KR100999261B1 - 여성호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화 억제제 스크리닝 방법 - Google Patents

여성호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화 억제제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

여성 호르몬에 의해 피부 각질형성세포에서 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하고, 그 정보를 여성 호르몬의 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화 정도를 진단하는데 사용하고자 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드에 대한 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 노화 진단 방법 및 노화 진단 키트가 개시된다.
여성 호르몬, 피부 노화, 키트, 유전자 발현

Description

여성호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화 억제제 스크리닝 방법 {Method for screening inhibitor against hormonal skin aging}
본 발명은 여성 호르몬의 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화를 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, 구체적으로는 여성 호르몬에 의해 피부 각질형성세포에서 발현 패턴이 변화되는 유전자를 확인하고, 그 정보를 여성 호르몬의 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화 정도를 진단하는데 사용하고자 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브로서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 상기 유전자 서열의 폴리뉴클레오티드에 대한 프라이머 쌍; 또는 상기 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하는 노화 진단 방법 및 노화 진단 키트에 관한 것이다.
사람의 유전체는 3x109개의 염기쌍으로, 대략 5 만개의 유전자를 가지고 있는 것으로 추측되며, 하나의 세포에서 발현되는 기능성 유전자의 개수는 대략 10,000개 정도로 추정된다. 즉 50,000개의 유전자로부터 약 10,000개의 단백질만을 선택적으로 만들어내고 있으며, 어떤 단백질을 발현하느냐에 따라 그 세포의 기능적 특성이 결정된다. 세포의 유전자 발현 특성의 차이는 단지 서로 다른 세포 간에서만 나타나는 것이 아니며, 동일한 세포의 병적인 상황, 예를 들면 젊은 세포와 노화된 세포 간에도 유전자 발현 특성의 차이가 나타난다. 종래의 생명과학은 이러한 유전자 발현의 변화를 일대일의 관계로부터 찾았으나, 특정 단백질의 작용이 하나의 단백질에만 국한되는 것이 아니라 다양한 단백질의 발현에 관여하며, 세포의 특성은 특정 단백질 하나에 의하여 결정되는 것이 아니라 다양한 단백질들의 특성이 총체적으로 조화를 이룸으로써 결정된다는 점을 생각할 때 과거의 접근은 매우 제한적일 수밖에 없다.
피부의 노화 과정 또한 다른 생리 현상과 비슷하게, 외부 자극 (UV, ROS 등)과 세포 내에 내재적으로 존재하는 인자 (유전자, 단백질)의 상호작용에 의해 결정되므로 이런 여러 인자들을 아울러 관찰할 필요가 있지만, 지금까지 피부 노화에 대한 연구는 노화를 유도하는 외적 인자에 의한 세포/조직 내의 내적 인자의 변화를 모니터하는 것이었으므로, 연령 증가에 따른 내재적 노화를 이해하는데 한계가 있었다. 또한, 피부 노화의 여러 현상과 노화 사이의 인과 관계가 명확하지 않기 때문에 효과적인 노화 조절 방법이 개발되지 못하고 있고, 노화 피부 세포의 특성을 총체적으로 이해하기 위해 다양한 단백질들의 특성을 이해하려는 시도 또한 효능 물질 (RA, 진세노사이드 등) 이나 자극원 (UV, ROS)을 세포에 처리한 배양 시스템 연구에 국한되어 그 한계를 가지고 있다.
연령 증가에 따른 여성 피부의 내재적 노화에 대해서는, 폐경기 시점에서 여 성이 경험하게 되는 매우 갑작스런 피부 변화를 근거로 하여 여성호르몬의 결핍이 하나의 원인으로 지목되고 있다. 특히, 활성을 가지는 여성호르몬인 17 베타-에스트라디올(E2)은 피부에서 콜라젠의 함량과 질을 개선시키고, 피부의 두께를 증가시키며, 혈관 형성을 촉진시킨다고 보고되었다. 또한, 여성호르몬은 여성의 표피에서 세포분열을 촉진시키는 것으로 확인되었고, 피부의 상처 치유 속도 및 정도를 촉진시키는 것으로 보고되었다.
