL-23은 선천 면역 반응의 매개인자로서 주로 기능하는 것으로 여겨지는 세포에 상당히 의존하는 것을 특징으로 하는 병원체에 대한 적응성 면역 반응을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 이러한 반응의 주요 효과인자 사이토킨인 IL-17은 유도된 케모카인 생성을 통하여 단구와 호중구의 보다 신속한 동원을 증진시킬 수 있다. 또한, IL-23에 반응하여 관찰된 고수준의 GM-CSF 생성은 부가의 골수성 세포 생성을 뒷받침해준다. 이는 국소 IL-17-자극된 기질성 세포로부터의 G-CSF 생성에 의해 추가로 증대된다. 그러나, 이러한 적응성 반응 형질은 골수세포 계열 반응의 식세포성 세포에만 전적으로 의존하지 않는데, 이는 IL-17가 IL-17에 의한 ICAM 유도를 증진시킴으로써 추가의 T 세포 반응의 중요한 동시-자극을 제공해주는 것으로 공지되었기 때문이다.
최근에는, 몇 가지 연구들이 p35 결핍성 마우스와 p40 결핍성 마우스 간의 중요한 차이점을 지적하였다 [참조: Decken et al., Infect Immun. 66: 4994-5000 (2002); Cooper et al., J. Immunol. 168: 1322-1327 (2002); Elkins et al., Infection & Immunity 70: 1936-1948; Holscher et al., J. Immunol. 167: 6957-6966 (2001)]. 이들 연구는 각종 유기체 모델의 면역-매개된 클리어런스 (clearance)에 있어서 p40 상실이 p35 상실 보다 일반적으로 더 불리하다는 관찰 결과를 공유한다.
IL-17 발현과 수 많은 심각한 염증 질환과의 연관성은 IL-23 길항제가 이러한 질환 치료에 있어 전도 유망한 약물 후보가 될 수 있다는 것을 제안해준다.
실시예 2
인터루킨-23 (IL-23) 결핍성 마우스
IL-23과 IL-17 간의 생체내 관계를 추가로 연구하기 위해, IL-23 결핍성 마우스의 표현형을 IL-17 결핍성 동물의 표현형과 비교하였다.
실험 과정
마우스: 모든 마우스를 병원체가 없는 특정 조건 하에 사육하였다. IL-12p40-/- 마우스를 공급원 [Jackson laboratory (Bar Harbor, MA)]로부터 구입하였고, C57BL/6은 공급원 [Charles River laboratories (San Diego, CA)]로부터 구입하였다.
시약: 달리 지시되지 않는 한, 시약은 다음 공급원으로부터 구입하였다: 항체 및 ELISA 시약은 BD Pharmingen (San Diego, CA)로부터 구입하였고, 사이토킨은 R & D systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였으며, TNP-커플링된 항원은 Biosearch Technologies (Novato, CA)로부터 구입하였고, 조직 배양용 시약은 Invitrogen (Carlsbad, CA)로부터 구입하였다.
IL23pl9 결핍성 마우스의 생성. 쥐과 IL23pl9 유전자 자리를 포괄하는 게놈 DAN를, Genome Systems (Incyte Genomics, Palo Alto, CA)에 의한 게놈 BAC 라이브러리의 클론 198a3으로부터 분리하였다. 완전한 IL23pl9 암호화 영역을 EGFP 리포터 유전자로 대체시키도록 고안된 표적화 벡터를, 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 다음 DNA 단편으로부터 작제하였다: 티미딘 키나제 선별 카셋트; 원위 및 근위 말단 각각에 위치한 내인성 SacII 및 BglII 부위에 의해 규정된 5403개 염기쌍의 5' 상동성 암(arm); BamHI (5'-말단) 및 AflIII (3'-말단)을 사용하여 pEGFP-1 (BD Clontech, Palo Alto, CA)로부터 절단된 EGFP 발현 카셋트; PGK-네오 내성 카셋트; 및 근위 말단에 내인성 XhoI 부위로써 규정되고 원위 말단에 프라이머 5'-GCTTGGTGGCCCACCTATGAT-3' (서열 번호 1)로써 규정된 1203 bp 짧은 암 (도 6A). 