KR101005556B1 - A cosmetic composition comprising an extract of saxifraga caespitosa var. uniflora and a preparation method of the extract - Google Patents
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Abstract
본 발명은 극지 식물의 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라(Saxifraga caespitosa var. uniflora) 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 피부노화방지, 피부개선 및 보호를 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention is a polar plant saxipraga casphytosha bar. Uni Flora (Saxifraga caespitosa var. Uniflora) relates to a cosmetic composition and a method of manufacturing the same comprising the extract, it may be useful in cosmetic compositions for the prevention of skin aging, skin improvement and protection.
화장료, 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라, 항산화, 세포보호, 미백, 주름 Cosmetics, saxpraga, caspitosha bar. Uniflora, Antioxidant, Cell Protection, Whitening, Wrinkles
Description
본 발명은 세포보호, 항산화, 주름개선 및 미백 효과가 우수한 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 제조방법에 관한 것이다.The present invention is a saxipraga casphytosha bar excellent in cell protection, antioxidant, wrinkle improvement and whitening effect. Cosmetic composition comprising a uniflora extract and the saxipraga casphytosha bar. It relates to a method of preparing a uniflora extract.
피부는 외부자극으로부터 몸을 보호해 주는 기능을 가진다. 이러한 외부 자극, 즉 환경적, 물리적, 화학적 자극은 피부기능을 저하시키고 피부의 노화를 촉진한다. 따라서 이러한 피부 현상을 방지하면서 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위한 노력이 계속되고 있다. 최근 피부 개선을 위한 연구 노력은 부작용이 없고 인체 친화적이며 체질과 상관없이 안심하고 사용할 수 있는 식물추출물을 이용한 소재 개발이 활발하게 연구되어 오고 있다.Skin protects the body from external stimuli. These external stimuli, that is, environmental, physical and chemical stimuli, deteriorate skin function and promote skin aging. Therefore, efforts to maintain healthy and beautiful skin while preventing such skin phenomena continue. Recently, research efforts to improve skin have been actively studied for developing materials using plant extracts that have no side effects, are friendly to human beings, and can be used safely regardless of constitution.
일반적으로 식물추출물을 함유하는 기능성 화장품은, 식물이 생장하기에 적합한 조건에서 생육하는 식물들을 갖가지 용매들을 이용하여 추출하여 제조한다. 식물들이 생육할 수 있는 조건은 열대우림기후로부터 냉 한대 기후까지 매우 다양하다. 하지만 일조량, 온도, 수분, 토양의 비옥도 등 기후조건에 따라 생육할 수 있는 고유의 식물상이 나타난다. 식물내부의 유효성분은 기후와 토양 등에 의해 좌우된다. 특히 극한의 기후조건에서 생육하는 식물의 경우 그 식물만의 특이한 생체 메커니즘을 가지고 있어 다른 기후에 사는 같은 종의 식물과도 차별된 성분을 가지고 있는 경우가 많다. In general, functional cosmetics containing plant extracts are prepared by extracting plants growing under conditions suitable for plant growth with various solvents. The conditions under which plants can grow vary widely from tropical rainforest climate to cold climates. However, there are unique flora that can grow according to climatic conditions such as sunshine, temperature, moisture, and fertility of the soil. The active ingredient inside the plant depends on the climate and soil. In particular, plants that grow in extreme climatic conditions often have their own unique biomechanical mechanisms, so they often have different components from plants of the same species living in different climates.
극지식물은 남북 양극지방의 한대에서 생육하는 식물로서 주로 선태류, 지의류가 많다. 또한, 종자식물로는 왜성관목과 키가 작은 여러해살이풀이 주종을 이루며 극히 소수가 알려져 있다. 다년생 초본은 염색체의 배수성의 정도가 높아 주아 등에 의해서 무성생식을 하는 것이 많다. 중위도지대의 고산지역에 분포하는 식물들과 공통된 식물종이 많지만 극지주변에서만 자생하는 고유한 종속(種屬)의 식물들도 많다. 식물의 생활형에서 보면 고위도 지방으로 갈수록 1년생 식물이 줄어들고, 이끼 등과 같은 지표식물의 비율이 증가되는 것이 특징이다. 북반구에 생육하고 있는 왜생관목은 진달래과에 속하는 식물이 많다.Polar plants are plants that grow in the north and south of the polar region, and are mainly abundant in phytopods and lichens. In addition, as a seed plant, dwarf shrubs and short perennials are predominant, with only a few known species. Perennial herb has a high degree of drainage of chromosomes, and adolescents often reproduce asexually. There are many plant species in common with alpine vegetation, but many of the indigenous subspecies grow only in the polar regions. In terms of the life style of plants, annual high-growth plants decrease, and the proportion of indicator plants such as moss increases. The dwarf tree growing in the northern hemisphere has many plants belonging to the rhododendron.
색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라는 식물 분류학상으로 범의귀속 범의귀과에 속하는 극지에서 자생하는 다년생 식물로 3 내지 15cm되며 여러 개의 곧게 뻗은 화경을 가지고 있다. 잎은 5 내지 10mm 정도로 딱딱하고 털이 매우 많다. 잎의 끝은 3개의 열편으로 갈라진다. 줄기의 가장윗부분에서 2 내지 10개의 꽃이 피는데 각각의 꽃은 5개의 하얀 꽃잎으로 구성되어 있으며 종모양과 비슷하며 활짝 피었을 때는 별모양과 비슷하다. 색시프라가의 속은 매우 다양하다. 그 중 색시프 라가 캐스피토샤 바. 유니플로라는 탄수화물을 저장하기 위한 지하근계가 잘 발달되어 있어 툰드라같이 추운 기후에도 빠르게 적응할 수 있다. 군생하는 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라는 툰드라의 바위가 많은 경사진 곳이나 갈라진 틈 사이에서 자란다. 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라는 효능에 대해서 보고된 과학적 실험 결과는 미비하다. 또한 화장료 성분으로 응용하기 위한 연구결과도 보고된 바 없다. Saxpraga Caspitosha Bar. Uniflora is a perennial plant native to the Arcticaceae family of plants belonging to the genus Pantheus genus, 3-15 cm long, with several straight flowers. The leaves are 5-10 mm hard and very hairy. The tip of the leaf is divided into three lobes. At the top of the stem, two to ten flowers bloom, each of which consists of five white petals, which resemble a bell and when in full bloom, resemble a star. Saxipraga's genus is very diverse. Among them, Saxif Laga Caspitosha Bar. Uniflora has a well-established underground root system for storing carbohydrates, allowing it to adapt quickly to cold climates such as tundra. Saskia, a sapphire, is a caspitosha bar. Uniflora grows among the rocky slopes and crevices of the tundra. Saxpraga Caspitosha Bar. The results of scientific experiments reported on the efficacy of UniFlor are inadequate. In addition, there have been no reports on the application of cosmetic ingredients.
