KR101059724B1 - 천연 킬러 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝방법 - Google Patents

Abstract

동물에게 시험 물질과 톨 유사 수용체 리간드를 투여하여, 당해 동물에서 천연 킬러 (NK) 세포의 유도를 검출함으로써, NK 세포 증식 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.

락토페린, 천연 킬러 세포(NK 세포), 톨 유사 수용체 리간드, 폴리이노신산-폴리시티딜산

Description

천연 킬러 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법{A method for screening for a substance having an action of proliferating natural killer cells}

본 발명은 천연 킬러 세포의 증식제 및 증식 방법, 천연 킬러 세포의 제조 방법 및 천연 킬러 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 의료 분야 및 식품 분야 등에서 유용하다.

천연 킬러 세포(NK 세포)는 여러 가지 종양 세포, 바이러스 감염 세포 및 상이한 주요 조직 적합 항원을 갖는 세포에 대하여 세포독성 활성을 갖는 세포 그룹이고, 주로 자기, 비자기를 인식하는 수용체에 의해서 활성화 또는 이의 억제가 조절된다.

NK 세포는 자연 면역에 관계하는 림프구의 한 형태로서 중요한 기능을 담당하고 있는 것으로 생각되고 있으며, 특히 바이러스 감염에 있어서는, T 림프구 및 B 림프구에 의한 획득 면역이 성립될 때까지 초기 감염에 있어서의 면역 반응에 매우 중요한 역할을 하고 있다.

즉, T 림프구 및 B 림프구가 정상이더라도, 천연 킬러 기능이 결손되어 있는 면역결핍 환자나 마우스에서는 특정한 바이러스에 대단히 감염되기 쉬워진다. 또한 최근, NK 세포의 수용체가 특정한 바이러스 산물을 인식하는 것이 명백해졌다.

이와 같이, 종양 면역에 관계되는 NK 세포의 여러 가지 기능을 종양 치료 및 종양의 발생원이 되는 것으로 추정되는 바이러스 감염 세포의 제거에 효과적으로 이용하고자 하는 시도가 이루어져 왔다.

실험 동물로부터 NK 세포를 수득하는 방법으로서, 비장, 혈액, 골수 등으로부터 세포를 채취하여 정제하는 방법이 공지되어 있지만, 이들 모든 조직에는 NK 세포가 낮은 비율로밖에 포함되어 있지 않기 때문에, 실험에 필요한 NK 세포를 확보하기 위해서는 숙련된 기술과 상응의 설비가 필요하다.

NK 세포의 제조 또는 증식 방법에 관해서는, 인터류킨-2를 대량으로 첨가한 배양액에서 말초혈 단핵구 세포를 배양하는 경우, 사람의 경우 1주일 전후로 림포카인 활성화 킬러 림프구(LAK 세포)가 증식되고, 이 배양액 중에 NK 세포가 많이 포함되어 있음은 잘 공지되어 있다. 최근, 세포 표면상에 주요 조직 적합 항원 클래스 I(MHC-I)이 거의 발현되어 있지 않은 사람 B 세포주 721.221에 방사선을 조사하여 분열능을 손실시키고, 이를 말초혈 단핵구 세포와 함께 5 내지 6일 동안 혼합 배양하여, 이로부터 NK 세포를 정제하고, 추가로 배양을 계속하여 NK 세포를 대량으로 수득하는 방법이 개발되었다[참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol.94, 1997, pp.13140-13145].

또한, 말초혈 단핵구 세포와 사람 윌림스(Wilms) 종양 세포주 HFWT를 혼합 배양하는 공정을 포함하는 사람 NK 세포의 증식 방법[참조: 일본 공개특허공보 제2001-149069호] 및 공액 리놀레산류를 유효 성분으로 하는 동물의 천연 킬러 림프구의 활성을 높이는 방법[참조: 일본 국제공개특허공보 제2001-503430호] 등이 각각 개시되어 있다. 그러나, 일본 공개특허공보 제2001-149069호에 개시된 기술은, 말초혈 단핵구 세포와 사람 윌림스 종양 세포주 HFWT를 혼합 배양함으로써 사람 NK 세포를 증식시키는 방법이고, 생체내에서 증식시킨 NK 세포를 채취하는 방법 및 천연 킬러 활성을 상승시키는 인자의 스크리닝에 관해서는 동문헌에는 개시되어 있지 않다. 또한, 일본 국제공개특허공보 제2001-503430호에는 공액 리놀레산류에 의해서 높여진 킬러 림프구의 비장에서의 변화를 추적한 것이며, 생체내에서 증식시킨 NK 세포를 채취하는 방법 및 천연 킬러 활성을 상승시키는 인자의 스크리닝에 관해서는 개시되어 있지 않다.

