KR101003960B1 - 미토콘드리아 표적화 산화방지제로서 사용되는 미토퀴논 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

미토콘드리아 표적화 산화방지제로서 사용되는 미토퀴논 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약제학적으로 허용되는 양친성 산화방지성 화합물, 이 화합물을 포함하는 조성물 및 투여 제형, 이러한 화합물의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 예시된 화합물은 모두 메톡시페닐 알킬 트리페닐포스포늄 또는 메톡시 디옥소사이클로헥사디엔 알킬 트리페닐포스포늄 유도체와 같은 미토퀴논 유도체이다. 본 발명의 화합물, 조성물, 투여 제형, 용도 및 방법은, 예컨대, 산화성 스트레스와 관련한 질환 또는 상태의 치료에 유용하다.
산화성 스트레스, 미토퀴논, 산화방지제

Description

미토콘드리아 표적화 산화방지제로서 사용되는 미토퀴논 유도체를 포함하는 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition comprising mitoquinone derivatives used as mitochondrially targeted antioxidants}
본 발명은 친유성 양이온성 그룹을 갖는 양친성 산화방지성 화합물, 이러한 화합물의 합성 방법, 조성물, 및, 예컨대, 약제로서의 이들의 용도를 지지하는 이들 화합물의 물리화학적 특성에 관한 것이다.
산화성 스트레스는 노화와 관련한 사람의 각종 퇴행성 질환, 예를 들어, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병(Huntington's Chorea) 및 프리드라이히 보행실조(Friedreich's Ataxia)와 노화되면서 축적되는 비특이적 손상의 원인이 된다. 이것은 또한 뇌졸중과 심장 마비 및 장기 이식 및 수술에서의 허혈성 재관류 조직 손상 및 염증의 원인이 되기도 한다. 산화성 스트레스에 의해 유발되는 손상을 막기 위하여 다수의 산화방지 요법이 개발되고 있다. 그러나, 이들은 대부분 세포 내에 표적화되지 않으며 따라서, 최적의 효과를 거두지 못한다. 더우기 이러한 다수의 산화방지제는, 예컨대, 이들의 생체이용률 및 치료 효능을 발휘하기 위한 표적 기관을 투과하는 이들의 능력을 제한하는 바람직하지 못한 물리화학적 특성을 갖는다.
미토콘드리아는 에너지 대사를 담당하는 세포내의 소기관이다. 따라서, 미토콘드리아 결함은 높은 에너지 요구량을 갖는 신경계와 근육 조직에 특히 손상을 입히게 된다. 이들은 대부분의 세포 내에서 산화성 스트레스를 일으키는 반응성 산소 성분과 유리 라디칼의 주요 공급원이기도 하다. 따라서, 본 출원인은 미토콘드리아에 선택적으로 산화방지제를 공급하는 것이 비-표적화 산화방지제를 사용하는 것보다 더 효과적일 것이라고 믿는다. 따라서, 본 발명은 미토콘드리아를 표적화할 수 있는 산화방지제를 제공하고자 하는 것이다.
친유성 양이온은 이의 양 전하 때문에 미토콘드리아 기질 내에 축적될 수 있다(참조: Rottenberg, 1979 Methods Enzymol 55, 547, Chen, 1988 Ann Rev Cell Biol 4, 155). 이러한 이온은 양의 전하를 차단하거나 넓은 표면적에 걸쳐서 이를 비편재시키기에 충분한 친유성을 띠고 활성의 유출 경로가 없으며 양이온이 대사되거나 세포에 직접 독성을 주지 않는다는 조건이 충족되었을 경우에 축적된다.
따라서, 본 발명은 미토콘드리아가 특정의 친유성 양이온들을 집중시켜서 결합된 산화방지제를 흡수하는 능력을 사용하여, 산화성 스트레스를 일으키는 반응성 산소 성분과 유리 라디칼의 주요 공급원에 산화방지제를 표적화하도록 하는 방법에 초점을 맞추고 있다.
생체내 산화방지 활성은 양호하지만 생체내 표적 구획에 관한 산화방지제 기능성이 불량한 산화방지성 화합물의 예로는 코엔자임 Q(CoQ) 및 이데베논(Idebenone)이 포함된다. 이들 두 화합물은 생체이용률이 낮고 매우 높은 용량으로 투여되어야만 효과를 나타내므로 투여량에 비해서 치료 효과가 낮다.
본 발명자들은 어떠한 이론에도 구애되지 않기를 바라면서, 산화방지성 화합물에 대하여, 시험관내 또는 생체외 활성(예: 산화방지 활성 또는 미토콘드리아 축적)이 생체내의 산화방지제 기능성 및/또는 효능(예: 치료 효능)의 유일한 결정 인자는 아니라고 믿는다. 산화방지성 화합물이 적합한 시험관내 또는 생체외 산화방지 활성을 나타내는 것이 본 발명의 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물로서 유용하다는 점은 사실이나, 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물은 생체내 효능을 나타내기 위하여, 예를 들면, 적합한 생체이용률, 표적 미토콘드리아 내에서의 적합한 편재화 또는 분포, 및/또는 적합한 안정성과 같은 기타의 바람직한 물리화학적 특성을 가져야 한다.
본 발명자들은 어떠한 이론에도 구애되지 않기를 바라면서, 본 발명의 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물이, 예컨대, 이들의 양친성, 물리적 구조 및/또는 치수, 및/또는 저 내지 중간 소수성 및/또는 분배 계수와 같은 이들의 물리화학적 특성으로 인하여 적어도 부분적으로 생체이용률 및/또는 생체내 미토콘드리아 표적화 및 축적을 포함하는 유리한 산화방지제 기능성을 나타낸다고 믿는다. 따라서, 이러한 화합물은 다른 산화방지성 화합물에 비해 낮은 투여량에서 유효한 치료 효과를 제공한다.
미국 특허 제6,331,532호에는 미토퀴놀 및 미토퀴논 화합물(본 명세서에서는 미토퀴논/미토퀴놀로 통칭한다)의 예와 관련하여, 산화방지성 잔기에 공유 결합된 친유성 양이온에 의존하는 산화방지성 잔기의 미토콘드리아 표적화에 대한 가능성을 개시하였다. 이 특허문헌에 예시된 화합물은 (브릿지 길이의 일반화에도 불구하고) 탄소 브릿지 길이가 10인 (즉, C10 브릿지된) 화학식
Figure 112009073343553-pat00001
의 미토퀴논 화합물이다. 이의 환원 형태인 미토퀴놀도 C10 브릿지를 갖는다.
본 발명자들은 미토퀴논/미토퀴놀은 시험관내 및 생체내 산화방지 활성과 미토콘드리아 표적화 및 축적에 있어서 우수하지만 브로마이드 염으로서는 다소 불안정하다는 사실을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 미국 특허 제6,331,532호에 개시된 것과 같은 미토퀴논/미토퀴놀의 물리화학적 특성은, 예컨대, 경구 또는 비경구로 투여되고/되거나 화합물이 내부 기관(예: 뇌, 심장, 간 또는 기타 기관)의 조직 속에 존재하는 미토콘드리아를 표적화하는 약제학적 조성물에는 덜 적합하다는 사실을 밝혀내었다.
본 발명의 화합물의 예는 약제학적 조성물에 적합하다. 이들은 결정성 및/또는 고체 형태 이외의 형태를 가질 수 있으나, 예컨대, 담체, 부형제, 착화제, 또 는, 예컨대, 사이클로덱스트린 등의 다른 첨가제와 같은 기타의 제제들과 혼합됨으로써 고체 형태로 제형화될 수 있다. 유리하게 이러한 제제는 약제학적으로 허용된다.
본 발명자들은 적합한 음이온과 결합하여 고체 또는 결정성 생성물을 포함한 일반적으로 중화된 염 형태의 화합물을 제공하는 양 전하를 갖는 본 발명의 양친성 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 예를 제공함이 바람직하다고 단정하였다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 염 형태에서 특정한 염 형성 음이온은 산화방지성 화합물에 대해 반응성, 예를 들면 산화방지성 잔기, 결합 잔기 또는 친유성 양이온성 잔기에 대해 반응성을 나타내고/내거나 산화방지성 잔기에서 또는 이의 절단을 초래할 수 있기 때문에 제외시켜야 함을 알았다. 다른 염 형성 음이온은 약제학적으로 바람직하지 않다고 여겨진다. 예를 들면, 니트레이트 잔기는 약제학적 또는 환경적으로 허용될 수 없기 때문에 제약 회사로부터 보통 부적합한 것으로 여겨지며, 본 발명자들은 이러한 화합물의 염 형성에 자주 사용되는 브롬화수소는 산화방지성 잔기에 대해 반응성, 예를 들면 본 명세서의 화학식 2의 화합물의 산화방지성 잔기로부터 메틸 그룹을 절단시키고/시키거나 전체 화합물의 다소 총체적인 안정성의 감소를 초래할 수 있는 친핵성을 갖는다는 사실을 밝혀내었다. 일례로, 본 발명자들은 미토퀴논의 브로마이드 염이 다소 불안정하다고 단정하였다.
따라서, 본 발명자들은 미토콘드리아 표적화 산화방지제의 액체, 고체 또는 결정 형태로서의 염 형태를 포함한 염 형태는 친핵성이 아니고/아니거나 산화방지성 화합물 또는 착물을 포함하는 임의의 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 음이 온 또는 유사 잔기에 결합하는 것이 최선이라고 믿는다. 음이온은 약제학적으로 허용되는 것이 또한 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 예를 들어, 산화성 스트레스와 관련한 질환 또는 상태의 치료에 유용한 약제학적으로 허용되는 양친성 산화방지성 화합물 및 조성물, 투여 제형 및 이러한 화합물의 제조 방법을 제공하거나, 일반인에게 유효한 선택안을 제공하는 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 당해 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 염 형태가 화학적으로 안정하고/하거나 음이온성 보충물이 산화방지성 잔기, 양이온성 잔기 또는 결합 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 화합물이다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔를 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저, 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포 스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
Figure 112009080254428-pat00101
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 약 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
바람직한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
Figure 112009073343553-pat00003
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3을 갖는다.
Figure 112009073343553-pat00004
다른 측면에서, 본 발명은 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 이 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 염 형태가 화학적으로 안정하고/하거나 음이온성 보충물이 산화방지성 잔기, 양이온성 잔기 또는 결합 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00102
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 약 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 2
Figure 112009073343553-pat00006
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
추가의 양태에서, 당해 조성물은 Z가 비-친핵성 음이온인 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태의 화합물 및 사이클로덱스트린을 포함한다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 당해 조성물은 화학식 3의 화합물을 포함하고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00007
한 양태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 당해 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 염 형태가 화학적으로 안정하고/하거나 음이온성 보충물이 산화방지성 잔기, 양이온성 잔기 또는 결합 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 화합물을 약제학적으로 허용되는 희석제 및/또는 담체 및/또는 부형제와 함께 포함하는 투여 단위를 제공한다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00103
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 2
Figure 112009073343553-pat00009
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
추가의 양태에서, 당해 투여 제형은 Z가 비-친핵성 음이온인 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태의 화합물, 및 사이클로덱스트린을 포함한다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 투여 단위는 화학식 3의 화합물을 포함하고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00010
한 양태에서, 투여 단위는 경구 투여에 적합하다.
추가의 양태에서, 투여 단위는 비경구 투여에 적합하다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포유동물에 투여함으로써 포유동물의 산화성 스트레스를 예방 또는 치료하는 데에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 조성물 또는 투여 제형을 제공한다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
다른 양태에서, 상기 화합물 또는 이의 염은 첫째 날에는 1일 유지 용량의 약 1.02 내지 약 2.0배의 용량으로, 그 다음 날부터는 1일 유지 용량으로 투여된다.
바람직하게, 염은 메탄설포네이트의 염이며, 당해 화합물은 사이클로덱스트린과 결합된다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3을 갖는다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00011
바람직하게, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포유동물에 투여함으로써 포유동물의 노화 증상을 예방 또는 치료하는 데에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염, 조성물 또는 투여 제형을 제공한다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
다른 양태에서, 화학식 3의 화합물 또는 이의 염은 첫째 날에는 1일 유지 용량의 약 1.02 내지 약 2.0배의 용량으로, 그 다음 날부터는 1일 유지 용량으로 투여된다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00012
바람직하게, 염은 메탄설포네이트의 염이며, 화합물은 사이클로덱스트린과 결합된다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3을 갖는다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00013
바람직하게, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 이 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 음이온성 보충물이 할로겐 이온이 아니고, 음이온성 보충물이 비-친핵성이고/이거나, 음이온성 보충물이 양이온성 잔기, 결합 잔기 또는 산화방지성 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 안정한 화합물이다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00104
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 약 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 2
Figure 112009073343553-pat00015
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3을 갖는다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00016
다른 측면에서, 본 발명은 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 이 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 음이온성 보충물이 할로겐 이온이 아니고, 음이온성 보충물이 비-친핵성이고/이거나, 음이온성 보충물이 양이온성 잔기, 결합 잔기 또는 산화방지성 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 안정한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00105
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 2
Figure 112009073343553-pat00018
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
추가의 양태에서, 당해 조성물은 Z가 비-친핵성 음이온인 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태의 화합물 및 사이클로덱스트린을 포함한다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 당해 조성물은 화학식 3을 갖는 화합물을 포함하고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00019
한 양태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 희석제 및/또는 담체 및/또는 부형제와 함께, 결합 잔기에 의해 산화방지성 잔기에 결합된 친유성 양이온성 잔기와, 당해 양이온성 잔기를 위한 음이온성 보충물을 포함하고, 양이온성 종이 산화방지성 종을 미토콘드리아로 표적화할 수 있으며, 음이온성 보충물이 할로겐 이온이 아니고, 음이온성 보충물이 비-친핵성이고/이거나, 음이온성 보충물이 양이온성 잔기, 결합 잔기 또는 산화방지성 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 안정한 화합물을 포함하는 투여 단위이다.
한 양태에서, 산화방지성 잔기는 퀴논 또는 퀴놀이다.
다른 양태에서, 산화방지성 잔기는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔을 포함하는 쇄 절단형 산화방지제, 유도체화 플러린을 포함하는 일반적 라디칼 스캐빈저 및 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함하는 스핀 트랩으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 친유성 양이온성 잔기는 치환되거나 치환되지 않은 트리페닐포스포늄 양이온이다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00106
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기 및 H로부터 선택되고,
n은 약 2 내지 20의 정수이고,
Z는 비반응성 음이온이다.
바람직하게, Z는 알킬 설포네이트, 아릴 설포네이트, 알킬 니트레이트 및 아 릴 니트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 당해 화합물은 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태를 갖는다.
화학식 2
Figure 112009073343553-pat00021
상기 화학식 2에서,
Z는 비-친핵성 음이온이다.
추가의 양태에서, 당해 투여 단위는 Z가 비-친핵성 음이온인 화학식 2 및/또는 이의 퀴놀 형태의 화합물, 및 사이클로덱스트린을 포함한다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 투여 단위는 화학식 3의 화합물을 포함하고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00022
한 양태에서, 투여 단위는 경구 투여에 적합하다.
추가의 양태에서, 투여 단위는 비경구 투여에 적합하다.
추가의 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서, 결정성 형태 및/또는 비-액체 형태로 제형화된 본 발명에 따르는 화합물을 포함하는 경구 투여에 적합한 투여 단위이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 활성 성분으로서 본 발명에 따르는 화합물을 포함하는 비경구 투여에 적합한 투여 단위이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 유효량을 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는, 산화성 스트레스 감소 또는 노화 증상의 감소가 유리한 환자를 치료하는 데에 적합한 약제학적 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1의 화합물이다.
한 예에서, 당해 화합물은 사이클로덱스트린과 착화된다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1 이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3의 화합물이고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 내의 산화성 스트레스의 감소 방법을 제공한다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1의 화합물이다.
한 예에서, 당해 화합물은 사이클로덱스트린과 착화된다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3의 화합물이고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
한 양태에서, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 유효량을 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병 또는 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 데에 적합한 약제학적 조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 치료는 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자의 치료이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산화성 스트레스의 감소가 유리한 환자에게 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 산화성 스트레스의 감소가 유리한 환자의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
한 양태에서, 당해 화합물은 화학식 1의 화합물이다.
한 예에서, 당해 화합물은 사이클로덱스트린과 착화된다.
다양한 예에서, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 또는 약 1:1이며, 예컨대, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
더욱 바람직하게, 당해 화합물은 화학식 3의 화합물이고, 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이며, 더욱 바람직하게, 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비는 약 1:2이다.
한 양태에서, 상기 투여는 경구 투여이다.
추가의 양태에서, 상기 투여는 비경구 투여이다.
다른 측면에서, 본 발명은 산화성 스트레스의 감소 또는 노화 증상의 감소가 유리한 환자에게 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 산화성 스트레스의 감소 또는 노화 증상의 감소가 유리한 환자의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병 또는 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자에게 본 발명의 화합물을 투여 하는 단계를 포함하는, 이들 질환에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 치료 또는 예방 방법은 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자를 대상으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포에 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포 내의 산화성 스트레스의 감소 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 환자의 산화성 스트레스를 감소시키는 데에 사용하기 위한 약제, 투여 단위 또는 약제학적 조성물의 제조에서의 상술한 화합물의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 환자의 노화 증상을 감소시키는 데에 사용하기 위한 약제, 투여 단위 또는 약제학적 조성물의 제조에서의 상술한 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병 또는 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이들 환자의 치료 또는 예방에 효과적인 약제, 투여 단위 또는 약제학적 조성물의 제조에서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
바람직하게, 약제, 투여 단위 또는 약제학적 조성물은 프리드라이히 보행실조에 걸렸거나 걸리기 쉬운 환자의 치료 또는 예방에 효과적이다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 내의 산화성 스트레스를 감소시키는 데에 사용하기 위한 약제, 투여 단위 또는 약제학적 조성물의 제조에서의 상술한 바와 같 은 화합물의 용도를 제공한다.
바람직하게, 상기 제조는 다른 재료(들), 더욱 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 및/또는 담체를 사용한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 사이클로덱스트린과의 혼합 단계를 포함하는, 잔기 또는 화학식 1 (및/또는 이의 퀴논 형태)의 잔기를 갖는 화합물의 합성 방법이다.
화학식 1
Figure 112009080254428-pat00107
위의 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이할 수 있으며, (치환될 수 있는) C1 내지 C5 알킬 잔기로부터 선택되고,
n은 2 내지 20의 정수이다.
