KR101047129B1 - 구리 이온 선택성을 갖는 쿠마린 유도체, 이의 제조 방법, 이를 이용한 구리 이온 검출 방법 및 형광화학센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 하기 화학식 (1)의 쿠마린(coumarin) 유도체, 이를 제조하는 방법, 이를 이용한 구리 이온 검출 방법 및 형광화학센서에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구리 이온 선택성을 갖는 이미노-쿠마린(imino-coumarin: IC)이 구리 이온과 착물을 형성할 때 나타나는 형광 방출 증가를 이용하여 구리 이온을 검출하는 방법에 관한 것이다.

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쿠마린, 구리 이온, 화학센서

Description

구리 이온 선택성을 갖는 쿠마린 유도체, 이의 제조 방법, 이를 이용한 구리 이온 검출 방법 및 형광화학센서{Coumarin derivatives having Cu(II) ion selectivity, method for preparing therefor, detecting method and fluorescence sensor using the same}

본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체, 이를 제조하는 방법, 이를 이용한 구리 이온 검출 방법 및 형광화학센서에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구리 이온 선택성을 갖는 이미노-쿠마린(imino-coumarin:IC)이 구리 이온과 착물을 형성할 때 나타나는 형광 방출 증가를 이용하여 구리 이온을 검출하는 방법에 관한 것이다.

구리는 인체에 존재하는 필수 중금속 중에서 세 번째로 풍부한 금속으로서, 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 비정상적인 구리 이온의 섭취는 윌슨병, 위장질환, 저혈당증, 난독증, 유아 간질환을 유발하는데, 이러한 질환들은 특히 여러 기관들 중에서도 주로 간과 신장에서의 구리 이온들의 축적에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 생체 시스템 및 환경 분야에서 잔류 구리 이온의 양을 검출하는 것은 매우 중요하다.

최근에는 구리 이온을 검출하기 위한 도구로서, 수용액 중의 구리 이온을 선택적으로 인식하여 형광을 발산하는 화학적 수용체가 개발되고 있다. 이러한 방법들은 근래 들어 그들의 잠재적인 응용 가능성 때문에 임상학적 생화학분야 및 환경과학 분야에서 상당한 관심을 받아 왔다. 이러한 형광방출 화학적 수용체들은 검출 가능한 형광 신호를 생산하는 방법과 마찬가지로 화학종과 상호작용을 통해 생리화학적 특성이 변화되는 분자 시스템이다.

구리 이온 검출을 위한 새로운 형광방출을 유발하는 화학센서를 개발하기 위해서는, 신속한 신호전달 메카니즘을 야기하는 적절한 형광방출체가 선택되어야 하며, 새로운 형광방출체뿐만 아니라 구리 이온을 인식하고, 이를 신호로서 제공하는 유닛을 개발하는 것이 매우 중요하다. 지금까지 여러 가지 형광방출체 및 다양한 종을 광학적으로 검출하기 위한 신호전달 메카니즘이 개발되어 왔는데, 대표적인 신호전달 메카니즘으로 주로 이용되었던 것으로는 PET(photo-induced electron/energy transfer), ICT(intramolecular charge transfer), eximer/exciplex formation 및 ESIPT(excited-state intra-/intermolecular proton transfer)를 들 수 있다.

한편 가장 최근에는 Wu 등이 Zn²⁺에 의해 유발되는 형광방출 센서로서 쿠마린 유도체를 개발하였다고 보고하였는데, 상기 유도체는 Zn²⁺와 착물을 형성하여 착물 형성 전에 비해 약 200배 정도 형광방출이 증가하는 것으로 나타났다. 이와 유사한 방법으로 Bharadwaj 등은 Mg²⁺의 첨가로 따라 강한 형광 방출을 나타내는 이민 -이성질화 현상에 기초한 새로운 형광 방출체를 고안하기도 하였다. 그러나 구리이온의 검출을 위해 FEGIB(fluoroscence enhancement by geometric isomerization blocking) 메카니즘이 실제 사용된 경우는 아직까지 없었다.