현재, NK 세포의 활성(천연 킬러 활성: NK 활성)의 측정 방법으로서 가장 일반적인 것은 사람 K562 세포 또는 마우스 림프종 세포 Yac-1에 대한 세포독성 활성을 보는 것이며, ⁵¹Cr 등으로 방사능 표지된 Yac-1 세포를 포함하는 세포 그룹을 동시배양하여, 배양 상청액 중에 방출된 방사 활성을 측정하는 방법이다. 또한, 생체내에서 NK 활성을 측정하는 방법으로는 상기와 동일하게 방사능 표지된 종양 세포를 생체내에 이식하거나, 또는 바이러스 등을 동물에게 감염시켜 NK 활성을 관찰하는 것으로, 이들 방법은 특수한 시설이나 설비를 필요로 한다.

락토페린은 항균 작용, 면역 활성화 작용 및 항종양 작용 등, 여러 가지 작 용을 갖는 유단백질로서 공지되어 있다. 락토페린은 젖 유래의 당단백질이고, 안전성이 높으며, 장기간 연속적으로 섭취하는 것이 가능하고, 그 자체는 거의 무미 무취이며, 각종 식품, 의약품 및 사료의 첨가물로서 범용성이 높은 단백질이다.

일본 국제공개특허공보 제2002-515893호에는, 사람 락토페린 개변체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 공정을 포함하여, 환자에서 NK 세포를 자극하는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 일본 국제공개특허공보 제2002-515893호에는, 실제로 사람 락토페린 개변체가 NK 세포를 자극하는 효과는 기재되어 있지 않으며, 그 근거는 불명확하였다.

톨 유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)는 여러 가지 세균 균체 구성 성분을 인식하여 자연 면역에 있어서의 세균의 인식뿐만 아니라, 획득 면역의 활성화에 중요한 작용을 담당하고 있으며, 다른 병원체 성분을 인식하여 특이한 반응을 야기하는 기능을 갖고 있다고 여겨진다. 현재, 포유동물에서 톨 유사 수용체는 10개의 패밀리 수로 이루어져 있고, 각각의 톨 유사 수용체가 인식하는 병원체 구성 성분(리간드)이 동정되고 있다. 이들 병원체 구성성분인 리간드에는, 지질, 당, 단백질 및 핵산 등이 포함되어 있다[참조: Molecular Medicine, Vol.39, 2002, pp.238-246; Molecular Medicine, Vol.40, 2003, pp.186-193].

본 발명은, 생체내에서 NK 세포를 증식시키는 기술 및 NK 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 천연 킬러 활성을 상승시키는 음식품 유래의 인자를 스크리닝하는 방법에 관해서 검토하던 중, 음식물(젖(乳)) 유래의 인자인 락토페린을 동물에게 일정 기간 투여하고, 그 투여 기간 내의 특정한 타이밍에서 톨 유사 수용체의 리간드를 투여한 결과, 당해 동물의 복강내에서 복강내 세포에 있어서의 NK 세포의 비율이 현저히 증가하는 것을 밝혀냈다. 또한, 상기 방법에 의해서 복강내에 NK 세포를 유도하는 것이 가능해졌기 때문에, 천연 킬러 활성의 분석이나 NK 세포의 채취를 간편하게 할 수 있음을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상기 과제를 해결하는 본원의 제1 발명은, 락토페린을 포함하는 제1 제제와 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제를 포함하며, 상기 제1 제제와 제2 제제가 별도 포장되어 있음을 특징으로 하는, 동물의 NK 세포의 증식제이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 NK 세포의 증식제는 이하의 1) 내지 3) 중 어느 하나를 특징으로 한다.

