CN106667976B

CN106667976B - (e)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(e)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚的应用和药物组合物

Info

Publication number: CN106667976B
Application number: CN201510766662.4A
Authority: CN
Inventors: 朱宝泉; 彭涛; 林军; 胡海峰; 周斌
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2035-11-11
Also published as: CN106667976A

Abstract

本发明提供了(E)‑4‑(3‑羟基‑1‑丙烯基)‑2‑甲氧基苯酚和(E)‑4‑(3‑羟基‑1‑丙烯基)邻苯二酚的应用和药物组合物。如式I所示化合物，或其药学可接受的盐、溶剂化物、光学异构体或多晶型物在制备NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用；其中，R为羟基或甲氧基；并且其为抗丙肝病毒新药的研发提供了先导化合物。

Description

(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羟基- 1-丙烯基)邻苯二酚的应用和药物组合物

技术领域

本发明涉及化合物(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚的应用和药物组合物。

背景技术

丙肝也称为丙型肝炎，由丙型肝炎病毒(HCV)感染导致，呈全球性流行趋势，约有1.8亿人感染丙肝病毒，每年约有35万人死于HCV感染相关的疾病，据保守估计中国目前约有4000万人感染丙肝病毒。丙型肝炎可导致慢性肝坏死和肝组织纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。

HCV属于黄病毒科，其基因组为9.6kb单股正链RNA，编码一条含3000个氨基酸残基的多聚蛋白，分别为核心蛋白C、囊膜糖蛋白E1、E2、膜整合蛋白p7以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。

HCV NS3丝氨酸蛋白酶属于胰蛋白酶超家族，编码631个氨基酸，从N端到C端分别为丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酸酶和RNA解旋酶。它是HCV非结构蛋白加工和成熟过程的关键酶。NS4A作为辅助因子，与NS3丝氨酸蛋白酶形成非共价二聚体(NS3/4A)发挥作用。HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶是丙肝病毒复制的关键酶，对病毒完成其生命周期具有不可替代的作用，它承担了裂解产生NS4A/B，NS5A/B的功能，并能拮抗宿主体内免疫信号分子介导的细胞内抗病毒反应，从而抑制干扰素的产生。而目前已上市的NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制药物(如奥司他韦、特拉匹韦、波西普韦)一方面具有副作用，如特拉匹韦具有疲劳、贫血、恶心、头痛、味觉障碍等副作用，波西普韦具有皮疹、贫血、恶心、痔疮等副作用；另一方面易出现耐药性，出现耐药后该药疗效显著下降。因此开发毒副作用小、价格低廉的新型HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制药物十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于目前开发毒副作用小、价格低廉的新型HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制药物十分必要，因而提供了一类靶向HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的新型抑制剂——(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚，并为抗丙肝病毒新药的研发提供了先导化合物。

本发明采用下述技术方案来解决上述技术问题：

本发明提供一种如式I所示化合物，或其药学可接受的盐、溶剂化物、光学异构体或多晶型物在制备NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用；其中，R为羟基或甲氧基；

其中，当R为甲氧基时，如式I所示化合物为(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚，即为如式II所示的化合物。

其中，当R为羟基时，如式I所示化合物为(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚，即为如式III所示的化合物。

其中，如式I所示化合物还可以作为先导化合物，在制备NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂中应用。

本发明还提供如式I所示化合物，或其药学可接受的盐、溶剂化物、光学异构体或多晶型物在制备抗丙肝病毒药物中的应用；其中，R为羟基或甲氧基。

本发明中，所述的抗丙肝病毒药物为以NS3/4A丝氨酸蛋白酶为靶标的抗丙肝病毒药物。

其中，如式I所示化合物还可以作为先导化合物，在制备抗丙肝病毒药物中应用。

本发明还提供一种药物组合物，包括如式I所示化合物和药学可接受的载体；其中，R为羟基或甲氧基。

本发明中，所述的药学可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，较佳的包括：稀释剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、填充剂和崩裂剂中的一种或多种。

本发明中，根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、乳液、悬浮液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液和悬浮液)等。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)和(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚(化合物III)首次被发现具有HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制活性，且活力较强，对于新型HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂类抗丙肝药物的设计和研发具有一定指导意义，甚至可作为先导化合物进行研究。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所述的底物P06221是一条多肽(Ac-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Alg-Ala-Ser-Lys)，并用荧光剂EDANS和猝灭剂DABCUL标记(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)

1)化合物获得

分离自香榧树枝叶的4种化合物：香榧酯、异海松酸、(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)、(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物IV)。

经过筛选发现，(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚具有显著的HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制活性；而(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚、香榧酯、异海松酸均不具有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制活性。

我们以(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚作为母体，对其进行结构改造，得到(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚(化合物III)，同样通过HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂筛选模型的测定，其抑制活性为128μM。

具体技术细节如下：

1)从香榧树枝叶的乙醇浸提物中分离得到了四种化合物香榧酯、异海松酸、(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚。