이러한 작제물을 129/SvEv 배아 줄기 (ES) 세포 [참조: Huang et al., Science 259: 1742 (1993)] 내로 전기천공시키고, G418 및 간시클로비르 (Gancyclovir)로의 선별 후 600개 클론 중의 9개에서 상동 재조합이 일어났다. 유전자 자리의 정확한 표적화를 검증하기 위해, ES 세포 및 동물로부터의 게놈 DNA를 서던 블롯으로 분석하였다. BamHI로 분해시킨 다음, 막을 프로브 1 [올리고 5'-AGACCCTCAAAGTTCATGAC-3' (센스) (서열 번호 2) 및 5'-CTGACGGCGCTTTCTCTACC-3' (안티센스) (서열 번호 3)을 이용하여 PCR함으로써 수득된 831 bp 게놈 DNA 단편]과 하이브리드화시키면, 야생형 대립 유전자에 대해서는 7027 bp 단편이 생성되었고 정확하게 표적화된 돌연변이체 대립 유전자에 대해서는 11788 bp 단편이 생성되었다. 유사하게, 게놈 DNA를 EcoRI로 분해시킨 다음, 막을 프로브 2 [올리고 5'- TTTTGCCAGTGGGATACACC-3' (센스) (서열 번호 4) 및 5'-AACTGCTGGGGCTGTTACAC-3' (안티센스) (서열 번호 5)를 이용하여 PCR함으로써 수득된 390 bp 게놈 DNA 단편]과 하이브리드화시키면, 야생형 대립 유전자에 대해서는 9197 bp 단편이 생성되었고 정확하게 표적화된 돌연변이체 대립 유전자에 대해서는 6211 bp 단편이 생성되었다. 2개의 ES 세포 클론 (lc5 and 3h6)을 포배 (blastocyst) 내로 주사하고, 돌연변이체 대립 유전자를 자신의 생식 세포로 전달시킨 키메라 동물을 수득하였다. 통상적인 유전자형별 검사를 위해, 본 발명자들은 공통의 안티센스 프라이머 (5'-GCCTGGGCTCACTTTTTCTG-3') (서열 번호 6), 및 야생형 특이적 센스 프라이머 (5'-GCGTGAAGGGCAAGGACACC-3') (서열 번호 7)와 녹아웃-특이적 센스 프라이머 (5'-AGGGGGAGGATTGGGAAGAC-3') (서열 번호 8)를 이용하는 PCR에 기초한 방법을 사용하였다. 이러한 프라이머-삼중체는 야생형 대립 유전자에 대해서는 210 bp 단편을 증폭시키고 돌연변이체 대립 유전자에 대해서는 289 bp 단편을 증폭시킨다. 다음 조건을 이용하여, PCR을 로보사이클러 (Robocycler: Stratagene, La Jolla, CA)에서 수행하였다: 94℃, 60" 1주기; 94℃, 30", 58℃, 30", 72℃, 60" 35주기; 72℃, 7" 1주기.
혈액 세포 아세트의 FACS 분석: 비장, 흉선 및 림프절을 6 내지 8주생 마우스로부터 분리하고, 표준 방법에 의해 단일 세포 현탁물을 제조하였다. 말초혈을 심장 천자에 의해 수득하고 EDTA로 처리하여 응고를 방지하였으며, ACK 용해 완충액 (Biosource, Camarillo, CA)를 사용하여 적혈구를 용해시켰다. 2% 열 불활성화 송아지 혈청이 보충된 행크스 평형 염 용액 (HBSS) 중의 얼음 상에서 모든 세포를 30분 동안 항온 배양하였다. 이어서, 세포를 동일한 완충액 중에서 수 백만개 세포당, 피코에리트린, 바이오틴 또는 Cychrome™과 커플링된 각종 항체 1 ㎍으로 염색하였다. 바이오티닐화 항체를 사용한 경우에는, 스트렙타비딘-커플링된 PE-TR 접합체 (Caltag, Burlingame, CA)를 검정에 사용하였다. 동일한 완충액으로 2회 세척한 후, Epics-XL 유동 세포계수 시스템 (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)을 사용하여 형광을 탐지하였다.
