JP2007125038A - ナチュラルキラー細胞を増殖させる作用を有する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】動物(ヒトを除く)に被検物質を7日間連日投与し、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を被検物質の投与開始5日目に1回投与し、被検物質の投与終了後に同動物中のナチュラルキラー細胞の誘導を検出することにより、動物の生体内でナチュラルキラー細胞を増殖する作用を有する物質をスクリーニングする。
【選択図】なし
Description
的なものは、ヒトK562細胞、又はマウスリンパ腫細胞Yac-1に対する細胞傷害活性を見るものであり、51Cr等で放射能ラベルしたYac-1細胞を含む細胞群を共培養し、培養上清中に放出された放射活性を測定する方法である。また、生体内でNK活性を測定する方法としては、前記と同様に放射能ラベルした腫瘍細胞を生体内に移植したり、あるいはウイルス等を動物に感染させて観察するというもので、いずれも特殊な施設や設備を必要とするものである。
1)被検物質の投与開始8日目に何も投与せず、その後、前記動物中のナチュラルキラー細胞の誘導を検出すること。
2)被検物質を経口投与し、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を腹腔内投与すること。
3)前記被検物質が飲食品又はその成分であること。
本発明の動物のNK細胞の増殖剤は、ラクトフェリンを含む第1剤と、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を含む第2剤からなり、かつ、前記第1剤と第2剤が別包されているものである。
本発明に使用するラクトフェリンは、市販のラクトフェリンや、哺乳動物(例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等)の初乳、移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、ホエー等を原料とし、例えばイオン交換クロマトグラフィー等の常法により、前記原料から分離して得られるラクトフェリンを用いることができる。中でも、工業的規模で製造されている市販のラクトフェリン(例えば、森永乳業社製)を使用することが好適である。更に、遺伝子工学的手法により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等で生産したラクトフェリンを使用することも可能である。また、ラクトフェリンのNK細胞の増殖作用を損わない限り、アミノ酸配列が改変され、又は修飾された改変体も、本発明のラクトフェリンに含まれる。
ル酸を含む第2剤はそれぞれ、動物に別個に投与される。
細胞を製造することができる。動物からのNK細胞の採取は、予め設定した投与スケジュールに従って、NK細胞が効果的に誘導されることが予想される時点で行うことができる。具体的には、ラクトフェリン投与後、1日間何も投与せずに放置し、その後、増殖したNK細胞を採取する。
killer)療法に用いることができる。
本発明のスクリーニング法により見い出されるNK細胞増殖作用を有する物質、特に食品又はその成分は、NK細胞の増殖、又はNK細胞の増殖によって予防され得る疾患の予防を目的とする医薬もしくは健康食品又はそれらの成分として、利用することができる。
本実施例では、ラクトフェリンによるNK細胞増殖効果を検討するための試験を行った。
7週齢のC57BL/6マウス(日本チャールスリバーより購入)45匹を、それぞれ9匹ずつ5群に分け、1週間馴化飼育し、各群にウシ・ラクトフェリン(森永乳業社製)の投与量が0(対照試料)、30、100、300、1000mg/kg体重となるように、生理食塩水(大塚製薬社製)に溶解したウシ・ラクトフェリン溶液を経口ゾンデを使用して、7日間連日投与した。投与完了後、1日間放置した後、それぞれのマウスから脾臓を採取し、脾臓細胞の懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液中の細胞数を1検体当たり2×106個となるように調整した。1%ウシ胎児血清を含むCell Wash(ベクトン・ディッキンソン社製)溶液(以下、「希釈バッファー」と記載する。)を用いて1μg/10μlの濃度となるように希釈した抗マウスCD16/CD32モノクローナル抗体(Fc
BlockTM、ベクトン・ディッキンソン社製)溶液を、1検体当たり10μlずつ前記細胞懸濁液に添加し、氷上で5分間静置して、FcγIII/IIレセプターをブロックした。
その結果、脾臓細胞中におけるNK1.1陽性細胞、すなわちNK細胞の割合は、ラクトフェリン投与量が100〜300mg/kg体重の投与群において、用量依存的に増加することが判明した。
本試験では、ラクトフェリン及びポリイノシン酸−ポリシチジル酸によるNK細胞増殖・誘導効果を検討する試験を行った。
実施例1と同様に、1群9匹、計63匹のマウスを1週間馴化飼育した後、3群をラクトフェリン投与群(LF群。ラクトフェリン投与量:300mg/kg体重/日)、残りの4群を対照群(生理食塩水投与)として群分けした。ここで、全7群のマウスに経口ゾンデを使用して、各試料(ラクトフェリン投与、生理食塩水投与)を7日間連日投与し、さらに1日間何も投与せず、8日目を投与完了日とする投与スケジュールを計画した。ここで、ラクトフェリン投与群3群、及び対照群のうちの3群のそれぞれについて、投与完了7日前にポリIC(POLYINOSINIC-POLYCYTIDYLIC ACID Sodium salt、製品番号:P-0913。シグマ社製)を100μg腹腔内に投与する群、投与完了3日前にポリICを100μg腹腔内に投与する群、投与完了1日前にポリICを100μg腹腔内に投与する群を設定し、また、対照群の残り1群はポリICの投与は行わない群として設定して、それぞれ試験を行った。
液を回収して腹腔内細胞溶液を調製した。次いで、実施例1に記載された方法と同様の方法でFITC標識NK1.1抗体(ファーミンジェン社製)を用いて、腹腔内細胞を染色し、フローサイトメーター(FACSTM Calibur:ベクトン・ディッキンソン社製)にてNK1.1陽性細胞の割合を測定した。
上記試験の結果を表1に示す。その結果、ラクトフェリン投与群のうち、投与完了3日前にポリICを投与した群において、腹腔内のNK細胞の割合及びNK細胞の絶対数は顕著に増加することが判明した。しかしながら、その他のラクトフェリン投与群および対照群では、腹腔内のNK細胞の割合及びNK細胞の絶対数のいずれも有意な増加は確認されなかった。尚、ラクトフェリン投与群3群において、いずれも脾臓でNK細胞の割合及びNK細胞の絶対数の増加は確認されたが、前記腹腔内で確認されたような顕著な変化は確認されなかった。
以上の結果より、上記の投与条件では、特に、ラクトフェリンを7日間連日投与し、8日目に投与を完了する投与スケジュールにおいて、投与完了3日前にポリICを投与することによって、腹腔内に特異的にNK細胞を誘導し、かつ顕著にNK細胞の割合及びNK細胞の絶対数を増加させることが可能であることが判明した。
Claims (4)
- 動物の生体内でナチュラルキラー細胞を増殖する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、動物(ヒトを除く)に被検物質を7日間連日投与し、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を被検物質の投与開始5日目に1回投与し、被検物質の投与終了後に同動物中のナチュラルキラー細胞の誘導を検出することを含む方法。
- 被検物質の投与開始8日目に何も投与せず、その後、前記動物中のナチュラルキラー細胞の誘導を検出することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被検物質を経口投与し、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を腹腔内投与することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 被検物質が飲食品又はその成分である請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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