이에, 본 발명자들은 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 효능효과 평가를 중심으로 하여, 순수 자연성 화장품으로서의 응용 가능성에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.Thus, the inventors of the saxi saga caspitosha bar. Focusing on the evaluation of the efficacy of the uniflora extract, the present invention was completed by continuing the study on the applicability as a pure natural cosmetic.
본 발명은 세포보호, 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 가지는 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라는(Saxifraga caespitosa var. uniflora) 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is saxipraga casphytosha bar having a cytoprotective, antioxidant, anti-wrinkle and whitening effect. It is an object of the present invention to provide a cosmetic composition comprising the extract ( Saxifraga caespitosa var. Uniflora ) and a method for producing the same.
본 발명은, 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라(Saxifraga caespitosa var. uniflora) 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 제조방법을 제공한다.The present invention, saxpraga caspitosha bar. Cosmetic composition comprising a extract of Saxifraga caespitosa var. Uniflora and the saxifraga caspitosha bar. It provides a method of preparing a uniflora extract.
본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라의 추출물을 0.1 내지 10.0 중량%로 포함할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention is based on the total weight of the composition, the saxipraga caspitosha bar. The extract of Uniflora may be included in an amount of 0.1 to 10.0% by weight.
또한, 본 발명은 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 3 내지 30일 동안 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및 상기 침적용액을 여과하여 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 얻는 단계를 포함하는 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention is a saxipraga caspitosha bar. Immersing the uniflora extract in at least one extraction solvent selected from the group consisting of purified water, C1 to C4 alcohol, and C1 to C5 alkylene glycol for 3 to 30 days to form an immersion solution; And filtering the immersion solution to the saxy praga casphytosha bar. Saxipraga casphytosha bar comprising the step of obtaining a uniflora extract. It provides a method of preparing a uniflora extract.
본 발명의 화장료 조성물은 천연 추출물을 이용하기 때문에 피부 자극으로부터 자유롭고, 세포보호효과와 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 가지므로 피부노 화방지, 피부개선 및 보호에 매우 효과적이다. Since the cosmetic composition of the present invention uses a natural extract, it is free from skin irritation, and has a cytoprotective effect, antioxidant, anti-wrinkle and whitening effect, and thus is very effective in preventing skin aging, skin improvement and protection.
이하, 본 발명은 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 설명한다.Hereinafter, the present invention saxpraga caspitosha bar. It describes a cosmetic composition comprising a uniflora extract.
본 발명의 화장료 조성물은 천연의 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 함유함으로써, 각종 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기 있게 가꾸어주며, 피부기능 개선에 도움을 준다.The cosmetic composition of the present invention is natural saxy praga caspitosha bar. By containing uniflora extract, it protects the skin from various external stimuli to make the skin soft and shiny and helps to improve skin function.
본 발명의 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 0.1 내지 10.0 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 상술한 범위를 만족하면, 유의성 있는 효과가 얻어진다. 또한, 최종 제품에서의 추출물의 고유 냄새, 색상 등을 고려할 때 상기와 같은 범위로 포함되는 것이 유리하다.Cosmetic composition of the present invention, saxipaga caspitosha bar relative to the total weight of the composition. It is preferable to include the uniflora extract in 0.1 to 10.0% by weight. If the above range is satisfied, a significant effect is obtained. In addition, when considering the intrinsic smell, color, etc. of the extract in the final product is advantageously included in the above range.
상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물은 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다The saxpraga caspitosha bar. Uniflora extract is preferably extracted using at least one solvent selected from the group consisting of purified water, C1 to C4 alcohol and C1 to C5 alkylene glycol.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 메이크업베이스, 트윈케익, 마스카라, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저 등이 있으며, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화장품 조성물이 상술한 형태의 제형으로 제조될 때, 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있다. 또한, 이들 성분의 종류와 양은 당 업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. As a product to which the cosmetic composition of the present invention can be added, for example, various skin lotions, skin softeners, skin toners, astringents, lotions, milk lotions, nutrition lotions, massage creams, nutrition creams, hand creams, foundations, makeups Base, twin cake, mascara, essence, nutrition essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser and the like, but is not limited thereto. When the cosmetic composition of the present invention is prepared in a formulation of the form described above, it may contain various bases and additives necessary and appropriate for the formulation of the formulation. In addition, the type and amount of these components can be easily selected by those skilled in the art.
이하, 본 발명의 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 제조방법을 설명한다.Hereinafter, the saxy praga caspitosha bar of the present invention. The manufacturing method of the uniflora extract is demonstrated.
또한, 본 발명은 a)색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라(Saxifraga caespitosa var. uniflora)를 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 3~30일, 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및 b)상기 침적용액을 여과하여 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 얻는 단계를 포함한다. In addition, the present invention is a) saxy praga casphytosha bar. Immersing uniflora ( Saxifraga caespitosa var.uniflora ) in at least one extraction solvent selected from the group consisting of purified water, C1 to C4 alcohol and C1 to C5 alkylene glycol for 3 to 30 days to form an immersion solution ; And b) the sap solution is filtered and the saxy praga caspitosa bar. Obtaining a uniflora extract.