1) 상기 제1 제제는 체중 1kg당 10 내지 2000mg/일의 락토페린의 양으로 5 내지 10일 동안 매일 투여되며, 상기 제2 제제는 제1 제제의 투여 종료 5 내지 2일전에 체중 1kg당 10 내지 1000㎍/일의 톨 유사 수용체 리간드의 양으로 투여된다.

2) 락토페린을 포함하는 제1 제제는 경구 투여되고, 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제는 복강내 투여된다.

3) 상기 톨 유사 수용체 리간드가 폴리이노신산-폴리시티딜산(이하, 「폴리 IC」라고 기재하는 경우가 있다)이다.

본원의 제2 발명은, 동물(사람 제외)에게 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드를 투여함을 특징으로 하는 동물에서 NK 세포의 증식 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 NK 세포의 증식 방법은 이하의 4) 내지 6) 중 어느 하나를 특징으로 한다.

4) 체중 1kg당 10 내지 2000mg/일의 락토페린을 5 내지 10일 동안 매일 투여하고, 락토페린의 투여 종료 5 내지 2일전에 체중 1kg당 10 내지 1000㎍/일의 톨 유사 수용체 리간드를 투여한다.

5) 락토페린을 경구 투여하고, 톨 유사 수용체 리간드를 복강내 투여한다.

6) 상기 톨 유사 수용체 리간드가 폴리이노신산-폴리시티딜산이다.

본원의 제3 발명은, 동물(사람 제외)에게 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드를 투여하고, 당해 동물로부터 NK 세포를 채취함을 특징으로 하는, NK 세포의 제조 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 NK 세포의 제조 방법은 이하의 7) 내지 9) 중 어느 하나를 특징으로 한다.

7) 동물(사람 제외)에게 체중 1kg당 10 내지 2000mg/일의 양으로 락토페린을 5 내지 10일 동안 매일 투여하고, 락토페린의 투여 종료 5 내지 2일전에 체중 1kg당 10 내지 1000㎍/일의 양으로 톨 유사 수용체 리간드를 투여하고, 당해 동물로부터 천연 킬러 세포를 채취한다.

8) 락토페린을 경구 투여하고, 톨 유사 수용체 리간드를 복강내 투여하여 천연 킬러 세포를 복강으로부터 채취한다.

9) 상기 톨 유사 수용체 리간드가 폴리이노신산-폴리시티딜산이다.

본원의 제4 발명은, 동물(사람 제외)에게 시험 물질과 톨 유사 수용체 리간드를 투여하여 당해 동물중의 NK 세포의 유도를 검출하는 것을 포함하는, 동물의 생체내에서 NK 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 이하의 10) 내지 13) 중 어느 하나를 특징으로 한다.

10) 동물(사람 제외)에게 시험 물질을 5 내지 10일 동안 매일 투여하고, 시험 물질의 투여 종료 5 내지 2일 전에 톨 유사 수용체 리간드를 투여한다.

11) 시험 물질을 경구 투여하고, 톨 유사 수용체 리간드를 복강내 투여한다.

12) 상기 톨 유사 수용체 리간드가 폴리이노신산-폴리시티딜산이다.

13) 상기 시험 물질이 음식품 또는 이의 성분이다.

본원의 제5 발명은, 천연 킬러 세포의 증식제가 락토페린을 포함하는 제1 제제와 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제를 포함하며, 상기 제1 제제와 제2 제제가 별도 포장 되어 있음을 특징으로 하는, 동물의 천연 킬러 세포의 증식제 제조에 있어서의 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드의 용도이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 용도는 이하의 14) 내지 16)중 어느 하나를 특징으로 한다.

14) 상기 제1 제제는 체중 1kg당 10 내지 2000mg/일의 락토페린의 양으로 5 내지 10일 동안 매일 투여되고, 상기 제2 제제는 제1 제제의 투여 종료 5 내지 2일전에 체중 1kg당 10 내지 1000㎍/일의 톨 유사 수용체 리간드의 양으로 투여된다.

15) 락토페린을 포함하는 제1 제제는 경구 투여되고, 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제는 복강내 투여된다.