그러나 이와 같이 여성호르몬이 피부에 미치는 여러 영향에 대한 중요성이 부각되고 있음에도 불구하고, 여성호르몬의 피부에서의 작용점이나 작용 기작에 대한 세포 수준, 또는 세포 하위 수준에서의 연구는 매우 미흡하다. 또한 표피의 미세 환경에서의 여성호르몬 작용기작에 대한 연구는 충분히 진행되지 못하였다. 또한 E2에 의한 특정 유전자 개개의 발현 조절에 초점이 맞추어진 최근의 연구는 E2에 대한 각질 세포의 반응을 전체적으로 설명하기에 한계가 있다.
E2의 작용은 핵에 존재하는 특정 수용체 (estrogen receptors)를 경유하는 과정과 세포막에서 시작되는 신호전달 과정(membrane-initiated signal transduction pathways)으로 크게 나누어지고 이 과정에 참여하는 수많은 인자들 간의 상호작용이 복잡하게 얽혀 있는 것으로 밝혀지고 있다.
이에, 본 발명자들은 폐경기 여성의 피부 조직으로부터 분리한 각질형성세포에서 여성호르몬에 의해 그 발현 패턴이 변화되는 유전자 및 이들 유전자의 발현을 조절하는 전사인자 유전자를 생물정보학 기법으로 추출하여, 이를 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 내재적 노화 진단을 위한 분자 표적으로 새로이 규명하였다. 따라서 본 발명의 목적은 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화를 진단하는 방법 및 노화 진단 키트를 제공하고, 또한 피부 노화 억제제 개발을 위한 스크리닝 방법 구축에 활용될 정보를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 기준치 이하이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 기준치 이상이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 기준치 이하이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 기준치 이상이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양이 기준치 이하이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며, 진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양이 기준치 이상이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서, 진단 대상 각질형성세포에서 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 기준치 이하이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서, 진단 대상 각질형성세포에서 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 기준치 이상이면 여성호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 노화 억제제의 스크리닝 방법으로서, 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 촉진되는지를 확인하는 단계를 포함하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 노화 억제제 스크리닝 방법으로서, 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지를 확인하는 단계를 포함하는 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 노화 억제제를 스크리닝하는 방법으로서, SREBF1(SREBP1), LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR), IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), TBP, SP1, HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1(AML1) 및 ZEB1 (AREB6) 로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 여성 호르몬에 의해 피부 유래 각질형성세포에서 기준치 이상으로 발현이 증가되는 유전자와 발현이 감소되는 유전자, 및 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자 유전자를 여성 호르몬의 결핍으로 초래되는 여성 피부의 노화에 대한 마커 유전자로 하여 피부에서의 노화 정도를 빠르게 진단할 수 있다. 또한 이들 유전자를 피부 노화 억제제를 개발하는 유전자 타겟으로 활용하고, 개발된 피부 노화 억제제를 평가하는 방법으로 활용할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 여성호르몬에 의해 피부에서 유래한 각질형성세포에서 기준치 이상으로 발현이 증가되는 91종의 유전자와 발현이 감소되는 76종의 유전자, 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자 유전자 27종을 발굴하였으며, 이들이 폐경기 여성의 피부 노화와 관련이 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았다.
하기 표 1은 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 증가한 유전자, 표 2는 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 감소한 유전자를 나열한 것이다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미한다.