유전적 T-세포의 자극: CD4 및 CD62L 이중 양성 T-세포를 2-단계 분리 프로토콜에 의해 6 내지 8주생 balb/c 마우스의 비장으로부터 분리하였다. 먼저, 음성 자기 선별 (Miltenyi, Auburn, CA)에 의해 T-세포로부터 기타 세포 유형을 고갈시켰다. 이어서, 이들 세포를 CD4 및 CD62L에 대항한 항체로 표지시키고 MoFlo 분류기 (DakoCytomation, Fort Collins, CO) 상에서 FACS함으로써 분류하였다. 야생형 마우스 또는 IL-29p19-/- 마우스 (둘 다 C57BL/6 배경 내이다)로부터의 수지상 세포를 또한 2-단계 프로토콜에 의해 분리하였다. CDl1c 양성 비장 세포는, CD11c, MHC 부류 II, 및 CD8에 대항한 항체로 표지시키기에 앞서 자기 분리함으로써 (Miltenyi, Auburn, CA) 양성 선별하였다. 이어서, MoFlo 분류기를 다시 사용하여, CD11c+/MHC-II+/CD8- 세포를 FACS에 의해 분류하였다. 이러한 실험에 사용된 모든 집단은 98% 이상 순수하였다. 동종-자극 반응을 유발시키기 위해, 104개 수지상 세포 및 105개 T-세포를, 페니실린-스트렙토마이신과 10% 열 불활성화 송아지 혈청 (Hyclone, Logan, UT)이 보충된 총 200 ㎕의 IMDM에서 2회 항온 배양하였다. 몇몇 경우에는, 100 ng/ml 세균성 리포펩티드를 가하여 수지상 세포에 의한 사이토킨 생성을 자극하였다. 항온 배양한지 5일 후, ELISA에 의한 사이토킨 측정을 위해 120 ㎕의 상등액을 제거하고, 이를 1 μCi 3H-티미딘/웰을 함유하는 신선한 배지로 대체시켰다. 제조업자 (Packard Instruments, Meriden, CT)의 지시에 따라서 Top Count 액상 신틸레이션 계수기를 사용하여 16시간 후에 티미딘 혼입량을 결정하였다.
생체내 T-세포 분화: 그룹당 4마리 숫컷 마우스와 4마리 암컷 마우스를 대상으로 하여, CFA (BD Biosciences, San Diego, CA)와 PBS의 1:1 에멀션 30 ㎕ 중의 75 ㎍의 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin: KLH) (Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 왼쪽 뒷발바닥으로 면역시켰다. 배농 서혜부 및 오금 림프절 (draining inguinal and popliteal lymph nodes)을 5일 후에 수거하고, 페니실린-스트렙토마이신, 10% 열 불활성화 송아지 혈청 (Hyclone, Logan, UT), 및 25 ㎍/ml KLH이 보충된 IMDM에서 재자극하였다. 증식 검정을 위해, 5*105개 세포를 96 웰 판 중에 200 ㎕으로 3회 시딩하고, 항온 배양 기간의 마지막 18시간 동안 1 μCi 3H-티미딘/웰을 부가하면서 112시간 동안 증식시켰다. 제조업자 (Packard Instruments, Meriden, CT)의 지시에 따라서 Top Count 액상 신틸레이션 계수기를 사용하여 티미딘 혼입량을 결정하였다. 사이토킨 분비를 위해, 2.5*106개 세포를 48 웰 판 중의 1 ml에서 항온 배양하고, 72시간 후에 상등액을 수거하였다. 사이토킨 분비는 ELISA에 의해 결정하였다. 제시된 데이터는 총 3가지 실험 결과로부터 대표적인 것이다.
지연형 과감작 반응: 그룹당 6마리 마우스에게 CFA (BD Biosciences, San Diego, CA)와 PBS의 1:1 에멀션의 조합된 총 200 ㎕ 중의 메틸화 소 혈청 알부민 (mBSA) (Sigma, St. Louis, MO) 200 ㎍을 복부내 3개 부위에 피하 주사하였다. 면역시킨지 8일째 되는 날에, PBS 중의 20 ㎕의 5 mg/ml mBSA를 마우스 한쪽 뒷발바닥에 주사함으로써 챌린지한 반면, 다른 쪽 뒷발바닥에는 20 ㎕의 PBS를 투여하였다. 일련의 7 스프링-부하된 칼리퍼 (Mitutoyo, City of Industry, CA)를 사용하여, 챌린지한 후 18, 42, 66시간 째에 발바닥 부종을 측정하였다. 항원-주사된 발바닥과 PBS-주사된 발바닥 간의 발바닥 두께 차이로부터 DTH 반응 크기를 결정하였다.