종래에는 구리 이온 결합은 고유의 형광 감소를 유발시키는 것으로 알려져 왔으며 합성된 수많은 형광방출 화학적 수용체들이 구리 이온과 결합하여 형광 감소를 유발하여 형광 방출을 중단시키는 센서로 알려져 있다. 그러나 실용적인 적용을 위해서는 형광방출 중단 센서보다는 형광방출 작동 센서가 더 유용하며, 이에 따라 구리 이온과 결합하여 형광방출을 유발하는 화학적 수용체에 대한 관심이 지속되어 왔다. 그러나 현재까지는 구리 이온에 의해 형광 강화를 보이는 예는 거의 없었으며, 지금까지 진행된 대부분의 연구도 용해도 문제로 인해 수용액 상이 아닌 아세토나이트릴(CH₃CN)이나 테트라하이드로퓨란(THF)와 같은 유기 매질을 대상으로 진행되어 왔다. 그러나 이러한 유기 매질에서 사용할 수 있는 화학적 수용체는 수용액상으로 이루어진 환경적 또는 생물학적 시스템에 적용하는 데에 본질적인 문제가 있었다.

한편 국내등록특허 제10-690199호(2007. 2. 27 등록)에는 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체 및 이를 이용한 구리 이온 검출 방법이 개시되어 있는데, 구리 이온과 강하게 결합하는 플루오레세인 유도체를 이용하여, 생체 내에서 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질의 양이 증가함에 따라 형광이 증가하는 현상을 이용하여 구리 이온을 검출하는 것이 특징이다.

그러나 그 동안 개발되었던 구리를 검출하기 위한 형광화학센서는 수용성이 낮고, 응답시간이나 감도도 좋지 않았기 때문에 실제 산업에 적용하기에는 적합하지 않았다. 따라서 생물학적, 환경공학적 공정에 적용할 수 있도록 수용성 환경에서 구리 이온 검출 성능이 우수한 형광화학센서의 개발이 요구되어 왔다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 구리 이온(Cu²⁺)과 착물을 형성했을 때 현저한 형광 강화 현상을 보여주며, 특히 수용액에서 구리 이온의 검출 성능이 우수한 쿠마린 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 구리 이온 검출용 쿠마린 유도체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 쿠마린 유도체를 이용하여 구리 이온을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 네 번째 과제는 상기 쿠마린 유도체를 이용하여 구리 이온 검출하기 위한 고감도 형광화학센서를 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위하여, 구리 이온 선택성을 갖는 하기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체를 제공한다.

(1)

본 발명은 상기 두 번째 과제를 해결하기 위하여, 7-디에틸아미노 쿠마린-3-알데히드와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올을 반응시켜 상기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 세 번째 과제를 해결하기 위하여, 상기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체를 이용하여 시료 중에서 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 구리 이온의 검출은 형광 변화 측정에 의해 이루어지는 것일 수 있으며, 예를 들어 구리 이온 결합에 따른 형광 방출 증가를 측정하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 쿠마린 유도체와 구리 이온은 1:1로 착물을 형성하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 형광 변화는 금속이온을 포함하는 수용액에 상기 쿠마린 유도체를 포함하는 용액을 첨가하여 빛을 가하여 여기(excited)시키는 단계와; 상기 용액에서 방출된 형광을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 빛은 파장이 450nm 내지 470nm일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 쿠마린 유도체를 포함하는 용액은 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액일 수 있다. 이때, 상기 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액은 pH가 7.2 내지 7.4일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 시료는 수용액일 수 있으며, 상기 수용액은 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 혼합 용액이 사용가능하며, 상기 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 부피의 비는 4:6 또는 6:4일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 시료는 동물의 간, 신장 또는 소변인 것일 수 있다.

본 발명의 상기 네 번째 과제를 해결하기 위하여, 상기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체를 이용하여 시료 중에서 구리 이온을 선택적으로 검출하는 화학센서를 제공한다.

본 발명에 의한 형광 화학 센서인 이미노쿠마린(imino-coumarin)은 구리 이온(Cu²⁺)과 착물을 형성했을 때, 현저한 형광 방출 증가 현상을 보여주기 때문에 구리 이온 검출을 위한 고감도 형광화학센서로 이용할 수 있으며, 특히 수용액에서 구리 이온의 검출 성능이 우수하기 때문에 생물학 또는 환경공학 공정에 쉽게 적용할 수 있어 매우 유용하다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 구리 이온 선택성을 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체는 하기 화학식 (1)의 이미노-쿠마린(imino-coumarin:IC)이다.

(1)

본 발명에 따른 이미노-쿠마린의 제조 방법은 7-디에틸아미노 쿠마린-3-알데히드와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올을 반응시키는 것이 특징이다.