상기 a) 단계에서는, 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라가 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 침적시간은 10 내지 20일인 것이 바람직하다.In step a), the saxima is a caspitosha bar. Preferably, the uniflora is in a dried state. The deposition time is preferably 10 to 20 days.
상기 추출용매는, 상기 건조된 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라의 중량에 대비하여, 10 내지 20배(w/w)로 사용하는 것이 바람직하다.The extraction solvent, the dried saxipraga caspitosha bar. It is preferable to use 10-20 times (w / w) with respect to the weight of uniflora.
한편, 상기 C1 내지 C4의 알코올은 에탄올인 것이 바람직하고, 상기 C1 내지 C4의 알킬렌글리콜은 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 펜틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다. On the other hand, the C1 to C4 alcohol is preferably ethanol, the C1 to C4 alkylene glycol is preferably at least one member selected from the group consisting of 1,3-butylene glycol, propylene glycol and pentylene glycol. .
또한, 상기 추출용매가 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매일 경우, 이들의 혼합비(w/w)가 6:4 내지 9:1인 것이 바람직하다. 상기 알코올과 알킬렌글리 콜의 혼합용매의 경우, 함유량이 상술한 범위일 경우, 원하는 유용성분만을 추출하는데 보다 효율적인 극성을 갖는다. 여기서, 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매에 사용되는 알코올의 농도는 60 내지 100%인 것이 바람직하다.In addition, when the extraction solvent is a mixed solvent of the alcohol and alkylene glycol, it is preferable that their mixing ratio (w / w) is 6: 4 to 9: 1. In the case of the mixed solvent of the alcohol and the alkylene glycol, when the content is in the above-described range, it has a more efficient polarity to extract only the desired useful component. Here, the concentration of the alcohol used in the mixed solvent of the alcohol and alkylene glycol is preferably from 60 to 100%.
또한, 상기 추출용매는 상기 정제수와 상기 알킬렌글리콜의 혼합용매일 수 있는데, 이들의 혼합비가 3:7 내지 1:9인 것이 바람직하다. In addition, the extraction solvent may be a mixed solvent of the purified water and the alkylene glycol, the mixing ratio thereof is preferably 3: 7 to 1: 9.
상기 추출용매가 단독용매일 경우, 바람직하게는 에탄올이고, 혼합용매일 경우, 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜, 에탄올과 프로필렌글리콜 또는 에탄올과 펜틸렌글리콜의 혼합용매이고, 더 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜 또는 에탄올과 펜틸렌글리콜의 혼합용매이다.When the extraction solvent is a single solvent, preferably ethanol, in the case of a mixed solvent, a mixed solvent of alcohol and alkylene glycol, preferably ethanol and 1,3-butylene glycol, ethanol and propylene glycol or ethanol and pen It is a mixed solvent of styrene glycol, More preferably, it is a mixed solvent of ethanol and 1, 3- butylene glycol or ethanol and pentylene glycol.
상기 b) 단계는 상기 추출용매를 제거하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. The step b) preferably further comprises the step of removing the extraction solvent.
본 발명의 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라의 제조방법은, 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 피부자극에 대한 세포독성효과를 조사하는 단계, 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 외부자극에 대한 세포보호효과를 조사하는 단계, 상기 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 콜라겐 생합성에 따른 피부토화방지효과를 조사하는 단계, 타이로시나제 억제에 따른 피부미백개선효과를 조사하는 단계로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단계를 더 포함할 수 있다.Saxipraga Caspitosha bar of the present invention. The manufacturing method of the uniflora, said saxipraga caspitosha bar. Treating uniflora extract to human fibroblasts to investigate the cytotoxic effect on skin irritation, the saxipraga casphytosha bar. Treating the uniflora extract to human fibroblasts to investigate the cytoprotective effect against external stimuli, the saxipraga casphytosha bar. Treating uniflora extracts to human fibroblasts to investigate skin antifouling effect according to collagen biosynthesis, and to investigate the skin whitening improvement effect due to tyrosinase inhibition. It may include.
이하, 본 발명을 제조예, 시험예, 및 실시예 등을 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기에 기재된 제조예, 시험예, 및 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 이들에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Preparation Examples, Test Examples, Examples, and the like. However, the production examples, test examples, examples, and the like described below are for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto and may be variously modified and changed.
제조예1 내지 제조예4, 비교제조예1 내지 4: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 제조Preparation Examples 1 to 4, Comparative Preparation Examples 1 to 4: Saxypraga Caspitosha Bar. Preparation of Uniflora Extract
색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라와 바위취의 전초를 물로 씻어 거즈로 물기를 제거한 후, 건조 및 세절하여 준비하였다. 상기 준비된 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라와 바위취를 표 1에 기재된 함량으로, 표 1에 기재된 함량으로 존재하는 혼합용매에 2주간 침적하여 숙성하였다. 그 후 여과지(일본 ToyoroshiKaisha, Ltd.에서 시판되는 5C, 185㎜)에 여과하고 에탄올을 증발 시켜 여액 상태인 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 수득하였다.Saxpraga Caspitosha Bar. The uniflora and rock odors were washed with water, dried with gauze, dried and chopped to prepare. Saxipraga Caspitosha bar prepared above. Uniflora and rock odors were aged by dipping for 2 weeks in the mixed solvent present in the contents shown in Table 1 and the contents shown in Table 1. After that, the filtrate was filtered through a filter paper (5C, 185 mm commercially available from Toyoroshi Kaisha, Ltd., Japan), and ethanol was evaporated to obtain filtrate saxpraga caspitosha bar. Uniflora extract was obtained.
b-1: 70% 에탄올 b-2: 1,3-부틸렌글리콜b-1: 70% ethanol b-2: 1,3-butylene glycol
b-3: 프로필렌글리콜b-3: propylene glycol
시험예1: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 세포독성 측정Test Example 1: Saxpraga Caspitosha Bar. Cytotoxicity Measurement of Uniflora Extract
제조예1 비교제조예1에 대한 세포독성 시험을 통해, 안전성을 평가하였다.Preparation Example 1 Safety was evaluated through a cytotoxicity test for Comparative Preparation Example 1.