香榧枝叶(10kg)用80％乙醇浸泡10天，期间不时搅拌，过滤枝叶后即得乙醇浸提液。乙醇浸液经减压旋转干燥后获得乙醇浸提物(1000g)，之后用4L水溶解，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯进行萃取，每种溶剂各萃取5次，并将萃取液减压旋转蒸发干燥得到石油醚(200g)、乙酸乙酯(250g)萃取物。用甲醇溶解石油醚、乙酸乙酯萃取物备用。

香榧酯和异海松酸分离：

①以反相硅胶柱层析法对石油醚萃取物进行初步分离纯化，洗脱流动相为水-甲醇混合液，洗脱梯度为水、60％、80％、85％、90％、100％的甲醇水溶液，检测光波长为210nm。收集80％、85％洗脱液并减压蒸发干燥即得分离物1和分离物2。硅胶柱填料为ODS-C18，品牌YMC，柱体积为80g，每次进样10mL，洗脱流速15mL/min。

②采用正相硅胶柱层析对分离物1进行分离纯化，洗脱流动相为石油醚-丙酮混合液，洗脱浓度为100:1(石油醚：丙酮)，收集洗脱液，令其自然挥发，在容器底部会出现结晶，该结晶即为香榧酯。硅胶柱填料为C18，品牌YMC，柱体积为40g，洗脱流速15mL/min。

③采用正相硅胶柱层析对分离物2进行分离纯化，洗脱流动相为石油醚-丙酮混合液，洗脱梯度为：100％、99％、98％、96％、92％、84％的丙酮石油醚溶液，收集98％洗脱液经减压蒸发干燥获得组分2-2。将组分2-2用甲醇溶解，使用反相柱层析进一步分离，流动相为80％甲醇水溶液，收集洗脱液，经减压蒸发干燥即得异海松酸。硅胶柱填料为C18，品牌YMC，柱体积为40g，洗脱流速15mL/min。

(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚分离：

以反相硅胶柱层析法对石油醚萃取物进行初步分离纯化，洗脱流动相为水-甲醇混合液，洗脱梯度为水、20％、40％、60％、80％、100％的甲醇水溶液，检测波光长为210nm和254nm。收集60％洗脱液并减压蒸发干燥即得分离物3，将分离物3溶于甲醇备用。硅胶柱填料为ODS-C18，品牌YMC，柱体积为80g，每次进样10mL，洗脱流速15mL/min。

使用正相硅胶柱层析对分离物3进行分离纯化，流动相为石油醚-乙酸乙酯混合液，洗脱梯度为5％、15％、25％、35％的乙酸乙酯石油醚溶液。分别收集15％和35％洗脱液，经减压蒸发干燥即得(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚。硅胶柱填料为C18，品牌YMC，柱体积为40g，洗脱流速15mL/min。其中，(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚为略带黄色的透明油状液体，具有浓郁的香味，易溶于甲醇、乙醇、氯仿，微溶于水，其核磁共振氢谱数据为：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ6.98(d,J＝1.8Hz,1H),6.83(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),6.73(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(d,J＝15.8Hz,1H),6.18(dt,J＝15.8,5.9Hz,1H),4.18(dd,J＝5.9,1.4Hz,2H),3.84(s,3H).(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚的核磁共振氢谱数据为：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.01(d,J＝1.9Hz,1H),6.85(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.74(d,J＝8.1Hz,1H),6.53(d,J＝15.9Hz,1H),6.13(dt,J＝15.8,6.3Hz,1H),4.06(dd,J＝6.3,1.3Hz,2H),3.86(s,3H),3.36(s,3H)。

2)采用HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂筛选模型测定上述的四种化合物以及(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制活性

化合物(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚市售可得，具体来源为香港先进技术工业有限公司深圳分公司，本领域技术人员也可通过对(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚进行常规的脱甲基化反应制得此化合物。

其中，HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制活性测定具体步骤为：

取2mg待测化合物分别溶于100μL甲醇中制成浓度为20mg/mL的母液。将母液倍比稀释，获得浓度为10、5、2.5、1.25mg/mL的甲醇溶液。取2μL各浓度待测化合物溶液分别与95μL HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶(蛋白酶浓度为：0.1mg/mL，缓冲液浓度为：25mM Hepes，150mMNaCl，10％丙三醇，10mM DTT)、3μL底物P06221(浓度为：5μM)一同加入到96孔板内，检测反应体系的初始荧光值(a)，以缓冲液作为阴性对照，以特拉匹韦作为阳性对照。37℃温育2小时后，以相同条件再次检测反应体系的终点荧光值(b)。终点荧光值减初始荧光值即得反应体系荧光值的变化量，以阴性对照的变化量(c)为基准(抑制率为0)计算(计算公式为：I＝(c-c_n)/c，其中I为抑制率，c＝b-a，c_n为荧光值变化量)各待测化合物对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制活性，以阳性对照(特拉匹韦，分子量为679.8)作为抑制活性参考。根据抑制剂的浓度和抑制率绘制标准曲线，根据标准曲线计算抑制剂的IC₅₀。抑制实验结果如表1所示。