바람직하게, (CH2)n 브릿지의 C는 각각 포화된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 사이클로덱스트린과의 혼합 단계를 포함하는, 화학식
Figure 112009073343553-pat00024
의 화합물의 합성 방법이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본질적으로 본 명세서에 설명된 바와 같은 화학식 3의 화합물의 합성 방법이다.
화학식 3
Figure 112009073343553-pat00025
본 명세서에 포함되는 문헌, 법령, 자료, 장치, 논문 등에 대한 모든 논의도 단지 본 발명에 대한 문맥을 제공하기 위한 목적만을 갖는다. 이들 중 일부 또는 모두는 본 출원의 우선일 이전에 존재하였기 때문에 종래 기술의 일부라거나 본 발명이 속한 분야에서 통상의 일반적 지식이라는 사실은 인정되지 않는다.
본 명세서에서 "포함한다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형태는 언급된 원소, 정수 또는 단계, 또는 원소, 정수 또는 단계의 그룹을 포괄하지만, 다른 임의의 원소, 정수 또는 단계, 또는 원소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제시키지 않는 의미이다.
본 명세서에서 "퀴논"이란 용어는 단독으로 사용되든지 접두사가 붙어 화합 물의 산화 형태를 의미하든지 그의 범위 안에 화합물의 환원된 형태, 즉 퀴놀 형태도 포함하는 것으로 이해한다. 마찬가지로, 예컨대, 구조식으로 표시된 퀴논도 그의 범위 안에 퀴놀 형태를 포함한다.
본 명세서에서 "퀴놀"이란 용어는 단독으로 사용되든지 접두사가 붙어 화합물의 환원 형태를 의미하든지 그의 범위 안에 화합물의 산화된 형태, 즉 퀴논 형태도 포함하는 것으로 이해한다. 마찬가지로, 예컨대, 구조식으로 표시된 퀴놀도 그의 범위 안에 퀴논 형태를 포함한다.
본 명세서에서 "및/또는"이란 "및"과 "또는"을 선택 사항으로서 포함한다.
본 명세서에서 "분배 계수" 및 "분배 계수(옥탄올:물)"란 25℃ 또는 37℃에서 측정된 옥탄-1-올/포스페이트 완충된 염수의 분배 계수(참조: Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G. Porteous, W. K., Ledgerwood, E. C., Smith, R. A. J. 및 Murphy, M. P. 2001 J Biol Chem 276 4588. Smith, R. A. J., Porteous, C. M., Coulter, C. V. 및 Murphy, M. P. 1999 Eu. J Biochem 263, 709. Smith, R. A. J., Porteous, C. M., Gane, A. M. 및 Murphy, M. P. 2003 Proc Nat Acad Sci 100, 5407.), 또는 ACD(Advanced Chemistry Development) 소프트웨어 솔라리스(Solaris) V4.67을 사용하여 산출한 옥탄올/물 분배 계수(참조: Jauslin, M. L., Wirth, T., Meier, T. 및 Schoumacher, F., 2002, Hum Mol Genet 11, 3055)를 의미한다.
본 명세서에서 "약제학적 제제용으로 허용되는"이라함은 약제의 투여에 관한 허용가능성 뿐만 아니라, 예컨대, 허용되는 안정성, 저장 수명, 흡습성 및 제제화 에 대한 제형의 허용가능성도 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 "비반응성 음이온"이란 산화방지성 잔기, 친유성 양이온 또는 결합 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않는 음이온이다. 예컨대, 화합물의 이러한 잔기 중 하나가 친핵성 공격 표적을 포함하는 경우에 음이온은 비-친핵성이다.
상기 기재한 바와 같이 광범위하지만, 본 발명은 이하에 실시예를 통해 설명하는 양태들로 구성되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조로 할 때 가장 잘 이해될 것이다.
본 발명에 의해, 산화성 스트레스와 관련한 질환 또는 상태의 치료에 유용한 약제학적으로 허용되는 양친성 산화방지성 화합물 및 조성물, 투여 제형 및 이러한 화합물의 제조 방법이 제공된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 산화성 스트레스를 감소시키기 위한 치료 및/또는 예방을 주된 목적으로 하는 화합물의 미토콘드리아 표적화에 초점을 맞추고 있다.
미토콘드리아는 내막을 가로질러 180mV 이하의 실질적인 막 전위를 갖는다(내부: 음). 이 전위로 인해서 미토콘드리아 기질 내부에는 막 투과성의 친유성 양이온이 수백 배로 축적된다.
본 출원인은 친유성 양이온(예: 친유성 트리페닐포스포늄 양이온)을 산화방지성 잔기에 결합시킴으로써, 생성된 양친성 화합물은 완전한 세포 내의 미토콘드리아 기질에 전달될 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 이에 따라 산화방지제는 무작위로 분산되지 않고 세포 내의 유리 라디칼 및 반응성 산소 종의 일차적 생성 부위에 표적화된다.
본 출원인은 본 발명에 이르러, 산화방지제의 특성, 예를 들면, 산화방지성 잔기의 성질, 결합 잔기의 길이 또는 친유성과 같은 결합 잔기의 물리적 및 화학적 특성, 및/또는 친유성 양이온의 성질이 산화방지성 화합물의 생체내 효능에 기여하고 화합물의 산화방지제 기능성에 기여한다는 사실도 밝혀내었다. 본 발명의 산화방지성 화합물에 대하여 생체내 효능은 부분적으로는 적합한 생체이용률, 적합한 안정성, 적합한 약동학, 적합한 산화방지 활성, 및/또는 적합한 미토콘드리아 표적화 및/또는 축적을 포함할 수 있다.
원칙적으로, 미토콘드리아 막에 및/또는 막을 통해 이동될 수 있고 완전한 세포의 미토콘드리아에 또는 이의 내부에 축적될 수 있는 모든 친유성 양이온 및 산화방지제가 본 발명의 화합물을 형성하는 데에 사용될 수 있다.
그러나, 친유성 양이온으로는 본 명세서에 예시된 트리페닐포스포늄 양이온이 바람직하다. 본 발명에 따른 산화방지제에 공유 결합될 수 있는 다른 친유성 양이온은 트리벤질 암모늄 및 포스포늄 양이온을 포함한다. 본 발명의 산화방지성 화합물의 몇몇 예에서 친유성 양이온은 1 내지 약 30개의 탄소원자, 예컨대, 2 내지 약 20개, 약 2 내지 약 15개, 약 3 내지 약 10개, 또는 약 5 내지 약 10개의 탄 소원자를 갖는 포화된 직선의 탄소 쇄에 의해 산화방지성 잔기에 결합된다. 특히 바람직한 예에서, 직선의 탄소 쇄는 10개의 탄소원자를 포함한다.
바람직하게, 탄소 쇄는 알킬렌 그룹(예: C1-C20 또는 C1-C15)이지만 1개 이상의 이중 또는 삼중 결합을 임의로 포함하는 탄소 쇄도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 1개 이상의 치환체(예: 하이드록실, 카복실산 또는 아미드 그룹)를 포함하고/하거나, 예로서 치환되거나 치환되지 않은 알킬, 알케닐 또는 알키닐 그룹으로부터 선택된 것과 같은 1개 이상의 측쇄 또는 분지를 갖는 탄소 쇄도 포함된다. 또한, 약 30개 이상의 탄소원자를 갖지만 길이는 1 내지 약 30개의 탄소원자를 갖는 포화된 직선 탄소 쇄와 동일한 탄소 쇄도 포함된다.
당업자들은 직선 알킬렌 이외의 잔기가, 산화 반응성 잔기를 친유성 양이온, 예를 들면, 치환되거나 분지된 알킬 그룹, 펩티드 결합 등에 공유 결합시키는데 사용될 수 있음을 알게 될 것이다.
일부 양태에서, 친유성 양이온은 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 직쇄 알킬렌 그룹, 예를 들면, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌 또는 데실렌 그룹에 의해 산화방지성 잔기에 결합된다.
본 발명에 유용한 산화방지성 잔기는 초기의 산화방지 활성 또는 산화방지 활성의 재순환 또는 이 둘 모두의 산화방지 활성을 위한 환원제와의 상호 작용을 필요로 하는 것들을 포함한다. 예를 들면, 활성 산화방지성 잔기로서 퀴놀 잔기를 포함하는 본 발명의 산화방지성 화합물은 퀴논 형태로 투여될 수 있다. 산화방지제로서 작용하기 위하여, 다시 말하면 산화방지 활성을 갖기 위하여 퀴논은 초기 산화방지 활성에 대해서는, 예컨대, 착물 II와 같은 미토콘드리아 환원제와 같은 환원제와의 상호 작용에 의해 퀴놀 형태로 환원되어야 한다. 산화된 퀴논 형태와 환원제와의 후속적 상호 작용은 산화방지 활성의 재순환을 유발할 수 있다.
본 발명에 유용한 다른 산화방지성 잔기의 예는 이미 환원된 형태로 존재하여 초기 산화방지 활성을 위한 환원제와의 상호 작용을 필요로 하지 않는 것들을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 산화방지성 잔기의 산화된 형태와 미토콘드리아 환원제와의 후속적 상호 작용은 산화방지 활성의 재순환을 유발할 수 있다. 예컨대, 산화방지성 잔기인 비타민 E는 환원된 형태로 투여될 수 있어서 초기의 산화방지 활성을 위한 환원제와의 상호 작용을 필요로 하지 않지만, 예컨대, 내생성 퀴논 풀(pool)과 같은 환원제와 연속적으로 상호 작용함으로써 산화방지 활성을 재순환시킬 수 있다.
본 발명에 유용한 추가의 산화방지성 잔기의 예는 미토콘드이아 환원제와의 상호 작용에 의해 재순환되지 않는 것들을 포함한다.
본 발명에 유용한 산화방지성 잔기의 예는 비타민 E 및 비타민 E 유도체, 쇄 절단형 산화방지제, 예컨대, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 퀴놀, 및 일반적 라디칼 스캐빈저, 예컨대, 유도체화 플러린을 포함한다. 추가로, 유리 라디칼과 반응하여 안정한 유리 라디칼을 생성하는 스핀 트랩도 사용 가능하다. 이들은 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함할 것이다.
본 명세서의 화학식 1 및 2의 화합물을 포함하는 바람직한 산화방지성 화합 물은, 예컨대, 다음의 반응에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
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일반적 합성 방법은 적합한 이탈 그룹, 바람직하게는 알킬 설포닐, 브로모 또는 요오도 전구체를 함유하는 전구체를 1당량 초과의 트리페닐포스핀과 함께 아르곤 하에서 수 일간 가열한다. 이어서, 포스포늄 화합물을 이의 염으로서 단리시킨다. 이를 수행하기 위하여 생성물을 회백색 고체가 남을 때까지 디에틸 에테르를 사용하여 반복적으로 연마시킨다. 그런 다음, 이것을 클로로포름 또는 디클로로메탄에 용해시키고 디에틸 에테르로 침전시켜서 과량의 트리페닐포스핀을 제거한다. 고체가 클로로포름에 더이상 용해되지 않을 때까지 이것을 반복한다. 이 때 생성물을 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트 또는 고급 알코올과 같은 적합한 용매로부터 여러 번 재결정시킨다.
화학식 3의 바람직한 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물(본 명세서에서 미토퀴논-C10 메실레이트 또는 미토퀴논-C10 메탄설포네이트라고도 부른다)의 안정한 형태를 제조하는 데에 사용될 수 있는 바람직한 합성 경로는 하기 실시예 1에 설명된 바와 같다.
이렇게 제조된 산화방지성 화합물의 음이온은 필요하거나 바람직하다면 이온 교환 또는 당업계에 공지된 다른 기술을 사용하여 약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는 다른 음이온으로 쉽게 교환될 수 있을 것으로 또한 이해된다.
본 출원인은 산화방지성 화합물의 염 형태의 안정성은 음이온이 산화방지성 잔기, 결합 잔기 또는 친유성 양이온성 잔기에 대해 반응성을 나타내지 않을 때에 향상된다는 사실을 밝혀냈다. 예컨대, 본 발명의 산화방지성 화합물의 바람직한 예의 경우, 음이온은 친핵성을 띠지 않는다. 또한, 음이온은 약제학적으로 허용되는 음이온이 바람직하다. 추가로, 약제학적 조성물에 대하여 음이온은 조성물을 구성하는 다른 성분들에 대해 반응성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
비-친핵성 음이온의 예는 헥사플루오로안티모네이트, -아르세네이트 또는 -포스페이트, 또는 테트라페닐보레이트, 테트라(퍼플루오로페닐)보레이트 또는 다른 테트라플루오로보레이트, 트리플루오로메탄 설포네이트, 아릴 및 알킬 설포네이트,예를 들어, 메탄설포네이트 및 p-톨루엔설포네이트 및 포스페이트를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 음이온의 예는 플루오라이드 이온, 클로라이드 이온, 브로마이드 이온 및 요오다이드 이온과 같은 할로겐 이온; 니트레이트, 퍼클로레이트, 설페이트, 포스페이트 및 카보네이트와 같은 무기산 염의 음이온; 메탄설폰산, 및 에탄설폰산 염과 같은 저급 알킬설폰산 염의 약제학적으로 허용되는 음이온; 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산 및 p-톨루엔설폰산 염과 같은 아릴설폰산 염의 약제학적으로 허용되는 음이온; 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 하이드록시아세트산, 벤조산, 만델산, 부티르산, 프로피온산, 포름산, 푸마르산, 석신산, 시트르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 아세트산, 말산, 락트산 및 아스코르브산 염 과 같은 유기산 염의 약제학적으로 허용되는 음이온; 및 글루탐산 및 아스파르트산 염과 같은 산성 아미노산 염의 약제학적으로 허용되는 음이온을 포함한다.
본 발명의 바람직한 산화방지성 화합물의 예에서, 할로겐 음이온 전구체는 아릴 또는 알킬 설포네이트 음이온으로 교환된다. 그 예는 벤젠 설포네이트, p-톨루엔 설포네이트, 2-나프틸렌 설포네이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 프로판설포네이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 음이온은 메탄설포네이트 음이온이다. 상술한 바와 같이, 음이온이 메탄설포네이트인 본 발명의 산화방지성 화합물의 예는 본원에서 미토퀴논-C10 메탄설포네이트 또는 미토퀴논-C10 메실레이트라 불리우는 특히 바람직한 화학식 3의 산화방지성 화합물이다.
트리페닐포스포늄(또는 다른 친유성 양이온성) 잔기(들)에 결합된 상이한 산화방지성 잔기 R을 갖는 다양한 미토콘드리아 표적 화합물들을 제조하는 데에 동일한 일반적 방법을 사용할 수 있다. 이들은 비타민-E 관능기와 트리페닐포스포늄(또는 다른 친유성 양이온성) 잔기의 브릿지 결합 길이가 상이한 일련의 비타민 E 유도체들을 포함할 것이다. R로 사용될 수 있는 다른 산화방지제는 쇄 절단형 산화방지제, 예를 들어, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 퀴놀, 및 유도체화 플러린과 같은 일반적 라디칼 스캐빈저를 포함한다. 추가로, 유리 라디칼과 반응하여 안정한 유리 라디칼을 생성할 수 있는 스핀 트랩도 합성 가능하다. 이들은 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, 3급-부틸니트로소벤젠, 3급-니트로소벤젠, α-페닐-3급-부틸니트론의 유도체 및 관련 화합물을 포함할 것이다.
본 발명의 산화방지성 화합물에 대하여, 어떠한 약물에 대해서도 시험관내 활성이 생체내 기능성 또는 효율성을 결정짓는 유일한 인자가 아니라는 사실을 인식할 것이다. 본 발명의 산화방지성 화합물의 산화방지 활성은, 예컨대, 단리된 미토콘드리아 및/또는 단리된 세포를 사용하여 본 명세서에 기재된 것과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물로서 유용하기 위해서 산화방지성 화합물은 이러한 분석에서 적절하게 높은 산화방지 활성을 나타내어야 하지만, 생체내 효능을 나타내기 위하여 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물은, 예컨대, 적합한 생체이용률, 안정성 또는 산화방지제 기능성과 같은 다른 바람직한 물리화학적 특성을 가져야 하는 것이 사실이다.
생체내 산화방지 활성은 양호하지만 생체내 표적 구획에 관한 생체이용률이 불량한 산화방지성 화합물의 예로는 코엔자임 Q(CoQ) 및 이데베논이 포함된다. 이들 두 화합물은 사람 환자에서 최소의 임상 효과를 수득하기 위해 매우 높은 용량(예: 0.5 내지 1.2g)으로 투여되어야 한다.
본 발명의 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 예는 양호한 산화방지 활성 및 생체이용률을 나타내며 따라서, 낮은 용량에서 생체내 효능을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 양친성 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물인 미토퀴논-C10 메실레이트 및 이의 사이클로덱스트린 착물의 생체이용률의 측정은 실시예 11에 기재된다. 본 발명자들은 본 발명의 산화방지성 화합물이 산화방지 활성의 미토콘드리아 표적화에서 효과적이면서, 결정성 또는 고체 형태로 이용되거나 고체 형태로 제형화될 수 있는 점, 증가된 안정성, 향상된 생체이용률 및/또는 향상된 산화방지제 기능성을 포함한 하나 이상의 추가적 이점을 제공한다고 믿는다. 다시 한번 본 발명자들은 어떠한 이론에도 구애되지 않길 바라면서 본 발명의 산화방지성 화합물의 물리적 및 화학적 특성으로 인해, 본 발명의 산화방지성 화합물에 바람직한 특성을 제공하여 종래의 산화방지성 화합물이 그들의 화학적 및 물리적 특성 때문에 적합하게 사용될 수 없었던 분야의 조성물, 투여 제형 및 방법에 사용될 수 있다고 믿는다.
본 발명의 일부 양태에서, 산화방지성 화합물은 상기 정의된 화학식 2의 퀴놀 유도체이다. 예를 들면, 본 발명의 퀴놀 유도체는 상기 정의된 바와 같은 미토퀴논-C10 화합물이다(화학식 3의 화합물은 그의 특정한 염 형태이다). 본 발명의 화합물의 추가의 예는 (Cn)이 (CH2)5이고 퀴놀 잔기가 미토퀴논-C10의 것과 동일한, 미토퀴논-C5(도 3C 참조)라 불리우는 화학식 1의 화합물이다. 본 발명의 화합물의 다른 추가의 예는 (Cn)이 (CH2)3이고 퀴놀 잔기가 미토퀴논-C10의 것과 동일한, 미토퀴논-C3(도 3B 참조)라 불리우는 화학식 1의 화합물이다. 본 발명의 화합물의 또 다른 추가의 예는 (Cn)이 (CH2)15이고 퀴놀 잔기가 미토퀴논-C10의 것과 동일한, 미토퀴논-C15(도 3E 참조)라 불리우는 화학식 1의 화합물이다.