16) 상기 톨 유사 수용체 리간드가 폴리이노신산-폴리시티딜산이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 양태

다음에, 본 발명의 바람직한 실시 양태에 관해서 상세하게 설명한다. 단지, 본 발명은 이하의 바람직한 실시 양태에 한정되지 않으며, 본 발명의 범위내에서 자유롭게 변경할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 백분율은 특별히 언급하지 않는 한 질량에 의한 표시이다.

본 발명의 동물의 NK 세포의 증식제는 락토페린을 포함하는 제1 제제와 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제를 포함하며, 이 때, 상기 제1 제제와 제2 제제는 별도 포장 되어 있다.

본 발명에 사용하는 락토페린은, 시판중인 락토페린이나 포유 동물(예를 들면, 사람, 소, 염소, 양, 말 등)의 초유, 이행유, 정상유, 말기유 또는 이러한 젖의 처리물인 탈지유 및 훼이(whey) 등을 원료로 하여, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피 등의 통상적인 방법에 의해 상기 원료로부터 분리하여 수득되는 락토페린을 사용할 수 있다. 이 중에서도, 공업적 규모로 제조되는 시판중인 락토페린(예를 들면, 모리나가뉴교 제조)을 사용하는 것이 적합하다. 또한, 유전자 공학적 수법에 의해 미생물, 동물 세포, 형질전환 동물 등에서 생산한 락토페린을 사용하는 것도 가능하다. 또한, 락토페린의 NK 세포의 증식 작용을 손상시키지 않는 한, 아미노산 서열이 개변되거나 변화된 개변체도 본 발명의 락토페린에 포함된다.

본 발명에 있어서, 락토페린중의 금속 함유량은 특별히 한정되지 않으며, 락 토페린을 염산이나 시트르산 등에 의해 탈철한 아포형 락토페린; 당해 아포형 락토페린을 철, 구리, 아연 및 망간 등의 금속으로 킬레이트화하여 수득되는 포화도 100% 상태의 금속 포화 락토페린; 및 100% 미만의 각종 포화도로 금속이 결합하고 있는 상태의 금속 부분 포화 락토페린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 어느 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하는 톨 유사 수용체 리간드는, 현재 확인된 톨 유사 수용체 1 내지 10개의 패밀리 수를 인식하는 리간드라면 어느 것이라도 가능하지만, 이 중에서도, 리포 다당, β-글루칸, 2쇄 RNA, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 IC), 탁솔 등의 항암제, 디펜신, 열 쇼크 단백질, 피브리노겐, 하이알루론산 분해 산물 등이 바람직하고, 본 발명의 NK 세포의 증식제를 투여한 동물중, 바람직하게는 복강내에서 NK 세포를 유도 및 증식시킨다는 관점에서는, 특히 폴리 IC를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 현재 확인되지 않은 톨 유사 수용체 리간드라도, 락토페린과 동시에 동물의 NK 세포를 증식시킬 수 있는 것이면, 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 NK 세포의 증식제에 있어서, 상기 락토페린과 톨 유사 수용체 리간드는 각각 별도 포장된다. 본 발명에 있어서 별도 포장이란, 락토페린과 톨 유사 수용체 리간드가 각각 별개로 투여될 수 있도록 분리된 상태에 있는 것을 말하며, 전형적으로는 락토페린과 톨 유사 수용체 리간드는 별도의 용기 또는 주머니 등에 수용된다. 락토페린을 포함하는 제1 제제 및 톨 유사 수용체 리간드를 포함하는 제2 제제는 각각 동물에게 별개로 투여된다.

상기 제1 제제는 동물의 체중 1kg당 바람직하게는 10 내지 2000mg/일, 보다 바람직하게는 100 내지 100Omg/일의 락토페린의 양으로 투여된다. 투여 방법은 특별히 제한되지 않지만, 경구 투여가 바람직하다. 또한, 상기 투여량을 1일당 1회 내지 수회로 나누고, 5 내지 10일 동안 매일 투여하는 것이 바람직하며, 7 내지 8일 동안 매일 투여하는 것이 보다 바람직하다.

