KR101035799B1

KR101035799B1 - 씨형 간염 바이러스의 표면 단백질 e2에 부착하는 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드

Info

Publication number: KR101035799B1
Application number: KR1020090038990A
Authority: KR
Inventors: 명희준; 홍혜원
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2009-05-04
Filing date: 2009-05-04
Publication date: 2011-05-20
Also published as: KR20100120009A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 표면 E2 단백질에 부착하는 펩티드(peptide)에 관한 것으로, 실험을 통하여 선별 되어진, E2에 부착하는 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드의 아미노산 서열이다.

C형 간염 바이러스(HCV), 표면 단백질 E2, 펩티드

Description

씨형 간염 바이러스의 표면 단백질 이2에 부착하는 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드{The 7mer peptide binding to E2 protein of HCV}

본 발명은 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 표면 E2 단백질에 부착하는 펩티드(peptide)에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 표면 단백질 E2에 특이적으로 부착하는 펩티드의 서열에 관한 것이다.

Hepatitis C virus (HCV)는 C형 간염을 유발하는 virus로서, 전세계적으로 1억 7천만 명 이상의 인구가 감염되었다고 보고 되어있다. 일반적으로 host의 immune system을 피해가며 감염된 개인의 70%이상을 지속적인 감염상태로 유지시킨다. 주로 수혈에 의해 전염되며 감염된 후 만성으로 진행될 경우 간경화나 간암으로까지 발병하는 것으로 보고되고 있다.

HCV는 flaviviridae family 내에서 Hepaticivirus genus에 속하는 envelope protein을 가진 직경 약 50㎚의 구형 virus이다. viral genome은 9.6kb로 이루어진 positive sense single-stranded RNA로 하나의 커다란 open reading frame (ORF)을 포함하여 약 3,010 amino acids로 구성된 polyprotein을 가지는데 이는 최소한 10개의 protein으로 나뉜다. 이 polyprotein의 translation은 positive strand를 template로 하여 host의 ribosome을 통해 이루어진다. 이때 ribosome은 HCV의 genome의 5‘UTR에 존재하는 IRES(internal ribosomal entry site)에 binding하여 translation한다. polyprotein이 expression 된 후, host와 virus 자신이 encode하는 protease에 의해 processing이 되어 각각의 기능을 수행한다. HCV의 protein은 크게 structural protein과 nonstructural protein으로 구성되어 있으며 genome의 5‘ end와 3’ end에는 고유의 noncoding region이 존재하여 HCV의 replication과 translation에 중요한 역할을 한다.

Structural protein중 HCV envelope 을 구성하는 E1, E2 두 protein이 존재하는데 이중 E2에는 hypervariable region이 있으며 virus의 receptor로 작용을 하는 CD81의 binding site가 있다. E2가 숙주세포의 receptor인 CD81에 binding함으로써 세포 내로 virus particle이 들어가게 된다. 이러한 virus infection을 위해서는 CD81 외에도 scavenger receptor B member I, tight junction protein Claudin 1, 그리고 low-density lipoprotein receptor등이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

위에서 밝힌 바에서 분명해졌듯이, 본 발명의 목적은 C형 간염 바이러스에 의한 질환을 치료할 수 있거나, 바이러스 검출에 이용될 수 있는 펩티드의 서열을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus)의 표면 E2 단백질에 부착하는 아미노산의 서열이 서열목록 7-1(TSQNIRS)와 같이 구성된 펩티드인 것을 특징으로 한다.

아래에서 살피는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 HCV E2 surface protein에 특이적으로 부착하는 서열목록 7-1의 펩티드를 확보하였다.

본 발명은, phage display peptide library를 스크린하여 HCV E2 surface protein에 특이적으로 부착하는 peptide의 서열을 확보하였다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예와 함께 설명한다.

<실시예 1> HCV E2 surface protein 에 특이적으로 부착하는 peptide 의 선별

- Plasmid construct

E. coli에서 발현하는E2 protein을 얻기 위해 E2의 C-terminal transmembrane domain이 제거된 construct를 제작하였다. 이때 E2-F 5’-AAT TAG GAT CCG GCA CCA CCA CCG TT-3’, E2-R 5’-GAC TAC AAG CTT GAT GTT CTG GTG AAG-3’을 primer로 사용하여, JFH1으로부터 PCR을 수행하였다. 이것을 N-terminal 6X His-tag를 가진 pQE30 vector(Qiagen)에 BamHI/HindIII site로 cloning하였다.

