KR101070654B1 - 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(ｓｃｖ)에 대한 저해활성을 가지는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정한 서열의 올리고뉴크레오타이드를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해제에 대한 발명으로 더욱 상세하게는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)의 헬리케이즈에 대한 이중나선 DNA 언와인딩 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가지는 올리고뉴크레오타이드에 관한 발명이다.

SARS 코로나바이러스; nsP10 NTPase/헬리케이즈; RNA 압타머; SELEX

Description

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(ＳＣＶ)에 대한 저해제{Inhibitor for Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus}

본 발명은 특정한 서열의 올리고뉴크레오타이드를 포함하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해제에 대한 발명으로 더욱 상세하게는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)의 헬리케이즈에 대한 이중나선 DNA 언와인딩 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가지는 올리고뉴크레오타이드에 관한 발명이다.

새로운 코로나바이러스에 의해 발병되는 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, 이하 'SARS'라 함)은 2002년에서 2003년 사이에 약 800여명의 사상자를 내었다[World Health Organization, Summary of probable SARS cases with onset of illness from 1st November 2002 to 31st July 2003, http://www.who.int/csr/sars/country/ (2003)]. SCV는 ~30 kb의 지놈을 가지는 엔 벨로프된 단일 나선 RNA 양성 가닥 바이러스이다 [M.A. Marra, et. al., Science 300 (2003) 1399-1404;P.A. Rota, et. al., Science 300 (2003) 1394-1399]. 바이러스 메인 프로테이즈(3CL protease)[U. Bacha, 등, Biochemistry 43 (2004) 4906-4912;K. Anand, 등, Science 300 (2003) 1763-1767] 및 SCV NTPase/헬리케이즈(nsP10)에 대한[R.Y. Kao, et. al., Chem. Biol. 11 (2004) 1293-1299;J.A. Tanner, et. al., Chem. Biol. 12 (2005) 303-311]

이와 같이 최근 거의 800 여명의 희생을 야기한 중증급성호흡기증후군은 SARS 코로나바이러스(SCV)에 대한 효율적인 저해제의 개발을 필요로 한다.

한편 SCV NTPase/헬리케이즈의 3차 구조는 실험적으로 증명되지는 않았지만 그 단백질의 구조 예측은 최근 보고되었다[A. Bernini, et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 343 (2006) 1101-1104]. SCV nsP10는 5'에서 3' 극성을 가지고 이중 나선 DNA를 언와인딩하는 헬리케이즈 활성을 가지는 것을 보였다[J.A. Tanner, et. al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 39578-39582]. 또 RNA 호모폴리머는 헬리케이즈의 ATPase 활성을 크게 촉진한다고 관찰되었다. 바이러스 헬리케이즈는 바이러스 복제에서 필수불가결하므로 다른 바이러스에서 타겟으로 동정되어 왔다[P. Borowski, 등, Antiviral Res. 55 (2002) 397-412;J.J. Crute, et. al., Nat. Med. 8 (2002) 386-391;G. Kleymann, et. al., Nat. Med. 8 (2002) 392-398]. 따라서 최근 정제되고 규명된 SCV NTPase/헬리케이즈 (nsP10)는 항-SCV 약제의 개발에 매력적인 타겟이다.

in vitro 선택 전략으로 SELEX 법(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)을 사용하여 동정된 RNA 리간드(압타머)는 높은 친화도를 가지고 타겟 단백질에 결합하는 복합체 구조들에 채택될 수 있다[C. Tuerk, L. Gold, Science 249 (1990) 505-510;A.D. Ellington, 등, Nature 346 (1990) 818-822]. SELEX는 단백질, 유기 염료 및 다른 소분자들을 포함하는 타겟 분자들에 대한 높은 친화도의 DNA 및 RNA 리간드를 NSFL하는 효율적인 방법이다[S.D. Jayasena, Clin. Chem. 45 (1999) 1628-1650]. RNA 압타머들은 HIV Tat [R. Yamamoto, et. al., Genes Cells 5 (2000) 371-388] 및 역전사효소[C. Tuerk, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 89 (1992) 6988-6992] 등에 대한 SELEX법을 사용하여 분리되었고 이들 모두는 인 비트로에서 효소 활성을 저해할 수 있다. 그러나 SCV nsP10의 NTPase/헬리케이즈 활성을 저해하기 위하여 SCV nsP10에 대한 RNA 압타머를 분리한 시도는 없었다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로 본 발명의 목적은 SARS 코로나바이러스(SCV)에 대한 효율적인 저해제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