본 발명은 상기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체를 이용하여 시료 중에서 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법을 제공하며, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 구리 이온의 검출은 형광 변화, 구체적으로 형광 방출 증가에 의해 이루어지는 것일 수 있는데, 그 원리는 다음과 같다.

본 발명에 따른 고감도 형광화학센서는 기하 이성질체화 저해에 의한 형광 증가(Fluorescence Enhancement by Geometric Isomerization Blocking: FEGIB) 메카니즘에 의해 구리 이온을 검출할 수 있는데, 구체적으로 수용액 중에 존재하는 구리 이온(Cu²⁺)과 착물을 형성할 때 나타나는 뚜렷한 형광 증가 현상을 통해 구리 이온을 검출할 수 있다.

도 1은 이미노쿠마린과 Cu²⁺ 이온이 결합하여 형광이 증가되는 메카니즘을 도시한 그림이다. 도 1을 참조하면, 이미노쿠마린의 C=N 이성질화가 Cu²⁺과 착물 형성 에 의해 차단되면서, C=N 이성질화에 의해 발생하는 비방사성(non-radiative)의 감쇄가 여기 상태에서 일어날 수 없기 때문에 이미노쿠마린의 형광 방출이 작동된다. 이는 '압 이니쇼'(AB INITIO) 연산들을 통해서 확인되었다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 시료는 수용액일 수 있고, 상기 수용액은 바람직하게는 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 혼합 용액일 수 있으며, 상기 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 부피의 비는 4:6 또는 6:4일 수 있다. 아세토니트릴(CH₃CN)을 포함하는 수용액에 구리를 포함하는 금속 이온이 잘 용해되며, 바람직하게는 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 부피의 비가 4:6 내지 6:4인 경우에 이미노쿠마린과 수은 이온이 결합하였을 때 형광이 강하게 나타내기 때문이다.

상기 이미노쿠마린은 상기 수용액에 0.1μM 내지 1mM의 농도로 가해주는 것이 바람직한데, 이미노쿠마린의 농도가 0.1μM 미만의 경우에는 결합하는 구리 이온의 양도 감소하여 형광의 증가가 뚜렷하게 나타나지 않으며, 1mM을 초과하게 되면, 이는 더 적은 양의 이미노쿠마린에 의해 분석에 필요한 충분한 형광을 검출할 수 있음에도 필요 이상의 이미노쿠마린을 가하게 되어 이미노쿠마린을 불필요하게 소모하는 것이기 때문이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 쿠마린 유도체를 포함하는 용액은 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid: HEPES) 버퍼용액일 수 있고, 상기 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액은 pH가 7.2 내지 7.4일 수 있다. N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES)산은 흔히 세포 배양액의 pH를 일정하게 유지시키는 역할을 하는 완충용액으로서 무기 나트륨 바이카보네이트 완충 시스템에 비해, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES)은 pH 7.2 내지 7.6의 범위에 생리학적 완충범위에 적합하다. N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES)은 양이온화 및 음이온화 모두가 가능한 그룹을 포함하고 있어 버퍼로서의 필요한 우수한 성질을 가지고 있다. 2차 아민 및 3차 아민 그룹은 양전하를 제공하고 술폰산과 카르복실산 그룹은 음전하를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 형광 변화는 금속이온을 포함하는 수용액에 상기 이미노쿠마린을 포함하는 용액을 첨가하여 빛을 가하여 여기(excited)시키는 단계와 상기 용액에서 방출된 형광을 측정하는 단계가 포함될 수 있는데, 이때, 상기 빛의 파장은 450nm 내지 470nm이 바람직하다. 이는 상기 파장의 빛을 가하여 여기시킨 경우에 형광의 강도가 증가되어 형광의 검출이 용이해지기 때문이다.

실시예 1 : 이미노쿠마린의 합성

7-디에틸아미노 쿠마린-3-알데히드(245.0mg, 1.0mmol)와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(222.4 mg, 1.10 mmol)을 20.0mL의 고온의 순수 에탄올에 혼합하여 순식간에 주홍색 침전을 얻었다. 그후 상기 용액을 4시간 동안 환류시키면서 교반하였으며, 침전물을 여과시킨 후 고온의 순수 에탄올로 3회 세척한 다음 CHCl₃/C₂H₅OH (v/v, 1/3)로 재결정하여 황색 결정의 이미노쿠마린 (366.4 mg, 0.85 mmol)을 85 % 수득률로 얻었다. 녹는점은 186 ~ 187 ℃ 였으며, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 FAB MS 데이터는 다음과 같았다.