- E2 Protein purification

6x His이 tagging된 E2 protein을 얻기 위해 pQE-E2를 1L의 LB broth(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl)에 키운 후에 1mM IPTG로 25 ℃에서 6h동안 induction하였다. Cell을 harvest한 후, lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole)로 resuspension하고 1mM PMSF, 10mM DTT, 1mg/ml lysozyme을 넣어 ice에 1시간 동안 두었다. French press cell pressure로 cell을 lysis하고, 13000rpm에서 1시간 동안 원심분리로 pellet은 제거하여 crude extract를 얻었다. 이를 Ni-NTA agarose resin (Qiagen)이 packing된 resin에 흘려주었다. Resin에 결합한 protein을 wash buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 30mM imidazole)로 washing하고, elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 300mM imidazole)로 elution 하였다. SDS-PAGE로 정제된 protein을 확인하고, Bradford assay로 농도를 측정하였다.

- Biopanning

96well plate에 2ug의 E2 protein을 0.1M NaHCO3(pH 8.6) buffer와 섞어 4℃에서 overnight coating하였다. 이후 TBST(TBS buffer + 0.05% Tween 20)로 3번 washing하고 blocking buffer(5mg/ml BSA in TBST)를 채워 1시간 동안 두었다. TBST로 3번 washing하고 (NewEnglandBioLabs)3ul(5.5x10¹⁰pfu)를 TBS(10mM Tris-HCl, pH8.0, 150mM NaCl)와 섞어 BSA가 coating되어 있는 well에 넣었다. 1시간 후에 BSA에 binding하지 않은 phage library를 얻어 E2가 coating되어 있는 well에 넣어 상온에서 2시간 동안 binding시켰다. TBST buffer로 30번 washing하고 phage elution buffer(0.2M Glycine, pH2.2)를 넣었다. 이것을 1M의 Tris-Cl, pH9.0과 섞어 중성화 시켰다. 이렇게 얻은phage를 증폭하기 위해 LB broth에 overnight culture한 ER2738과 elution한 phage를 넣어주고 37℃에서 4시간 30분 동안 shaking incubation하였다. 증폭이 끝나면 5분간 원심분리 하여 상층액을 얻고, 여기에 total volume의 1/5 로 PEG/NaCl을 넣어 4℃에서 1시간 동안 두었다. 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet은 TBS buffer로 풀어준 후 다시 PEG/NaCl을 넣고 4℃에서 1시간 동안 두었다. 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellet은 TBS buffer로 녹여 4℃에 보관하였다. 이 과정을 3번 반복 수행하였다.

- Phage DNA isolation

3번의 panning으로 얻은 plaque을 pipette으로 picking하여 LB broth에 ER2738과 함께 넣고 37℃에서 4시간 30분 동안 shaking하였다. 5분간 원심분리하여 상층액을 얻어 200ul의 PEB/NaCl을 넣고 섞어준 후, 상온에서 10분간 incubation하였다. 4℃에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 100ul iodide buffer로 pellet을 풀어주었다. 여기에 100% ethanol 250ul를 넣어 상온에서 10분간 incubation시킨 후, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 70% ethanol로 washing 한 후, 30ul D.W.로 pellet을 풀어주었다. 96gIII sequencing primer(5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’)를 사용하여 phage DNA를 sequencing하였다(Solgent, Korea).

표 1은 phage display peptide library를 HCV E2 protein를 표적으로 biopanning 한 후에 얻어진 peptide들의 서열을 나타낸 것이다.

<표 1> HCV E2에 특이적으로 binding하는 selected peptides

Peptide name Peptide sequence Number of hits

Pep1 TSQNIRS (서열목록 7-1) 2
Pep2 SQAQTRK (서열목록 7-2) 1
Pep3 SKTQAQK (서열목록 7-3) 1

도 1은 HCV E2 단백질을 정제한 결과이다. 26 KDa의 정제된 단백질이 관찰된다.

도 2에서는 정제된 HCV E2 단백질을 대상으로 phage display peptide library를 이용하여 biopanning을 수행하는 과정을 보이고 있다. 3차 biopannoing 이후에 1.5 X 10⁵으로 바이러스의 타이터가 증가함을 확인할 수 있다.

Claims

아미노산의 서열이 서열목록 7-1(TSQNIRS)와 같이 구성된 펩티드인 것을 특징으로 하는, C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus)의 표면 E2 단백질에 부착하는 펩티드.