<세포 배양 (Cell culture)>Cell culture
ATCC사로부터 구입한 CCD-1064sk 사람섬유아세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 이스코브스 모디파이드 둘베코스 미듐(Iscove's modified Dulbeco's medium: IMDM)으로 10㎝ 세포 배양접시에 10㎖의 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포가 70 내지 80% 합류(confluency)가 되도록 배양하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, 합류에 도달한 세포는 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 사용하여 트립신처리(trypsinization)를 한 후 계대 배양하여 유지하였다. 상기에서 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트(96-multiwell plate)에 각각 1×104 세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물인 제조예1과 바위취 추출물인 비교제조예1을 각각 처리 농도별로 배지에 희석하여 처리한 후 48시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.CCD-1064sk human fibroblasts purchased from ATCC were used with Iscove's modified Dulbeco's medium with 10% fetal calf serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. ) Were cultured in a 10 cm cell culture dish with 10 ml of medium at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator so that the cells were 70-80% confluent. The medium was changed twice a week, and the cells reached the confluence were maintained by passage culture after trypsinization using trypsin-EDTA. Human fibroblasts cultured above were divided into 96 × multiwell plates at 1 × 10 4 cells / well and incubated for 24 hours. The medium of cultured cells was replaced with 2% FBS medium and Saxipraga Casphytosha bar. Preparation Example 1, a uniflora extract, and Comparative Preparation Example 1, a rock odor extract, were each diluted in a medium for each treatment concentration, and then incubated in a CO 2 incubator for 48 hours.
시험예 1-1: 세포독성효과의 측정(MTT assay)Test Example 1-1: Measurement of Cytotoxic Effect (MTT assay)
배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT 저장(stock) 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포마즌 (MTT-formazan) 결정으로 환원되므로 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포마즌 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포마즌의 흡광도가 최대가 되는 시험필터(Test filter)인 540㎚의 파장에서의 O.D값과 참조필터(Reference filter)인 630㎚ 파장의 O.D값을 측정하여 그 차이값의 흡광도를 구하였다 (참고문헌 The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417외 다수). 세포 독성은 흡광도의 백분율로 나타내었다.To the cultured cells, MTT stock solution (5 mg / ml) dissolved in PBS (phosphate buffered saline) was diluted 10-fold in fresh medium, and 100 µl of each solution was added to each well of the cell at 37 ° C. The reaction was carried out for 4 hours. After the reaction, the living cells were dehydrated by the dehydrogenase present in the mitochondria and the yellow water-soluble substrate MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium-bromide] was insoluble in water. Since it is reduced to (MTT-formazan) crystals, the amount of this can be measured to measure cell viability. Remove the culture supernatant and add 200 μl of DMSO to each well to dissolve the MTT-formenic crystals produced in the cells, and then use the absorption spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA) to filter the maximum absorbance of the formazin. The absorbance of the difference value was obtained by measuring the OD value at a wavelength of 540 nm as a test filter and a 630 nm wavelength as a reference filter (The EMBO Journal (2002) 21, 2407). -2417 and many more). Cytotoxicity is expressed as a percentage of absorbance.
※ 세포생존율(%) = (시료 처리군 흡광도/무처리군 흡광도)×100※ Cell survival rate (%) = (Sample absorbance / untreated group absorbance) × 100
로(Raw) 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였다.The standard deviation was obtained by calculating the average of the absorbance of the untreated group and the absorbance of the sample treated group based on raw data.
(% of 대조군)OD Mean ± SD
(% of control)
(100.0)0.479 ± 0.08
(100.0)
(94.61)0.454 ± 0.012
(94.61)
(100.41)0.481 ± 0.013
(100.41)
(104.00)0.499 ± 0.015
(104.00)
(106.40)0.510 ± 0.015
(106.40)
(105.78)0.507 ± 0.011
(105.78)
(100.0)0.479 ± 0.08
(100.0)
(96.08)0.461 ± 0.015
(96.08)
(98.27)0.471 ± 0.012
(98.27)
(100.98)0.484 ± 0.018
(100.98)
(102.23)0.490 ± 0.011
(102.23)
(102.54)0.492 ± 0.007
(102.54)
시험예 1-2: 세포독성효과의 측정(Neutral Red assay)Test Example 1-2: Measurement of Cytotoxic Effects (Neutral Red assay)
배양이 끝난 세포에 각각의 웰에 뉴트랄 레드(Neutral Red, Sigma-Aldrich, USA) 50㎍/㎖를 첨가하고 3시간 동안 반응 시켰다. 뉴트랄 레드는 완전히 살아있는 세포 또는 손상 받지 않는 세포의 리소좀에 농축된다. 반응 후, 세포를 1.0% 포르말린/1.0% 염화칼륨으로 고정한 다음 1.0% 아세트산/50% 에탄올 용액을 첨가하여 뉴트랄 레드를 추출하였다. 추출된 뉴트랄 레드를 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 540-630㎚의 농도 별 세포독성 값을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다 세포 독성은 흡광도의 백분율로 나타냈으며 3로트(lot)로 3회 실시하였다. Neutral Red (Neutral Red, Sigma-Aldrich, USA) was added to the cultured cells and the cells were reacted for 3 hours. Neutral Red is concentrated in the lysosomes of completely living or intact cells. After the reaction, cells were fixed with 1.0% formalin / 1.0% potassium chloride and then neutral red was extracted by adding 1.0% acetic acid / 50% ethanol solution. The extracted neutral red was measured by absorbance spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA) to measure the cytotoxicity value of each concentration of 540-630 nm. Table 2 shows the cytotoxicity expressed as a percentage of absorbance and 3 lots. (lot) was performed three times.