서열번호 1에 기재된 MAAGGRGAMV의 서열의 올리고뉴크레오타이드를 제공한다. 여기서 M은 아데닌 또는 사이토신, R은 푸린이며, V는 아데닌 또는 구아닌 또는 사이토신 염기인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 서열번호 2에 기재된 AAAGGRGAAG의 서열의 올리고뉴크레오타이드를 제공한다. 여기서 R은 푸린 염기인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 올리고뉴크레오타이드의 7번째 위치에 G염기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 서열번호 3에 기재된 올리고뉴크레오타이드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 올리고뉴크레오타이드는 서열번호 4 또는 5에 기재된 올리고뉴크레오타이드를 제공한다.

본 발명의 상기 올리고뉴크레오타이드들은 3' 하단부에 GAAAG 서열을 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 올리고뉴크레오타이드의 바람직한 실시예는 도 1B에 기재되어 있으나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 올리고뉴크레오타이드 및/또는 그 상보적 서열을 유효성분으로 함유하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가지는 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기의 조성물은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)의 헬리케이즈에 대한 이중나선 DNA 언와인딩 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가진다.

본 발명의 올리고뉴크레오타이드를 일시적 또는 안정적으로 트랜스팩션된 포유류 세포에서 발현하게 발현벡터를 고안할 수 있다(Brummelkamp et al., 2002, Science 296: 550 553; Sui et al., 2002, PNAS 99(6): 5515 5520; Paul et al., 2002, Nature Biotechnol. 20: 505 508).

본 발명의 RNA는 하나 이상의 중합된 리보뉴크레오타이드를 포함할 수 있다. 그것은 인산-당 골격 또는 뉴크레오사이드에 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 천연 RNA 포스포다이에스테르 결합이 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하게 변형될 수 있다.

본 발명의 RNA는 효소 또는 부분적/전체적으로 합성에 의하여 생산될 수 있다.

본 발명의 타겟 서열에 대하여 삽입, 결손 및 치환을 가지는 본 발명의 RNA 서열도 저해에 효과적일 것이다. 따라서 본 발명의 청구범위에 기재된 서열과 100% 일치하지 않는 서열이라 하더라도 본 발명의 저해활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

본 발명의 RNA는 세포 내로 직접 또는 생명체의 구강, 간질공간, 순환기 등으로 세포 외적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 뉴크레오타이드 분자를 포함하는 조성물은 바이러스에 노출되었거나 노출될 대상에 투여될 수 있다.

여러 전달 시스템이 본 발명의 약학 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다고 알려졌다, 예를 들어 리포좀에 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 등(Wu and Wu, 1987 J. Biol. Chem. 262: 4429 4432 참조). 투여 방법은 피내, 피하, 근육내, 복강, 혈관내, 및 경구 투여 등을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 본 화합물들은 통상적인 경로 예를 들어 흡입 등으로도 투여될 수 있고 다른 생리활성 물질들과 같이 투여될 수 있다. 투여는 국소 또는 전신성이 가능하고 바람직하게는 본 발명의 조성물은 폐에 적당한 경로로 투여될 수 있다. 폐 투여는 예를 들어 흡입기 또는 네뷰라이져를 사용하여 에어로졸화제화 제제로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 상기 올리고뉴크레오타이들과 약학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 담체는 희석제, 외제, 어쥬번트 또는 소립자 등을 의미한다. 그러한 담체는 물 또는 기름과 같은 멸균된 액체일 수 있다.

특정 질환의 치료에 효과적인 본 발명의 약학 조성물의 양은 질환의 특성에 의존할 것이고 표준 임상 기술에 의하여 결정될 것이다. 또 적정 용량 범위를 확정 하기 위한 인 비트로 분석도 선택적으로 사용될 것이다. 정확한 용량은 투여 경로, 질병의 중증도 및 각 환자의 상황과 의료진의 판단에 따라야 하겠으나, 혈관애 투여의 적정 용량 범위는 체중 kg 당 약 10∼500 ㎍이 바람직할 것이다. 또 코내 투여의 적당 범위는 약 0.01 pg/kg 체중에서 1 mg/kg 체중 정도가 바람직할 것이다.

구강 제제는 바람직하게는 10%에서 95% 활성 성분을 포함한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 40 nt의 랜덤 서열을 함유하는 RNA 라이브러리로부터 SCV NTPase/헬리케이즈에 대한 RNA 압타머를 분리하기 위하여 SELEX법을 이용하였다.