일단 제조되면, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 착화제 또는 첨가제를 임의로 포함하는 약제학적으로 적합한 형태의 본 발명의 산화방지성 화합물은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여될 것이다. 일단 투여되면, 당해 화합물은 산화방지 활성을 환자의 세포 내에 존재하는 미토콘드리아로 표적화할 것이다.
본 발명의 산화방지성 화합물은 경구 및/또는 비경구 투여 경로에 의해 환자에 투여될 수 있다.
산화방지성 화합물은 환자에 투여하기에 안정하고 안전한 약제학적 조성물로 제형화되어야 한다. 당해 조성물은 소정량의 산화방지성 화합물 성분을 희석제에 용해 또는 현탁시킴으로써 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 산화방지성 화합물의 양은 희석제 1㎖ 당 0.1 내지 1,000mg이다. 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트 또는 글루타메이트 완충액을 첨가하여 최종 조성물의 pH를 5.0 내지 9.5로 할 수 있으며, 탄수화물 또는 다가 알코올 강장제(tonicifier), 및 m-크레솔, 벤질 알코올, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤 및 페놀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방부제도 또한 임의로 첨가할 수 있다. 원하는 농도의 용액을 얻기 위해서는 충분량의 주사용수를 사용한다. 염화나트륨과 같은 부가적 강장제, 및 기타의 부형제도 필요에 따라 첨가할 수 있다. 그러나, 이러한 부형제는 산화방지성 화합물의 전체적 강장성을 유지시켜야 한다.
완충제, 완충 용액 및 완충된 용액이란 용어는 수소-이온 농도 또는 pH에 대해 사용될 때, 산 또는 알칼리의 첨가시 또는 용매를 사용한 희석시에 시스템, 특히 수용액이 pH의 변화를 견디는 능력을 의미한다. 산 또는 염기의 첨가시 적은 pH 변화를 겪는 완충액의 특성은 약산 및 약산의 염, 또는 약염기 및 약염기의 염의 존재이다. 전자 시스템의 예는 아세트산 및 나트륨 아세테이트이다. 첨가된 하이드록실 이온의 양이, 이를 중화시키는 완충계의 용량을 초과하지 않는 한 pH의 변화는 적다.
본 발명의 비경구 조성물의 안정성은 조성물의 pH를 대략 5.0 내지 9.5의 범위로 유지시킴으로써 향상된다. 다른 pH 범위는 예를 들면 5.5 내지 9.0, 또는 6.0 내지 8.5, 또는 6.5 내지 8.0, 또는 7.0 내지 7.5를 포함한다.
본 발명의 실행시 사용되는 완충제는, 예컨대, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제 또는 글루타메이트 완충제로부터 선택되며, 가장 바람직한 완충제는 포스페이트 완충제이다.
화합물의 투여를 용이하게 하기 위하여 담체 또는 부형제를 사용할 수도 있다. 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 예를 들어, 락토스, 글루코스 또는 수크로스, 또는 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 및 생리적으로 상용가능한 용매를 포함한다.
안정화제가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있으나, 필수적이지는 않다는 점이 중요하다. 그러나, 포함되는 경우, 본 발명에 유용한 안정화제는 탄수화물 또는 다가 알코올이다. 다가 알코올은 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물을 포함한다. 탄수화물은, 예컨대, 만노스, 리보스, 트레할로오스, 말토스, 이노시톨, 락토스, 갈락토스, 아라비노스 또는 락토스를 포함한다.
적합한 안정화제는, 예컨대, 소르비톨, 만니톨, 이노시톨, 글리세롤, 크실리톨 및 폴리프로필렌/에틸렌 글리콜 공중합체와 같은 다가 알코올, 및 분자량 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000 및 8000의 각종 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
미국 약전(USP)은 복합 용량 용기에 함유되는 제제에는 정균 또는 정진균 농 축물 중의 항균제를 첨가하여야 한다고 진술한다. 이들은, 피하 주사용 바늘 및 주사기로 내용물의 일부를 빼내거나 펜 인젝터(pen injector)와 같은 전달용의 다른 침습성 전달 수단을 사용하는 동안에 부주의하게 제제에 도입되는 미생물의 번식을 막기 위해서는 사용시 적합한 농도로 존재해야 한다. 항균제는 조성물의 다른 모든 성분들과의 상용성을 보장해야 하며, 이들의 활성은 한 조성물 내에서 효과적인 특정 제제가 다른 조성물에서는 비효과적이지 않도록 총체적 방식으로 평가되어야 한다. 특정 제제가 어느 조성물에서는 효과적이지만 다른 조성물에서는 효과를 나타내지 않는 경우는 드물지 않게 발견된다.
일반적인 약제학적 의미에서 방부제는 미생물의 성장을 예방 또는 억제하고, 이러한 목적으로 약제학적 조성물에 첨가되어 미생물에 의한 조성물의 변질을 막을 수 있는 물질이다. 방부제는 사용량은 많지 않으나 산화방지성 화합물의 전체적 안정성에 영향을 끼칠 수 있다. 따라서, 방부제의 적절한 선택은 더 어려울 수 있다.
본 발명의 실행시 사용하기 위한 방부제는 0.005 내지 1.0%(w/v) 범위일 수 있으나, 단독으로 또는 다른 성분과의 배합물로서 사용되는 각각의 방부제에 대한 바람직한 범위는, 벤질 알코올(0.1 내지 1.0%), 또는 m-크레솔(0.1 내지 0.6%) 또는 페놀(0.1 내지 0.8%), 또는 메틸(0.05 내지 0.25%)과 에틸 또는 프로필 또는 부틸(0.005 내지 0.03%) 파라벤의 배합물이다. 파라벤은 파라-하이드록시벤조산의 저급 알킬 에스테르이다.
각각의 방부제에 대한 상세한 설명은 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 및 Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 제1권, 1992, Avis 등]에 설명되어 있다. 이들 목적을 위하여, 결정성 트리엔틴 디하이드로클로라이드 염을 약제학적으로 허용되는 통상의 무독성 담체, 보조제 및 비히클을 함유한 투여 단위 조성물로서 비경구(피하 주사, 정맥내, 근육내, 진피내 주사 또는 주입 기술 포함) 또는 흡입 분무에 의해 투여할 수 있다.
약제학적 조성물의 강장성을 조절하기 위해서는 선택된 강장제에 따라서, 염화나트륨 또는 다른 염을 첨가하는 것도 바람직할 수 있다. 그러나, 이것은 임의적이며 선택된 특정 조성물에 의존한다. 비경구 조성물은 등장성이거나 실질적으로 등장성이어야 하며, 그렇지 않으면 투여 부위에 심한 자극과 통증이 일어날 수 있다.
바람직한 등장성은 염화나트륨, 또는 덱스트로스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜, 폴리올(예: 만니톨 및 소르비톨) 또는 다른 무기 또는 유기 용질과 같은 약제학적으로 허용되는 기타 제제를 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로, 당해 조성물은 대상의 혈액과 등장성이다.
경우에 따라, 메틸 셀룰로스와 같은 증점제를 사용하여 비경구 조성물을 농축시킬 수 있다. 당해 조성물은 유중수 또는 수중유의 유화 형태로 제조될 수 있다. 예컨대, 아카시아 분말, 비이온성 계면활성제 또는 이온성 계면활성제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 매우 다양한 유화제를 사용할 수 있다.
약제학적 조성물에 적합한 분산제 또는 현탁제를 첨가하는 것도 바람직할 수 있으며, 이들의 예는 합성 및 천연 검과 같은 수성 현탁제, 즉 트라가칸트, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함할 수 있다.
비경구 생성물에 대한 가장 중요한 비히클은 물이다. 비경구 투여에 적합한 품질의 물은 증류 또는 역삼투에 의해 제조되어야 한다. 이들 수단에 의해서만 물로부터 각종 액체, 기체 및 고체 오염 물질을 적절하게 분리시킬 수 있다. 주사용수는 본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기에 바람직한 수성 비히클이다. 물로부터 산소 또는 산소의 유리 라디칼을 제거하기 위하여 물을 질소 기체로 퍼징할 수 있다.
본 발명의 비경구 약제학적 조성물에는 기타의 성분들이 존재할 수 있다. 이러한 부가적 성분은 습윤제, 오일(예: 참깨유, 땅콩유 또는 올리브유와 같은 식물성 오일), 진통제, 유화제, 산화방지제, 벌크화제, 강장성 조절제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예: 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터 이온(예: 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 물론 이러한 부가적 성분들은 본 발명의 약제학적 조성물의 전체적 안정성에 악영향을 주지 않아야 한다.
용기도 주사 조성물의 통합된 부분이며 하나의 구성 요소로서 생각될 수 있는데, 이는 특히 액체가 수성인 경우에는 완전히 불용성이거나 수용된 액체에 어떻게든 영향을 주지 않는 용기는 없기 때문이다. 따라서, 특정한 주입용 용기는 용기의 조성, 용액의 조성, 및 용기가 사용되어질 치료를 고려하여 선택되어야 한다.
다수회용 용량 바이알에 피하주사용의 바늘을 삽입하고 바늘을 빼자마자 다시 밀봉시킬 수 있도록 각각의 바이알을 알루미늄 밴드로 적소에 유지시킨 고무 마개로 밀봉시킨다.
투여용 바이알을 위한 마개로는 웨스트(West) 4416/50, 4416/50(테플론이 대어져 있음) 및 4406/40, 애보트(Abbott) 5139와 같은 유리 바이알용 마개 또는 이와 등가인 마개를 사용할 수 있다. 이들 마개는 환자의 사용 양식을 이용하여 시험할 경우 마개의 완전성 시험을 통과하는데, 예를 들면 마개는 약 100회 이상의 주사에 견딜 수 있다.
상술된 약제학적 조성물의 각각의 성분들은 당업계에 공지되어 있고, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 제1권, 제2판, Avis 등, Ed., Mercel Dekker, New York, N. Y. 1992)에 기재되어 있다.
상기 조성물의 제조 방법은 배합, 멸균 여과 및 충전 단계를 포함한다. 배합 과정은, 예를 들면, 성분들을 특정한 순서로 용해시키거나(예컨대, 먼저 방부제, 이어서 안정화제/강장제, 완충제, 그 다음 산화방지성 화합물을 용해시킨다), 비경구 조성물을 형성하는 모든 성분들을 동시에 용해시키는 단계를 포함할 수 있다. 비경구 투여용 조성물의 제조 방법의 한 예는 산화방지성 화합물 형태, 예를 들면, 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2)을 물에 용해시키고, 생성된 혼합물을 포스페이트 완충 염수로 희석시킨다.
달리, 본 발명의 비경구 조성물은 다음과 같은 일반적으로 허용되는 방법에 따라 성분들을 혼합하여 제조한다. 예를 들면, 선택된 성분들을 배합기 또는 기타 표준 제조 장치를 사용하여 혼합시켜 농축 혼합물을 제조한 다음, 물, 증점제, 완충제, 5% 사람 혈청 알부민, 또는 강장성을 조절하기 위한 부가적 용질을 첨가하여 최종 농도 및 점도로 조절할 수 있다.
달리, 산화방지성 화합물은 용매를 사용하여 재구성되는 건조 고체 및/또는 분말로서 패킹하여 재구성시 사용하기 위한 본 발명에 따른 비경구 조성물을 생성할 수 있다.
추가로, 제조 방법은 본 발명의 비경구 조성물을 개발할 때 적합한 멸균 공정을 포함할 수 있다. 전형적인 멸균 공정은 여과, 증기(습식 가열), 건조 가열, 기체(예: 에틸렌 옥사이드, 포름알데히드, 이산화염소, 프로필렌 옥사이드, 베타-프로피오락톤, 오존, 클로로피크린, 퍼아세트산 메틸 브로마이드 등), 방사선 조사 및 방부 처리를 포함한다.
비경구 투여의 적합한 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 피하, 관절내, 경막내, 복강내 등을 포함한다. 정맥내 투여가 바람직하다. 점막 전달도 허용된다. 용량 및 투여 요법은 환자의 체중 및 건강 상태에 따라 달라질 것이다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 착화제 또는 첨가제는, 예컨대, 산화방지성 화합물의 안정성을 향상시키고 약제학적 조성물의 합성 또는 제형화를 용이하게 하고/하거나 산화방지성 화합물의 생체이용률을 향상시키도록 선택할 수 있다.
예컨대, 당업계에서 사이클로덱스트린 및 이의 유도체와 같은 담체 분자는 약물 분자의 물리화학적 특성을 변화시킬 수 있는 착화제로서의 가능성이 잘 알려져 있다. 예로서, 사이클로덱스트린은 함께 착화되어 활성제를 (열적 및 산화적으로) 안정화시키고 활성제의 휘발성을 감소시키며 활성제의 용해도를 변화시킬 수 있다. 사이클로덱스트린은 도넛형(toroidal) 구조를 형성하는 글루코피라노스 환 단위로 이루어진 사이클릭 분자이다. 사이클로덱스트린 분자의 내부는 소수성을 띠고 외부는 친수성을 띠어 사이클로덱스트린 분자를 수용성으로 만든다. 용해도는 사이클로덱스트린의 외부에 존재하는 하이드록실 그룹의 치환을 통해 변화될 수 있다. 마찬가지로 내부의 소수성도 치환을 통해 변화될 수 있으나, 내부의 소수성은 일반적으로 공동 내부에 비교적 소수성인 게스트(guest)가 축적되게 한다. 한 분자 내에 다른 분자가 축적되는 것은 착화로 알려져 있으며, 그 생성물을 내포 착물이라 부른다. 사이클로덱스트린 유도체의 예는 설포부틸사이클로덱스트린, 말토실사이클로덱스트린, 하이드록시프로필사이클로덱스트린 및 이의 염을 포함한다.
미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 내포 착물, 이러한 경우 β-사이클로덱스트린과 착화된 미토퀴논-C10을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조 방법이 본원에서 실시예 1 및 실시예 7에 기재된다. 바람직한 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 내포 착물인 β-사이클로덱스트린과 착화된 미토퀴논-C10 메실레이트를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조 방법이 실시예 9 및 실시예 10에 기재된다.
산화방지성 화합물-사이클로덱스트린 착물의 약제학적 특성을 포함한 물리화학적 특성은, 예컨대, 산화방지성 화합물과 사이클로덱스트린의 몰 비를 변화시키 거나 사이클로덱스트린 자체를 변화시켜서 조절할 수 있다. 예로서, 화학식 1의 바람직한 산화방지성 화합물에 대하여, 산화방지성 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비(산화방지성 화합물:사이클로덱스트린)는 약 10:1 내지 약 1:10, 약 5:1 내지 약 1:5, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2 또는 약 1:1일 수 있다. 추가의 예에서, 대표적 산화방지성 화합물인 미토퀴논-C10 대 사이클로덱스트린의 바람직한 몰 비는 1:2이고 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린이다.
달리, 산화방지성 화합물을 약제학적으로 적합한 형태로 제형화하여 산화방지성 화합물의 안정성과 생체이용률을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 정제에 장용 피를 도포하여 산화방지성 화합물이 위에서 방출되는 것을 막음으로써, 그렇지 못할 경우 위 환경에의 노출에 의해 분해될 수 있는 산화방지성 화합물의 안정성을 유지시키거나 불쾌한 부작용의 위험을 줄일 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 중합체는 대부분 수성 매질 중의 용해도가 pH-의존성이고 위 속의 통상적 pH보다 더 높은 pH를 갖는 조건을 필요로 한다는 사실하에 기능하는 폴리산이다.
조절 방출형 경구 구조물의 바람직한 한 형태는 고체 투여 제형의 장용피이다. 장용피는 위액에 노출되는 특정 기간 동안에는 화합물이 투여 제형 안에 물리적으로 혼입된 채 남아있도록 도와주며, 장액에서는 흡수를 위해 분해되도록 고안된다. 흡수의 지연율은 위장관을 통한 이동 속도에 의존하기 때문에 위 배출 속도는 중요한 인자이다. 일부의 투여에서는 과립과 같은 복합 단위 형태의 투여 제형이 단일 단위 형태보다 더 나을 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 산화방지성 화합물은 장용 피복된 복합 단위 투여 제형 안에 함유될 수 있다. 더욱 바람 직한 양태에서, 산화방지성 화합물 투여 제형은 산화방지성 화합물-장용 피복제 고체를 갖는 입자를 불활성 코어 재료 위에 생성함으로써 제조된다. 이들 과립은 산화방지성 화합물의 흡수를 지연시켜 양호한 생체이용률을 제공할 수 있다.
전형적인 장용 피복제는 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 메타크릴산-메타크릴산 에스테르 공중합체, 폴리비닐 아세테이트-프탈레이트 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 산화방지성 화합물 및/또는 이의 조성물 및/또는 착물의 예는 유리한 약제학적 특성을 나타낸다. 예를 들면, 이들은 쉽게 제형화될 수 있고 화학적 및 물리적으로 안정하며 물에 쉽게 용해되고 낮은 흡습성 및 양호한 저장 수명을 갖는다.
이하, 본 발명을 비제한적인 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1. 미토퀴논-C10의 합성
이하, 대표적인 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물인 미토퀴논-C10, 미토퀴논-C10 메실레이트, 및 이의 사이클로덱스트린 착물의 바람직하고 안정한 염 형태의 바람직한 합성 방법을 설명한다.
제1 과정
반응식:
Figure 112009073343553-pat00027
단계:
1. 이데베논(A1, 0.25kg, 0.74mol)을 반응 등급 DCM 2.5ℓ에 용해시킨 후, 혼합물을 불활성 대기 하에서 10±3℃로 냉각시킨다.
2. 트리에틸아민(0.152kg, 1.5mol)을 주위 온도에서 한번에 첨가하고 혼합물을 10±3℃로 다시 평형화한다.
3. DCM 0.5ℓ 중의 메탄설포닐 클로라이드(0.094kg, 0.82mol)의 용액을 내부 온도가 대략 10 내지 15℃로 유지되도록 하는 속도로 서서히 첨가한다(이 규모에서 첨가는 75분 후에 완료된다).
4. 반응 혼합물을 15 내지 30분간 더 교반한다.
5. TLC(Rf 0.65, 5% 에탄올/디클로로메탄)에 의해 완료를 IPC 확인한다.
6. 이어서, 혼합물을 물(0.85ℓ) 및 중탄산나트륨 포화 수용액(0.85ℓ)으로 세척한다.
7. 유기층을 40 내지 45℃에서 감압하에 증발시켜서 적색 액체를 수득한다. 주위 온도에서 높은 진공하에 2 내지 4시간 동안 더 건조시킨 후 조악한 A2를 수득 하고 이것을 다음 단계에 직접 사용한다. 수율은 용매가 액체 중에 포집되어 있어서 알지 못한다.