※ 세포생존율(%) = (시료 처리군 흡광도/무처리군 흡광도)×100※ Cell survival rate (%) = (Sample absorbance / untreated group absorbance) × 100
(% of 대조군)OD Mean ± SD
(% of control)
(100.0)0.303 ± 0.010
(100.0)
(94.52)0.286 ± 0.013
(94.52)
(101.30)0.307 ± 0.018
(101.30)
(104.93)0.318 ± 0.009
(104.93)
(107.08)0.324 ± 0.014
(107.08)
(107.74)0.326 ± 0.020
(107.74)
(100.0)0.303 ± 0.010
(100.0)
(98.49)0.298 ± 0.020
(98.49)
(100.31)0.304 ± 0.014
(100.31)
(101.79)0.308 ± 0.013
(101.79)
(102.79)0.311 ± 0.007
(102.79)
(104.11)0.315 ± 0.013
(104.11)
로(Raw) 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였다.The standard deviation was obtained by calculating the average of the absorbance of the untreated group and the absorbance of the sample treated group based on raw data.
표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제조예1의 MTT50, NR50 값은 1% 이상이며, 비교제조예1 과 비교하여 안전한 원료임을 알 수 있다.As shown in Table 2 and Table 3, MTT 50 , NR 50 value of Preparation Example 1 of the present invention is 1% or more, it can be seen that the raw material is safe compared to Comparative Preparation Example 1.
시험예2: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 세포보호효과 측정Test Example 2: Saxpraga Caspitosha Bar. Measurement of Cytoprotective Effect of Uniflora Extract
제조예1과 비교제조예1 에 대한 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 세포독성에 대한 세포 보호 효과 실험를 실시하였다. Cytoprotective effect experiments were performed on SDS (Sodium dodecyl sulfate) cytotoxicity against Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1.
사람섬유아세포를 10% 우태아혈청 (FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 IMDM으로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트에 각각 1×104 세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 0.002%를 1시간 전처리 후 제조예1과 비교제조예1을 각각 처리 농도 별로 배지에 희석하여 병행 처리한 후 24 hr 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT 저장 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포마즌 결정으로 환원되므로 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포마즌 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포마즌의 흡광도가 최대가 되는 시험필터인 540 ㎚의 파장에서의 O.D값과 참조필터인 630㎚ 파장의 O.D값을 측정하여 그 차이값의 흡광도를 구하였다 (참고문헌 The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417외 다수). 세포 보호 효과는 흡광도의 백분율로 나타내었다.Human fibroblasts were cultured in 37 ° C., 5% CO 2 incubator with IMDM with 10% fetal calf serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin. Cultured human fibroblasts were dispensed at 1 × 10 4 cells / well in 96-multiwell plates and incubated for 24 hours. The medium of cultured cells was replaced with 2% FBS medium, and 0.002% of SDS (Sodium dodecyl sulfate) was pretreated for 1 hour, followed by dilution of Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1 in the medium for each treatment concentration for 24 hr. Incubated in a CO 2 incubator. In cultured cells, MTT stock solution (5 mg / ml) dissolved in PBS (phosphate buffered saline) was diluted 10-fold in fresh medium, and 100 µl of each solution was added to each well of the cell, followed by 4 hours at 37 ° C. Reacted. After the reaction, the living cells were dehydrated by the dehydrogenase present in the mitochondria, and the yellow water-soluble substrate MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium-bromide] was insoluble in water. Since it is reduced to crystals, the amount of this can be measured to determine cell viability. Remove the culture supernatant and add 200 μl of DMSO to each well to dissolve the MTT-formenic crystals produced in the cells, and then use the absorption spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA) to filter the maximum absorbance of the formazin. The OD value at a wavelength of 540 nm and the OD value at a wavelength of 630 nm as a reference filter were measured to determine the absorbance of the difference (Ref. EMBO Journal (2002) 21, 2407-2417 et al.). The cytoprotective effect is expressed as a percentage of absorbance.
※ 세포생존율(%) = (시료 처리군 흡광도/무처리군 흡광도)×100※ Cell survival rate (%) = (Sample absorbance / untreated group absorbance) × 100
로(Raw) 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였다.The standard deviation was obtained by calculating the average of the absorbance of the untreated group and the absorbance of the sample treated group based on raw data.
(% of 대조군control)OD Mean ± SD
(% of control)
(100.0)0.426 ± 0.009
(100.0)
(52.18)0.222 ± 0.015
(52.18)
(53.98)0.230 ± 0.019
(53.98)
(61.33)0.261 ± 0.011
(61.33)
(72.29)0.308 ± 0.021
(72.29)
(75.49)0.322 ± 0.012
(75.49)
(100.0)0.532 ± 0.009
(100.0)
(52.18)0.222 ± 0.013
(52.18)
(53.12)0.226 ± 0.014
(53.12)
(56.76)0.240 ± 0.015
(56.76)
(63.76)0.272 ± 0.014
(63.76)
(66.58)0.284 ± 0.012
(66.58)
표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제조예1의 세포 보호 효과는, 비교제조예1보다 외부자극에 대하여 세포 보호 효과를 촉진 시킴을 알 수 있다.As shown in Table 4, it can be seen that the cell protective effect of Preparation Example 1 of the present invention promotes the cell protective effect against external stimulation than Comparative Preparation Example 1.
시험예 3. 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 항산화 효과 측정Test Example 3 Saxy Praga Caspitosha Bar. Antioxidant Effect of Uniflora Extracts
제조예1과 비교제조예1에 대한 항산화 효과 시험을 실시하였다. Antioxidant effect test was carried out for Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1.