IR (KBr pellet, cm^-1): 1698, 1616, 603;

¹H-NMR (DMSO-d ₆, 200 MHz) δ14.14 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.89-7.86 (m, 2H), 7.65-7.60 (d, J = 9.3Hz, 1H), 7.51-7.50 (s, 3H), 6.79-6.74 (d, J = 9.1Hz 1H), 6.59 (s, 1H), 3.34 (s, 4H), 1.15 (t, J = 6.79Hz, 6H);

¹³C-NMR (DMSO-d ₆, 50 MHz) δ162.3, 160.0, 157.8, 152.7, 148.5, 142.9, 138.7, 132.0, 130.6, 128.7, 128.3, 125.6, 110.2, 109.4, 180.0, 96.4, 44.4, 40.7, 40.3, 39.9, 39.5, 39.1, 38.6, 38.2, 12.4 ppm;

FAB MS m/z (M⁺): calcd, 419.5. Found, 416.0.

실시예 2: 세포배양

두 개의 세포주 LLC-MK2 및 NCTC 1469가 형광 이미지 측정을 위해 사용되었다. 세포주들은 10%(v/v) 광-불활성화된 송아지 태아의 세럼(HyClone), 100.0 ug/ml 페니실린, 100.0 ug/ml 스트렙토마이신 및 0.25 mM 이미노쿠마린-글루타민이 첨가된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, GibcoBRL사, 미국)에서, 37^oC, 5% CO₂ 가습된 공기를 주입하여, 연속배양으로 준비되었다. 세포들이 로그대수기에 도달하였을 때, 세포 밀도를 한 웰 당 1 x 10⁵ 로 맞추었다. 이렇게 배양된 세포들은 각 웰 당 1.0mL의 세포용액이 되도록 12 웰 플레이트에 접종되었다. 세포 부착 후, 배양액을 제거하고, 세포층을 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척한 후, 각 웰마다 1.0mL의 배양액을 첨가했다.

실험예 1 : 이미노쿠마린의 형광 변화 관찰

형광 스펙트럼은 RF-5301PC 스펙트로플루오로포토미터를 이용하여 측정하였다. 염화금속염의 스탁용액(1.00mM)을 물(H₂O):아세토니트릴(CH₃CN) (1:1, v/v)에 용해시켜 준비하였다. 이미노쿠마린의 스탁용액(0.030mM) 또한 물(H₂O):아세토니트릴(CH₃CN) (1:1, v/v)에 용해시켜 준비하였다. 모든 여기 슬릿의 폭은 1.5nm 및 방출 슬릿의 폭은 3.0nm로 하였으며, 460nm 파장으로 여기시켰다.

도 2는 다양한 금속 양이온의 존재하에서 이미노쿠마린의 형광 변화를 나타내는 그래프이다. 도 2에 나타난 이미노쿠마린의 형광 방출 스펙트럼은 pH가 7.4인 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액에 용해된 3.0μM 이미노쿠마린에, 아세토니트릴(CH₃CN)/물(H₂O) (1:1, v/v)에 용해된 Cu²⁺ 이온 및 여러 가지 다른 양이온(X는 알칼리와 알칼리토금속 이온 및 Zn²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺) 각각 20μM을 460 nm에서 여기시킨 후 형광방출을 측정하였다. Cu²⁺ 이온은 주로 형광 방출을 감소시키는 소광 금속 양이온으로 알려져 있지만, 이미노쿠마린의 경우, Cu²⁺ 이온에 의해 형광방출이 유발됨으로써 다른 금속 이온들 중 Cu²⁺ 이온에 대하여 우수한 선택성을 보여준다. C=N 과 C=O와 같은 킬레이트 형성 그룹은 알칼리 금속 및 알칼리토 금속에 대하여는 결합 친화도가 낮은 반면에, 전이후 금속뿐만 아니라 전이 금속에 대해서는 높은 친화도를 보이는데, 이는 Cu²⁺ 이온에 대한 높은 선택성 원인의 가능성이 되는, 금속들간의 전자 구조상의 차이에서 기인한다.