제2 과정
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Figure 112009073343553-pat00028
단계:
1. 이데베논 메실레이트(A2, 최종 단계로부터의 추정 수율 100%, 0.31kg, 0.74mol)를 메탄올 2ℓ에 용해시킨 후, 혼합물을 불활성 대기 하에서 0 내지 5℃로 냉각시킨다.
2. 수소화붕소나트륨(0.03kg, 0.79mol)을 내부 온도가 15℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 소량씩 첨가한다. 반응의 완료는 적색에서 황색으로의 색 변화를 동반할 것이다(이 규모에서 첨가는 20분 후에 완료된다).
3. 반응 혼합물을 10 내지 30분간 더 교반한다.
4. TLC(A3 Rf 0.60, 5% 에탄올/디클로로메탄, A2 Rf 0.65)에 의해 완료를 IPC 확인한다.
5. 이어서, 혼합물을 2M 염산 용액 2ℓ로 급냉시키고 디클로로메탄 1.2ℓ로 3회 추출한다.
6. 합한 유기상을 물 1.2ℓ로 1회 세척하고 무수 황산마그네슘(0.24kg)으로 건조시킨다.
7. 유기상을 40 내지 45℃에서 감압하에 증발시켜서 황색/갈색 시럽을 수득한다. 주위 온도에서 높은 진공하에 2 내지 8시간 동안 더 건조시킨 후 조악한 생성물 A3(0.304kg, 수율 98%)을 수득하고 이것을 다음 단계에 직접 사용한다.
제3 과정
반응식:
Figure 112009073343553-pat00029
단계:
1. 적당한 크기의 환저 플라스크에서 트리페닐포스핀 덩어리(0.383kg, 1.46mol)를 이데베놀 메실레이트(A3, 0.304kg, 0.73mol)에 첨가한다.
2. 플라스크를 회전 증발기에 부착시키고 내용물을 진공하에 80 내지 85℃의 욕 온도로 가열한다.
3. 혼합물은 이 온도에서 균질 용융물을 형성해야 한다. 용융물이 형성되고 탈기 작용이 더이상 분명하지 않으면, 진공을 불활성 대기로 바꾸고 혼합물을 80 내지 85℃로 설정된 욕에서 대략 3일 동안 부드럽게 교반한다.
4. 1H 및 31P NMR에 의해 완료를 IPC 확인한다. 후처리를 수행할 수 있기까지는 최소 95%의 전환율이 필요하다.
5. 이어서, 혼합물을 거의 실온으로 냉각시키고 디클로로메탄 0.8ℓ에 용해시킨다.
6. 에틸 아세테이트 3.2ℓ를 서서히 승온시키면서 소량씩 첨가하여 과량의 트리페닐포스핀으로부터 목적 생성물을 침전시킨다.
7. 적은 용적의 용매를 감압하에(DCM 제거용) 증발시켜서 제거한 후 남은 혼합물을 거의 주위 온도로 냉각시키고 웃물을 따라낸다.
8. 남은 시럽상 잔류물을 동일한 방법으로 2회 더 세척하고 마지막으로 높은 진공에서 일정 중량까지 건조시켜서 황갈색 발포체(0.441kg, 수율 89%)를 수득한다(주의: 생성물은 여전히 약간의 용매를 함유한다. nmr 참조). 이렇게 얻은 A4를 다음 단계에 직접 사용한다.
제4 과정
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Figure 112009073343553-pat00030
단계:
1. 조악한 미토퀴놀 메실레이트 염(0.44kg, 약 0.65mol)을 무수 DCM 6ℓ에 용해시키고 플라스크를 산소로 퍼징한다.
2. 플라스크 내용물을 산소 대기하에서 30분간 격렬하게 교반하여 용매가 기체로 포화되도록 한다.
3. 무수 DCM(NO2 2mol%) 중의 0.65M NO2의 용액 0.1ℓ를 한꺼번에 신속하게 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서 산소 대기하에 4 내지 8시간 동안 격렬하게 교반한다.
4. (1H NMR 및 임의로 31P NMR에 의해) 완료를 IPC 확인한다.
5. 산화가 완료되지 않았으면 DCM 중의 용액으로서 NO2 2mol%를 더 첨가한다. 이것은 반응을 완료시킬 것이다. 상기와 같이 IPC 확인한다. 이 규모에서는 반응을 완료시키는 데에 DCM 중의 용액으로서 NO2 8mol%가 필요하다.
6. 이어서, 용매를 감압하에 증발 제거시켜 적색의 시럽상 잔류물을 수득한다. 이 잔류물을 40 내지 45℃에서 디클로로메탄 2ℓ에 용해시킨다.
7. 에틸 아세테이트 3.2ℓ를 서서히 승온시키면서 소량씩 첨가하여 목적 생성물을 침전시킨다. 적은 용적의 용매를 감압하에(DCM 제거용) 증발시켜서 제거한 후 남은 혼합물을 거의 주위 온도로 냉각시키고 웃물을 따라낸다.
8. 마지막으로 오일상 잔류물을 높은 진공하에 일정 중량까지 건조시켜 적색 유리(419g, 수율 94%)를 수득한다. 이렇게 얻은 A5를 다음 단계에 직접 사용한다.
제5 과정
반응식:
Figure 112009073343553-pat00031
단계:
1. 조악한 미토퀴논 메실레이트 염(A5, 0.419kg)을 40 내지 43℃에서 적당하게 가열하면서 물 6ℓ에 용해시킨다.
2. 베타-사이클로덱스트린 1.24kg을 60℃에서 가열하면서 별도로 물 20ℓ에 용해시킨다.
3. 이들 두 용액을 대략 실온으로 냉각시키고 합하여 균질 혼합물을 형성한다. 이 용액은 5℃ 미만에서 보관해야 한다.
4. 이어서, 상기 오렌지색 용액을 -20℃로 냉동시키고 일정 중량까지 배치식으로 동결 건조시킨다(48시간 이상).
5. 생성된 고체를 부드럽게 분쇄하여 균일한 자유 유동성 황색/오렌지색 분말(1.433kg)을 형성한다.
상술된 합성 방법에서 제4 과정의 산화 단계 3이 용액을 통해 산소를 버블링함으로써 달성되는 별도의 합성 방법이 수행되었는데, 이는 산화 반응이 N2O를 사용 한 산화 이외의 산화 수단에 의해 거의 완료 상태까지 진행되어질 수 있음을 나타낸다.
실시예 2. 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 합성
미토퀴논-C3, 미토퀴논-C5 및 미토퀴논-C15의 화학적 합성을 도 2에 요약하고 아래에 설명한다. 핵 자기 공명 스펙트럼은 바리안(Varian) 300MHz 장치를 사용하여 수득했다. 1H-NMR에 대하여 CDCl3 중의 내부 표준은 테트라메틸실란이었다. 31P NMR에 대하여 외부 표준은 85% 인산이었다. 화학적 이동(δ)은 표준에 대한 ppm이다. 원소 분석은 오타고(Otago) 대학의 캠벨 미량분석 실험실(Campbell Microanalytical Laboratory)에서 수행했다. 전자 분사 질량 분석법은 시마즈(Shimadzu) LCMS-QP800X 액체 크로마토그래피 질량 분석계를 사용하여 수행했다. 저장 용액은 무수 메탄올 중에서 제조했고 -20℃의 암실에서 보관했다.
미토퀴논-C3(6).
미토퀴논-C3의 합성 경로는 도 2A에 기재한다. 출발 물질인 2,3,4,5-테트라메톡시톨루엔(1)(참조: Lipshutz, B. H., Kim, S. -k., Mollard, P. 및 Stevens, K. L. (1998) Tetrahedron 54, 1241-1253)은 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논(CoQ0)을 하이드로퀴놀로 환원시킨 후(참조: Carpino, L. A., Triolo, S. A. 및 Berglund, R. A.(1989) J. Org. Chem. 54, 3303-3310) 메틸화하여 화합물 1을 수득하는 방법으로 제조한다(참조: Lipshutz, B. H., Kim, S. -k., Mollard, P. 및 Stevens, K. L. (1998) Tetrahedron 54, 1241-1253). 무수 헥산(80㎖) 중의 화합물 1(6.35g, 29.9mmol)의 용액 및 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(8.6㎖)을 질소하에서 불꽃 건조식 교반기 바아가 달린 불꽃 건조식 슐렌크(Schlenk) 관에 넣는다. n-부틸 리튬의 헥산 용액(1.6M, 26.2㎖)을 실온에서 서서히 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 냉각 및 교반시킨다. -78℃로 냉각시킨 후 무수 테트라하이드로푸란(THF, 250㎖)을 첨가하고, 반응 혼합물 소량을 제거하고 D2O로 급냉시킨 후 1H NMR로 조사하여 금속화의 완료를 확인한다. 그런 다음, 황색 현탁액을 -78℃에서 질소하에 CuCN(0.54g, 6.03mmol)을 함유한 제2의 불꽃 건조식 슐렌크 관에 옮겨 넣는다. 혼합물을 10분간 0℃로 승온시킨 후 -78℃로 냉각시키고, 알릴 브로마이드(3.62㎖)를 첨가하고 반응물을 밤새(19시간) 교반한 후 실온으로 승온시킨다. 반응물을 10% NH4Cl 수용액(75㎖)으로 급냉시키고 에테르(2×200㎖)로 추출한다. 합한 에테르성 추출물을 H20(2×150㎖), 10% NH40H 수용액(200㎖) 및 NaCl 포화된 수용액(200㎖)으로 세척한다. 유기 용매를 MgSO4로 건조시키고 여과한 후 진공 중에서 회전 증발기로 용매를 제거하여 조악한 생성물(7.25g)을 수득한다. 20% 에테르/헥산으로 용출시키면서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 순수한 1,2,3,4-테트라메톡시-5-메틸-6-(2-프로페닐)벤젠(2)(6.05g, 83.5%)을 수득한다(참조: Yoshioka, T., Nishi, T., Kanai, T., Aizawa, Y., Wada, K., Fujita, T. 및 Horikoshi, H. (1993), 유럽 특허 출원 제EP 549366 A1호).
Figure 112009073343553-pat00032
무수 THF(45㎖) 중의 화합물 2(8.0g, 33.05mmol)의 용액을 25℃에서 아르곤하에 THF 중의 9-보라비사이클로[3,3,1]노난의 교반된 현탁액(79㎖, 39.67mmol, 0.5M)에 20분에 걸쳐 적가한다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반하고 65℃에서 아르곤하에 2시간 동안 더 교반한다. 그런 다음 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 3M NaOH(53㎖), 이어서 30% H202 수용액(53㎖)을 적가한다. 실온에서 30분간 교반한 후 수상을 NaCl로 포화시키고 THF로 3회 추출한다. 합한 유기 분획물을 NaCl 포화 수용액으로 세척하고 건조시키고(Na2S04) 여과한 후 증발시켜서 얻은 오일상 잔류물(11.5g)을 실리카 겔(200g, 에테르/헥산 1:9로 충전) 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제한다. 에테르/헥산 1:4로 용출시켜 순수한 3-(2,3,4,5-테트라메톡시-6-메틸-페닐)-프로판-1-올(3)을 무색의 점성 오일(6.85g, 80%)로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00033
CH2Cl2(50㎖) 중의 화합물 3(3.88g, 15mmol) 및 트리에틸아민(3.0g, 30mmol, 4.2㎖)의 용액을 실온에서 10분간 교반한다. CH2Cl2(50㎖) 중의 메탄설포닐 클로라이드(1.8g, 1.20㎖, 15.75mmol)를 20분에 걸쳐 적가하고 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한다. 그런 다음 혼합물을 CH2Cl2(50㎖)로 희석시키고 유기층을 H2O(5×100㎖) 및 10% NaHC03 수용액(100㎖)으로 세척하고 건조시키고(MgSO4) 여과한 후 용매를 진공 중에서 회전 증발로 제거하여 1-(3-메탄설포닐옥시프로필)-2-메틸-3,4,5,6-테트라메톡시벤젠(4)을 액체(4.8g, 95%)로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00034
조악한 메탄설포네이트 4(3.30g, 9.8mmol)를 키맥스(Kimax) 관에서 트리페닐포스핀(4.08g, 15.6mmol) 및 NaI(7.78g, 51.9mmol)의 새롭게 분쇄된 혼합물과 혼합시켜서 후속 반응에 직접 사용한다. 그런 다음 혼합물을 자기 교반하면서 70 내지 74℃에서 3시간 동안 유지시키고, 이 때 혼합물은 용융된 진한 액체로부터 유리질의 고체로 변한다. 관을 실온으로 냉각시키고 잔류물을 CH2Cl2(30㎖)와 함께 교반한다. 그런 다음 현탁액을 여과하고 여액을 진공 증발시킨다. 잔류물을 최소량의 CH2Cl2에 용해시키고 과량의 에테르(250㎖)로 연마시켜서 백색 고체를 침전시킨다. 고체를 여과하고 에테르로 세척한 후 진공 건조시켜서 순수한 [3-(2,3,4,5-테트라메톡시-6-메틸-페닐)-프로필]트리페닐포스포늄 요오다이드(5)(5.69g, 90%)를 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00035
CH2Cl2(80㎖) 중의 요오다이드 형태의 화합물 5(4.963g, 7.8mmol)의 용액을 분리 깔대기에서 5분간 10% NaNO3 수용액(50㎖)과 함께 진탕시킨다. 유기층을 분리하고 건조시키고(Na2SO4) 여과한 후 진공 증발시켜서 화합물 5의 니트레이트 염(4.5g, 7.8mmol, 100%)을 수득하고, 이것을 CH3CN 및 H20의 혼합물(7:3, 38㎖)에 용해시키고 0℃의 빙욕에서 교반한다. 피리딘-2,6-디카복실산(6.4g, 39mmol)을 첨가한 후 CH3CN/H2O(1:1, 77㎖) 중의 질산암모늄세륨(21.0g, 39mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 적가한다. 반응 혼합물을 0℃에서 20분간 교반한 후 실온에서 10분간 더 교반한다. 그런 다음 반응 혼합물을 H20(200㎖)에 붓고 CH2Cl2(200㎖)로 추출하고 건조시키고(Na2S04) 여과한 후 진공 증발시켜서 조악한 [3-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-사이클로헥사디엔-1-일)프로필]트리페닐포스포늄(6) 니트레이트를 수득한다. 전체 생성물을 CH2Cl2(100㎖)에 용해시키고 20% KBr 수용액(50㎖)과 함께 10분간 진탕시킨다. 유기층을 분리하고 건조시키고 진공 증발시켜서 브로마이드 염(6)(4.1g, 93.6%)을 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00036
CH2Cl2(75㎖) 중의 브로마이드 6(3.65g, 6.5mmol)의 용액을 분리 깔대기에서 10% w/v 나트륨 메탄설포네이트 수용액(100㎖)과 함께 5분간 진탕시킨다. CH2Cl2 층을 분리하고 건조시키고(Na2S04) 여과한 후 진공 증발시켜서 [3-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-사이클로헥사디엔-1-일)프로필]트리페닐포스포늄 메탄설포네이트 염(6)(3.7g, 98%)을 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00037
미토퀴논-C5(14).
미토퀴논-C5의 합성 경로는 도 2B에 기재한다. 디하이드로피란(46.83g, 0.55mol)을 아세트산(500㎖)에 용해된 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조하이드로퀴논(CoQ0)(50g, 0.275mol)에 첨가하고 실온에서 10분간 교반한다. 이 용액에 BF3ㆍEt20(38.57g, 0.271mol)를 첨가한다. 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반한다. 이 후 조악한 반응 혼합물을 빙수(500㎖)에 붓고 클로로포름(1,000㎖)으로 추출한다. 유기 추출물을 염수(500㎖)로 세척하고 건조시킨다(MgS04). 용매를 진공 제거하여 조악한 2,3-디메톡시-5-메틸-6-(테트라하이드로-피란-2-일)-4-(테트라하이드로-피란-2-일옥시)-페놀(7)을 적색 오일(115g)로서 수득하고 이것을 더 정제하지 않고서 사용한다. 아세트산/과염소산 혼합물(97.5:2.5, 500㎖) 중의 조악한 화합물 7(110g)의 용액을 실온에서 대기 압력하에 5% 팔라듐/목탄(5.42g)을 사용하여 수소 흡수가 멈출 때까지(3일) 수소화한다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 고체 잔류물을 에탄올(500㎖)로 세척한다. 합한 여액을 동일하게 삼등분한 후 각각의 부분을 증류수(1,000㎖)에 첨가하고 CH2Cl2(2×200㎖)로 추출한다. 합한 유기 추출물을 염수(500㎖), 중탄산나트륨 포화 용액(500㎖) 및 염수(300㎖)로 세척한 후 건조시킨다(MgS04). 이어서, 혼합물을 여과하고 용매를 진공 제거하여 조악한 4-아세톡시-3-(5-아세톡시-펜틸)-5,6-디메톡시-2-메틸-페닐 아세테이트(8)를 적색 오일(110g)로서 수득하고 이것을 더 정제하지 않고서 다음 단계에 사용한다.
Figure 112009073343553-pat00038
자기 교반기와 환류 응축기가 달려 있고 실온의 수조로 둘러싸인 1ℓ들이 환저 플라스크 안에서 수소화리튬알루미늄(8.0g, 0.21mol)을 무수 THF(500㎖)에 첨가한다. 새롭게 증류된 무수 THF(100㎖) 중의 조악한 화합물 8(74g)의 용액을 THF/LiAlH4 혼합물에 25 내지 30분에 걸쳐 적가한다. 교반을 용이하게 하기 위해 건조 THF(200㎖)를 더 첨가하고 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반시킨다. 그런 다음 3M HCl(20㎖)을 적가하여 반응물을 급냉시킨 후 증류수(70㎖)를 서서히 첨가한다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 염수(2×300㎖)로 세척하고 건조시키고(MgS04) 여과한 후 용매를 진공 제거한다. 여과 깔대기에 남은 녹색 잔류물을 15% HCl(500㎖)에 용해시키고 CH2Cl2(1×300㎖, 2×200㎖)로 추출한다. 유기 분획물을 합하고 염수(400㎖)로 세척하고 건조시키고(MgS04) 여과한 후 진공 증발시킨다. 이 추출물을 여액을 후처리하여 얻은 물질과 합하여 조악한 2-(5-하이드록시펜틸)-5,6-디메톡시-3-메틸-벤젠-1,4-디올(9)(68.3g)을 적색 오일로서 수득한다. 이 생성물(9)을 실리카 겔(600g, 10% 에테르/CH2Cl2로 충전) 상에서 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제한다. 10% 에테르/CH2Cl2로 용출시켜서 약간의 미반응 화합물 8 및 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조하이드로퀴논 출발 물질을 수득한다. 20% 에테르/CH2Cl2로 용출시켜서 화합물 9와 퀴논 10의 혼합물(14.14g, 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴놀로부터의 수율 19%)을 수득한다. 화합물 9는 공기 중에 방치시 퀴논 10으로 서서히 전환되어 만족스러운 원소 분석치를 얻을 수 없었다.