<DPPH (1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl) 라디칼에 의한 항-하이드록실 라디칼 활성(%) 측정><Measurement of anti-hydroxyl radical activity (%) by DPPH (1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl) radicals>
활성 산소에 의한 반응은 거의 대부분 라디칼 반응으로서 자동산화반응 과정이 포함된다. 생체 내에서 자동산화반응을 차단시키는 역할은 항산화제가 담당하고 있다. 전자를 주는 능력으로서 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다. 항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-디페닐-2-피크릴하이드로질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 라디칼이 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517㎚에서 최대 흡수를 나타내며 환원되면 517㎚에서 흡수가 없어진다. DPPH(D9132, SIGMA)를 메탄올과 증류수의 6:4(v/v) 혼합용매에 녹이고, 상기 DPPH 용액을 513㎚에서 흡광도가 0.6 정도 되도록 맞추었다. DPPH 용액 2㎖를 농도에 따라 희석한 시료 1㎖에 각각 첨가하여 혼합하였다. 상온에서 약 1시간 동안 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 사용하여 513㎚에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. Reactions by free radicals are almost always radical reactions, including the process of automatic oxidation. Antioxidants are responsible for blocking the automatic oxidation in vivo. The greater the reducing power as an electron-giving ability, the stronger the antioxidant. A reagent that measures the reducing power of antioxidants is the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical. DPPH exists as a radical of a stabilized structure of the nitrogen center in the compound. The maximum absorption at 517 nm is shown and the reduction is absent at 517 nm. DPPH (D9132, SIGMA) was dissolved in a 6: 4 (v / v) mixed solvent of methanol and distilled water, and the DPPH solution was adjusted to have an absorbance of about 0.6 at 513 nm. 2 ml of DPPH solution was added to 1 ml of the diluted sample and mixed. After standing at room temperature for about 1 hour, absorbance at 513 nm was measured using an absorption spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA) and the results are shown in Table 5 below.
(% of 대조군control)OD Mean ± SD
(% of control)
(0.00)0.862 ± 0.008
(0.00)
(81.32)0.161 ± 0.007
(81.32)
(65.78)0.295 ± 0.015
(65.78)
(39.68)0.520 ± 0.008
(39.68)
(27.96)0.621 ± 0.012
(27.96)
(11.60)0.762 ± 0.007
(11.60)
(0.00)0.862 ± 0.008
(0.00)
(75.52)0.211 ± 0.009
(75.52)
(43.16)0.490 ± 0.011
(43.16)
(17.40)0.712 ± 0.014
(17.40)
(11.72)0.761 ± 0.011
(11.72)
(5.80)0.812 ± 0.011
(5.80)
표 5에 나타난 바와 같이, 제조예1은 우수한 항산화 효과를 나타내었다.As shown in Table 5, Preparation Example 1 showed an excellent antioxidant effect.
시험예 4: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라의 타이로시나제 활성 및 멜라닌 합성 억제 효과 측정Test Example 4: Saxpraga Caspitosha Bar. Measurement of Tyrosinase Activity and Inhibition of Melanin Synthesis by Uniflora
시험예 4-1. 타이로시나제 활성 저해 시험Test Example 4-1. Tyrosinase Activity Inhibition Test
제조예1 및 비교제조예1의 미백활성을 조사하기 위해 타이로시나제 활성 저해 시험을 실시하였다. 실험을 위해, 타이로시나제 효소액은 버섯 타이로시나제 (mushroom tyrosinase, T-3824, 1530U/㎎, Sigma)를 1000 U/㎖이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였으며, 기질액은 L-타이로신(L-tyrosine, 45160-0410,Junsei chemical co. Ltd)을 1.5 mM이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였다.Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1 Tyrosinase activity inhibition test was conducted to investigate the whitening activity. For the experiment, tyrosinase enzyme solution was prepared by dissolving mushroom tyrosinase (mushroom tyrosinase, T-3824, 1530U / mg, Sigma) in phosphate buffer (pH 6.5) to 1000 U / ml, and the substrate solution L-tyrosine (L-tyrosine, 45160-0410, Junsei chemical co. Ltd) was prepared by dissolving in phosphate buffer (pH 6.5) to 1.5 mM.
제조예1 및 비교제조예1을 완충액에 농도 별로 희석하여 검액을 준비하였다. 검액 170㎕, 타이로시나제 효소액 10㎕를 넣고 37℃에서 10분간 방치하였다. 여기에 기질액 20 ㎕를 넣은 다음 37 ℃에서 10분간 반응시킨 후, 바로 얼음 중에 5분간 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 상기에서 측정된 흡광도를 하기 수학식 1에 대입하여 타이로시나제 활성저해율을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 검액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 공시험액으로, 기질액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 보정액으로 하였다.Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1 were prepared by diluting each sample in a buffer at different concentrations. 170 μl of sample solution and 10 μl of tyrosinase enzyme solution were added thereto, and the mixture was left at 37 ° C. for 10 minutes. 20 μl of substrate solution was added thereto, followed by reaction for 10 minutes at 37 ° C., and then left for 5 minutes in ice, and then absorbance was measured at wavelength 490 nm using an absorption spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA). Substituting the absorbance measured in the above Equation 1 to calculate the tyrosinase activity inhibition rate is shown in Table 6 below. A solution prepared by adding phosphate buffer (pH 6.5) instead of the sample solution was used as a blank test solution, and a solution prepared by adding phosphate buffer (pH 6.5) instead of the substrate solution was used as a calibration solution.