도 2를 참조하면, 이미노쿠마린 용액에 Cu²⁺ 이온이 가해졌을 때, 형광 방출의 증가가 약 8배 정도로 관측되었음을 알 수 있는 반면에, 다른 여러 금속 이온들 (Zn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Fe³⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Cd²⁺, Pb²⁺, 알칼리 금속 양이온 및 알칼리토 금속 양이온)이 가해진 경우에는 형광 방출 증가가 거의 이루어지지 않았음을 확인할 수 있다. 이는 FEGIB 방법에 기초한 의도한 결과였다.

실험예 2 : 이미노쿠마린의 형광 적정 스펙트럼 관찰

도 3은 이미노쿠마린과 구리 이온(Cu²⁺)의 결합 특성을 관측하기 위해서, 아세토니트릴(CH₃CN)/물(H₂O) (1:1, v/v)에 용해된 구리 이온(Cu²⁺)을 점진적으로 가해 얻은 이미노쿠마린의 형광 적정 스펙트럼을 나타내는 그래프이다. 도 3에 나타난 이미노쿠마린의 형광 적정 스펙트럼은 pH가 7.4인 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액에 용해된 3.0μM 이미노쿠마린 용액에 아세토니트릴(CH₃CN)/물(H₂O) (1:1, v/v)에 용해된 CuCl₂를 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 μM의 순으로 점진적으로 가하고, 460 nm에서 여기시킨 후 형광방출을 측정하였다.

도 3을 참조하면, 이미노쿠마린은 515nm에서 최대 방출 파장을 가지는 약한 형광성을 나타낸다. 이때 도면으로 나타내지 않았지만, 형광 적정 스펙트럼의 Job 플롯 분석은 Cu²⁺ 의 0.5 몰분율에서 최대치를 보여주었는데, 이는 이미노쿠마린과 Cu²⁺ 사이에 1:1 착물을 형성하는 것을 암시하는 결과이다. 또한, 도면으로 나타내지 않았지만, MALDIF-TOF 질량분석 스펙트럼도 이미노쿠마린과 Cu²⁺ 사이에 강력한 1:1 착물을 형성함을 나타내는 증거인 m/z 482.167 피크를 보여 주었다. 그리고 1:1 화학양론과 형광 적정 데이터에 기초하여 Cu²⁺ 이온과 이미노쿠마린의 결합상수를 계산한 결과, 2.39 x 10⁴ M^-1의 값을 얻었다.

실험예 3 : DFT 연산 실행을 통한 메카니즘 예측

이미노쿠마린은 Cu²⁺ 의 존재하에서 상당한 형광 증가를 나타낸다. 수용액에서 이미노쿠마린의 약한 방출은 C=N 다이나믹 이성질체화를 통한 비방사성(non-radiative)의 감쇄가 원인으로 보이는데, 반면에 Cu²⁺ 의 존재하에서 515nm에서 강한 방출은 C=N 다이나믹 이성질체화가 저해됨으로써 발생하는 것으로 보인다. 도 4는 Cu²⁺ 와 이미노쿠마린의 착물형성 및 형광 감지 메카니즘을 나타내는 그림이다.

이미노쿠마린과 Cu²⁺ 이온들이 결합하는 메카니즘을 관측하고, FEGIB 메카니즘을 충분히 이해하기 위해서, 한 세트의 Gaussian 03 프로그램을 사용한 6-31G^＊ 베이시스 세트로 실행된 DFT(density functional theory) 연산을 수행하였다.

먼저 이미노쿠마린의 도 4에 나타난 구조식 및 크리스탈 구조인 두 개의 구조들의 기체 및 용액상에서의 안정도를 각각 비교하였다. 용액상에서 PCM(polarizable continuum model)이 가장 널리 사용되며, 다양한 예들에서 성공적인 설명을 제공하므로 PCM 연산을 채택하였다. 다만, 아세토나이트릴과 물을 1:1로 혼합한 용매가 본 발명에 사용되었지만, PCM 연산에서 혼합 용매는 사용할 수 없어, 물을 용매로 한 PCM 연산을 적용하였다. 또한 이는 이미노쿠마린이 수소결합이 가능하기 때문에 물이 아세토나이트릴보다 용매화에 보다 우세한 역할을 할 것으로 예상되기 때문이었기도 하다.