Figure 112009073343553-pat00039
CH2Cl2(150㎖) 중의 퀴놀 9(7.5g, 27.7mmol)의 용액을 대기 압력에서 산소 기체로 포화시키고 CH2Cl2 중의 NO2 용액(1㎖, 1.32M)을 첨가한다. 반응물을 실온에서 산소 대기하에 18시간 동안 교반하고, TLC(40% 에테르/CH2Cl2)에 의해 퀴논 2-(5-하이드록시펜틸)-5,6-디메톡시-3-메틸-[1,4]벤조퀴논(10)의 형성이 완료되었음을 확인한다. 그런 다음 용매를 진공 제거하여 생성물 10(7.40g)을 적색 오일로서 수득한다(참조: Yu, C. A. 및 Yu, L. (1982), Biochemistry 21, 4096-4101).
Figure 112009073343553-pat00040
CH2Cl2(150㎖) 및 트리에틸아민(5.46g, 5.46mmol) 중의 화합물 10(7.40g, 27.3mmol)의 용액을 제조하고, CH2Cl2(50㎖) 중의 메탄설포닐 클로라이드(2.48g, 30mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 교반하면서 첨가한다. 실온에서 1.5시간 동안 더 교반한 후 반응 혼합물을 증류수(5×100㎖) 및 중탄산나트륨 포화 용액(150㎖)으로 세척하고 건조시킨다(MgS04). 혼합물을 여과하고 용매를 진공 제거하여 조악한 메탄설포네이트(9.03g)를 적색 오일로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00041
메탄설포네이트를 아세톤(100㎖) 중의 10% (w/v) NaI에 용해시키고 실온에서 44시간 동안 교반한다. 혼합물을 진공 농축시키고 잔류물에 H2O(100㎖)를 첨가한 다. 혼합물을 CH2Cl2(3×70㎖)로 추출하고, 합한 유기 추출물을 염수로 세척하고 건조시키고(MgSO4) 여과한 후 용매를 진공 제거하여 조악한 2-(5-요오도펜틸)-5,6-디메톡시-3-메틸-[1,4]벤조퀴논(11)을 수득한다. 이 생성물을 실리카 겔(150g) 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제한다. CH2Cl2 및 10% 에테르/CH2Cl2로 용출시켜 순수한 화합물 11(7.05g, 69%)을 적색 오일로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00042
메탄올(20㎖) 중의 화합물 11(1.14g, 2.87mmol)의 용액을 NaBH4(0.16g, 4.3mmol)로 처리하면, 혼합물은 1분 이내에 무색으로 변한다. 실온에서 5분 후 5% HCl 수용액(100㎖)을 첨가하고 용액을 CH2Cl2(2×50㎖)로 추출한다. 유기 분획물을 합하고 건조시키고(MgSO4) 여과한 후 용매를 진공 제거하여 화합물 12(1.15g, 100%)를 산소 민감성 황색 오일로서 수득하고 이것을 즉시 사용한다.
Figure 112009073343553-pat00043
화합물 12(1.15g, 2.87mmol) 및 트리페닐포스핀(1.2g, 4.31mmol)의 혼합물을 교반 막대가 달린 키맥스 관에 넣는다. 관을 아르곤으로 플러싱하고 단단히 밀폐 시킨 후 14시간 동안 70℃로 가열 교반한다. 형성된 짙은 고체를 CH2Cl2(10㎖)에 용해시키고 에테르(200㎖)로 연마시키고 형성된 백색 침전물을 신속하게 여과한다. 공기에 노출시 점성을 띠게 되는 침전물을 CH2Cl2에 다시 용해시키고 진공 증발시켜서 조악한 생성물 [5-(2,5-디하이드록시-3,4-디메톡시-6-메틸-페닐)-펜틸]트리페닐포스포늄 요오다이드(13)(2.07g, 115%)를 갈색 오일로서 수득한다. 이 물질은 장기간 보관하기에 안정하지 못하며, 가능한 한 신속하게 후속 반응에 사용한다.
Figure 112009073343553-pat00044
CH2Cl2(50㎖) 중의 화합물 13(2.07g)의 용액을 산소 기체로 포화시키고 CH2Cl2 중의 NO2(0.5㎖, 1.32M)의 용액을 첨가한다. 반응물을 실온에서 산소 대기하에 18시간 동안 교반한다. 용매를 진공 제거하여 조악한 생성물 [5-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-사이클로헥사디엔-1-일)펜틸]트리페닐포스포늄 요오다이드(14)를 적색 오일로서 수득한다. 이 잔류물을 CH2Cl2(10㎖)에 재용해시키고 에테르(200㎖)로 연마시켜서 초기의 황색 침전물을 수득한다. 이것은 수 분 이내에 적색 오일로 응고된다. 용매를 따라내고 침전물을 CH2Cl2에 용해시키고 용매를 진공 제거하여 생성물 14(1.866g)를 적색 오일로서 수득한다. 생성물 14의 분취량(0.880g)을 실리카 겔(20g) 상의 칼럼 크로마토그래피로 정제한다. CH2Cl2로 용 출시켜서 확인되지 않은 자주색 물질을 일부 수득한다. 5% 에탄올/ CH2Cl2로 용출시켜서 순수한 요오다이드 생성물 14(0.606g)를 적색 오일로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00045
미토퀴논-C15(16).
미토퀴논-C15의 합성 경로는 도 2C에 기재한다. H2O(25㎖) 중의 K2S208(0.450g, 1.66mmol)의 용액을 75℃로 유지되는 H2O:CH3CN(1:1, 36㎖) 중의 AgN03(0.262g, 1.54mmol), 16-하이드록시헥사데칸산(0.408g, 1.50mmol) 및 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논(0.271g, 1.49mmol)의 교반된 현탁액에 2.5시간에 걸쳐 적가한다. 30분간 교반한 후 혼합물을 냉각시키고 에테르(4×30㎖)로 추출한다. 합한 유기상을 H20(2×100㎖), NaHCO3(1M, 2×50㎖) 및 NaCl 포화 용액(2×50㎖)으로 세척한다. 유기상을 건조시키고(Na2S04) 여과한 후 진공 농축시켜서 적색 오일(0.444g)을 수득한다. 조악한 오일을 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔, 15g)하고 CH2Cl2 및 에테르 혼합물(0%, 5%, 20%)로 용출시켜서 2-(15-하이드록시펜타데실)-5,6-디메톡시-3-메틸-[1,4]벤조퀴논(15)(0.192g, 33%)을 적색 오일로서 수득한다.
Figure 112009073343553-pat00046
트리페닐포스핀(0.066g, 0.25mmol), Ph3PHBr(0.086g, 0.25mmol) 및 화합물 15(0.1O1g, 0.25mmol)의 혼합물을 70℃의 밀폐된 키맥스 관에서 아르곤하에 24시간 동안 교반하고, 이 때 혼합물은 점성의 적색 오일로 변한다. 잔류물을 최소량의 CH2Cl2(0.5㎖)에 용해시키고 에테르(10㎖)에 부어서 적색 오일성 침전물을 수득한다. 용매를 따라내고 잔류물을 CH30H(0.5㎖)에 용해시킨 후 48% HBr(1적)을 함유한 H20(10㎖)로 희석시킨다. 적색 침전물이 형성되며 침전물을 가라앉힌 후 상청액을 따라 버리고 잔류물을 H2O(5㎖)로 세척한다. 잔류물을 에탄올(5㎖)에 용해시키고 용매를 진공 제거한다. 잔류물을 CH2Cl2(0.5㎖)에 재용해시키고 에테르(5㎖)로 희석하고 용매를 따라낸 후 잔류물을 24시간 동안 진공계(0.1mbar)에 넣어서 [15-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소-1,4-사이클로헥사디엔-1-일)펜타데실]트리페닐포스포늄 브로마이드(16)(0.111g, 61%)를 황색 발포체로서 수득한다. 이것은 공기와 접촉시 적색 오일로 변한다.
Figure 112009073343553-pat00047
전자분사 질량 분석 측정치(M+) 653, C42H54O4P+에 대한 계산치 653. 연소 분석 결과는 일정하지 않는 용매 함유 정도로 인해 만족스럽지 않았다.
실시예 3. 대표적인 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 특성
본 발명은 다양한 응용 분야, 예컨대, 정제와 같은 투여 제형의 제형화에 적합하기 위해서는 결정성 또는 고체 형태의 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물을 형성하는 것이 유리하다고 인식한다. 마찬가지로 어떠한 이론에도 구애되지 않길 바라면서 본 발명의 화합물의 산화방지제 기능성은 적어도 부분적으로는 이들의 물리화학적 특성에 의해 결정된다고 믿는다.
다양한 산화방지성 화합물의 분배 계수를 표 1에 기재한다. 옥탄-1-올/PBS(포스페이트 완충 염수) 분배 계수는 화합물 400nmol을 PBS-포화된 옥탄-1-올 2㎖에 첨가하고 옥탄-1-올 포화된 PBS 2㎖와 함께 37℃에서 30분간 혼합함으로써 측정된다. 2개의 상에서의 화합물 농도를 268㎚에서의 UV 흡수에 의해 측정하고 옥탄-1-올 포화된 PBS 또는 PBS-포화된 옥탄-1-올에서의 화합물의 표준 곡선으로부터 정량화한다(참조: Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteus, W. K., Ledgerwood, E. C., Smith, R. A. J., 및 Murphy, M. P., 2001, J Biol Chem 276, 4588; Smith, R. A. J., Porteous, C. M., Coulter, C. V., 및 Murphy, M. P. 1999, Eur J Biochem 263, 709). 무수 에탄올 중에서 사용하여 화합물의 저장 용액을 제조하고 -20℃의 암실에서 보관한다. [3H]TPMP는 American Radiolabelled Chemicals Inc.(MO, USA)로부터 수득한다.
산화방지성 잔기와 포스포늄을 브릿지 결합하는 탄소원자의 수가 적은 화합물이 낮은 분배 계수를 가짐에 주목한다. 예를 들면, 3개의 탄소 브릿지를 갖는 미토퀴논-C3으로 불리우는 본 발명의 화합물은 미토퀴논-C10인 관련 화합물에서 관찰되는 분배 계수보다 대략 50배 낮은 분배 계수를 갖는다(표 1).
Figure 112009073343553-pat00048
데이타a-c는 상술한 바와 같이 25℃ 또는 37℃에서 측정된 옥탄-1-올/포스페이트 완충 염수 분배 계수, 또는 ACD(Advanced Chemistry Development) 소프트웨어 솔라리스(Solaris) V4.67을 사용하여 산출한 옥탄올/물 분배 계수d(참조: Jauslin, M. L., Wirth, T., Meier, T. 및 Schoumacher, F., 2002, Hum Mol Genet 11, 3055)이다.
a Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteus, W. K., Ledgerwood, E. C., Smith, R. A. J., 및 Murphy, M. P., 2001, J Biol Chem 276, 4588.
b Smith, R. A. J., Porteous, C. M., Coulter, C. V., 및 Murphy, M. P. 1999, Eur J Biochem 263, 709.
c Smith, R. A. J., Porteous, C. M., Gane, A. M., 및 Murphy, M. P. 2003, Proc Nat Acad Sci 100, 9, 5407.
이들의 옥탄-1-올/PBS 분배 계수로부터 미토퀴논-C3, 미토퀴논-C5, 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C15는 광범위한 소수성에 걸쳐져 있다는 사실이 분명하다. 미토퀴논-C3의 계수는 비교적 수용성인 단일 TPMP 양이온과 유사한 반면, 미토퀴논-C15의 계수는 미토퀴논-C15가 매우 낮은 수용성을 가짐을 표시한다. 미토퀴논과 같은 알킬트리페닐포스포늄 양이온은 카복실산 그룹의 수준에서 양이온을 갖는 인지질 이중층 위에 흡착되지만 소수성 알킬 그룹은 막의 소수성 중심부 안으로 침투한다고 한다. 메틸렌 브릿지가 길수록 산화방지제 유비퀴놀이 막의 소수성 중심부 안으로 더 깊이 침투한다고 믿어진다. 한 겹의 막 안으로의 최대 침투도는 도 3에 예시된 화합물들에 대해 일어날 것으로 믿는다(도 3은 전형적인 인지질과 함께 배열된 미토퀴논 변형체들을 보여준다). 이 도면은 미토퀴논-C3의 유비퀴놀 잔기는 단지 막 표면에 가깝게 침투되는 반면 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C15의 유비퀴놀 잔기는 인지질 이중층의 중심부에 가깝게 침투됨을 보여준다.
본 발명자들은 여러 가지 소수성 및 인지질 이중층으로의 침투 깊이를 갖는 일련의 산화방지성 화합물을 합성하였다.
실시예 4. 미토콘드리아에 의한 미토콘드리아 표적화 화합물의 흡수
미토콘드리아 표적화의 유효성을 증명하기 위하여, 대표적인 산화방지 화합물인 미토퀴논-C3, 미토퀴논-C5, 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C15의 막 전위에 반응하여 일어나는 미토콘드리아에 의한 흡수를 측정한다.
전위 발생된 미토콘드리아에 의해 일어나는 산화방지성 화합물의 흡수를 측정하기 위하여 이온-선택적 전극을 구성한다(참조: Smith, R. A., Kelso, G. F., James, A. M. 및 Murphy, M. P. (2004) Meth. Enzymol. 382, 45-67; Davey, G. P., Tipton, K. F. 및 Murphy, M. P. (1992) Biochem. J. 288, 439-443; Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R. 및 Kobatake, Y. (1979) J. Membr. Biol. 49, 105-121). 이 전극과 Ag/AgCl 기준 전극을 기질의 첨가를 위한 주입 포트가 달린, 30℃에서 교반 및 자동 온도 조절되는 3㎖들이 배양 챔버의 퍼스펙스(Perspex) 밀폐 뚜껑을 통하여 삽입한다. 산화방지성 화합물 흡수를 측정하기 위하여, 래트의 간 미토콘드리아(1mg 단백질/㎖)를 30℃에서 KCl 배지(120 mM KCl, 10mM HEPES, pH 7.2, 1mM EGTA) 및 니게리신(1㎍/㎖) 및 로테논(8㎍/㎖) 중에 배양한다. 지시된 곳에 석시네이트(10mM) 및 FCCP(500nM)를 첨가한다. 이온-선택적 전극의 출력값을 프론트엔드(front-end) pH 증폭기를 통하여 파워랩(PowerLab) 데이타 수집 장치에 통과시키고 챠트(Chart) 소프트웨어를 사용하여 분석한다(모두 AD Instruments사 제품).
래트의 간 미토콘드리아를, 균질화한 후 250mM 수크로스, 5mM Tris-HCl, 1mM EGTA, pH 7.4를 함유한 빙냉 완충제 중에서 시차 원심분리하여 제조한다(참조: Chappell, J. B. 및 Hansford, R. G. (1972): Subcellular components: preparation and fractionation, 제77-91쪽(Birnie, G. D. 편저) Butterworths, London). 단백질 농도는 표준물로서 BSA를 사용하여 뷰렛 분석에 의해 측정한다(참조: Gomall, A. G., Bardawill, C. J. 및 David, M. M. (1949) J. Biol. Chem. 177, 751-766). 미토콘드리아 막 전위는 25℃에서 KCl 배지(120mM KCl, 10mM HEPES, pH 7.2, 1mM EGTA)에 현탁시킨 미토콘드리아에 50nCi [3H]TPMP로 보강된 500nM TPMP를 첨가함으로써 측정한다(참조: Brand, M. D. (1995): Bioenergetics - a practical approach, 제39-62쪽 (Brown, G. C. 및 Cooper, C. E. 편저) IRL, Oxford). 배양 후, 미토콘드리아를 원심분리에 의해 펠릿화하고 상청액과 펠릿 내의 [3H]TPMP의 양을 섬광 계수에 의해 정량화하고, 미토콘드리아 용적을 0.5㎕/㎎ 미토콘드리아 단백질, 및 TPMP 결합 교정치를 0.4로 하여 막 전위를 산출한다(참조: Brown, G. C. 및 Brand, M. D. (1985) Biochem. J. 225, 399-405).
본 발명자들은 정상 상태의 농도를 측정하기 위하여 이온-선택적 전극을 구성한다(참조: Smith, R. A., Kelso, G. F., James, A. M. 및 Murphy, M. P. (2004) Meth. Enzymol. 382, 45-67; Davey, G. P., Tipton, K. F. 및 Murphy, M. P. (1992) Biochem. J. 288, 439-443; Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R. 및 Kobatake, Y. (1979) J. Membr. Biol. 49, 105-121). TPMP와 같은 단일 트리페닐포스포늄 양이온에 대한 이들 전극의 반응은 log10[양이온 농도]에 대한 전극 전압의 선형 반응 및 30℃에서 약 60mV의 기울기를 갖는 네른스트적이다(Nernst)(참조: Davey, G. P., Tipton, K. F. 및 Murphy, M. P. (1992) Biochem. J. 288, 439-443; Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R. 및 Kobatake, Y. (1979) J. Membr. Biol. 49, 105-121). 가장 친수성인 화합물인 미토퀴논-C3도 10μM 이상의 농도에서 60mV에 가까운 기울기를 갖는 네른스트적 전극 반응을 나타낸다. 이것은 도 4A의 오른쪽에, 미토콘드리아 부재하에 1pM 미토퀴논-C3의 순차적 첨가에 대한 대수적 전극 반응으로 나타난다. 미토퀴논-C5, 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C15에서도 전극은 미토콘드리아 부재하에 순차적 첨가에 대해 신속하고 안정하게 반응한다(각각 도 4B, 4C 및 4D의 오른쪽 부분). 그러나, 이 경우 전극 반응은 네른스트적이지 않고, 본 발명자들은 이들 화합물의 큰 소수성 때문이라 믿는다. 그렇다고 하더라도, 네 가지의 모든 산화방지성 화합물에 대하여, 이온-선택적 전극은 화합물의 유리 농도의 측정을 가능케 하고 따라서, 미토콘드리아에 의한 실시간 흡수의 측정이 가능하다.