<수학식 1>&Quot; (1) "
타이로시나제 활성저해율 (%) = 100 - (A-A')/(B-B') X 100Tyrosinase activity inhibition rate (%) = 100-(A-A ') / (B-B') X 100
A: 검액 반응 후의 흡광도A: absorbance after the liquid reaction
B: 공시험액의 반응 후의 흡광도B: absorbance after reaction of blank test solution
A': 검액의 보정액A ': correction liquid of the test liquid
B': 공시험액의 보정액B ': Correction amount of blank
활성 저해 측정Tyrosinase
Activity inhibition measurement
(% of 대조군)OD Mean ± SD
(% of control)
(0.00)0.225 ± 0.008
(0.00)
(79.09)0.047 ± 0.08
(79.09)
(65.29)0.078 ± 0.011
(65.29)
(43.94)0.126 ± 0.004
(43.94)
(16.35)0.188 ± 0.008
(16.35)
(0.00)0.225 ± 0.008
(0.00)
(60.85)0.088 ± 0.010
(60.85)
(36.82)0.142 ± 0.013
(36.82)
(14.57)0.192 ± 0.007
(14.57)
(8.79)0.205 ± 0.011
(8.79)
시험예 4-2: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 농도에 따른 멜라닌 합성 억제 측정 실험 Test Example 4-2: Saxy Praga Caspitosha Bar. Melanin synthesis inhibition test according to the concentration of uniflora extract
제조예1 및 비교제조예1에 대하여 B-16 멜라노마 세포(Melanoma cell: 연세대학교 원주 의과대학 분양)를 이용하여 미백효과를 측정하였다. 측정방법으로는 블랙 마우스에서 유래된 B-16 멜라노마 세포를 10% FBS(GIBCO., USA)가 함유된 DMEM으로 6 웰 조직 배양 접시에 2 x 104 세포/웰 농도로 2㎖씩 첨가하고 5% CO2, 37℃조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 2uM α-MSH(Sigma., USA, Melanocyte stimulating Hormone)과 2mM 테오필린(Sigma., USA, theophylline)이 함유된 DMEM으로 교체한 후, 조직배양한 산삼 부정근 추출물을 동일배지로 적당량 희석한 후 각각 첨가하고 나서, 5% CO2, 37℃ 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS(Sigma., USA, Phosphate buffered Saline)로 세척하고 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 5000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 세포를 60℃ 항온기에서 24시간 건조시킨 후 1N NaOH를 첨가하여 세포내의 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌을 흡수분광광도계(Uvmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. For Preparation Example 1 and Comparative Preparation Example 1, the whitening effect was measured using B-16 melanoma cells (prepared Yonsei University Wonju Medical College). As a measuring method, B-16 melanoma cells derived from black mice were added to a 6 well tissue culture dish with 2 ml of 2 x 10 4 cells / well in DMEM containing 10% FBS (GIBCO., USA). 5% CO 2 , and incubated for 24 hours under 37 ℃ conditions. After incubation, the medium was removed and replaced with DMEM containing 10% FBS, 2uM α-MSH (Sigma., USA, Melanocyte stimulating Hormone) and 2 mM theophylline (Sigma., USA, theophylline), and then cultured wild ginseng root muscle extract Were diluted in the same medium and added, respectively, and then cultured under 5% CO 2 , 37 ° C. until the cells were at least about 80% at the bottom of the well. After incubation, the medium was removed, washed with PBS (Sigma., USA, Phosphate buffered Saline) and treated with trypsin to recover the cells. The recovered cells were centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes and the supernatant was removed. Cells from which the supernatant was removed were dried for 24 hours at 60 ° C. incubator and lysed melanin by adding 1N NaOH. The dissolved melanin was measured for absorbance at wavelength 490 nm using an absorption spectrophotometer (Uvmax, Molecular Device, USA).
<수학식 2><Equation 2>
타이로시나제 활성저해율 (%) = 100 - (A-A')/(B-B') X 100Tyrosinase activity inhibition rate (%) = 100-(A-A ') / (B-B') X 100
A: 검액 반응 후의 흡광도A: absorbance after the liquid reaction
B: 공시험액의 반응 후의 흡광도B: absorbance after reaction of blank test solution
A': 검액의 보정액A ': Correction liquid of the test liquid
B': 공시험액의 보정액B ': Correction amount of blank
억제 측정Melanin synthesis
Suppression measurement
(% of 대조군)OD Mean ± SD
(% of control)
(0.00)0.267 ± 0.011
(0.00)
(72.61)0.073 ± 0.015
(72.61)
(57.60)0.113 ± 0.09
(57.60)
(30.96)0.184 ± 0.013
(30.96)
(10.32)0.239 ± 0.016
(10.32)
(0.00)0.267 ± 0.011
(0.00)
(42.59)0.153 ± 0.009
(42.59)
(32.08)0.181 ± 0.018
(32.08)
(4.32)0.255 ± 0.011
(4.32)
(2.81)0.259 ± 0.009
(2.81)
표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 제조예1은 타이로시나제 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 세포 내 멜라닌 생성억제 효과가 우수하였다.As shown in Table 6 and Table 7, Preparation Example 1 inhibited tyrosinase activity in a concentration-dependent manner, and was excellent in inhibiting melanin production in the cell.
시험예 5: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물의 콜라겐 생합성 측정Test Example 5: Saxpraga Caspitosha Bar. Collagen Biosynthesis Determination of Uniflora Extracts
피부 주름의 발생 원인 중 하나로 피부교원질 즉 콜라겐의 결핍을 들고 있다. 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부 구조와 탄력을 유지하는 역할을 하고 있다. 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. One of the causes of skin wrinkles is a deficiency of collagen, or collagen. Collagen is a major protein that makes up the skin dermis and plays a role in maintaining skin structure and elasticity. Collagen is known to show a decrease in production with increasing age and to increase the decomposition to induce depression of the dermal dermal layer to produce wrinkles of the skin.
<콜라겐 생합성량 측정><Measurement of collagen biosynthesis amount>
본 발명에 따른 화장료의 주름개선 효과를 조사하기 위해 섬유아세포를 이용한 콜라겐 생합성 촉진 시험(SircolTM Soluble Collagen Assay Kit)을 실시하였다. In order to investigate the anti-wrinkle effect of the cosmetics according to the present invention, a collagen biosynthesis promoting test (Sircol ™ Soluble Collagen Assay Kit) using fibroblasts was performed.