기체상에서의 연산 결과는 크리스탈 이미노쿠마린 구조가 예상된 이미노쿠마린 구조보다 4.351 kcal/mol 정도로 더 안정한 것으로 나타났으나, 물에서의 PCM 연산 결과는 예상된 이미노쿠마린 구조가 크리스탈 이미노쿠마린 구조보다 0.278 kcal/mol 정도 더 안정한 것으로 나타났다. 이는 주로 제안된 구조가 용매화에 의해 크리스탈 구조보다 훨씬 더 안정화되기 때문인데 안정한 형태가 용매화 에너지, 팩킹 효과, 다른 여러 요인들을 고려할 때, 기체, 액체, 고체 상태에 의존한다는 것을 고려하면 당연한 결과이다. 또한 제안된 이미노쿠마린 구조가 크리스탈 이미노쿠마린 구조보다 Cu²⁺ 와 더욱 단단히 결합하는데, 이는 제안된 이미노쿠마린 구 조가 보다 유기적이기 때문이다.

이미노쿠마린과 이미노쿠마린-Cu²⁺ 착물 사이에 중요한 구조적 차이점은 C=N-N-C의 2면각(dihedral angle)으로 표시되는 쿠마린과 크리아졸 링들 사이의 2면각이다. 이미노쿠마린의 C=N-N-C의 2면각은 44.2°이고, 이미노쿠마린-Cu²⁺의 C=N-N-C의 2면각은 22.0°인데, 이는 이미노쿠마린이 Cu²⁺ 와 착물을 형성할 때 트리아졸-티올 부분의 회전에 의해 더 평면화됨을 의미한다. 형광의 약화나 강화는 FMT(frontier molecular orbital)에 기초하여 종종 이론적으로 설명된다. 도 5는 이미노쿠마린(IC), 이미노쿠마린-Cu²⁺ (IC-Cu²⁺)및 이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺ (IC@IC-Cu²⁺) 경계분자궤도함수를 나타내는 그림이다. 여기에서 이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺(IC@IC-Cu²⁺)은 최적화된 이미노쿠마린-Cu²⁺(IC-Cu²⁺)의 기하학적 배열에서 Cu²⁺가 제거된 쿠마린에 기초한 센서를 의미하고 HOMO-1은 second highest occupied molecular orbitals를 의미한다.

도 5를 참조하면, 이미노쿠마린에서의 HOMO(the highest occupied molecular orbitals )와 LUMO(the lowest unoccupied molecular orbitals)는 전자들이 거의 트리아졸-티올과 쿠마린 부위에 제각각 거의 배타적으로 분포되어 있다. 반대로 이미노쿠마린-Cu²⁺에 있어서는 HOMO와 LUMO는 오직 쿠마린 부위에 전자들이 주로 분포되어 있음을 알 수 있다. 이 시스템에서 쿠마린 부분은 주 형광발산체이므로 여기되었을 때, 이미노쿠마린은 형광방출 상태로 뛰어들지 않는 반면에, 이미노쿠마린-Cu²⁺는 형광방출 상태로 뛰어들 것으로 보인다. 이는 형광방출감소가 비방사성(non-radiative)의 감쇄를 유발하는 동적인 이성질화 과정에 기인하기 때문에 동적인 개념이다.

이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺의 HOMO 및 LUMO가 이미노쿠마린-Cu²⁺의 HOMO 및 LUMO와 매우 유사한데, 이는 형광방출 모습이 Cu²⁺ 의 전자적인 효과보다는 이미노쿠마린의 구조적인 변화에 의해 이해될 수 있음을 암시한다. 또한 형광발산체와 이웃한 부위 사이의 상반각(dihedral angle)에서의 그러한 변화가 형광방출에 있어 중요한 변화를 일으키도록 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있게 한다. 더 나아가 이성질화 과정이 연산된 결과에 포함되지 않음을 고려할 때, 형광 감소/증가는 단지 동적인 이성질화 과정뿐만 아니라 정적인 형태의 변화에 의해 조절될 수 있음을 알 수 있다.

이미노쿠마린 및 이미노쿠마린-Cu²⁺ 의 HOMO 에서 LUMO로의 전이 기여도를 확인하기 위하여, TDDFT(Time-dependant DFT)연산이 실행되었다. TDDFT(Time-dependent density functional theory)는 닫힌 쉘 시스템(closed shell systems)의 여기 에너지 연구에는 성공적으로 사용되어 온 반면에, 열린 쉘 시스템(often shell systems), 특히 전이 금속 화합물들의 열린 쉘 시스템에서는 여전히 제한적으로 적용되어 왔다. 이미 앞서 상술한 바와 같이 Cu²⁺ 의 전자적 효과는 착물에서 구조적 변화와 비교하여 적게 영향을 미치는 것으로 예상된다. 따라서 TDDFT 연산을 위해 이미노쿠마린-Cu²⁺은 이중 스핀 다중도를 갖기 때문에 이미노쿠마린-Cu²⁺ 대신에 이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺의 기하학을 사용하였다.