상기 제2 제제는 동물의 체중 1kg당 바람직하게는 10 내지 1000㎍/일, 보다 바람직하게는 50 내지 200㎍/일, 더욱 바람직하게는 약 100㎍/일의 톨 유사 수용체 리간드의 양으로 투여된다. 제2 제제는, 상기의 양을 1회로 투여하는 것이 바람직하고, 100㎍/kg 정도의 양을 1회 투여하는 것이 특히 바람직하다. 제2 제제의 투여 방법은 특별히 제한되지 않지만, 복강내 투여가 바람직하다. 또한, 제2 제제는 락토페린 투여 종료 5 내지 2일 전, 바람직하게는 3일 전에 1회 투여하는 것이 바람직하다.

제1 제제 및 제2 제제는 상기의 투여 방법 및 투여 스케쥴에 적합하도록 제조되는 한, 제형은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 제1 제제 및 제2 제제는 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드 이외에, 이러한 성분의 보존 및 작용을 저해하지 않는 다른 성분, 예를 들면 담체, 부형제 및 pH 변형제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 동물에 있어서의 NK 세포의 증식 방법은 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드를 동물에게 투여함을 포함한다. 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드는 각각 본 발명의 NK 세포의 증식제를 구성하는 제1 제제 및 제2 제제일 수 있다.

상기 동물로서는, 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드의 투여에 의해서 NK 세포가 유도되어 증식하는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 마우스, 래트, 염소, 양, 말 및 소 등을 들 수 있다.

락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드의 투여 방법 및 투여 스케쥴은 상기의 본 발명의 NK 세포의 증식제에 관해서 기재한 것과 동일하다. 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드를 투여함으로써, 이들을 투여한 동물에서 NK 세포가 유도되어 증식된다. 특히, 톨 유사 수용체 리간드를 투여한 장기 또는 조직에서, 예를 들면 복강에 투여한 경우는 복강내에서 NK 세포가 유도된다.

톨 유사 수용체 리간드의 투여의 바람직한 타이밍은 사용하는 동물에서 효율적으로 NK 세포가 유도되도록, 미리 예비 실험함으로써 결정할 수 있다. 즉, 락토페린을 매일 투여한 동물에게 락토페린 투여 종료 예정일부터의 기간을 변경하여 톨 유사 수용체 리간드를 투여하고, NK 세포의 유도를 비교함으로써, 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 일단 바람직한 조건이 결정되면, 동종의 동물을 사용하는 경우는, 이러한 조건에 따라서 투여 스케쥴을 설정할 수 있다.

NK 세포의 증식은 예를 들면, 동물의 장기 또는 조직, 예를 들면 복강으로부터 채취한 세포에 관해서, NK 세포를 인식하는 표지된 항체를 사용하여 항체와 반응하는 양성 세포의 비율을 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, 동물로서 마우스를 사용한 경우, 항-CD49b/Pan-NK 세포 항체[참조: 파민젠사 제조]를 사용하여, CD49b/Pan-NK 세포 항체에 대한 양성 세포의 비율을 측정함으로써 NK 세포를 확인할 수 있다. 이 때, 배경값과 관련되는 CD16/CD32(FcγIII/II 수용체)를 통한 항체 결합을 감소시키기 위해, 항-마우스 CD16/CD32 항체 또는 항-래트 CD32 항체 를 사용하여 이들의 항원을 차단시키는 것이 바람직하다. 또한, 마우스로서 C57BL/6(균주)를 사용한 경우는, NK 세포를 인식하는 항체로서 항-NK1.1 항체를 사용하여 NK1.1 양성 세포의 비율을 측정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 실시예에 기재한 바와 같이, 세포를 FITC-표지된 NK1.1 항체를 사용하여 염색하고, 유세포 분류기(예를 들면, FACS^TMCalibur: 벡톤·디킨슨사 제조)를 사용하여 NK1.1 양성 세포의 비율을 측정할 수 있다.

상기한 바와 같이 NK 세포가 증식된 동물로부터 NK 세포를 채취함으로써 NK 세포를 제조할 수 있다. 미리 설정한 투여 스케쥴에 따라서 NK 세포가 효과적으로 유도되는 것이 예상되는 시점에서 동물로부터 NK 세포를 채취할 수 있다. 또한, 락토페린 투여후, 1일 동안 아무것도 투여하지 않고서 방치한 후, 증식된 NK 세포를 채취할 수 있다.