T-의존적 체액성 반응 및 면역글로불린 분석: 총 면역글로불린 수준을 측정하기 위해, 어느 한 유전자형의 면역되지 않은 6 내지 8주생의 8마리 숫컷 마우스와 8마리 암컷 마우스로부터 혈청을 수득하였다. 총 면역글로불린 이소형 수준을 루미넥스 (Luminex) 비드 검정법 (Upstate, Lake Placid, NY)에 의해 측정하였다. OVA 특이적 체액성 면역 반응을 평가하기 위해, 표현형당 7마리 마우스 그룹 (4마리는 숫컷이고 3마리는 암컷이다)를 0일째에 CFA 중의 OVA로 면역시키고, 21일 및 42일째에 불완전 프로인트 아쥬반트 (IFA) (Sigma, St. Louis, MO) 중의 동일한 항원으로 부스터 면역시켰다. 혈청 분석을 위해, 면역시키기 전 및 면역 후 14일, 28일 및 49일 째에 눈뒤 출혈 (retro-orbital bleeding)시킴으로써 혈액을 수집하였다. 포획제로서 OVA를 사용하고 탐지용의 이소형 특이적 2차 항체를 사용하여, ELISA에 의해 OVA 특이적 면역글로불린 이소형을 탐지하였다. ELISA의 선형 범위 내에 존재하도록 하기 위해서는, 혈청 샘플을 다음과 같이 희석하였다: IgGl의 경우에는 1:3125000, IgG2a의 경우에는 1:25000, IgG2b의 경우에는 1:625000, 및 IgG3, IgM, IgA 및 IgE의 경우에는 1:1000이다. 기존의 실험으로부터 OVA-면역시킨 마우스로부터 수득한 일련의 혈청 희석물을 표준물로서 사용하였는데, 이는 정제된 OVA 특이적 이소형이 시판되고 있지 않기 때문이다. 결과는 임의 단위로서 표시하였는데, 마지막으로 출혈시킨 야생형 그룹의 평균을 100으로 설정하였다. 기억 T-세포가 체액성 반응에 기여하는지를 평가하기 위해, 어느 한 유전자형의 5 내지 6마리 마우스 그룹을 0일 째에 CFA 중의 OVA로 면역시키고, 21일 째에 IFA 중의 TNP11-OVA로 부스터 면역시켰다. 혈청 분석을 위해, 면역시키기 전 및 면역 후 14일 및 28일 째에 눈뒤 출혈시킴으로써 혈액을 수집하였다. 포획제로서 TNP28-BSA를 사용하고 탐지용의 이소형 특이적 2차 항체를 사용하여, ELISA에 의해 TNP 특이적 면역글로불린 이소형을 탐지하였다. TNP-특이적 IgGl의 경우에는, 시판용 표준물을 사용하였다. TNP-특이적 IgG2a의 경우에는, 기존의 실험으로부터 TNP-면역시킨 마우스로부터 수득한 일련의 혈청 희석물을 사용하였고, 그 결과를 앞서 기재된 바와 같이 산정하였다. 샘플 희석은 IgG1의 경우에는 1:31250이고 IgG2a의 경우에는 1:1250이다.
T-독립적 체액성 반응: 유전자형당 6마리 마우스 그룹을 PBS 중의 50 ㎍ TNP1-LPS 또는 lOO ㎍ TNP20-AECM-Ficoll로 복강내 면역시켰다. 10일 후에 혈청을 수거하고, 포획제로서 TNP28-BSA를 사용하고 탐지용의 IgM 특이적 2차 항체를 사용하여, ELISA에 의해 TNP-특이적 IgM을 분석하였다. TNP 특이적 IgM 항체를 ELISA에 대한 표준물로서 사용하였다. 샘플 희석은 Ficoll의 경우에는 1:1280이고 LPS의 경우에는 1:5120이다.