이미노쿠마린에서는 HOMO-1에서 LUMO로의 전이에 일치하는 전자적 오실레이터의 기여도는 96.44%이고, HOMO 에서 LUMO로의 전이의 경우에는 3.56%로 계산되었다. 이와 달리, 이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺의 경우, HOMO에서 LUMO로의 전이에 일치하는 전자적 오실레이터의 기여도는 100%로 나타났다. 상기 경계분자궤도 모습과 여기 특성에 따라, Cu²⁺과 착물을 이룬 이미노쿠마린의 형광 방출 증가는 FEGIB 메카니즘에 의해 명확하게 이해될 수 있었으며, 이는 구리 이온을 검출하는 새로운 형광방출 유발 센서를 디자인하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

실험예 4 : 세포 형광 이미지 측정

이론적으로 계산된 형광방출 유발 센서를 가지고, 생물학적 시스템에 적용을 시도하였다. 최근의 생체 시스템으로 유입된 종을 선택적으로 추적하는 바이오센서 분자들과 마찬가지로 이미노쿠마린을 이용하여 생물학적 시험이 수행되었다. 첫째로 이미노쿠마린의 세포 투과성을 확인하기 위하여, 원숭이의 신장 세포(LLC-MK2)가 이미노쿠마린(20.0μM)과 함께 배양되었다.

공초점 현미경 이미지를 사용하여 관측한 결과, Cu²⁺ 이온 (80.0μM)을 배양 액에 가하였을 때, 37℃에서 5분간 배양 후에 의미 있는 형광방출의 증가가 관측되었다. 도 6은 D-MEM 용액에 있는 LLC-MK2세포에서의 Cu²⁺ 이온에 의한 공초점 형광 이미지를 나타내는 그림이다. 사용된 공초점 현미경은 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경이고, 형광을 위해 458nm에서 여기시켰다.

도 6의 (a)는 이미노쿠마린을 20μM가한 LLC-MK2 세포의 형광 이미지이고, (b)는 이어서 Cu²⁺ 이온을 80μM 가한 후의 이미지이고, (c)는 Cu²⁺ 이온을 50μM 가한 후의 LLC-MK2 세포의 명시야 투과 이미지이며, (d)는 (b)와 (c)의 이미지를 오버레이(overlay)시킨 것이다. 도 6의 (a)를 참조하면, 이미노쿠마린은 Cu²⁺ 이온이 존재하지 않으면 형광을 방출하지 않는다는 것을 알 수 있으며, (b)를 참조하면, Cu²⁺ 이온을 가할 경우(4당량)에 강한 공초점 이미지를 보인다는 것을 알 수 있었다. 이러한 형광 증가는 상기 도 3에서 보여준 용액에서의 실험 결과와도 일치하는 것이다. 따라서 생체 밖에서 Cu²⁺ 이온을 추적하는 데 있어 이미노쿠마린이 잠재적인 적용 가능성이 크다는 사실에 주목할 필요가 있다.

실험예 5 : 쥐의 기관 형광 이미지 측정

세포주 연구에 덧붙여, Cu²⁺ 이온과 결합한 이미노쿠마린의 상반되는 증가 효과가 ICR(Institute for Cancer Research)의 쥐를 이용하여 생체내에서 확인되었 다. 구리이온을 구강으로 주입한 지 3일이 지난 쥐를 대상으로 부검을 실시하였다. 폐, 심장, 간, 근육, 신장 및 비장이 추출되었고, 상기 각 기관들은 0.5% 이미노쿠마린으로 20분간 처리되었으며, 잔류하는 이미노쿠마린을 제거하기 위하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척되었다.

도 7은 구리 이온 투여 전후의 폐, 심장, 간, 근육, 신장 및 비장의 형광 이미지이다. 상기 기관들에 대해 사용된 이미노쿠마린은 20.0μM 이었다. 도 7을 참조하면, 구리 이온이 오직 간과 신장에만 축적되는 것을 알 수 있는데, 이는 구리 이온이 이러한 기관들에 선택적으로 축적된다는 것을 보고한 이전의 연구 결과와 일치되는 것이다. 또한, 이러한 이미지의 결과는 FEGIB에 의해 촉진된 이미노쿠마린이 생체 밖에서 구리 이온에 대해 강한 흡착력을 가지고 있는 것으로 관찰된 것과 일치하는 결과이다.