GBAcc 유전자 이름 공식유전자심볼
BM759549 Aldolase C, fructose-bisphosphate ALDOC
BM788742 Armadillo repeat containing 6 ARMC6
BM766969 Actin related protein 2/3 complex, subunit 4, 20kDa ARPC4
BM795885 BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 1 BNIP1
BM792946 Chromosome 1 open reading frame 122 C1orf122
BM754866 Chromosome 20 open reading frame 19 C20orf19
BM762306 Chromosome 3 open reading frame 1 C3orf1
BM740544 Chromosome 9 open reading frame 88 C9orf88
AI796642, BM743084 CAP, adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast) CAP1
BM790712 Cyclin D2 CCND2
BM754343 Chaperonin containing TCP1, subunit 5 (epsilon) CCT5
BM750659 CD47 molecule CD47
AB014522 Cytoplasmic linker associated protein 1 CLASP1
BM750709 Chloride intracellular channel 5 CLIC5
BM748783 CSE1 chromosome segregation 1-like (yeast) CSE1L
BM786046 Catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa CTNNB1
BM794137 Chromosome X open reading frame 26 CXorf26
BM782578 Cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 CYR61
BM791387 DEP domain containing 6 DEPDC6
BM979081 Der1-like domain family, member 3 DERL3
BM782883 DiGeorge syndrome critical region gene 6-like DGCR6L
BM749552 DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9 DHX9
BM759512, BM770073 Desmoplakin DSP
BM737612 Echinoderm microtubule associated protein like 3 EML3
BM785896 Family with sequence similarity 8, member A1 FAM8A1
BM781868 Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 FDFT1
BM791018 Farnesyl diphosphate synthase (farnesyl pyrophosphate synthetase, dimethylallyltranstransferase, geranyltranstransferase) FDPS
BM738725 GIPC PDZ domain containing family, member 1 GIPC1
BM792998 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 HNRPA3
BM745313 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M HNRPM
BM739441 HtrA serine peptidase 1 HTRA1
BM772782 IMP3, U3 small nucleolar ribonucleoprotein, homolog (yeast) IMP3
BM794327 Insulin induced gene 1 INSIG1
BM786790 Iroquois homeobox protein 2 IRX2
BM792931 Integrin beta 1 binding protein 1 ITGB1BP1
BM754695 Kinesin family member 15 KIF15
BM770718 Lactate dehydrogenase A LDHA
BM743834 LEM domain containing 2 LEMD2
BM773111 Lamin B2 LMNB2
BM759079 Similar to hypothetical protein MGC27019 LOC389833
CB104921 Similar to bK246H3.1 (immunoglobulin lambda-like polypeptide 1, pre-B-cell specific) LOC91316
BM767087 Lymphocyte antigen 6 complex, locus D LY6D
BM788702 Macrophage erythroblast attacher MAEA
BM753075 Midnolin MIDN
BM751644 Microphthalmia-associated transcription factor MITF
BM049852, BM792810 Mevalonate kinase (mevalonic aciduria) MVK
BM768333 Myeloma overexpressed 2 MYEOV2
BM767045 Nuclear receptor coactivator 4 NCOA4
BM783408 Neuroepithelial cell transforming gene 1 NET1
BM795368 Nuclear distribution gene C homolog (A. nidulans) NUDC
BM792605 Platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform Ib, alpha subunit 45kDa PAFAH1B1
BM782132 Proliferating cell nuclear antigen PCNA
BM748943 Pelota homolog (Drosophila) PELO
BM792234 Pescadillo homolog 1, containing BRCT domain (zebrafish) PES1
BM763958 Phosphatidylinositol glycan, class C PIGC
BM763943 Phosphatidylinositol transfer protein, alpha PITPNA
BM785430 Paired-like homeodomain transcription factor 1 PITX1
BM751239 Pyruvate kinase, muscle PKM2
BM760618 Polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide F POLR2F
BM770840 Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 13 like PPP1R13L
BM790065 Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2 PPP4R2
BM786452 Palmitoyl-protein thioesterase 1 (ceroid-lipofuscinosis, neuronal 1, infantile) PPT1
BM791369 Peroxiredoxin 1 PRDX1
BC034545 PRP8 pre-mRNA processing factor 8 homolog (yeast) PRPF8
BM751738, BM787248 Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 1 PSMD1
BM791065 Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 11 PSMD11
BM793399 R3H domain and coiled-coil containing 1 R3HCC1
BM744761 Arginyl-tRNA synthetase RARS
BM741368 Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 7 RASSF7
BC005290 RNA (guanine-7-) methyltransferase RNMT
BM741551 Ribosomal protein L26 RPL26
BM787845 Ribonucleotide reductase M1 polypeptide RRM1
BE928214 R-spondin homolog (Xenopus laevis) RSPO1
BM786739 RUN and TBC1 domain containing 1 RUTBC1
BM737849 S100 calcium binding protein A2 S100A2
BM790077 Secretory carrier membrane protein 3 SCAMP3
BM788902 Stratifin SFN
BM767159 Splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding protein associated) SFPQ
BM762738 Splicing factor, arginine/serine-rich 1 (splicing factor 2, alternate splicing factor) SFRS1
BM739117, BM789779, BM792207 Splicing factor, arginine/serine-rich 2 SFRS2
BM755276 Stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing protein) STIP1
BM755576 TAR DNA binding protein TARDBP
BQ082251 TBC1 domain family, member 4 TBC1D4