SELEX의 15연속 라운드 후에, 본 발명자들은 그 단백질의 ATPase 활성에는 큰 영향을 주지 않고 헬리케이즈의 언와인딩 활성에 효과적으로 저해하는 RNA 압타머 풀을 분리하였다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

SCV NTPase/헬리케이즈에 대한 고 친화 RNA 리간드의 분리를 위한 SELEX 과정을 사용하기 위하여, 정의된 지역을 가지는 프랭크된 40 nts의 랜덤 코어 서열을 포함하는 RNA 라이브러리 풀(~10¹⁴ 분자들)을 제조하였다(도 1A). 라운드 #8 후에 연속적으로 단백질 농도를 감소시켜서 RNA 풀은 SCV 헬리케이즈에 대한 특이성 및 고 결합 친화도를 가지는 RNA 리간드에 더 풍부하여졌다. 15 주기의 선택 후, 그 결합된 RNAs (ES15 RNA 풀)는 RT-PCR에 의하여 증폭되고, 그 결과 cDNA들은 클로닝되었다. 16 서브클론의 뉴크레오타이드 서열들은 결정되고 다른 4 서열들은 가운데 랜덤 코어 부위를 가지는 10 ~ 11 뉴크레오타이드들[AAAGGR(G)GAAG; R, 푸린 염기]의 AG-풍부한 보존 서열을 가지는 것을 확인되었다(도 1B). 이들 RNA들을 AG-풍부한 보존 서열 이후에 5 뉴크레오타드들[GAAAG]의 부가적인 서열의 존재에 따라 I군과 II군으로 나누었다. 이들 군들 외에, 16 서브클론 중 6 클론이 [GAAAG] 서열을 가지는 변형된 AG-풍부한 보존 서열을 포함한다( III 군).

ES15 RNA 풀에서 동정된 다른 6 RNA 서열을 MFold 프로그램에 의하여 2차 구조에 분석하였다[M. Zuker, Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180 (1989) 262-288]. 모든 RNA 압타머의 예측된 2차 구조는 몇 가지 스템-루프 구조를 포함하고, 그 AG-풍부한 보존 서열 및 [GAAAG] 서열은 주로 그 구조의 루프 부위에 위치한다(도 2). 이 결과는 RNA 압타머에서 노출된 [AAAGGR(G)GAAG] 및 [GAAAG] 서열은 SCV NTPase/헬리케이즈와 상호작용하는데 중요하다는 것을 암시한다. 따라서 RNA에서 보존 서열을 포함하는 루프 구조는 SCV RNA 헬리케이즈에 대한 결합 모티프 구조를 구성하는 반면 어느 서열의 스템 구조는 안정화 작용을 가진다.