산화방지성 화합물 흡수를 측정하기 위해, 로테논의 존재하에 미토콘드리아를 전극 챔버에 첨가하여 막 전위의 형성을 막는다(도 4의 왼쪽). 그런 다음 전극 반응을 보정하기 위하여 1μM 산화방지성 화합물을 5회 순차적으로 첨가한 후, 막 전위를 발생시키기 위하여 호흡 기질 석시네이트를 첨가한다. 미토콘드리아 전위 발생은 모든 산화방지성 화합물 변형물의 미토콘드리아에 의한 신속한 흡수를 일으키고, 후속적인 탈결합제 FCCP의 첨가는 막 전위를 소멸시키며 미토콘드리아로부터의 그의 신속한 방출을 일으킨다(도 4A 내지 4D, 왼쪽). 이들 실험은 미토퀴논-C3, 미토퀴논-C5 및 미토퀴논-C10의 흡수가 미토콘드리아 막 전위에 의존한다는 사실을 명백하게 보여준다. 미토퀴논-C15도 막 전위의 유도시에 미토콘드리아에 의해 흡수되지만 미토콘드리아 존재하의 미토퀴논-C15에 대한 전극 반응은 더 미약하고 노이즈가 많으며 이동하기 쉬운 경향을 갖는다. 이것은 미토콘드리아 부재하의 미토퀴논-C15에 대한 전극 반응(오른쪽 부분 참조)과 대조되며 미토콘드리아 존재하의 그의 낮은 유리 농도에 기인한다.
이어서, 산화방지성 화합물의 전위 차단된 미토콘드리아에 결합되는 정도를 측정한다(도 4, 오른쪽). 이들 실험에서는 먼저 각종 산화방지성 화합물 변형물을 전극 챔버에 첨가하고, 이어서 막 전위의 형성을 막기 위하여 로테논의 존재하에 미토콘드리아를 첨가한다. 미토콘드리아 첨가시 산화방지성 화합물 농도가 감소하는 것은 산화방지성 화합물이 전위 차단된 미토콘드리아에 결합하기 때문이다. 막 전위를 발생시키기 위한 석시네이트의 후속적 첨가는 막 전위에 의존하는 화합물의 흡수를 보여주며, 이것은 막 전위를 소멸시키기 위한 FCCP의 첨가에 의해 역전된다.
미토퀴논-C3의 유리 농도는 미토콘드리아의 첨가에 의해 영향을 받지 않으며, 이것은 전위 차단된 미토콘드리아에는 미량의 미토퀴논-C3이 결합됨을 보여준다(도 4A, 오른쪽). 석시네이트를 사용한 전위 발생시 미토퀴논-C3의 FCCP-감응성 흡수는 약 2×103의 축적 비율에 상응하는 약 3.7nmol 미토퀴논-C3/mg 단백질이었다. 이것은 미토콘드리아내 결합에 대한 보정을 고려하여 약 180mV의 미토콘드리아 막 전위 및 네른스트 등식으로부터 예상한 값과 일치한다.
미토퀴논-C5에 대해서는 전위 차단된 미토콘드리아에 약간의 화합물의 결합이 존재한다(약 0.6nmol/mg 단백질). 그러나, 이것은 후속의 석시네이트를 사용한 전위 발생시의 후속적 흡수인 약 1.4×103의 축적 비율에 상응하는 약 2.8nmol 미토퀴논-C5/mg 단백질에 비하면 무시할 만한 값이다(도 4B, 오른쪽).
미토퀴논-C10에 대해서는 전위 차단된 미토콘드리아에 약 2.6nmol의 미토퀴논-C10의 상당한 결합이 존재하며, 석시네이트 첨가시 약 1nmol/mg 단백질의 흡수가 추가로 존재한다(도 4C, 오른쪽).
유리된 미토퀴논-C15는 거의 모두가 전위 차단된 미토콘드리아에 결합하지만, 석시네이트를 사용한 전위 발생시 약간의 추가적 흡수가 존재한다. 미토퀴논-C15의 막 전위-의존적 흡수는 도 4D의 왼쪽 부분에서 명백하게 나타나며, 여기서 전극 반응은 매우 민감해서 미토콘드리아 존재하에 전극을 보정할 때에 소량의 유리된 미토콘드리아-C15의 측정이 가능하다. 이와 대조적으로, 도 4D의 오른쪽에서는 미토퀴논-C15의 흡수를 보기 힘들고, 여기서 전극 반응은 미토콘드리아 부재하에서의 미토퀴논-C15의 측정을 가능하게 하는데 훨씬 덜 민감하다.
이들 실험은 산화방지성 화합물의 메틸렌 브릿지의 길이가 적어도 부분적으로 미토콘드리아 막에의 흡착률을 결정한다는 사실을 보여준다(도 4의 오른쪽). 흡착률은 미토퀴논-C3의 무시할 만한 값에서부터 미토퀴논-C15의 거의 완전한 결합에 이르는 범위를 갖는다. 전위 차단된 미토콘드리아에 미토퀴논-C15를 첨가할 때 본질적으로 모든 화합물이 결합되며 내부 및 외부 막의 표면 모두에 걸쳐 분포된다. 막 전위가 유도될 때 본 발명자들은 내부 막의 외부 표면과 외부 막으로부터 내부 막의 기질-접촉 표면으로 화합물이 상당량 재분포될 것으로 믿는다. 요약하면, 모든 산화방지성 화합물 변형물은 막 전위에 의해 미토콘드리아 속으로 흡수되며, 메틸렌 브릿지가 길수록 인지질 이중층에의 이들의 흡착률이 커진다.
실시예 5. 대표적인 미토콘드리아 표적화 화합물의 산화방지 효과
본 발명의 화합물은 산화성 스트레스를 방지하는 효과도 매우 크다. 산화방지 효과를 측정하기 위하여, 산화방지성 화합물이 미토콘드리아 내의 지질 과산화를 방지하는 능력을 제1 철 이온 및 과산화수소에 노출시 미토콘드리아 내의 TBARS의 축적으로부터 측정한다(도 5).
지질 과산화를 정량하기 위하여 TBARS 분석을 사용한다. 래트의 간 미토콘드리아(2mg 단백질/㎖)를 37℃에서 10mM 석시네이트 및 8mg/㎖ 로테논, 또는 2.5mM ATP, 1mM 포스포에놀 피루베이트 및 4U/㎖ 피루베이트 키나제의 ATP 재생계로 보강된 0.8㎖의 배지(100mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.6) 중에서 배양한다. 그런 다음 37℃에서 15분간 50mM FeCl2/300mM H202를 첨가함으로써 미토콘드리아를 산화성 스트레스에 노출시킨다. 배양 후, 에탄올 중의 2%(w/v) 부틸화 하이드록시톨루엔 64㎖를 첨가한 후 35%(v/v) HClO4 200㎖ 및 1%(w/v) 티오바르비투르산 200㎖를 첨가한다. 이어서 시료를 100℃에서 15분간 배양하고 원심분리하고(12,000×g에서 5분) 상등액을 유리관으로 옮긴다. 물 3㎖ 및 부탄-1-올 3㎖를 첨가한 후 시료를 교반시키고 두 상을 분리시킨다. 유기층 분취량 200㎖를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 티오바르비투르산 반응성 종(TBARS)에 대해 분석하고(λEx = 515㎚; λEm = 553㎚) 0.01 내지 5mM 1,1,3,3-테트라에톡시프로판으로부터 제조한 말론디알데히드(MDA) 표준 곡선과 비교한다(참조: Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteous, W. K., Ledgerwood, E. C., Smith, R. A. J. 및 Murphy, M. P. (2001), J. Biol. Chem. 276, 4588-4596).
석시네이트로 전위 발생된 미토콘드리아에 대하여, TBARS의 배경 수준은 무시할 정도이지만 산화성 스트레스에 노출시 약 3.75nmol MDA/mg 단백질까지 증가한다(도 5A, 흑색 막대). 모든 산화방지성 화합물의 고농도(5μM)에서 TBARS의 축적을 크게 억제하지만 단일 양이온 TPMP는 그렇지 않다. 이는 산화방지 작용을 담당하는 것은 미토퀴논 산화방지성 화합물의 유비퀴놀 측쇄이며, 양이온과 미토콘드리아의 비특이적 상호 작용이 아니라는 사실을 증명한다.
이들 실험에서, 석시네이트는 미토콘드리아로의 양이온 흡수를 추진시키는 막 전위를 유지하며, 미토퀴논 산화방지성 화합물의 유비퀴논 형태를 유비퀴놀 형태의 활성 산화방지제로 재순환시킬 것이다(참조: Kelso, G. F., Porteous, C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteous, W. K., Ledgerwood, E. C., Smith, R. A. J. 및 Murphy, M. P. (2001), J. Biol. Chem. 276, 4588-4596). 미토퀴논 산화방지성 화합물의 산화방지 효과에 호흡 연쇄에 의한 환원이 필요한지를 보기 위하여, ATP 및 ATP 재생계의 존재하에 미토콘드리아를 배양했다. ATP 가수분해 및 미토콘드리아 ATP 합성의 역전은 석시네이트에 의해 발생된 것과 유사한 막 전위를 제공하는 대규모의 양성자 펌프를 일으킨다(도 5B). 이것은 석시네이트에 의해 전위 발생된 미토콘드리아와 동일한 미토퀴논 산화방지성 화합물 흡수를 일으킬 것이지만, 현재 미토퀴논 산화방지성 화합물은 호흡 연쇄에 의해 이들의 활성 유비퀴놀 형태로는 더이상 재순환되지 않을 것이다. 미토퀴논 산화방지성 화합물은 ATP 가수분해에 의해 전위 발생된 미토콘드리아에서는 지질 과산화를 방지하는 데에 효과적이지 못하는(도 5A, 백색 막대) 반면, 석시네이트에 의해 전위 발생된 미토콘드리아에서는 현저한 보호 효과가 나타난다(도 5B, 흑색 막대). 따라서, 미토퀴논 산화방지성 화합물의 산화방지 효과를 위해서는 미토콘드리아 막 전위에 의한 축적은 물론 호흡 연쇄에 의한 미토퀴논 산화방지성 화합물의 환원이 필요하다.
석시네이트로 전위 발생된 미토콘드리아의 대조 시료에서는 ATP로 전위 발생된 미토콘드리아에 비해 더 낮은 지질 과산화도가 관찰된다(도 5A). 이것은 석시네이트의 존재하에서는 환원 상태로 유지되나 ATP의 존재하에서는 산화되는 내생성 미토콘드리아 코엔자임 Q 풀의 보호성 산화방지 효과에 기인한다(참조: James, A. M., Smith, R. A. 및 Murphy, M. P. (2004), Arch. Biochem. Biophys. 423, 47-56; Erster, L., Forsmark, P. 및 Nordenbrand, K. (1992), Biofactors 3, 241-8). 요약하면, 모든 미토퀴논 산화방지성 화합물은 효과적인 산화방지제이도록 하기 위하여 호흡 연쇄에 의한 활성화를 필요로 한다.
도 5A에 대하여, 모든 미토퀴논 산화방지성 화합물에서 5pM의 단일 농도를 사용한다. 이들의 상대적인 산화활성 효과를 비교하기 위하여, 석시네이트 존재하에 화합물을 적정한다: 전형적인 적정값은 도 5C에 기재한다. 이 실험은 이들 화합물의 산화방지 효과는 메틸렌 브릿지의 길이와 관계가 있음을 제시한다. 이것을 정량화하기 위하여, 4종의 대표적인 미토퀴논 산화방지성 화합물에 의한 지질 과산화방지에 대한 IC50 값을 산출한다(도 4D). 이 측정을 통하여 산화방지 효과는 미토퀴논-C15 > 미토퀴논-C10 > 미토퀴논-C5 > 미토퀴논-C3의 순서임이 확인된다.
모든 미토퀴논 산화방지성 화합물은 미토콘드리아 막 전위에 의해 미토콘드리아 안에 축적된다. 가장 소수성이 큰 화합물인 미토퀴논-C15에 대하여 이 효과는 인지질 이중층에의 광범위한 결합에 의해 크게 차단된다. 모든 화합물은 효과적인 산화방지제이며, 15분에 걸친 지속적인 산화방지 활성을 갖기 위해서는, 모두 지질 과산화 중간체를 독성 제거한 후 미토퀴논 산화방지성 화합물을 그의 활성 산화방지 형태로 재순환시키기 위한 호흡 연쇄 작용이 필요하다.
실시예 6. 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물이 심장 혈역학 및 미토콘드리아 기능에 미치는 영향
미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물, 구체적으로는 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 심장 기능에 미치는 영향을 랑겐도르프(Langendorf) 적출 심장 관류 모델을 사용하여 분석한다. 대조군(플라시보), TPMP(메틸트리페닐 포스포늄), 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3의 4개의 투여 그룹에 래트를 할당한다. 처리 기간 후 래트를 치사시키고 적출한 심장을 랑겐도르프 적출 관류 시스템에 연결시킨다. 이 시스템은 심장을 지탱하면서 심장 기능을 측정하도록 대동맥을 통한 역관류를 사용한다. 좌심실 벌룬을 사용하여 좌심실 혈압을 측정한다. 관상동맥 유량도 측정한다.
도 6은 각각의 처리 그룹에 대하여 10㎜Hg 좌심실 혈압에서의 관상동맥 유량을 보여준다. 관상동맥 유량은 허혈 전에 측정하고 허혈을 유도한 후 0분, 20분, 40분 및 60분에 다시 측정한다. 일원 배치 ANOVA를 본페로니(bonferroni) 사후 검정과 함께 수행한다. 허혈전 대조군에 대한 유의성: *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. 각각의 시간의 대조군에 대한 유의성: †P < 0.05; ††P < 0.01; †††P < 0.001.
결과는 미토퀴논-C10을 사용한 처리가 관상동맥 유량의 허혈-유도된 저하를 유의적으로 감소시킴을 보여준다. 미토퀴논-C3은 보다 적은 효과를 갖지만 허혈후의 시간에서 여전히 유의적인 효과를 갖는다. TPMP의 투여는 효과가 없다는 사실은 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물에서 관찰되는 효과를 부여하는 것은 트리페닐포스포늄 양이온이 아닌 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3의 산화방지성 잔기임을 가리킨다.
도 7은 10㎜Hg에서 좌심실 확장기 혈압에 미치는 처리 효과를 보여준다. 좌심실 확장기 혈압은 허혈 유도 전에 측정하고 허혈을 유도한 후 0분, 20분, 40분 및 60분에 다시 측정한다. 통계적 분석은 등급에 관한 ANOVA와 듄(Dunns) 사후 검정이었다. 허혈전 대조군에 대한 유의성: *P < 0.05. †는 허혈후 60분의 대조군에 대한 P < 0.05를 나타낸다. 결과는 미토퀴논-C10을 사용한 처리가 처리되지 않은 래트에 대해 통계적으로 유의한 좌심실 확장기 혈압의 증가를 일으켜서, 좌심실 확장기 혈압의 허혈-유도된 저하를 감소시킴을 보여준다. TPMP의 투여는 효과가 없다는 사실은 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물에서 관찰되는 효과를 부여하는 것은 트리페닐포스포늄 양이온이 아닌 미토퀴논-C10의 산화방지성 잔기임을 가리킨다.
이어서, 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 심박수에 미치는 영향을 측정한다. 도 8은 허혈전과, 허혈 유도 후 0분, 20분, 40분 및 60분에서의 각각의 처리군의 심박수를 보여준다. 일원 배치 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정을 수행하여 결과를 수득한다. †††는 허혈전 대조군에 대한 P < 0.001을 나타낸다. ††는 각각의 허혈후 대조군에 대한 P < 0.05를 나타낸다. 결과는 미토퀴논-C10을 사용한 처리가, 대조군 래트와 비교해서, 심박수의 허혈-유도된 저하를 유의적으로 감소시킴을 보여준다. TPMP의 투여는 효과가 없다는 사실은 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물에서 관찰되는 효과를 부여하는 것은 트리페닐포스포늄 양이온이 아닌 미토퀴논-C10의 산화방지성 잔기임을 가리킨다.
미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 투여가 심장의 수축률 및 이완율에 미치는 영향을 측정함으로써 심장 기능을 추가로 분석한다. 도 9A는 허혈전과, 허혈 유도 후 0분, 20분, 40분 및 60분에서의 각각의 4개의 처리군의 수축률을 보여준다. 도 9B는 허혈전과, 허혈 유도 후 0분, 20분, 40분 및 60분에서의 각각의 4개의 처리군의 이완율을 보여준다. 각각의 경우에 등급에 관한 ANOVA를 수행하고 듄 사후 검정을 수행한다. *는 허혈전 대조군에 대한 유의성 P < 0.05을 나타낸다. †는 허혈후 각각의 시간의 대조군에 대한 유의성 P < 0.05을 나타낸다. ††는 허혈후 각각의 시간의 대조군에 대한 유의성 P < 0.01을 나타낸다.
결과는 미토퀴논-C10의 투여가 통계적으로 유의한 효과를 나타내고 대조군 래트에 비해 좌심실의 수축률 및 이완률의 허혈-유도된 저하를 감소시킴을 보여준다.
상기 데이타는 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 투여가 심장 기능에 미치는 유리한 효과를 명백하게 보여준다. 심장 기능에 대해 관찰된 효과가 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물이 미토콘드리아 기능에 미치는 효과로 인한 것인지를 측정하기 위하여, 각각의 처리군에 대해 허혈전 및 허혈후의 미토콘드리아 활성을 분석한다. 도 10A는 각각의 4개의 처리군에 대한 허혈전 및 허혈후의 미토콘드리아의 NAD+ 결합된 호흡 기능을 보여준다. 도 10B는 각각의 4개의 처리군에 대한 허혈전 및 허혈후의 FAD 결합된 호흡 기능을 보여준다. ***는 허혈전 대조군에 대한 유의성 P < 0.001을 나타낸다. †††는 허혈후 대조군에 대한 유의성 P < 0.001을 나타낸다.
이들 데이타는 미토퀴논-C10이 대조군 래트에 비해 허혈후 미토콘드리아 호흡 기능에 통계적으로 유의한 유리한 효과를 제공한다는 사실을 보여준다. 이들 결과는 미토콘드리아 표적화 산화방지성 화합물의 투여가 심장 기능에 미치는 효과는 미토콘드리아 기능에 미치는 보호 효과로 인한다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 7. β-사이클로덱스트린을 갖는 미토퀴논-C10 착물의 안정성
조기제형화 연구에서, 브로마이드 염 형태의 미토퀴논-C10은 25℃, 50% RH, 및 40℃, 75% RH에서 보관시 고체 상태에서는 시간이 경과함에 따라 분해되는 것으로 밝혀졌다. 이 연구의 목적은 미토퀴논-C10의 고체 상태 안정성이 β-사이클로덱스트린과의 착화에 의해 개선될 수 있는가를 확인하는 것이다.