실험예 4 : 쥐의 오줌 형광 측정

쥐의 오줌은 기본적인 대사 과정과 깊히 관련된 것으로 알려져 있다. 구리로 중독시킨 쥐와 중독시키지 않은 쥐로부터 오줌을 수집한 후 오줌에 있는 구리 이온을 검출하기 위하여 이미노쿠마린을 사용하였다. 구리 이온으로 중독된 쥐로부터 수집된 오줌을 450nm로 여기시킨 후에 460 내지 700nm의 파장에서 방출되는 형광을 측정하였더니, 531nm에서 강한 형광이 검출되었다. 그러나 구리 이온으로 중독되지 않은 쥐의 오줌이나 구리 이온으로 중독시키더라도 이미노쿠마린이 가해지지 않은 쥐의 오줌의 경우에는 형광이 약했다. 이러한 결과들은 생물학적 시료에서 이미노 쿠마린이 구리 이온을 위한 신호전달 시스템으로서 사용될 수 있음을 제안하는 것이며, 인간의 소변에 있어서도 구리 이온을 검출하는 가능한 수단임을 나타내는 것이기도 하다.

도 1은 이미노쿠마린과 Cu²⁺ 이온이 결합하여 형광 방출이 증가되는 메카니즘을 도시한 도면이다.

도 2는 여러 금속 양이온의 존재하에서 이미노쿠마린의 형광 변화를 나타내는 그래프이며, X는 알칼리와 알칼리토금속 이온 및 Zn²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺이다.

도 3은 이미노쿠마린과 구리 이온(Cu²⁺)과의 결합 특성을 관측하기 위해서, 아세토니트릴(CH₃CN)/물(H₂O) (1:1, v/v)에 용해된 구리 이온(Cu²⁺)을 점진적으로 가해 얻은 이미노쿠마린의 형광 적정 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.

도 4는 구리 이온(Cu²⁺)과 이미노쿠마린의 착물 형성 및 형광 방출 메카니즘을 나타내는 화학구조도이다.

도 5는 이미노쿠마린, 이미노쿠마린-Cu²⁺ 및 이미노쿠마린@이미노쿠마린-Cu²⁺ 경계분자궤도함수를 나타내는 도면이다.

도 6은 D-MEM 용액에 있는 LLC-MK2세포에서의 구리 이온(Cu²⁺)에 의한 공초점 형광 이미지 사진이다.

도 7은 구리 이온 투여 전후의 폐, 심장, 간, 근육, 신장 및 비장의 형광 이 미지이다.

Claims (15)

1. 구리 이온 선택성을 갖는 하기 화학식 (1)로 표시되는 쿠마린 유도체.

   

   (1)
2. 7-디에틸아미노 쿠마린-3-알데히드와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올을 반응시켜 제 1항에 따른 쿠마린 유도체를 제조하는 방법.
3. 제 1항의 쿠마린 유도체를 이용하여 시료 중에서 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 구리 이온의 검출은 상기 쿠마린 유도체와 구리 이온의 착물 형성에 따른 형광 변화 측정에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 형광 변화는 상기 쿠마린 유도체와 구리 이온의 착물 형성에 따른 형광 방출 증가인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 쿠마린 유도체와 구리 이온은 1:1로 착물을 형성하는 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
7. 제 4항에 있어서, 금속이온을 포함하는 수용액에 상기 쿠마린 유도체 용액을 첨가하여 빛을 조사함으로써 여기(excited)시키는 단계와; 상기 용액에서 방출된 형광을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 빛은 파장이 450nm 내지 470nm인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 쿠마린 유도체 용액은 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼 용액인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 버퍼용액은 pH가 7.2 내지 7.4인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
11. 제 3항에 있어서, 상기 시료는 수용액인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 수용액은 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 혼합 용액인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 물(H₂O)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 부피의 비는 4:6 또는 6:4인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
14. 제 3항에 있어서, 상기 시료는 동물의 폐, 심장, 간, 근육, 신장, 및 비장 및 소변 중에서 선택되는 생체시료인 것을 특징으로 하는 구리 이온을 선택적으로 검출하는 방법.
15. 제 1항에 따른 쿠마린 유도체를 이용하여 구리 이온을 선택적으로 검출하는 화학센서.

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