배양한 사람섬유아세포를 12웰 세포 배양접시에 1ⅹ105 세포/웰이 되도록 5% FBS를 포함하는 배지에 분주하여 24시간 배양하고, 2% FBS를 포함하는 배지에 조직 배양한 제조예1 및 비교제조예1을 각각 처리 농도 별로 희석하여 세포에 처리하고 48시간 배양하여 하기 실험에 사용하였다. 상기 섬유아세포(fibroblast)에서 실제적으로 콜라겐의 합성이 증가되었음을 확인하기 위하여 Biocolor 사의 SircolTM 용해 콜라겐 분석 키트(Soluble Collagen Assay kit)를 구입하여 제품 매뉴얼의 실험 방법에 따라 콜라겐 양을 측정하였다. SircolTM 용해 콜라겐 분석 키트는 세포를 배양 하는 동안 배양 배지로 분비된 콜라겐과 염색시약의 결합에 의한 방법으로 확인 할 수 있는 정량방법이다. 상세하게는, 배양 상등액 100㎕에 염색 시약(dye reagent, 피크릭산에 Sirius red reagent이 포함된 용액) 1㎖을 첨가하고 30분간 반응시켰다(콜라겐 생성량에 따라 시험 시 배양액을 농축하거나 배양 상등액을 200㎕까지 염색 시약 1㎖와 반응시킬 수 있다.) Sirius red는 음이온계 색소로서 콜라겐에 특이적으로 결합한다. 30분간 반응시킨 후 반응액을 12,000× g 이상에서 10분간 원심분리하여 콜라겐-색소 결합체를 침전시켰다. 침전물에 알칼리 시약 1.0㎖을 첨가하여 실온에서 5분 동안 용해시켰다. 상기 용액의 흡광도를 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 540㎚에서 측정하여 하기 표 8에 나타내었으며, 이를 비시험군의 흡광도 비교하여 콜라겐 생합성 촉진 효과를 평가하였다.The cultured human fibroblasts were cultured in a medium containing 5% FBS for 24 hours to be 1 × 10 5 cells / well in a 12 well cell culture dish, and cultured in a medium containing 2% FBS. Preparation Example 1 was diluted for each treatment concentration, treated with cells, and cultured for 48 hours, and used in the following experiment. In order to confirm that the synthesis of collagen was actually increased in the fibroblasts, Biocolor's Sircol TM soluble collagen assay kit (Soluble Collagen Assay kit) was purchased, and the amount of collagen was measured according to the experimental method of the product manual. Sircol TM soluble collagen assay kit is a quantitative method that can be identified by combining collagen and staining reagent secreted into the culture medium during cell culture. Specifically, 1 ml of a dyeing reagent (a solution containing Sirius red reagent in picric acid) was added to 100 µl of the culture supernatant and allowed to react for 30 minutes (concentration of the culture solution or the culture supernatant during the test depending on the amount of collagen production). Sirius red is an anionic pigment that specifically binds to collagen. After reacting for 30 minutes, the reaction solution was centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes to precipitate the collagen-pigment conjugate. 1.0 ml of alkaline reagent was added to the precipitate and dissolved for 5 minutes at room temperature. Absorbance of the solution was measured at 540 nm using an absorbance spectrophotometer (UVmax, Molecular Device, USA), and is shown in Table 8 below. The effect of promoting collagen biosynthesis was evaluated by comparing the absorbance of the test group.
(% of 대조군)OD Mean ± SD
(% of control)
(100)0.479 ± 0.048
(100)
(102.24)0.490 ± 0.024
(102.24)
(106.73)0.512 ± 0.031
(106.73)
(110.38)0.529 ± 0.021
(110.38)
(107.15)0.514 ± 0.031
(107.15)
(100)0.479 ± 0.048
(100)
(99.79)0.478 ± 0.029
(99.79)
(103.70)0.497 ± 0.022
(103.70)
(104.75)0.502 ± 0.029
(104.75)
(106.52)0.511 ± 0.035
(106.52)
표 8에 나타난 바와 같이, 제조예1은 비교제조예1과 비교하여 콜라겐 생합성 효과가 우수함을 확인하였다. As shown in Table 8, Preparation Example 1 was confirmed that the collagen biosynthesis effect is superior to Comparative Preparation Example 1.
실시예 1: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 함유하는 에센스의 제조. Example 1 Saxypraga Caspitosha Bar Preparation of Essences Containing Uniflora Extracts.
제조예1을 포함하는 에센스를 하기 표 9의 조성에 따라 제조하였다. An essence comprising Preparation Example 1 was prepared according to the composition of Table 9 below.
A를 충분히 분산, 습윤하여 균일한 겔(Gel)상이 되도록 하고, B를 첨가하여 중화하였다. (A+B)에 C를 첨가하여 균일교반하여 가용화시킨 후, D를 실온에서 첨가하여 균일하게 분포되도록 교반하고, 용기에 담아 제품화하였다. A was sufficiently dispersed and wetted to form a uniform gel, and neutralized by adding B. C was added to (A + B), uniformly stirred and solubilized, and then D was added at room temperature, stirred to distribute uniformly, and put into a container to produce a product.
실시예2 내지 4: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 포함하는 유연화장수(스킨)의 제조Examples 2-4: Saxypraga casphytosha bar. Preparation of Softening Soap (Skin) Containing Uniflora Extract
제조예1을 포함하는 화장료 조성물 중 유연화장수(스킨)의 실시예는 하기 표 10과 같다. Examples of the flexible longevity (skin) in the cosmetic composition containing Preparation Example 1 are shown in Table 10 below.
실시예5 내지 7: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 포함하는 영양유액(밀크로션)의 제조Examples 5-7: Saxpraga caspitosha bar. Preparation of Nutrients (Milk Lotion) Containing Uniflora Extract
제조예1을 함유하는 화장료 조성물 중 영양유액(밀크로션)의 처방예는 하기 표 11와 같다. Formulation example of nutrient emulsion (milk lotion) in the cosmetic composition containing Preparation Example 1 is shown in Table 11.
실시예 8 내지 10: 색시프라가 캐스피토샤 바. 유니플로라 추출물을 포함하는 크림의 제조Examples 8-10: Saxpraga caspitosha bar. Preparation of a Cream Containing Uniflora Extracts
제조예1을 함유하는 화장료 조성물 중 크림의 처방예는 하기 표 12와 같다. Formulation example of the cream in the cosmetic composition containing Preparation Example 1 is shown in Table 12 below.
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