결과
IL-23pl9 유전자의 결실. IL-23의 비-중복성 생체내 효과를 결정하기 위해, IL-23이 결핍되긴 하지만 IL-12를 생성시키기에는 적격한 마우스를 생성하였다. 4개의 엑손으로 이루어진 p19의 전체 암호화 영역을 증강된 GFP (eGFP) 리포터 유전자 및 네오마이신 내성 카셋트로 대체시킨 표적화 벡터를 작제하였다 (도 6). 정확하게 표적화된 2개의 ES 세포 클론인 lc5 및 3h6으로부터 생식 세포 전달을 획득하였고, 염색체당 3개 마커를 이용한 스피드 유사유전자형 (speed congenic)을 사용하여 돌연변이를 C57BL/6 배경 내로 역교배하였다. 이러한 분석에 근거하여, 129 배경으로부터의 유전적 오염도가 실험에 대해 5% 미만인 마우스 만을 선별하였다. eGFP 발현 패턴은 내인성 pl9 mRNA에 필적하였다 (데이터는 도시되지 않음).
IL-23pl9 -/- 마우스는 현성의 (overt) 표현형을 갖지 않는다. IL-23/IL-12 이중 결핍성 IL-12p40-/- 마우스의 표현형으로부터 예상된 바와 같이, IL-23pl9-/- 동물은 어떠한 현성의 표현형도 표시하지 않았으며, 멘델 법칙에 근거한 빈도로 탄생되었다. 기관에 대한 조직병리학적 검사시 비정상적인 점이 전혀 발견되지 않았으며, 임상 화학과 혈액학적 파라미터에 관한 추가 분석 결과도 야생형 동물과 녹아웃 동물 간의 차이를 나타내지 않았다. 더우기, IL-23pl9-/- 마우스는 크기와 체중 면에서 정상이고, 양 성별 모두 전적으로 생식 가능하였다. 각종 세포 표면 마커를 이용하여 흉선 세포, 비장 세포 및 말초혈 백혈구를 유동 세포계수 분석한 결과, 야생형 동물과 IL-23pl9-/- 동물 간에는 어떠한 주요 차이점도 나타나지 않았다 (표 2). IL-23은 기억 T-세포 상에서 작용하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발명자들은 각 아세트의 기억 세포 (CD44highCD62L-) 대 본래 세포 (CD62L+) 비를 결정하였지만, 야생형 마우스와 IL-23pl9-/- 마우스 간의 차이점은 발견하지 못하였다. 전체적인 분석에서, 두 유전자형 간의 인지할 만한 유일한 차이점은 수지상 세포 아집단이 CD8+ 표현형을 향해 약간 구부러져 있다는 것이다. 이러한 효과가 사소한 것이긴 하지만, 데이터가 촘촘하게 제시되어 있기 때문에 통계적 유의성을 지닐 수 있고, IL-23이 항원 제시 세포에 대해 영향을 미친다는 최근의 관찰 결과와 부합될 수 있다. 요약하면, IL-23은 정상적인 발생에 요구되는 것으로 보이지 않으며, eGFP 카셋트의 도입은 시험된 어떠한 세포 유형에 대해서도 독성 효과를 나타내지 않는다.
Figure 112005022589375-pct00002
IL-23pl9 -/- 마우스에서의 체액성 면역 반응. 체액성 면역 반응 발생에 있어서의 IL-23의 역할을 결정하기 위해, 먼저, 모든 이소형의 총 면역글로불린 수준을 어느 한 유전자형의 16마리 마우스의 혈청에서 측정하였다. 야생형 마우스와 IL-23pl9-/- 마우스 간에는 통계상 유의적인 차이점이 전혀 없었는데 (도 7), 이는 IL-23이 정상적인 면역글로불린 수준을 유지하는데 결정적으로 요구되지 않는다는 것을 지시해준다. 이어서, 본 발명자들은 IL-23이 아쥬반트 내에서 전달된 단백질 항원에 대항한 T-의존적 체액성 반응의 발생에 관여하는지를 시험하였다. 이를 위해, 7마리 마우스 그룹을 각각 오브알부민 (OVA)로 면역시키고, 예비혈청에서 (모든 음성 데이터는 도시되지 않음), 및 2가지 연속되는 면역을 각각 수행한 후에 OVA-특이적 면역글로불린 이소형을 평가하였다 (도 8). 1차 면역 후, OVA 특이적 IgGl, IgG2b, IgG3, 및 IgE에 대해 서로 상당히 상이한 그룹은 없었다. 그러나, IL-23pl9-/- 및 IL-12p40-/- 동물에서는 상당히 감소된 수준의 OVA 특이적 IgG2a 및 IgA가 1차 면역 후에 관찰되었다. 예상대로, 모든 이소형의 수준은 2차 면역 후에 현격하게 증가하였다. 이때, IL-23pl9-/- 마우스와 IL-12p40-/- 마우스 둘 다는 시험된 모든 이소형의 현저한 감소를 나타내었다. 이들 두 유전자형 간의 차이점은 일반적으로 중요하지 않은데, 이는 내인성 IL-12가 IL-23의 부재 하에서 체액성 반응에 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 지시해준다.