BM789455 Transferrin receptor (p90, CD71) TFRC
BM756004 Triosephosphate isomerase 1 TPI1
BM744635 Tubulin, beta TUBB
BM773030 Tubulin, beta 3 TUBB3
BM771505 Von Hippel-Lindau tumor suppressor VHL
BM792805 WD repeat domain 74 WDR74
BM749405 Zinc fingers and homeoboxes 1 ZHX1
BM770317 Zinc finger protein 302 ZNF302
GenBank 유전자 이름 공식 유전자 심볼
BM740608 Actin, beta ACTB
BM768621 ADAM metallopeptidase domain 8 ADAM8
BM749602 Ankyrin repeat and IBR domain containing 1 ANKIB1
BM765479, BM782554 Rho/rac guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2 ARHGEF2
BM794293 ADP-ribosylation factor-like 16 ARL16
BM762356 Cyclic AMP phosphoprotein, 19 kD ARPP-19
BM741157 BCL2-like 1 BCL2L1
BM793770 Chromosome 17 open reading frame 40 C17orf40
BM751046 Calcium binding and coiled-coil domain 1 CALCOCO1
BM757056 Cyclin B1 interacting protein 1 CCNB1IP1
BM749946 CUB domain containing protein 1 CDCP1
BM753145 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) CDKN1A
BM755133 Carboxylesterase 2 (intestine, liver) CES2
BM786965 Chromodomain helicase DNA binding protein 2 CHD2
BM752296 Coatomer protein complex, subunit alpha COPA
BM787147 Death associated protein 3 DAP3
BM745250 Dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) DKK1
BM792504 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 11 DNAJB11
BM755356 Dynein, cytoplasmic 1, heavy chain 1 DYNC1H1
BM790644 Eukaryotic translation initiation factor 1 EIF1
BM784466 Eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 2 EIF4A2
BM787313 Eukaryotic translation initiation factor 5 EIF5
BM790578 Elongation factor, RNA polymerase II, 2 ELL2
BM750932, BM754350 Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase EPRS
AU280079 Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor) F3
BM739071 Family with sequence similarity 102, member B FAM102B
BM788839 Family with sequence similarity 89, member B FAM89B
BM792813 Hypothetical protein FLJ22795 FLJ22795
BM759296 CXYorf1-related protein FLJ25222
BM761603 FOS-like antigen 1 FOSL1
BM751078 Follistatin-like 3 (secreted glycoprotein) FSTL3
BM751152 Fragile X mental retardation, autosomal homolog 2 FXR2
BM751418 Golgi autoantigen, golgin subfamily a, 4 GOLGA4
BM745177 G protein-coupled receptor 56 GPR56
BM788582 Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor) HIF1A
BM746717 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like HNRPDL
BM763048 Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1 HS3ST1
BM762289 Interphase cyctoplasmic foci protein 45 ICF45
BM773187 Integrin, beta 4 ITGB4
BM751795 Kruppel-like factor 5 (intestinal) KLF5
BM751030 Kruppel-like factor 6 KLF6
BM741864 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta MAP1LC3B
BM788834 Mitogen-activated protein kinase kinase 3 MAP2K3
BM784775 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2 MKNK2
BM741311 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) MLL
BM761778 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 4 MLLT4
BM784915 Mercaptopyruvate sulfurtransferase MPST
BM756630 Nuclear receptor coactivator 3 NCOA3
BM786674 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 3, 10kDa NDUFV3
BM749562, BM753935, BM787950 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 NFE2L2
BM745221 Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila) NOTCH1
BM786385 Niemann-Pick disease, type C1 NPC1
AK000933 Opsin 3 (encephalopsin, panopsin) OPN3
BM771495 Origin recognition complex, subunit 4-like (yeast) ORC4L
BM790345 Poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 PABPC1
BM769219 Phosphatidylinositol glycan, class H PIGH
BM761640, BM781963 Plasminogen activator, urokinase PLAU
BM773147 Protein kinase D2 PRKD2
BM794592 Protease, serine, 8 (prostasin) PRSS8
BM762848 Phosphoserine aminotransferase 1 PSAT1
BM761644 PTK6 protein tyrosine kinase 6 PTK6
BM787956 Protein tyrosine phosphatase type IVA, member 1 PTP4A1
BM745237 Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 12 PTPN12
BM744521 Phosphorylase, glycogen; brain PYGB
BM787758 Reticulon 3 RTN3
BM742646 RuvB-like 1 (E. coli) RUVBL1
BM744942 Seryl-tRNA synthetase SARS
BM759590 SEC24 related gene family, member D (S. cerevisiae) SEC24D
BM790371 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1 SLC2A1
BM787478 Solute carrier family 38, member 2 SLC38A2
BM756519 Solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2 SLC3A2
BM786054 Thrombospondin 1 THBS1
BM773292 Tribbles homolog 3 (Drosophila) TRIB3
BM753459 Tyrosyl-tRNA synthetase YARS
BM741902 Zinc finger protein 36, C3H type, homolog (mouse) ZFP36
CB104867 Zinc finger protein 337 ZNF337
이상의 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 증가하거나 감소한 유전자에 대하여 프로모터 염기 서열을 분석한 결과, 통계값(fisher 통계, Z 통계, 하이퍼지오메트리(Hypergeometric) 통계, Audic 통계)을 기준으로 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역(TRE)을 추출하고 그 출현 빈도 및 그에 결합되는 전사인자를 표기한 것이 하기 표 3이다.