NK 세포는 통상적인 방법에 따라 채취할 수 있다. 예를 들면, NK 세포가 복강내로 유도된 경우에는, 동물의 복강내를 세정액(예를 들면 행크(Hank) 용액)으로 1회 또는 수회 세정하여, 세정액을 수거으로써 채취할 수 있다. NK 세포를 포함하는 세정액으로부터 NK 세포를 정제하기 위해서는, 예를 들면 세포 분별기를 사용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수득되는 NK 세포는 높은 세포독성 활성을 유지하는 것으로 기대된다. NK 세포는 항바이러스 활성이나 항종양 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득되는 NK 세포는, 예를 들면 헤 르페스 바이러스나 거대세포바이러스 등의 바이러스 감염증에 대한 세포 요법, 암환자에 대한 LAK(림포카인 활성화된 킬러) 요법에 사용할 수 있다.

본 발명에 의해서 톨 유사 수용체 리간드의 투여에 의해 락토페린의 NK 세포 증식 작용이 높아지는 것으로 나타났다. 따라서, 톨 유사 수용체 리간드를 사용함으로써 NK 세포 증식 작용을 갖는 물질의 당해 작용을 높일 수 있으며, NK 세포 증식 작용을 갖는 물질을 양호한 감도로 스크리닝할 수 있다. 즉, 동물에게 시험 물질과 톨 유사 수용체 리간드를 투여하여, 당해 동물에서 NK 세포의 유도를 검출함으로써, NK 세포 증식 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, 락토페린에 대해 상기한 바와 같이 결정된 투여 스케쥴에 있어서, 락토페린을 시험 물질로 대신하여 시험 물질 및 톨 유사 수용체 리간드를 동물에게 투여하고, 동물 중에서 NK 세포가 유도되면, 상기 시험 물질이 NK 세포 증식 작용을 갖는 것으로 간주된다.

투여 방법은 본 발명의 NK 세포의 증식제와 동일할 수 있다. 바람직하게는, 시험 물질은 경구 투여하고, 톨 유사 수용체 리간드는 복강내 투여한다. 또한, NK 세포의 유도는 상기와 같이, 예를 들면 NK 세포를 인식하는 표지된 항체를 사용하여, 항체와 반응하는 양성 세포의 비율을 측정함으로써, 검출할 수 있다. 이렇게 해서 NK 세포의 유도가 검출된 시험 물질에 관해서는, 추가로 동 시험 물질을 단독으로 동물에게 투여하고, 당해 동물의 장기 또는 조직, 예를 들면 비장 등에 있어서의 NK 세포의 증식을 확인하는 것이 바람직하다.

바람직한 시험 물질로는, 동물의 젖 등의 음식품, 또는 이러한 음식품 중의 각종 성분을 들 수 있다.

본 발명의 스크리닝법에 의해 밝혀진 NK 세포 증식 작용을 갖는 물질, 특히 식품 또는 이의 성분은, NK 세포의 증식, 또는 NK 세포의 증식에 의해서 예방될 수 있는 질환의 예방을 목적으로 하는 의약 또는 건강 식품 또는 이의 성분으로서 이용할 수 있다.

실시예

다음에 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

본 실시예에서는, 락토페린에 의한 NK 세포 증식 효과를 검토하기 위한 시험을 실시하였다.