체액성 면역 반응이 B 세포와 T 세포 둘 다의 적절한 기능에 좌우되기 때문에, 본 발명자들은 IL-23이 이의 자극 효과를 발휘하는 기전이 무엇인지에 대해 결정하고자 하였다. B-세포 기능이 IL-23 결여에 의해 직접적인 영향을 받는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 T-독립적 (TI) 항원에 대항한 B-세포 반응을 갖출 수 있는 IL-23 결핍성 마우스의 능력을 시험하였다. TI-1 항원 트리니트로페닐-(TNP-) LPS는 CD14 및 TLR4를 통한 B-세포 활성화를 유발시키는 반면, TI-2 항원 TNP-Ficoll은 표면 B-세포 수용체의 집락화를 통하여 B-세포를 활성화시킨다. IL-23pl9-/- 마우스는 양 유형의 항원에 대해 정상적인 B-세포 반응을 갖추었는데 (도 9), 이는 IL-23이 T-독립적 B-세포 반응에 일정 역할을 하지 않는다는 것을 지시해준다. 더우기, IL-23pl9-/- 마우스로부터의 B-세포는 LPS, 항-IgM, 및 항-CD40에 반응하여 시험관 내에서 정상적으로 증식하였으며, IL-4에 반응하여 정상적인 이소형 스위칭을 진행하였다 (도시되지 않음). B-세포의 IL-23 자극이 증식 증가 또는 이소형 스위칭을 유발시키지 않았으므로 (도시되지 않음), 본 발명자들은 IL-23이 B-세포 기능에 직접적으로 영향을 미치지 않는다고 결론지었다.
체액성 면역 반응이 주로 2차 면역 단계에서 상쇄되고, B-세포 기능이 IL-23pl9-/- 마우스에서 정상적인 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 항원 특이적 헬퍼 (helper) T-세포의 비효율적인 재활성화가 해당 표현형을 유발시켰을지 모른다고 가정하였다. 이러한 문제에 보다 직접적으로 역점을 두기 위해, 본 발명자들은 5 내지 6마리 마우스 그룹을 0일 째에 OVA로 면역시킨 다음, 14일 째에 TNP 접합된 OVA로 2차 면역시켰다. 이러한 면역 섭생을 이용함으로써, OVA에 대해 특이적인 기억 T 세포를 2차 면역에 의해 재활성화시켰지만, TNP에 대한 특이성을 지닌 신규한 B-세포 세트는 2차 시점에서만 활성화시켰다. 따라서, OVA 특이적 기억 B-세포 아세트는 TNP-특이적 면역글로불린의 형성에 기여하지 않는다. 부스터 면역시킨지 7일 후에, 본 발명자들은 혈청 중에서 TNP 특이적 IgG1 및 IgG2a에 대해 시험하였고, 그 결과 양 이소형이 IL-23pl9-/- 마우스에서 상당히 감소되었다는 사실을 밝혀내었다 (도 10A, B). 이러한 결과는 T-의존적 B-세포 반응에 있어서의 IL-23의 중요성을 추가로 강조해준다.