表1：HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制活性表

最终测得化合物(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的IC₅₀为330μM；化合物(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的IC₅₀为128μM；特拉匹韦的IC₅₀为10μM；而香榧酯、异海松酸和化合物(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶均无抑制活性。

以上结果显示：(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物IV)作为(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)的甲氧基化衍生物，其活性明显变弱；而当(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)苯环上的甲氧基以羟基替换，衍生物得到的(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)邻苯二酚(化合物III)则对NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制活性显著提高，达到128μM。我们可以从中得到构效关系的启示：化合物(E)-4-(3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚中苯环和丙烯基上的羟基对于发挥NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制活性具有重要作用。

其中，HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的制备方法参考专利申请文件记载内容(专利申请号：201510098364.2)，具体为：

1、构建重组质粒pET28a-NS3

1)从NCBI网站获得所有报道的丙型肝炎1b亚型的全基因序列共计164条，利用http://www.drive5.com/uclust软件进行聚类分析，选择相似度达到90％以上的、最具有代表性的序列作为研究对象，即序列HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank：EU155330.2)。选取其中的编码NS3/4A的全部序列，该序列的核酸全长为2055bp，编码685个氨基酸。为了增加NS3/4A蛋白酶的体外活性及稳定性，对基因序列进行密码子优化。对优化后的基因采用化学合成的方法进行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全长基因连接到载体pGH(购自上海捷瑞生物工程有限公司)上，获得克隆载体pGH-NS3，测序验证序列完全正确(由上海捷瑞生物工程有限公司测序验证)。

2)设计用于PCR扩增NS3/4A蛋白酶基因的引物，上游引物S3-up的序列为5’-AAACATATGGCGCCTATCACGGCTTACTC-3’，下游引物S4A-down的序列为5’-AAAGGATCCTTATTACTTCTTCTTTCC-3’。

3)以含有密码子优化的NS3/4A蛋白酶序列的克隆载体pGH-NS3为模板，利用引物S3-up和S4A-down在LA(TaKaRa)的催化下进行PCR扩增，获得2.1Kb的NS3/4A蛋白酶序列。扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30个循环，72℃再延伸5min。

4)用BamH I和Nde I分别对PCR扩增获得的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列和大肠杆菌表达载体pET28a(购自上海捷瑞生物工程有限公司)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用T4连接酶(购自TaKaRa)于4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养12h。

5)挑取抗性平板上生长的单菌落接种5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm 37℃下过夜培养，提取质粒，进行BamHI和NdeI双酶切鉴定，得到含有NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列的重组质粒pET28a-NS3。对酶切鉴定正确的重组质粒进行测序验证。

2、构建重组菌株、诱导表达及蛋白纯化。

1)将重组质粒pET28a-NS3转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养12h。挑取抗性平板上生长的单菌落接种于5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm 37℃下过夜培养，提取质粒，进行Bam HI和NdeI双酶切鉴定，即获得重组菌株。保存验证正确的菌株。

2)接50μL步骤1)所述验证正确的单菌落于5mL LB中，200rpm 37℃下震荡过夜，得过夜培养物。接500μL过夜培养物于50mL LB中，200rpm 37℃下震荡培养至OD₆₀₀为0.6时，添加0.5mM IPTG进行诱导，18℃，200rpm下诱导培养22h后收集菌液。

3)将步骤2)获得的收集菌液4℃7000～8000g离心10min，收集沉淀的菌体。将1g菌体加20mL裂解缓冲液(包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25mM、NaCl 300mM、咪唑(Imidazole)10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)，在冰上混合，涡旋震荡混匀。将细胞悬浮起来，加入溶菌酶(0.3mg/mL)，混匀，冰上静置30min。加入10％TritonX-100，使Triton的终浓度为0.05％，所述的百分比为体积百分比，充分混匀，超声破碎细胞，4℃8000g离心30min，取上清。在上清中加入1mL Resin(上海生工)4℃震荡过夜，充分结合，过亲和层析柱空柱，依次用15mL缓冲液(包括Hepes25mM、NaCl 300mM、Imidazole 10mM、EDTA1mM、甘油10％和Triton X-100)、15mL冲洗缓冲液(包括Hepes 25mM、NaCl 300mM、Imidazole 20mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)洗脱，得洗脱液。洗脱液中含有目的蛋白NS3/4A蛋白酶，将目的蛋白进行透析，用1L的透析液(包括Hepes25mM、NaCl 150mM、甘油10％、Triton X-100 0.1％和二硫苏糖醇(DTT)10mM，PH7.5)4℃透析过夜后得纯化的目的蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的目的蛋白的大小及纯度。后在纯化的目的蛋白中加入10mM的DTT，分装，-70℃保存。

Claims

1.一种如式I所示化合物或其药学可接受的盐在制备NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用；其中，R为羟基或甲氧基；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的如式I所示化合物是作为先导化合物。

3.一种如式I所示化合物或其药学可接受的盐在制备抗丙肝病毒药物中的应用；其中，R为羟基或甲氧基；

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗丙肝病毒药物为以NS3/4A丝氨酸蛋白酶为靶标的抗丙肝病毒药物。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的如式I所示化合物是作为先导化合物。