TRE TFs TFs의
Accession ID 		프로모터에서 관찰되는 빈도(%)
증가유전자군 감소유전자군
V$SREBP1_Q6 SREBF1(SREBP1) AB209609 66 0
V$LMO2COM_01 LMO2 NM_005574 52 0
V$AP2_Q6_01 TFAP2A NM_001032280 62 0
F$XBP1_Q2 XBP1 AK093842 60 0
V$MEF2_Q6 MEF2A AL831995 74 0
V$LEF1_Q2 LEF1 AK128255 64 0
V$OSF2_Q6 RUNX2 (OSF2) NM_004348 40 0
V$MAZR_01 PATZ1 (MAZR) NM_014323 40 0
V$AREB6_03 ZEB1 (AREB6) BX647794 18 0
V$HNF4_Q6 HNF4A NM_000457 72 52
V$AP2REP_01 KLF12(AP2REP) NM_007249 66 64
V$TTF1_Q6 NKX2-1 (TTF1) NM_003317 76 78
V$MYOD_Q6 MYOD1 NM_002478 74 78
V$AML1_01 RUNX1(AML1) NM_001001890 66 60
V$LYF1_01 IKZF1(LYF1, ZNFN1A1) AF432219 0 24
V$T3R_Q6 THRA AB209346 0 68
V$PITX2_Q2 PITX2 AK127829 0 24
V$NKX25_01 NKX2-5 BC025711 0 46
V$SOX5_01 SOX5 NM_152989 0 66
V$MYOGENIN_Q6 MYOG NM_002479 0 64
V$MEIS1_01 MEIS1 CR749827 0 64
V$IRF1_Q6 IRF1 AB209624 0 66
V$GATA3_01 GATA3 NM_001002295 0 78
V$TBX5_02 TBX5 NM_000192 0 48
V$AP1FJ_Q2 AP1(FOS/JUN) BX647104/
NM_002228		 0 46
V$AREB6_02 ZEB1 (AREB6) BX647794 0 66
V$TBP_01 TBP BC110341 0 52
V$SP1_Q2_01 SP1 BQ774060 0 84
본 발명의 진단 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 여성호르몬에 의해 발현이 증가하거나 감소하는 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18-22개인 것이 바람직하다. 이는 프라이머의 길이가 18bps미만이면 비특이적으로 결합되고, 22bps를 초과하면 프라이머끼리 자체 결합하여 효율성이 떨어지며, 제작시에도 비용과 기술적인 면에서 비생산적이기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에 포함된, 마커 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 일반적인 모노클로날 항체 제조방법으로 제조된다.
또한 폐경기 여성의 피부 각질형성세포에서 여성호르몬 처리에 의해 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 SREBF1(SREBP1),LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR); 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), TBP, SP1; 및 발현이 증가하는 유전자와 감소하는 유전자에서 동시에 과다 관찰되는 전사인자인 HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1(AML1), ZEB1 (AREB6)의 전사조절 활성을 측정하여 피부 노화 억제제를 스크리닝하는 방법은 일반적인 분자생물학 기법에 따라 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용할 수 있다.