배치 번호 6의 미토퀴논-C10과 이데베논은 Industrial Research Limited(New Zealand)에 의해 공급된다. β-사이클로덱스트린(제조 번호 70P225)은 ISP technologies Inc.로부터 구입한다. NaCl, NaH PU 및 메탄올(HPLC)은 BDH로부터 구입한다.
순수한 미토퀴논-C10의 고체 상태 안정성 연구
미토퀴논-C10의 시료(대략 5mg)를 정확히 평량하여 투명한 병에 담고 25℃, 50% RH, 및 40℃, 75% RH 및 4℃ 실리카 상에 노출시킨다. 1, 2, 4, 8, 16, 32 및 64일째에 병을 제거하고, 대조군으로서 -20℃ 실리카 상에서 보관된 미토퀴논-C10을 사용하여 미토퀴논-C10을 검증된 HPLC 방법에 의해 분석한다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 제조
배치 번호 6의 미토퀴논-C10을 사용하여 상이한 몰 비(미토퀴논-C10 브로마이드:β-사이클로덱스트린 1:1, 1:2 및 1:4)를 갖는 3개의 착물을 제조한다.
β-사이클로덱스트린 수용액의 제조
β-사이클로덱스트린(1.1397g, 수분 함량에 대한 보정 후의 1.0361g과 동일)을 정확히 칭량하고 2중 증류수에 10분 동안의 초음파 처리에 의해 용해시킨다. 물을 사용하여 용적을 100㎖가 되게 한다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(몰 비 1:1) 착물의 제조
미토퀴논-C10 브로마이드(90mg, 미토퀴논-C10 59.95mg과 동일)의 에탄올 용액을 40 내지 50℃로 유지되는 열판을 사용하여 질소하에 8분간 증발시킨다. β-사이클로덱스트린 용액(10㎖) 및 2중 증류수(30㎖)를 비이커에 첨가한 후 40분간 초음파 처리한다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(몰 비 1:2) 착물의 제조
미토퀴논-C10 브로마이드(89.8mg, 미토퀴논-C10 59.82mg과 동일)의 에탄올 용액을 37 내지 45℃로 유지되는 열판을 사용하여 질소하에 10분간, 이어서 50℃에서 3분간 증발시킨다. β-사이클로덱스트린 용액(20㎖) 및 2중 증류수(20㎖)를 비이커에 첨가한 후 30분간 초음파 처리한다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(몰 비 1:4) 착물의 제조
미토퀴논-C10 브로마이드(90mg, 미토퀴논-C10 59.95mg과 동일)의 에탄올 용액을 37 내지 50℃로 유지되는 열판을 사용하여 질소하에 12분간 증발시킨다. β-사이클로덱스트린 용액(40㎖)을 비이커에 첨가한 후 20분간 초음파 처리한다.
상기 모든 용액을 -18℃에서 밤새 보관함으로써 냉동시킨다. 냉동된 용액을 LABCONO 동결 건조기를 사용하여 2일 동안 동결 건조시킨다. 동결 건조된 화합물을 -20℃에서 보관한다.
동결 건조된 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 시차 주사 열량계
3개의 동결 건조된 착물의 시차 주사 열량계(DSC)를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 시차 주사 열량계 PYRIS-1을 사용하여 수행한다. 에탄올 용액을 35 내지 50℃에서 질소 기체하에 10분간 증발시켜서 미토퀴논-C10 시료를 제조한다.
알루미늄 팬(0219-0041호, 제조원: Perkin-Elmer)을 사용한다. 분석은 질소 퍼징하에 수행한다. 빈 팬을 사용하여 기저선을 설정한다.
주사 온도 범위는 50 내지 160℃이며, 초기에 50℃로 1분간 유지한 후 160℃까지 10℃/분으로 증가시킨다.
HPLC 분석
미토퀴논-C10에 대한 HPLC 방법은 이동상으로서 메탄올 및 0.01M 인산이수소나트륨(85:15)을 1㎖/min의 유속으로 사용하고 265㎚에서 UV-VIS 검출을 사용하여 수행한다. 내부 표준은 이데베논이다. 칼럼은 5㎛의 입도를 갖는 프로디지(Prodigy) ODS3100A(Phenomenex)이다. 후에 이 방법은 새로운 칼럼이 등장한 후 변형되었다. 변형된 방법에 사용되는 이동상은 메탄올 및 0.01M 인산이수소나트륨(80:20)이다. 이 방법은 검증을 거쳤다. 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물을 분석하기 전에 HPLC 방법에서의 β-사이클로덱스트린에 의한 간섭을 점검한다. β-사이클로덱스트린은 미토퀴논-C10 HPLC 분석에서 간섭을 일으키지 않는 것으로 보인다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 안정성 연구
세 가지의 미토퀴논-C10 및 β-사이클로덱스트린 착물이 존재하므로 상이한 착물 5mg 시료 내의 미토퀴논-C10의 양은 서로 다르다. 세 가지의 모든 착물에서 동일한 양의 미토퀴논-C10을 노출시키기 위하여 상이한 중량의 착물을 취하고(미토퀴논-C10 1.473mg을 함유한 1:1 착물 4mg, 미토퀴논-C10 1.469mg을 함유한 1:2 착물 6.5mg, 미토퀴논-C10 1.467mg을 함유한 1:4 착물 11.5mg) 표준 운용 절차(Standard Operating Procedure)에 의한 안정성 시험에 사용한다.
각각의 시료병에 HPLC용 물의 분취량(1.5㎖)을 첨가하여 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물을 완전히 용해시킨다. 이 용액의 분취량(50㎕)을 물을 사용하여 1㎖로 희석시킨다. 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 상기 희석 용액의 분취량(100㎕)을 내부 표준물의 10㎍/㎖ 메탄올 용액 200㎕와 함께 교반한다. 시료를 10,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액 50㎕를 HPLC 시스템에 주입한다. β-사이클로덱스트린의 5mg/㎖ 용액을 함유한 2.5 내지 120㎍/㎖ 농도 범위의 미토퀴논-C10의 용액을 사용하여 표준 곡선을 작성한다.
모든 화합물은 약간 오렌지색-황색이며 외관이 비상하게 솜털과 같다. 색은 균일하지 않고 동결 건조 플라스크의 바닥 쪽이 더 진하다.
DSC의 결과는 다음과 같다.
미토퀴논-C10: 순수한 미토퀴논-C10 시료의 분석시 120℃ 이상에서 피크가 관찰되었다. 하나의 미토퀴논-C10 시료에서 130℃와 140℃ 사이에 2개의 뚜렷한 피크가 관찰되었다. 다른 시료의 분석시 이러한 뚜렷한 피크는 관찰되지 않았으나 120℃ 이상에서 작은 피크들이 관찰되었다. 분석 후 팬을 절단하고 시료를 조사한 바, 시료는 두 경우 모두 암녹색 내지 흑색이었다.
β-사이클로덱스트린: 70℃와 85℃ 사이에 넓은 피크가 존재하였다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(1:1) 착물: 유의적 피크는 관찰되지 않았다. 분석 후 팬을 절단하고 조사한 바, 시료의 색은 담갈색으로 약간의 변화가 있었다(유의적 변화는 아니다).
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(1:2) 착물: 유의적 피크는 관찰되지 않았다. 분석 후 시료에서 색 변화는 관찰되지 않았다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린(1:4) 착물: 유의적 피크는 관찰되지 않았으나 매우 작은 발열 피크가 120℃에서 관찰되었다. 분석 후 시료에서 색 변화는 관찰되지 않았다.
순수한 미토퀴논-C10 시료에서 피크의 출현은 온도와 함께 화합물의 변화가 일어나고 있음을 가리킨다. 그러나, 다수의 피크들이 존재하고 시료에서 색 변화도 있기 때문에 이들은 분해로 인해 일어났을 수도 있다. 제2 미토퀴논-C10 시료를 분석했을 때 제1 시료와는 다른 열분석도가 얻어졌다. 착물의 경우, 유의적 피크 또는 색 변화가 나타나지 않았다.
순수한 미토퀴논-C10(배치 번호 3)의 고체 상태 안정성 연구 결과를 표 2 및 도 11에 기재한다.
Figure 112009073343553-pat00049
미토퀴논-C10(배치 번호 3)의 고체 상태 안정성은 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 5℃ 블루 실리카 겔 상에서 암실에서 측정한다. 데이타는 초기 함량의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
40℃, 75% RH에 비해 25℃, 50% RH에서 상당히 불안정하기 때문에 배치 번호 4의 미토퀴논-C10을 사용하여 25℃, 50% RH에서 안정성 연구를 반복했다. 두 번째 안정성 연구는 투명한 병과 불투명한 병 모두에서 수행했고 결과를 표 3 및 도 12에 기재한다.
Figure 112009073343553-pat00050
미토퀴논-C10(배치 번호 4)의 고체 상태 안정성은 25℃, 50% RH의 암실에서 측정했다. 데이타는 초기 함량의 백분율로서 표시된 3개의 값의 평균이다.
미토퀴논-C10의 두 배치(배치 번호 3 및 4)(공급원: Chemistry Department)는 16일 후 급격한 함량 저하를 보였다. 그러나, 4번 배치는 32 내지 64일 후 분해가 3번 배치에 비해 크지 않았다. 또한, 병이 투명한지 불투명한지의 여부는 미토퀴논-C10의 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물을 제조하기 위하여 IRL로부터 구입한 미토퀴논-C10을 사용했다. IRL로부터 구입한 미토퀴논-C10은 에틸 알코올 중의 적황색 시럽이었다. 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 안정성을 표 4 및 도 13, 14 및 15에 기재한다. 연구에 이용할 수 있는 미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물이 소량이기 때문에 1일과 4일째의 결과는 없다.
Figure 112009073343553-pat00051
미토퀴논-C10:β-사이클로덱스트린 착물의 고체 상태 안정성은 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 5℃ 블루 실리카 겔 상에서 암실에서 측정한다. 데이타는 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
상기 결과는 미토퀴논-C10이 β-사이클로덱스트린과 효과적으로 착물을 형성할 수 있으며 β-사이클로덱스트린과의 착화에 의해 안정화될 수 있음을 보여준다. 1:1 및 1:2 β-사이클로덱스트린 착물 내의 미토퀴논-C10이 다양한 조건하에서 안정하다는 사실도 보여준다. 또한, 1:4 착물 내의 미토퀴논-C10의 안정성은 1:1 및 1:2 β-사이클로덱스트린 착물 내의 미토퀴논-C10의 안정성에 비해 감소한다는 사실도 보여준다.
실시예 8. 미토퀴논-C10 메실레이트의 안정성 연구
미토퀴논-C10 메실레이트의 용액 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트의 용액 안정성은 출원인의 표준 운용 절차에 의해 5종의 용매, 즉 물, 0.01M HCl, 0.01M NaOH, IPB(pH 7.4) 및 50% MeOH 중에서 공기 및 질소의 두 가지 대기 조건하에 25℃ 및 40℃의 두 가지 온도에서 125일 동안 측정했다.
1mg/㎖ 미토퀴논-C10 메실레이트 저장 용액을 물에 희석시켜서 5종의 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트 용액(100㎍/㎖)을 제조한다. 용액(5㎖)을 유리 바이알에 넣고 공기 또는 질소로 플러싱하고 밀봉한 후 보관한다. 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 분취량(0.25㎖)을 모으고 미토퀴논-C10의 농도를 HPLC에 의해 측정한다.
결과를 표 5에 기재한다. 미토퀴논-C10 메실레이트는 0.01M NaOH 중에서 15분 이내에 분해되기 때문에 이 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트의 안정성은 포함시키지 않는다. 결과는 (a) 용액 안정성은 용액 위의 대기에 무관하며 (b) 온도는 HCl을 제외한 모든 용매 중에서 미토퀴논-C10의 안정성에 상당한 영향을 미친다는 사실을 보여준다.
Figure 112009073343553-pat00052
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
4종의 용매 중에서의 미토퀴논-C10 메실레이트의 용액 안정성은 도 16, 17, 18 및 19에도 기재된다.
미토퀴논-C10 메실레이트의 고체 상태 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트의 고체 상태 안정성을 출원인의 표준 운용 절차에 따라 서로 다른 세 가지 조건, 즉 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서 암실에서 측정했다.
공지된 중량의 미토퀴논-C10 메실레이트를 투명한 유리병에 넣고 서로 다른 조건하에서 보관한다. 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 시료를 두 개씩 모으고, 시료를 물에 용해시킨 후 HPLC에 의해 미토퀴논-C10 메실레이트의 농도를 측정한다. 결과를 표 6 및 도 20에 기재한다.
미토퀴논-C10 메실레이트는 4℃ 실리카 겔 상에서 125일간, 25℃, 50% RH에서 60일간 안정하다(분해율 10% 미만).
Figure 112009073343553-pat00053
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
실시예 9. 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 안정성 연구
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 용액 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 용액 안정성은 출원인의 표준 운용 절차에 의해 5종의 용매, 즉 물, 0.01M HCl, 0.01M NaOH, IPB(pH 7.4) 및 50% MeOH 중에서 공기 및 질소의 두 가지 대기 조건하에 25℃ 및 40℃의 두 가지 온도에서 64일 동안 측정한다.
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 저장 용액(미토퀴논-C10 메실레이트로서 1mg/㎖)을 물에 희석시켜서 5종의 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물 용액(미토퀴논-C10 메실레이트로서 100㎍/㎖)을 제조한다. 용액(5㎖)을 유리 바이알에 넣고 공기 또는 질소로 플러싱하고 밀봉한 후 보관한다. 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 분취량(0.25㎖)을 모으고 HPLC에 의해 농도를 측정한다.
결과를 표 7 및 도 21, 22, 23 및 24에 기재한다. 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물은 0.01M NaOH 중에서 15분 이내에 분해되기 때문에 이 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 안정성은 포함시키지 않는다. 결과는 (a) 용액 안정성은 용액 위의 대기에 무관하며 (b) 온도는 HCl을 제외한 모든 용매 중에서 β-사이클로덱스트린과의 1:2 착물에서 미토퀴논-C10 메실레이트의 안정성에 상당한 영향을 미친다는 사실을 보여준다.
Figure 112009073343553-pat00054
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 고체 상태 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 고체 상태 안정성을 출원인의 표준 운용 절차에 따라 서로 다른 세 가지 조건, 즉 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서 암실에서 측정했다.
공지된 중량의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물을 투명한 유리병에 넣고 서로 다른 조건하에서 보관했다. 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 시료를 두 개씩 모으고, 시료를 물에 용해시킨 후 HPLC에 의해 미토퀴논-C10 메실레이트의 농도를 측정한다. 결과를 표 8 및 도 25에 기재한다. 결과는 미토퀴논-C10 메실레이트가 4℃ 블루 실리카 겔 상 및 25℃, 50% RH에서 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물 내에서 안정하다는 사실을 보여준다. 40℃, 75% RH에서, 미토퀴논-C10 메실레이트의 37%는 64일 동안 보관시 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물 내에서 분해되었다.
Figure 112009073343553-pat00055
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다. *2개의 매우 다른 값의 평균(71.9 및 31.1%).
실시예 10. 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 안정성 연구
용액 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 용액 안정성은 출원인의 표준 운용 절차에 의해 5종의 용매, 즉 물, 0.01M HCl, 0.01M NaOH, IPB(pH 7.4) 및 50% MeOH 중에서 공기 및 질소의 두 가지 대기 조건하에 25℃ 및 40℃의 두 가지 온도에서 64일 동안 측정한다.
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 저장 용액(미토퀴논-C10 메실레이트로서 1mg/㎖)을 물에 희석시켜서 5종의 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물 용액(미토퀴논-C10 메실레이트로서 100㎍/㎖)을 제조했다. 용액(5㎖)을 유리 바이알에 넣고 공기 또는 질소로 플러싱하고 밀봉한 후 보관했다. 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 분취량(0.25㎖)을 모으고 HPLC에 의해 농도를 측정했다.
결과를 표 9 및 도 26, 27, 28 및 29에 기재한다. 미토퀴논-C10 메실레이트는 0.01M NaOH 중에서 15분 이내에 분해되기 때문에 이 용매 중의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 안정성은 포함시키지 않는다. 결과는 (a) 용액 안정성은 용액 위의 대기에 무관하며 (b) 온도는 HCl 또는 50% MeOH를 제외한 물 및 IPB 중에서 β-사이클로덱스트린과의 1:1 착물에서 미토퀴논-C10 메실레이트의 안정성에 상당한 영향을 미친다는 사실을 보여준다.
Figure 112009073343553-pat00056
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
고체 상태 안정성
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 고체 상태 안정성을 출원인의 표준 운용 절차에 따라 서로 다른 세 가지 조건, 즉 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서 암실에서 측정했다.
공지된 중량의 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물을 투명한 유리병에 넣고 서로 다른 조건하에서 보관한다. 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 125일째에 시료를 두 개씩 모으고, 시료를 물에 용해시킨 후 HPLC에 의해 미토퀴논-C10 메실레이트의 농도를 측정했다. 결과를 표 10 및 도 30에 기재한다. 결과는 미토퀴논-C10 메실레이트가 4℃ 블루 실리카 겔 상 및 25℃, 50% RH에서 안정하지만 미토퀴논-C10 메실레이트의 37%는 40℃, 75% RH에서 125일 동안 보관시 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물 내에서 분해된다는 사실을 보여준다.
Figure 112009073343553-pat00057
데이타는 0시간 값의 백분율로서 표시된 2개의 값의 평균이다.
실시예 11. 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 래트(P2 & P3)의 단일 정맥내 및 경구 투여의 약동학 연구
미토퀴논-C10 브로마이드의 이전의 약동학 연구 및 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 급성 경구 독성 연구의 결과를 근거로 하여, 약동학 연구를 위한 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 용량은 경구 투여의 경우 50mg/㎏ 미토퀴논-C10 메실레이트이고, 정맥내 투여의 경우 10mg/㎏ 미토퀴논-C10 메실레이트였다.
위스타(Wistar) 암컷 래트(평균 체중 약 236g)를 실험 시작 48시간 전에 할로탄 마취하에 오른쪽 경정맥에 실라스틱(Silastic) 관을 캐뉼러 삽입했다. 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물 수용액(미토퀴논-C10 메실레이트로서 10mg/㎖)을 새로 제조하고 경구(n=5) 또는 정맥내(n=5) 경로로 투여했다. 정맥 투여 후 0, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 720 및 1440분(24시간)과, 경구 투여 후 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 420, 540, 720 및 1440분(24시간)에 혈액 시료(0.2㎖)를 채취했다. 혈액 시료를 원심분리하고 혈장 시료(0.1㎖)를 -20℃의 냉동기에 보관했다. 24시간의 뇨 및 변의 시료도 채취했다.