(1) 시험 방법

7주령의 C57BL/6 마우스(니혼찰스리버로부터 구입) 45마리를 각각 9마리씩 5개 그룹으로 나누고, 1주동안 순화 사육하였다. 각 그룹의 동물에게 소·락토페린[참조: 모리나가뉴교 제조]의 투여량이 0(대조 시료), 30, 100, 300, 1000mg/체중kg이 되도록, 생리식염수[참조: 오오쓰카세야쿠 가부시키가이샤 제조]에 용해시킨 소·락토페린 용액을 경구 존데를 사용하여 7일 동안 매일 투여하였다. 투여 완료후, 1일 동안 방치한 후, 각각의 마우스로부터 비장을 채취하고, 비장 세포의 현탁액을 제조하였다. 제조한 세포 현탁액 중의 세포수를 1검체당 2×10⁶개가 되도록 조정하였다. 1% 소 태아 혈청을 포함하는 세포 세정[참조: 벡톤·딕슨사 제조] 용액(이하, 「희석 완충제」라고 기재한다)을 사용하여 1㎍/10㎕의 농도가 되도록 희석시킨 항마우스 CD16/CD32 모노클로날 항체(Fc Block^TM, 벡톤·딕슨사 제조) 용액을, 1검체당 10㎕ 씩 상기 세포 현탁액에 첨가하고, 빙상에서 5분 동안 정치하여 FcγIII/II 수용체를 차단하였다.

그 후, 농도가 1㎍/10㎕가 되도록 희석 완충제로 제조한 FITC 표지된 항마우스 NK1.1 항체[참조: 파민젠사 제조] 용액을 10㎕ 첨가하여 혼합하고, 25분 동안 정치하고, NK1.1 양성의 NK 세포를 염색하였다. 이어서, 희석 완충제를 500㎕ 첨가하고, 3500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 세정하고, 동 세정조작을 2회 반복하였다. 그 후, 세포에 FACS^TM 용균 용액[참조: 벡톤·딕슨사 제조] 500㎕를 첨가하여, 실온에서 10분 동안 정치하여 적혈구를 용해시켰다. 계속해서, 상기 세정 방법에 의해 2회 세포를 세정하여, 회수한 세포에 희석 완충제 1ml을 첨가하여 세포 현탁액을 제조하였다. 제조한 세포 현탁액은 나일론스크린(프론고교사 제조. 제품번호 F-3100-134)으로 여과하여 폴리스티렌 튜브에 회수하고, 유세포 분류기(FACS^TMCalibur: 벡톤·딕슨사 제조)로 NK1.1 양성 세포의 비율을 측정하였다.

(2) 시험 결과

그 결과, 비장 세포 중에 있어서의 NK1.1 양성 세포, 즉 NK 세포의 비율은 100 내지 300mg/체중kg의 양의 락토페린을 투여한 그룹에서 용량 의존적으로 증가하는 것이 판명되었다.

실시예 2

본 시험에서는 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드에 의한 NK 세포 증식 및 유도 효과를 검토하는 시험을 하였다.

(1) 시험 방법

실시예 1과 동일하게, 그룹당 9마리, 합계 63마리의 마우스를 1주동안 순화 사육한 후, 3개의 그룹을 락토페린 투여 그룹(LF 그룹. 락토페린 투여량: 300mg/체중kg/일), 나머지 4개 그룹을 대조군(생리 식염수 투여)으로서 그룹을 분류하였다. 여기서, 전체 7개 그룹의 마우스에게 경구 존데를 사용하여 각 시료(락토페린 투여 또는 생리 식염수 투여)를 7일 동안 매일 투여하고, 다시 1일 동안 아무것도 투여하지 않고, 8일째를 투여 완료일로 하는 투여 스케쥴을 계획하였다. 여기서, 락토페린 투여 그룹 3개 그룹 및 대조 그룹중의 3개 그룹의 각각에 관해서, 투여 완료 7일 전에 폴리 IC(폴리이노신산-폴리시티딜산 나트륨 염, 제품번호 P-0913. 시마다사 제조)를 100㎍ 복강내에 투여하는 그룹, 투여 완료 3일 전에 폴리 IC를 100㎍ 복강내에 투여하는 그룹, 투여 완료 1일 전에 폴리 IC를 100㎍ 복강내에 투여하는 그룹을 설정하고, 또한, 대조 그룹의 나머지 1개 그룹은 폴리 IC를 투여하지 않는 그룹으로서 설정하여, 각각 시험을 실시하였다.

투여 완료후, 각 군의 마우스의 복강에 행크 평형 염 용액(행크 용액「닛스 이」, 닛스이세야쿠사 제조) 5ml를 주입하여 복강내를 세정하고, 이를 2회 반복하여 세정액을 회수하고 복강내 세포 용액을 제조하였다. 이어서, 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FITC 표지된 NK1.1 항체[참조: 파민젠사 제조]를 사용하여, 복강내 세포를 염색하고, 유세포 분류기(FACS^TMCalibur: 벡톤·디킨슨사 제조)로 NK1.1 양성 세포의 비율을 측정하였다.