SELEX 라운드 #15 (ES15 RNA)에서 풍부하고 선택된 RNA 압타머 풀을 SCV 헬리케이즈의 ATPase 활성에 대한 그 효과를 테스트하였다. SCV 헬리케이즈의 ATPase 활성은 단일 가닥 RNA에 의하여 크게 촉진된다고 전에 보고되었다. 본 발명자들은 RNA 호모폴리머(폴리 (rU))를 사용하여 RNA-촉진된 정제된 SCV 헬리케이즈의 ATPase 활성을 확인하고, ATPase 활성에 대한 RNA 농도 의존성을 조사하였다. RNA 압타머 풀은 90 nts 길이의 RNA의 혼합물을 구성하기 때문에, 만약 그 단백질이 ATP 가수분해 활성의 진정한 코팩터로 그 RNA 풀을 인식한다면 그 단백질의 ATPase 활성을 촉진할 수 있다. 도 3A에서 알 수 있는 바와 같이, ES15 RNA는 2.34 ng/ml의 K_{1 /2} 값을 가지고 용량-의존적으로 ATPase 활성을 촉진하였다. ATPase 활성의 이 용량 의존적인 촉진은 랜덤 RNA 라이브러리에서도 관찰되었고, 이것은 RNA 서열과 결합 친화도에도 불구하고 ATPase 활성에 대한 RNA 코팩터로서 ES15 RNA를 이용하여 SCV 헬리케이즈는 ATP를 가수분해하는 것을 암시한다. 다음 본 발명자들은 RNA 압타머 풀이 100 nM 폴리 (rU) RNA의 존재하에서 헬리케이즈의 ATPase 활성을 저해하는지를 조사하였다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, ES15 RNA는 심지어 높은 농도에서도 폴리 (rU)-촉진된 ATPase 활성을 현저하게 저해하는데 실패하였다. 높은 용량의 RNA 압타머 풀에서 ATPase 활성을 약간 감소시키는 것을 보여주었다. MALDI-TOF 질량 분석기를 통한 압타머 풀(ES15 RNA)의 평균 분자량은 30,197 g/mol이었다(도 3C). 도 3A에 나타난 ATPase 촉진에 대한 ES15 RNA의 K_{1 /2} 값 및 평균 분자량을 사용하여, ES15 RNA에 대한 겉보기 ^ATPaseIC₅₀는 77 nM으로 계산되었다. 이 값은 SCV 헬리케이즈에서 ATP 가수분해 촉진에 대한 추정 자리에 대한 ES15 RNA의 결합 친화도를 간접적으로 반영한다. 본 발명에서 원래 랜덤 RNA 라이브러리 및 RNA 압타머 풀은 그 단백질의 ATPase 활성을 촉진하였고 그 SCV 헬리케이즈에 대한 RNA 압타머 풀은 경쟁적인 형태에서 RNA 기질을 대체할 수 있고 ATP 가수분해에서 코팩터로 작용한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 ES15 RNA가 SCV 헬리케이즈의 DNA 언와인딩 활성을 저해할 수 있는지를 테스트하였다. 그 단백질의 dsDNA 언와인딩 활성을 Fluorescein에서 TAMRA로 FRET에 기반한 형광 분석에 의하여 측정되었다(도 4A). 본 발명자들은 실시예에 기재된 것과 같이 20 nts의 5‘ 올리고(dT) 오버행을 가지는 dsDNA 기질을 고안하였다. 두 올리고머들이 어닐링으로 인하여 서로 가까이 근접할 때, 그 FRET는 Fluorescein에서 TAMRA로부터 일어나고, Fluorescein으로부터 매우 약한 형광을 방출한다. 반면, Fluorescein 염료에서 형광의 증가는 열 변성 또는 헬리케이즈에 의하여 이중나선이 풀린 후에 FRET의 부존재로 인하여 관찰될 수 있다(도 4A). 그 풀린 올리고DNA들이 재어닐링하지 않는다는 것을 확인하기 위하여 과량의 짧은 가닥(T0D25Flu)과 동일하나 Fluorescein을 포함하지 않은 트랩 DNA를 그 반응에 포함하였다. 따라서 재어닐링 과정은 Fluorescein의 형광에 거의 영향이 없다. 반응 조건은 헬리케이즈가 평형 상태에서 그것의 dsDNA 언와인딩 촉매작용을 수행하는 것을 확인하기 위하여 선택되었다. ATP 및 Mg^{2 +} 존재 하에서 dsDNA 기질 및 그 헬리케이즈의 5분 배양이 DNA 언와인딩의 평형 상태에 대하여 충분하기 때문에, 여러 농도의 ES15 RNA 또는 랜덤 RNA 라이브러리의 존재의 효과는 헬리케이즈 반응의 평형 상태 상의 중간에 테스트하고 RNA 첨가가 없는 대조군 반응과 비교하였다. 트랩 올리고DNA를 디스플레이스된 DNA 가닥의 5’말단 Fluorescein을부터 형광 신호를 증가시키기 위하여 테스트 RNA들에 첨가하였다.

도 4B에서 알 수 있는 바와 같이, SCV 헬리케이즈 활성의 더 효율적인 저해가 ES15 RNA를 가지고 약 85 %까지 저해된 반면에, 랜덤 RNA 라이브러리에서는 거의 저해를 나타내지 않았다. ES15 RNA는 하이버볼릭 형태로 0.035 ng/ml (= 1.2 nM)의 헬리케이즈IC₅₀ 값을 내면서 용량 의존적인 형태로 헬리케이즈 활성을 저해하였다(솔리드 라인, 도 4B). 현저하게 그 헬리케이즈IC₅₀ 값은 ^ATPaseIC₅₀ 값보다 더 작은 것을 나타내었고 이것은 그 RNA 압타머들이 그 단백질이 dsDNA 기질없이 헬리케이즈보다는 dsDNA 기질과 복합체될 때 헬리케이즈에 강하게 결합한다. 랜던 RNA 라이브러리는 헬리케이즈 활성의 현저한 저해를 나타내지 않았다. 이것은 헬리케이즈에 대한 정의된 서열(즉 SE15 RNA들에서 보존된 서열들)을 가진 강한 결합 친화도는 dsDNA 언와인딩 활성을 저해하는데 필요하다는 것을 나타낸다.