미토퀴논-C10 메실레이트의 혈장 농도를 LS/MS를 사용하여 ERS에 의해 측정했다(표 12).
약동학적 분석
미토퀴논-C10의 약동학을 MINIM을 사용하여 반복적 무가중 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 분석했다. 정맥내 데이타를 1-, 2- 및 3-구획 모델에 적합화시켰다. 최적의 적합성을 제공하는 모델은 아카이케 정보 기준(Akaike's information criterion, A.I.C.)에 따른 최소값을 갖는 모델이었다. 약물 투여 후의 혈장 약물 농도-시간 곡선은 하기 수학식으로 설명되는 3-구획 개방 모델에 의해 가장 알맞게 적합화되는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112009073343553-pat00058
상기 수학식에서,
C는 혈장 약물 농도이고,
A, B 및 E는 수학적 계수이며,
α는 분포기에 대한 속도 상수이고,
β는 중간기(분포 또는 소실)에 대한 속도 상수이며,
γ는 최종의 보다 느린 소실기에 대한 속도 상수이다.
최종 기에서의 약물 소실 반감기(t1/2)는 t1/2 = 0.693/γ로서 산출했다. 경구 데이타(4시간 후)를 1-구획 모델에 적합화시켰다. 피크 농도(Cmax)와 Cmax에 도달되는 시간(tmax)은 농도-시간 프로필로부터 직접 얻었다. 혈장 농도-시간 곡선하 면적(AUC)은 선형 사다리꼴 공식을 이용하여 최종 측정 농도로부터 최종 소실 속도 상수(γ)를 사용하여 측정한 무한대까지 외삽법으로 어림했다. 정맥내(CL) 및 경구(CL/F) 투여 후의 총 혈장 청소율은 CL = 용량/AUC로서 어림했다. 분포 용적은 Vβ = 용량/(AUCㆍβ) 및 Vγ = 용량/(AUCㆍγ)로서 산출했다. 절대적 생체이용률(F)은 F = AUCPO×용량IV/AUCIV×용량PO으로서 산출했다. 평균 체류 시간(MRT)은 AUMC/AUC로서 산출했다. 정상 상태에서의 겉보기 분포 용적(Vss)은 용량IV×AUMC/(AUC)2로서 산출했다.
결과 및 논의
미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 정맥내 및 경구 투여 후의 미토퀴논-C10 메실레이트의 평균 혈장 농도-시간 프로필을 도 31에 도시하고 평균 약동학적 인자들을 표 11에 열거한다. 미토퀴논-C10 메실레이트의 혈장 농도의 고유의 데이타를 첨부한다(표 12).
Figure 112009073343553-pat00059
Figure 112009073343553-pat00060
정맥내 투여 후에는, 매우 빠른 분포기에 이어 보다 느린 분포 또는 초기 소실기가 존재하고, 이어서 약 4시간 후에 장기적 소실기가 존재한다. 4시간후 용량이라 불리는 데이타를 토대로 한 반감기는 14.3시간이지만, 미토퀴논-C10의 농도-시간 프로필은 1.8시간의 최종 반감기를 갖는 3-구획 모델에 적합화되었다(표 13).
경구 투여 후에는, 래트의 위장관으로부터의 미토퀴논-C10의 흡수가 빨랐다. 미토퀴논-C10의 혈장 농도 피크는 경구 투여 1시간 이내에 일어나고, 이어서 시간 경과에 따라 서서히 감소하고, 4시간후 데이타를 토대로 한 소실 반감기는 약 14시간이었다. 어림된 F값은 12.4%이다.
Figure 112009073343553-pat00061
본 명세서에 언급된 모든 특허, 출판물, 과학 논문, 및 기타의 문헌과 자료는 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련자들에 대한 기술 수준을 나타내며, 이러한 각각의 참조 문헌과 자료는 이들이 하나하나 전체로서 참조되거나 본 명세서에 전문이 설명된 것과 같은 정도로 참조되어진다. 본 출원인은 이러한 모든 특허, 출판물, 과학 논문, 웹 사이트, 전자적 정보 및 기타의 참고 자료 또는 문헌으로부터 얻은 모든 자료와 정보를 본 명세서에 물리적으로 도입할 권리를 갖는다.
본 명세서에 개시된 특정한 방법 및 조성물은 여러 가지 양태 또는 바람직한 양태를 대표하는 것으로 단지 예일 뿐 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 당업자들은 본 명세서를 고찰할 때 기타의 목적, 특징, 실시예 및 양태들을 발견하게 될 것이며 이들도 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 정신에 속한다. 당업자는 본 발명의 범주와 정신에서 벗어나지 않고서 여기에 개시된 본 발명에 대해 다양한 변화와 개선이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다. 본 명세서에 적합하게 예시된 본 발명은 본 명세서에 필수 요소로서 구체적으로 기재되지 않은 어떠한 구성 요소(들) 또는 제한(들) 없이도 실시가 가능하다. 따라서, 일례로 본 발명의 양태 또는 실시예에서 "포함하는", "본질적으로 이루어지는" 및 "구성되는"이란 용어들은 서로 바꾸어서 쓸 수 있다. 또한, "포함", "함유" 등이란 용어는 제한을 두지 않는 광범위한 의미로 이해된다. 본 명세서에 적합하게 예시된 방법 및 공정은 본 명세서 또는 청구의 범위에 지시된 순서의 단계에 반드시 제한되는 것은 아니며 다른 순서의 단계로 실시될 수도 있다. 또한, 본 명세서 또는 청구의 범위에 사용된 단수 형태의 용어는 달리 명확한 설명이 없는 한 복수의 형태도 포함한다. 예를 들어 "숙주 세포"란 다수의 이러한 숙주 세포들(예: 배양물 또는 군집)을 포함하는 것이다. 본 특허는 본 명세서에 구체적으로 개시된 특정한 실시예 또는 양태 또는 방법에 결코 제한될 수 없다. 본 특허는 심사관이나 특허상표청의 기타 공무원 또는 직원의 진술이 본 출원인의 서면에 의한 회답으로서 구체적이고 무조건부로 명백하게 수용되지 않는 한 이러한 어떤 진술에 의해서도 결코 제한될 수 없다.
본 명세서에 사용된 용어와 표현은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되며, 개시된 특징들의 모든 동등물 또는 그의 부분을 제외시키고자 하는 의도는 없고, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명을 바람직한 양태와 임의의 특징에 의해 상세하게 기재하였더라도 당업자들은 여기에 설명된 개념의 변형 및 변화를 달성할 수 있으며 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 생각한다.
본 명세서에서 본 발명은 광범위하고 포괄적으로 설명된다. 포괄적인 설명에 속하는 보다 한정된 종류와 하위 그룹들도 본 발명의 부분을 구성한다. 이것은 그 부류로부터 주제를 제거한 음성적 제한을 조건으로, 삭제된 자료가 특정하게 인용되든 되지 않든 관계없이 본 발명의 포괄적인 설명을 포함하는 것이다.
기타의 양태들은 하기 청구의 범위에 속한다. 추가로, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹으로 설명된 경우, 당업자들은 본 발명이 마쿠쉬 그룹의 개별적 구성원 또는 그의 하위 그룹에 의해서도 설명된다는 사실을 알게 될 것이다.
본 발명의 화합물은 사람 환자의 미토콘드리아 손상을 방지하기 위한 선택적 산화방지제 요법에 특정의 목적을 갖는다. 이는 파킨슨병 또는 미토콘드리아 DNA 변이 관련성 질환과 같은 특정 질환에 관련되어 있는 상승된 미토콘드리아 산화성 스트레스를 방지하기 위한 것일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 신경퇴행성 질환의 세포 이식 요법에서 이식된 세포의 생존율을 높이는 데에도 사용될 수 있다.
추가로, 이들 화합물은 이식 중에 장기를 보호하거나 수술 중에 일어나는 허혈-재관류 손상을 완화시키기 위한 예방약으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 뇌졸중 및 심장 마비 후의 세포 손상을 감소시키거나, 뇌 허혈에 걸리기 쉬운 조산아를 예방하는 데에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 종래의 산화방지제 요법에 비하여 산화성 스트레스가 가장 많은 세포의 부분인 미토콘드리아에 산화방지제를 선택적으로 축적시킬 수 있다는 주요한 이점을 제공한다. 이는 산화방지제 요법의 효율성을 크게 증가시킬 것이다.
당업자들은 상기 설명이 단지 예시를 위하여 기재된 것이며, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고서 다른 친유성 양이온/산화방지제 배합물도 사용될 수 있다는 사실을 알게 될 것이다.
도 1은 미토콘드리아에 의한 양친성 산화방지성 화합물의 흡수를 나타낸 도면으로, 전위 발생된 미토콘드리온 내에 미토퀴논-C10이 흡수되는 것을 개략적으로 보여준다.
도 2A는 미토퀴논-C3, 도 2B는 미토퀴논-C5, 도 2C는 미토퀴논-C15의 합성 경로를 보여준다.
도 3은 미토퀴논 산화방지성 화합물의 구조와 관련 화합물 TPMP를 보여준다. 인지질 이중층의 한 겹 속으로 투과된 유비퀴놀 측쇄의 전위 최대 투과 깊이를 표시하기 위해 동일 비율로 표시된 인지질을 미토퀴논 산화방지성 화합물과 함께 배열하였다. A: TPMP, B: 미토퀴논-C3, C: 미토퀴논-C5, D: 미토퀴논-C10, E: 미토퀴논-C15, F: 인지질.
도 4는 이온 선택적 전극을 사용하여 측정한, 미토콘드리아에 의한 산화방지성 화합물의 흡수 및 결합을 나타낸 그래프이다. A: 미토퀴논-C3, B: 미토퀴논-C5, C: 미토퀴논-C10, D: 미토퀴논-C15. 왼쪽 부분에는 로테논 존재하의 미토콘드리아(1㎎ 단백질/㎖)가 존재하고 산화방지성 화합물을 5회의 순차적 1μM 첨가물(흑색 화살표)로 첨가하여 전극 반응을 보정한다. 오른쪽 부분에서는 먼저 전극을 5회의 순차적 1μM 첨가물(흑색 화살표)에 의해 보정한 후 미토콘드리아(1㎎ 단백질/㎖)를 첨가한다. 모든 경우에, 막 전위를 발생시키기 위하여 석시네이트를 첨가하고, 막 전위를 없애기 위해서는 FCCP를 첨가한다. 데이타는 실험을 2 내지 3회 이상 반복하여 얻은 전형적인 궤적이다.
도 5는 산화방지성 화합물의 산화방지 효능을 나타낸 그래프이다. A: 석시네이트를 사용하거나(흑색 막대), ATP, 포스포에놀 피루베이트 및 피루베이트 키나제로 이루어진 ATP 재생 시스템을 사용하여 배양함으로써(백색 막대) 미토콘드리아에 전위를 발생시킨다. 각종 미토콘드리아 동족체, TPMP 또는 담체로 30초 동안 예비배양한 후, 50μM FeCl2 및 300μM H2O2를 첨가하여 산화성 스트레스를 유도시킨다. 37℃에서 15분간 배양한 후, TBAR을 측정함으로써 지질 과산화를 평가한다. 데이타는 2회의 독립적 실험의 평균±범위이다. ATP 존재하의 지질 과산화에 대한 미토퀴논-C5의 약간의 보호 효과는 저장 용액으로부터 첨가된 미토퀴논-C5 중 일부가 유비퀴놀 형태로 존재하기 때문이다. B: 석시네이트로 또는 ATP 재생 시스템을 사용하여 유도된 미토콘드리아 막 전위는 [3H]TPMP의 축적으로부터 측정한다. 데이타는 25분간의 배양의 2회 측정의 평균±범위이다. 5분간 배양한 후의 막 전위는 동일했다(데이타는 기재되지 않음). C: 산화방지성 화합물에 의한 TBAR의 축적 방지의 농도 의존도를 측정한다. 모든 배양은 A에서 설명한 바와 같이 석시네이트의 존재하에 수행한다. 결과는 TBARS 형성 억제율(%)로서 표시하고, 미토퀴논 동족체 부재하에 FeCl2/H2O2에 노출된 시료의 값을 0% 억제율로 하며 대조군 시료(FeCl2/H2O2 무첨가)를 100%로 한다. 표시된 데이타는 3회 측정된 각각의 농도의 전형적인 적정값±표준편차(SD)이다. D: 지질 과산화 방지에 대한 IC50 농도. 데이타는 C에 나타낸 바와 같은 3회의 독립적 적정으로부터 평가된 평균±표준오차(sem)이다. 미토퀴논-C3의 IC50에 관한 통계적 유의성은 스튜던츠 양측 검정법(Student's two tailed t test)을 사용하여 측정한다: *p < 0.05; **p < 0.005.
도 6은 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 관상동맥 혈류에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 좌심실 확장기 혈압에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 8은 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 심박수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 좌심실 변화율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 미토퀴논-C10 및 미토퀴논-C3이 허혈후 미토콘드리아 호흡 기능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 투명 유리병 내의 순수한 미토퀴논-C10(배치 번호 3)의 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 5℃ 실리카 겔 상에서의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 미토퀴논-C10(배치 번호 4)의 25℃, 50% RH에서의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 미토퀴논-C10 β-사이클로덱스트린 착물(1:1)의 4℃ 실리카 상, 25℃, 50% RH 및 40℃, 75% RH에서의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 미토퀴논-C10 β-사이클로덱스트린 착물(1:2)의 4℃ 실리카 상, 25℃, 50% RH 및 40℃, 75% RH에서의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 15는 미토퀴논-C10 β-사이클로덱스트린 착물(1:4)의 4℃ 실리카 상, 25℃, 50% RH 및 40℃, 75% RH에서의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 16은 미토퀴논-C10 메실레이트의 수중 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 미토퀴논-C10 메실레이트의 0.01M HCl 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 미토퀴논-C10 메실레이트의 IPB, pH 7.4 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 19는 미토퀴논-C10 메실레이트의 50% MeOH 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 미토퀴논-C10 메실레이트의 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서의 고체 상태 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 21은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 수중 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 22는 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 0.01M HCl 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 23은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 IPB, pH 7.4 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 24는 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 50% MeOH 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 25는 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물의 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH, 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서의 고체 상태 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 26은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 수중 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 27은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 0.01M HCl 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 28은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 IPB, pH 7.4 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 29는 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 50% 메탄올 중의 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 30은 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:1) 착물의 40℃, 75% RH; 25℃, 50% RH, 및 4℃ 블루 실리카 겔 상에서의 고체 상태 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 31은 미토퀴논-C10 메실레이트를 미토퀴논-C10 메실레이트-β-사이클로덱스트린(1:2) 착물로서 래트에 단일 정맥내(A)(10㎎/㎏) 및 경구(B)(10㎎/㎏) 투여한 후의 미토퀴논-C10의 래트 혈장 농도-시간 분포를 나타낸 그래프이다(n=5). 이들 데이터로부터 유도된 약동학적 파라메터는 표 11에 제시되어 있다.

Claims (27)

  1. 화학식 1 또는 이의 퀴놀 형태의 화학적으로 안정한 산화방지성 화합물과 담체 또는 부형제를 포함하는, 아테롬성 동맥경화증, 심혈관 고혈압, 비-알코올 유도성 지방간염, 비-알코올 유도성 지방간 질환, 알코올 유도성 지방간염, 지방증(steatosis), 간경변증, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 간 이식에서의 간세포의 산화성 스트레스, 간세포 암, 피부 암, 당뇨병, 당뇨병성 신경병증, 심혈관 질환(CVD), 고콜레스테롤혈증, 심부전, 심혈관대사증후군, 안트라사이클린 유도성 심독성, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증, 폐기종, 폐 섬유증, 성인호흡곤란증후군, 폐 고혈압 또는 석면증, 폐혈증, 황반변성, 산화성 망막 광손상 또는 피부 광노화(skin photoaging)를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
    화학식 1
    Figure 112010054173375-pat00112
    위의 화학식 1에서,
    R1, R2 및 R3은 동일하거나 상이하며, C1 내지 C5 알킬 및 H로부터 선택되고,
    n은 2 내지 20의 정수이며,
    Z는 당해 산화방지성 화합물에 대해 반응성을 나타내지 않는 약제학적으로 허용되는 음이온이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 음이온이 (i) 알킬 설포네이트, (ii) 할로겐 이온이 아닌 약제학적으로 허용되는 음이온 및 (iii) 친핵성이 아닌 약제학적으로 허용되는 음이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 음이온이 메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트 및 2-나프탈렌설포네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 음이온이 메탄설포네이트인 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 퀴논 또는 퀴놀이 (i) 비타민 E 또는 비타민 E 유도체, (ii) 부틸화 하이드록시아니솔, (iii) 부틸화 하이드록시톨루엔, (iv) 5,5-디메틸피롤린-N-옥사이드, (v) 3급-부틸니트로소벤젠, (vi) 3급-니트로소벤젠 및 (vii) α-페닐-3급-부틸니트론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 산화방지성 잔기로 대체되는 약제학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, Z가 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, (CH2)n의 C가 포화된 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 산화방지성 화합물이 화학식 2 또는 이의 퀴놀 형태를 갖는 약제학적 조성물.
    화학식 2
    Figure 112010054173375-pat00109
    상기 화학식 2에서,
    Z는 약제학적으로 허용되는 음이온이다.
  12. 제1항에 있어서, 산화방지성 화합물이 화학식 3 또는 이의 퀴놀 형태를 갖는 약제학적 조성물.
    화학식 3
    Figure 112010054173375-pat00110
  13. 제1항, 제3항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 담체 또는 부형체가 사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 산화방지성 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비가 10:1 내지 1:10으로 존재하는 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 산화방지성 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비가 (i) 5:1 내지 1:5, (ii) 4:1 내지 1:4, (iii) 2:1 내지 1:2, (iv) 1:1 및 (v) 1:2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 사이클로덱스트린이 β-사이클로덱스트린인 약제학적 조성물.
  17. 제1항, 제3항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 산화방지성 화합물이 화학식 3 또는 이의 퀴놀 형태의 화합물을 포함하고, 담체 또는 부형제가 사이클로덱스트린을 포함하고, 산화방지성 화합물 대 사이클로덱스트린의 몰 비가 1:2인 약제학적 조성물.
    화학식 3
    Figure 112010054173375-pat00111
  18. 제1항, 제3항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 경구 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물 및 비경구 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 경구 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물 및 비경구 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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