IL-23pl9 -/- 마우스에서 지연형 과감작 (DTH) 반응. IL-23pl9-/- 마우스에서 기억 CD4+ 세포의 기능을 추가로 연구하기 위해, DTH 반응을 갖출 수 있는(준비할 수 있는) 이들 동물의 능력을 평가하였다. DTH 반응은 강력하게 T-세포 의존적이며, IL-12p40-/- 마우스에서 결함이 있는 것으로 보고되었지만, IL-12p35이 결여된 마우스에서는 정상적인 것으로 여겨지는데, 이는 이들이 IL-23에 의해 매개될 수도 있다는 것을 제안하고 있다. 이러한 문제에 역점을 두기 위해, 본 발명자들은 6마리 야생형, IL-23pl9-/-, 및 IL-12p40-/- 동물 각각을 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA) 중의 메틸화 BSA (mBSA)로 감작시키고, mBSA를 발바닥에 주사함으로써 7일 후에 DTH 반응을 유발시켰다. 비-특이적 부종을 제어하기 위해, 본 발명자들은 감작시키지 않은 야생형 마우스 그룹을 또한 챌린지하였다. 챌린지한지 18, 42 및 66시간 후에 특이적 발바닥 부종을 측정하였는데, 그 결과 야생형 마우스와 비교해서 양 IL-12p40-/- 및 IL-23pl9-/- 마우스에서 유사한 정도로 억제되었다는 사실을 밝혀내었다 (도 11). 역학 또한 유사하였는데, IL-12p40-/- 및 IL-23pl9-/- 마우스 둘 다는 42시간 및 66시간 째에 강력한 부종 감소를 나타냈지만, 18시간 째에는 그렇치 못하였다. 따라서, IL-23은 DTH 반응의 중요한 매개인자이고, IL-23의 결여는 기억 CD4+ T-세포에 의한 비효율적인 반응을 유발시킨다.
T-세포를 자극시키는 IL-23pl9 -/- 수지상 세포의 능력. IL-23pl9-/- 마우스에서 관찰된 결함이 IL-23 결핍성 항원 제시 세포에 의한 비효율적인 T-세포 프라이밍에 기인한다는 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 balb/c 마우스의 비장으로부터 분리된 유전적 본래의 CD4+ T 세포를 자극할 수 있는 IL-23pl9-/- DC의 잠재력을 연구하였다. DC의 부재 하에서는, 이들 T-세포가 인지할 만한 양의 사이토킨을 증식하지도 않았을 뿐만 아니라 이를 분비하지도 않았다 (도 12A). 어느 한 유전자형의 DC를 부가하면, 양 유전자형에서 IL-2가 왕성히 증식 및 생성되었다. 본 발명자들은 IL-23이 IL-17의 강력한 유도인자라는 사실을 미리 밝혀냈기 때문에, , 본 발명자들은 IL-23 생성의 강력한 Toll-유사 수용체- (TLR-) 2 효능제 및 유도인자인 세균성 리포펩티드를 사용하여 DC에 의한 IL-23 생성을 유도하였다. 이러한 조건 하에서, 야생형 DC는 T-세포에 의한 IL-17 생성을 강력히 유도시킨 반면 (도 12A, 하단 패널), IL-23pl9-/- DC로 자극시킨 T-세포는 상당히 덜한 양의 IL-17을 생성하였다. 이들 관찰 결과를 보다 생리학적 세팅에서 확인하기 위해, 본 발명자들은 8 마리 마우스 그룹을 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA) 중의 키홀-림펫 헤모시아닌 (KLH)로 면역시킴으로써 생체 내에서 T-세포 반응을 유발시켰다. 배농 림프절 세포 (LNC)를 5일 후에 수거하고, 시험관 내에서 KLH로 재자극시켰다. 다시 한번, 본 발명자들은 IL-23pl9-/- 마우스로부터 수거한 LNC가 상당한 덜한 양의 IL-17을 생성하였다는 사실을 관찰하였다 (도 12B, 하단 패널). LNC 증식은 양 유전자형에서 필적할 만한 수준인데 (도 12B, 상단 패널), 이는 야생형 마우스와 IL-23pl9-/- 마우스 둘 다 해당 항원에 대항한 강력한 T-세포 반응을 갖추고 있었다는 것을 지시해준다. 따라서, IL-23 결핍성은 수지상 세포의 자극 잠재력에 심각한 손상을 끼치지 않지만, T-세포에 의한 IL-17 생성의 약화를 가져다 준다.
토의
IL-23pl9 결핍성 마우스를 사용하여, IL-23의 비-중복성 생체내 기능을 평가한 결과, IL-23 결핍이 면역기능 저하된 T-세포 의존성 면역 반응, 예를 들면, 체액성 면역 반응 및 DTH 반응을 유발시킨다는 사실을 밝혀내었다.