SCV NTPase/헬리케이즈에 대한 분리된 ES15 RNA는 1.2 nM의 IC₅₀를 가지는 dsDNA 언와인딩 활성의 매우 효율적인 저해제이다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 압타머가 헬리케이즈 활성을 저해하는 알로스테릭 자리 또는 ATP 가수분해에 대한 기질 결합 도메인에서 헬리케이즈와 상호작용한다는 것을 추측할 수 있다.

본 발명에서 SCV NTPase/헬리케이즈 (nsP10)에 대한 RNA 압타머들(aptamer)은 in vitro 선택 기술을 사용하여 40nt의 랜덤 서열을 포함하는 RNA 라이브러리로부터 분리되었다. 풍부한 RNA 압타머 풀의 뉴크레오타이드 서열(SE15 RNA)은 모두 예상되는 2차 구조 내 루프 지역에 주로 존재하는 AG-리치 보존된 서열 및/또는 5 뉴크레오타이드들[GAAAG]의 부가적인 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 서열의 RNA들은 1.2 nM의 IC₅₀값을 가지고 약 85%까지 헬리케이즈의 이중 나선 DNA 언와인딩 활성을 효과적으로 저해하나 코팩터인 poly (rU)의 존재하에서 그 단백질의 ATPase 활성에는 작은 효과를 나타낸다.이 결과들은 선택된 압타머 풀은 항-SCV 화합물들로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다는 것을 나타낸다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: His - 태그된 SCV NTPase / 헬리케이즈의 정제 및 발현

J.A. Tanner, 등. J. Biol. Chem. 278 (2003) 39578-39582에 기재된 방법으로 제조된 SCV NTPase/헬리케이즈 도메인을 가지는 단백질 발현 프라즈미드(pHelA12, 중국 홍콩 대학의 Huang, J.-D. 박사로부터 제공)는 E. coli Rosetta^TM 반응능(competent) 세포(Novagen)으로 형질전환시켰다. 그 재조합 His-태그된 SCV NTPase/헬리케이즈는 상기 J.B.C논문에 기재된 방법을 다음과 같은 변형을 가지고 정제하였다;니켈-차지된 HiTrap 킬레이팅 컬럼(GE Healthcare) 크로마토그래피로 정제 후, 그 단백질을 가진 분획들은 10 % SDS-PAGE로 결정하고, Amicon stirred 쎌(YM-30)로 초여과하였다. 초여과(ultrafiltration) 동안에, 탈염 및 버퍼 교환이 Buffer A (25 mM Tris-HCl; pH 7.5, 0.3 mM NaCl)로 세척된 180 ml의 sephadex G- 100 레진(Sigma)을 포함하는 다음 컬럼에 수행되었다. 그 단백질 샘플(2 ml)을 컬럼에 건 후, 0.3 ml/min의 속도로 동일한 버퍼로 용출하였다. SDS-PAGE에 의하여 결정된 정제 분획을 모아서 그 모아진 분획들을 부피를 줄이기 위하여 Amicon stirred cell (YM-30)로 초여과하였다. 30 % (v/v) 글리세롤에 정제된 단백질들을 장기간 보존을 위하여 -80℃에서 냉동하였다. 단백질 농도는 표준으로 소 시럼 알부민을 사용하여 Bio-Rad 단백질 분석 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 결정하였다. 전형적인 수율은 박테리아 배양 6리터에서 약 5 mg의 정제된 단백질이었다.

실시예 2: 랜덤 라이브러리의 제조

In vitro 선택에 사용된 RNA 라이브러리는 40 랜덤 뉴크레오타이드들을 포함하는 109 bp DNA 주형 및 T7 RNA polymerase를 사용한 인 비트로 전사에 의하여 제조되었다(도 1A). in vitro 전사에 대한 DNA 주형은 T7 프로모터(밑줄 서열) (5'GATAATACGACTCACTATAGGGTTCACTGCAGACTTGACGAA-3'(서열번호:6)를 포함하는 정 프라이머 및 역 프라이머(5'GAATTCGTAGATGTGGATCCATT-3'(서열번호:7)를 가지고 단일 가닥 DNA의 15 사이클의 증폭에 의하여 제조되었다. PCR-증폭된 DNA 주형에서 랜덤 지역은 인 비트로 전사 및 클로닝 목적을 위하여 T7 프로모터 및 제한 자리를 포함하는 한정된 서열로 프랭크(flank)되었다(도 1A). 그 증폭된 DNA는 페놀 및 클로로포름으로 정제되고 T7 RNA polymerase로 전사되었다. 그 생성된 RNA는 12 % 요소-변성 젤로 젤-정제되었다. 그 생성된 RNA의 서열은 5'GGGUUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU-N40-AAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC-3'이고, 여기서 N40는 각 위치에 동일 몰의 A, G, C, 및 U가 삽입된 40nt를 나타낸다.