(2) 시험 결과

상기 시험의 결과를 표 1에 기재한다. 그 결과, 락토페린 투여 그룹중 투여 완료 3일 전에 폴리 IC를 투여한 그룹에 있어서, 복강내의 NK 세포의 비율 및 NK 세포의 절대수는 현저히 증가함이 판명되었다. 그렇지만, 그 밖의 락토페린 투여 그룹 및 대조 그룹에서는 복강내의 NK 세포의 비율 및 NK 세포의 절대수 중 어느 것이라도 유의적인 증가는 확인되지 않았다. 한편, 3개의 모든 락토페린 투여 그룹에 있어서, 비장에서 NK 세포의 비율 및 NK 세포의 절대수의 증가는 확인되었지만, 상기 복강내에서 확인된 것과 같은 현저한 변화는 확인되지 않았다.

이상의 결과로부터, 상기의 투여 조건에서는, 특히, 락토페린을 7일 동안 매일 투여하고, 8일째에 투여를 완료하는 투여 스케쥴에 있어서, 투여 완료 3일 전에 폴리 IC를 투여함으로써, 복강내에 특이적으로 NK 세포를 유도하고, 또한 현저히 NK 세포의 비율 및 NK 세포의 절대수를 증가시키는 것이 가능한 것으로 판명하였다.

실시예 1 및 실시예 2의 결과로부터, 락토페린을 경구 투여함으로써 적어도 비장중에 NK 세포가 증식하는 것 및, 또한 폴리 IC를 복강내 투여함으로써 NK 세포가 복강내에 유도되는 것이 확인되었다. 이상의 것으로부터, 락토페린 대신, 동물의 생체내에서 NK 세포를 증식시키는 작용을 갖는 다른 물질을 투여하고, 또한 폴리 IC 등의 톨 유사 수용체 리간드를 예를 들면 복강내에 투여한 경우도, NK 세포가 복강내로 유도되는 것으로 간주된다. 이러한 NK 세포 증식 작용을 갖는 물질과 톨 유사 수용체 리간드를 조합한 NK 세포의 유도는, NK 세포 증식 작용을 갖는 물질의 스크리닝에 이용할 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명에 의해서 나타나는 주된 효과는 다음에 나타내는 바와 같다.

(1) 락토페린 및 톨 유사 수용체 리간드, 특히 폴리 IC를 투여함으로써 사람을 포함하는 동물의 NK 세포를 특이적으로 유도 또한 대량으로 증식시키는 것이 가능하다. 이 경우, 다른 세포 그룹이 거의 혼입되지 않기 때문에, 표지된 항체를 사용하여 NK 세포를 제조할 때에 채취량이나 순도의 향상이 도모된다.

(2) 높은 세포독성 활성을 유지한 상태에서 NK 세포를 효율적으로 수득할 수 있기 때문에, 악성 종양의 치료 등의 세포 면역 요법 등을 위한 의약으로서 이용하는 것이 가능하다.

(3) 경구 투여에 의해서 생체내에서 천연 킬러 활성(특히 바이러스에 대한) 상승 내지 활성화시키는 음식품(음식물) 유래의 인자를, 방사능이나 특수한 시설을 필요로 하지 않고 스크리닝하는 것이 가능하다.

Claims (10)

1. 인간 제외 동물에게 시험 물질을 7일 동안 매일 경구 투여하고, 시험 물질의 투여 종료 3일 전에 폴리이노신산-폴리시티딜산을 복강내 투여하여, 당해 동물 중의 천연 킬러 세포의 유도를 검출함을 포함하여, 인간 제외 동물의 생체내에서 천연 킬러 세포를 증식시키는 작용을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 시험 물질이 음식품 또는 이의 성분인 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항 또는 제6항에 있어서, 폴리이노신산-폴리시티딜산이 체중 1kg당 10 내지 1000㎍/일 투여되는 방법.