현저하게 저하된 체액성 면여 반응이 IL-23pl9-/- 마우스에서 관찰되었는데, 이는 모든 면역글로불린 이소형에 영향을 미친다. 이와 동시에, IL-12p40-/- 마우스의 반응은 유사한 정도 또는 이 보다 약간 높은 정도로 억제되었다. 이러한 본 발명의 결과는 IL-23이 효율적인 체액성 반응에 적대적으로 요구된다는 결론을 뒷받침해주긴 하지만, IL-23이 IL-12의 부재 하에서 정상적인 체액성 반응에 충분한지의 여부는 IL-12p35-/- 마우스를 사용함으로써 여전히 결정해야 한다.
요약하면, IL-23pl9-/- 마우스는 저하된 DTH 반응과 체액성 면역 반응에서 분명하게 나타나는 생체내 T 세포 반응을 약화시켰고, IL-17 결핍성 마우스와 표현형적으로 유사하다. 이러한 결과는 IL-23 또는 이의 효능제를 임상적으로 투여하는 것이 면역 섭생 및 면역기능 저하 환자에게서 T 세포 기능을 지지시켜 주는데 유리할 수 있다는 것을 지시해준다.
본 발명이 이의 특정 양태를 참조로 하여 기재되긴 하였지만, 본 발명이 이러한 양태로 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다. 이와는 달리, 본 발명은 첨부된 청구의 범위 및 요지 내에 포함된 각종 변형 및 등가물을 포괄한다.
SEQUENCE LISTING <110> Gurney, Austin <120> INHIBITION OF IL-17 PRODUCTION <130> 39766/0125 <140> Unknown <141> 2003-10-30 <150> 60/423,090 <151> 2002-10-30 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gcttggtggc ccacctatga t 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agaccctcaa agttcatgac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ctgacggcgc tttctctacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ttttgccagt gggatacacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aactgctggg gctgttacac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gcctgggctc actttttctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gcgtgaaggg caaggacacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 agggggagga ttgggaagac 20

Claims (49)

  1. 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제를 포함하는, T 세포에 의한 인터루킨-17 (IL-17) 생성을 억제하기 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T 세포가 활성화 T 세포인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 T 세포가 기억 세포인 제약 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
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  7. 제1항에 있어서, 상기 길항제가 항-IL-23 또는 항-IL-23 수용체 항체인 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 제약 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항체가 전체 길이의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 사람 항체인 제약 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 인터루킨-23 (IL-23)의 길항제를 포함하는, 포유류 개체에서 인터루킨 17 (IL-17)의 발현 상승을 특징적으로 나타내는 염증 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유류 개체가 사람인 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 염증 질환이 만성 염증, 자가 면역 당뇨병, 류마티스성 관절염 (RA), 류마티스성 척추염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염 증상, 다발성 경화증 (MS), 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 성인 호흡기 장애 증후군, 베체트병, 건선, 만성 폐 염증 질환, 이식편 대 숙주 반응, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환 (IBD), 알츠하이머병 및 발열증 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 염증 질환이 만성 염증 질환인 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 만성 염증 질환이 류마티스성 관절염 (RA), 이식편 대 숙주 반응, 다발성 경화증 (MS) 및 건선으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 길항제가 항-IL-23 또는 항-IL-23 수용체 항체인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 제약 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항체가 전체 길이의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 사람 항체인 제약 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제15항에 있어서, 상기 길항제와 조합되는 추가적인 치료제를 포함하는 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 추가적인 치료제가 소염 분자인 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 소염 분자가 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드성 소염 약물 (NSAIDs)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
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  38. IL-23 효능제를 포함하는, 포유류 개체에서 IL-17 생성을 유도하기 위한 제약 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 포유류 개체가 사람인 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 사람 개체가 세균성 감염에 노출된 것인 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 사람 개체가 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염에 노출된 것인 제약 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 상기 IL-23 효능제가 항체인 제약 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 항체가 항-IL-23 또는 항-IL-23 수용체 항체인 제약 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  46. 제43항에 있어서, 상기 항체가 전체 길이의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 사람 항체인 제약 조성물.
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
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