실시예 3: RNA 압타머의 인 비트로 선택

인 비트로 선택은 정제된 His-태그된 SCV NTPase/헬리케이즈 및 생성된 RNA 라이브러리를 가지고 수행되었다. 먼저, 5 ㎍의 RNA 라이브러리를 100 ㎕의 결합 버퍼(30 mM TrisHCl; pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM dithiothreitol (DTT) 및 1 % (w/v) BSA)에 100 ml의 Ni-NTA sepharose 비드로 상온에서 종종 진탕하면서 20분간 전배양하였다. 그 RNA-비드 복합체는 침전되고 세파로스 비드에 비특이적으로 결합 활성을 가지는 RNA들을 제거하였다. 각 사이클에서, 사전(precleared) 상등액을 상온에서 30분간 100 ㎕ 결합 버퍼에서 2 ㎍의 His-태그된 SCV 단백질로 배양하였다. 100 ㎕의 Ni-NTA 세파로스를 첨가하고 배양을 또 20 분간 계속하였다. 그 ㅂ반응 혼합물을 단백질에 결합되지 않은 RNA 분자를 제거하기 위하여 원심분리하였고 펠렛을 500 ㎕의 결합 버퍼로 5회 세척하였다. RNA와 복합체된 헬리케이즈를 용출 버퍼(결합 버퍼 구성요소 + 250 mM imidazole)로 용출하여 Ni-NTA 비드들로부터 분리하였다. 그 단백질에 결합된 RNA들을 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의하여 상등액으로부터 회수하였다. 회수된 RNA들을 ImProm-II^TM reverse transcriptase (Promega)로 역전사하고, Taq DNA polymerase로 PCR하여 증폭하고, 선택의 다음 라운드에 사용하였다. 선택의 8 연속 라운드를 동일한 방법으로 수행하였다. 그러나 9 라운드 시작으로부터 매 하나 또는 두번째 라운드마다 단백질 농도를 감소시키기 위하여 좀 더 가혹한 조건을 채택하였다: 1 ㎍ (라운드 9), 0.5 ㎍(라운드 10-11), 0.25 ㎍(라운드 12-13), 및 0.125 ㎍(라운드 14-15). 15번째 라운드 후, cDNA를 PCR에 의하여 증폭하고 선형화된 pGEM T 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 대장균에 서브클로닝과 형질전환 후, 프라즈미드 DNA를 개별 클론으로부터 분리하여 그 클론들의 DNA 서열을 분석하였다. 선택된 RNA 압타머의 2차 구조는 Zuker 알고리즘에 기초한 MFOLD 프로그램에 의하여 예측되었다[M. Zuker, Computer prediction of RNA structure, Methods Enzymol. 180 (1989)262-288].

실시예 4: SCV NTPase / 헬리케이즈에 의한 ATP 가수분해

SCV NTPase/헬리케이즈의 ATPase 활성은 RNA 압타머들에 의한 ATPase 활성을 모니터하기 위하여 SELEX 라운드 #15 (ES15 RNA)로부터 풍부한 RNA 풀 또는 원래 RNA 라이브러리의 존재하에서 조사하였다. SCV 헬리케이즈의 ATPase 활성은 ATP로부터 나오는 인산의 양을 측정하여 분석하였다. 무기 인산은 P_i 에 특이적인 발색제를 사용하여 정량하였다[J.M. Piper, 등, Anal. Biochem. 117 (1981) 70-75.23]. ATP 가수분해 반응은 최종 부피 30㎕에서 50 mM TrisHCl 버퍼(pH 6.8)에서 100 nM 폴리 rU (~290 nts, GE healthcare로부터 구입)의 존재 또는 부존재에서 여러 농도의 RNA 압타머 풀(또는 랜덤 RNA 라이브러리), 0.5 mM ATP, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂와 0.1 uM SCV 헬리케이즈를 혼합하여 수행하였다. 그 반응은 37℃에서 3분간 배양하고, 70 ㎕의 발색제(1 분량의 10 % (w/v) 아스코르브 산 및 6 분량의 0.42 % (w/v) Ammonium molybdate in 1 M H₂SO₄)를 첨가하여 정지하였다. 그 다음 소멸된 반응은 37℃에서 1시간 배양하고 발색된 시안-블루색을 820 nm에서 읽었다. ATPase 활성은 분리된 인산의 양을 분석하고 표준 인산 정산 곡선으로 비교하여 정량하였다.

실시예 5: FRET -기초한 헬리케이즈 활성 분석

FRET(Fluorescence resonance energy transfer)를 SCV 헬리케이즈의 5‘에서 3’dsDNA 언와인딩 활성을 측정하기 위하여 사용하였다. 형광 염료로 말단-표지된 두 올리고머(25 base pair의 상보적인 부분과 20 nts의 5‘ 오버행을 포함하게 고안됨)는 합성되고 PAGE로 정제되었다(Bioneer, Korea): T20D25Tam (5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGCGGATTACTATACTACATTAGA(TAMRA)-3‘(서열번호:8), 및 T0D25Flu (5’(Fluorescein)TCTAATGTAGTATAGTAATCCGCTC-3‘(서열번호:9). dsDNA 기질을 제조하기 위하여, 두 올리고머는 5.0 μM (T0D25Flu의) 농도에서 1.2:1 혼합비의 T20D25Tam:T0D25Flu를 혼합하여 어닐링하고, 95℃로 가열하고, 1시간 이상 37℃로 천천히 냉각하였다. dsDNA 언와인딩 반응은 37℃에서 50㎕에서 처음에 100 nM dsDNA 기질과 2 mM ATP, 0.1 M NaCl, 2.5 mM MgCl₂, 20 nM SCV 헬리케이즈, 및 20 mM HEPES (pH 7.4)를 혼합하여 수행하였다. 반응 혼합물의 5분 배양 후, 여러 양의 압타머 RNA (또는 랜덤 RNA)의 존재 또는 부존재 하에서 트랩 DNA (500 nM)는 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 37℃에서 5분간 더 배양하고, 50 ml의 종결 버퍼(0.2 M EDTA, 0.2 M NaCl, 및 20 mM HEPES (pH 7.4))로 정지하였다. 그 형광은 형광분광계(Ex = 485 nm/ Em = 535 nm)를 사용하여 모니터하였다.

실시예 6: RNA 압타머 풀의 MALDI - TOF MS 분석

RNA 압타머 풀의 질량 분석은 Autoflex III MALDI-TOF 질량 분석기(Brucker Daltonics Inc, Billerica, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. 그 스펙트럼은 탈착/이온화 원으로 Smartbeam^TM 레이저를 사용한 선형 모드에서 얻었다. 음 이온들을 샘플 플레이트에 세트된 0 V에서 20 kV 가속 전압을 가하였다. 그 스펙트럼은 포인트 당 200을 가지는 5 포인트로부터 축적되었다. 동일 부피의 하이드록시피코린 산(20 mg/ml in acetonitrile : water = 1:1) 및 구연산 암모늄(50 mg/ml in water)을 혼합하여 제조된 1ml의 매트릭스 용액은 0.1 ㎍의 RNA 압타머 풀과 혼합하였다.

도 1은 SCV nsP10에 대한 선택된 RNA 압타머 및 인 비트로 선택을 위한 RNA 풀의 서열을 나타냄; (A) 40 랜덤 뉴크레오타이드들을 포함하는 DNA 주형의 인 비트로 전사에 의하여 형성된 RNA 라이브러리, (B) ES15 RNA 풀에서 동정된 6 종류의 다른 RNA 서열들. 세 군들의 이들 RNA들은 코어 부위 중간에 10 ~ 11 뉴크레오타이드들(흰 박스)의 AT-풍부한 보존 서열을 포함하고, II 군 및 III 군은 부가적인 보존 서열을 포함(회색 박스).

도 2는 ES15 RNA 풀로부터 유래한 RNA 압타머의 2차 구조를 나타낸 그림; ES15 RNA 풀에서 동정된 6 종류의 다른 RNA 서열들의 2차 구조는 MFOLD 프로그램을 사용하여 예측하였다. 그 보존된 모티프들(회색 서열들)은 주로 루프 지역에 위치.

도 3은 SCV NTPase/헬리케이즈의 ATPase 활성에 대한 ES15 RNA 풀의 효과를 나타낸 그림; (A) 그 단백질에 의한 ATP 가수분해 반응은 초기 랜덤 RNA 풀(○) 또는 ES15 RNA 풀(●)의 존재하에서 수행되었다. ATP 가수분해 반응은 실시예에 기재된 것과 같이 수행되고 ES15 RNA-촉진 프로화일의 하이퍼볼릭 피트(솔리드 라인)는 SCV NTPase/헬리케이즈에 의하여 RNA-촉진된 ATP 가수분해에 대하여 2.34 ng/ml 의 K_1/2 값을 제공하였다. (B) 그 단백질에 의한 폴리 rU (100 nM)-촉진된 ATP 가수분해 반응은초기 랜덤 RNA 풀(○) 또는 ES15 RNA 풀(●)의 존재하에서 수행되었다. 값들은 3중실험에서 수행된 값들의 평균을 나타냄(패널 A 및 B의 그래프). (C) ES15 RNA 풀의 평균 분자량은 MALDI TOF-MS에 의하여 30,197 g/mol로 결정.

도 4는 ES15 RNA에 의한 SCV 헬리케이즈의 저해 및 FRET-기반한 헬리케이즈 분석의 원리를 나타낸 그림; (A) 헬리케이즈 활성의 FRET-기반한 dsDNA 언와인딩 분석의 도식도. 3' 말단 및 5' 말단에 TAMRA 및 Fluorescein으로 각각 표지된 각 T20D25 및 T0D25 단일 가닥 DNA는 어닐링하고 10분 동안 SCV 헬리케이즈의 존재 또는 부존재하에서 37℃ 또는 95℃(열 변성)에서 배양하였다. 그 열처리에 의한 언와인딩 DNA(■)는 다른 경우보다 더 높은 형광을 내었다. (B) 여러 농도의 ES15 RNA의 존재하에서 SCV 헬리케이즈의 헬리케이즈 활성의 저해를 나타냄. ES15 RNA의 데이터(●)는 포물선(솔리드 라인)에 맞고, 0.035 ng/ml (1.2 nM에 해당) IC₅₀ 및 최대 저해량(85 %)을 나타냄. 비교를 위하여 랜덤 RNA 풀(○)을 동일한 dsDNA 언와인딩 분석에 대하여 조사하였다. 그래프에서 나타난 포인트들은 분리적으로 수행된 삼중 실험의 평균이다.

<110> KonKuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Inhibitor for Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 maaggrgamv 10 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 aaaggrgaag 10 <210> 3 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 aaagggggaa g 11 <210> 4 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 aaaggggacc 10 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 caaggagaaa 10 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 gataatacga ctcactatag ggttcactgc agacttgacg aa 42 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 gaattcgtag atgtggatcc att 23 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer <400> 8 tttttttttt tttttttttt gagcggatta ctatactaca ttaga 45 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomer <400> 9 tctaatgtag tatagtaatc cgctc 25 <210> 10 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-1 <400> 10 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuugcag aaaaggggga 60 agaagagggu gauucaggcg agagaaugga uccacaucua cgaauuc 107 <210> 11 <211> 109 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-2 <400> 11 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuucagg gaggaaaggg 60 ggaagcgacu caagaacugu agaggcaaug gauccacauc uacgaauuc 109 <210> 12 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-3 <400> 12 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuuccgg gcggucaaag 60 gagaagaaga aagagagagc ccagggaaau ggauccacau cuacgaauuc 110 <210> 13 <211> 109 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-4 <400> 13 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuuggag ggaaaagggg 60 aagcggaaag guuaaggaug cggaggaaug gauccacauc uacgaauuc 109 <210> 14 <211> 109 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-5 <400> 14 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuugguu agggggaaag 60 gggaccaggu ucgcaggaaa gcagagaaug gauccacauc uacgaauuc 109 <210> 15 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ES15-6 <400> 15 gauaauacga cucacuauag gguucacugc agacuugacg aagcuuggaa gggagagcgg 60 gaacaaggag aaagagaagg ggaauccaau ggauccacau cuacgaauuc 110

Claims (7)

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6. 서열번호 10 내지 서열번호 15에 기재된 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 RNA를 유효성분으로 함유하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가지는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기의 조성물은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)의 헬리케이즈에 대한 이중나선 DNA 언와인딩 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SCV)에 대한 저해활성을 가지는 조성물.

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