구체적으로는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터에 SREBF1(SREBP1),LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR), ZEB1 (AREB6), HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1 (AML1), RUNX1(AML1), IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), ZEB1(AREB6), TBP 및 SP1 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 1), 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열인 TRE (Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 2)를 사용한다. 플라스미드 2의 TRE 서열은, MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac (Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램에 표 1 및 2의 유전자들의 accession ID를 입력하여 서열을 검색한다. 플라스미드 1의 전사인자 유전자 부분은 표 3의 유전자들의 accession ID를 참고하여 준비한다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 플라스미드 1과 해당 TRE 프로모터-리포터 플라스미드 2를 동시에 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 피부 노화 억제제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하면, 피부 노화억제제 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다. 여성호르몬 처리에 의해 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 증가했을 때 효과적인 피부 노화 억제제라고 판단할 수 있고, 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 감소했을 때 효과적인 피부 노화 억제제라고 할 수 있을 것이다. 발현이 증가, 감소하는 유전자의 프로모터에서 모두 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 보조적인 스크리닝 방법으로 활용될 수 있다.
이하, 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 구체예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 한정하기 위한 것은 아니다.
<실시예 1.인체 세포의 획득 및 여성호르몬 처리 후 형광세포 유속기 분석>
55세 이상의 연령에 해당하는 한국인 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포(NHEKs)를 1 ml 당 0.5 μg 하이드로코티손, 5 ng 표피성장인자, 5 μg 인슐린, 0.5% 우태아 뇌하수체 추출물을 함유한 무혈청 각질세포배양 배지 (Clonetics, Walkersville, MD)에서 배양한다. 실험에 사용된 모든 세포는 3차례 계대 배양된 것으로 한다. 여성호르몬을 처리(이하, 처리군 1)하거나 여성호르몬 수용체 길항제인 ICI를 여성호르몬과 동시에 처리(이하, 처리군 2) 후 각 시간대별로 변화된 유전자를 검색하였다. 구체적으로는, 각질형성세포를 우태아 뇌하수체 추출물을 함유하지 않은 각질세포 배양액에서 4 일간 키운 후 사이클로덱스트린에 포집된 수용성 여성호르몬 10 nM을 첨가(처리군 1) 또는 여성호르몬 10 nM과 ICI-182780 100 nM을 동시 처리(처리군 2)하였다. 에탄올을 용매로 사용하지 않고, 사이클로덱스트린에 포집된 여성호르몬을 사용한 이유는 여성호르몬 수용체 신호전달 과정에 에탄올이 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 음성대조군으로는 여성호르몬 또는 ICI-182780 없이 동일한 양의 사이클로덱스트린만을 처리한 각질형성세포를 준비하였다. 각 물질 처리 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 경과한 시점에서 시료를 얻는다. 24시간 경과 시점의 세포의 모습을 나타낸 도 1에 의하면, 특별한 세포 독성은 관찰되지 않았다.
그 다음, 유세포 분석법 (flow cytometry)을 이용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. 이는 FACStarPLUS (Becton Dickinson) 세포분석기를 이용하여 세포 내 DNA 양을 측정하여 각 세포주기에 따른 DNA 양의 차이를 이용함으로써, G0/G1, S, G2/M에 해당하는 세포 수를 측정하는 방법이다. 구체적으로는, 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbeco's Phosphate-buffered saline)(pH 7.2)에 DNA에 대한 형광 염료인 요오드화 프로피디움 (propidium iodide, PI) (Sgma) 20 g/ml, RNase (Boehringer Mannheim) 2.2 mg/ml, 노니데트(Nonidet) P40 (Signa) 0.5 % v/v, EDTA 0.5 mM를 용해시킨 DNA 염색 용액을 15분간 세포에 처리한 후, FACStarPLUS (Becton Dickinson) 세포분석기를 이용하여 분석하였다. 488 nm 아르곤레이져를 사용하였고, 620 nm에서 요오드화 프로피디움의 적색 형광을 측정하여 세포내 DNA 양을 측정하였다. 도 2의 형광 유세포분석 결과에 의하면, 여성호르몬 처리에 의해(처리군 1) 세포주기상의 G0/G1에 해당하는 세포의 비율이 72.92 %에서 67.77 %로 감소하였고, S기와 G2/M기에 해당하는 세포의 비율이 각각 7.93 %, 16.84 %에서 8.32 %, 20.31 %로 증가하여 세포 분열이 증가하였음을 알 수 있다.
<실시예 2.인체 세포로부터 RNA 채취>
3차례 계대 배양한 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 트리졸(trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) )을 첨가해 세포를 분쇄시킨 후 클로로포름을 넣어 상층액의 RNA를 분리하였다. 얻어진 상층액의 RNA를 농축하기 위해 동량의 이소프로파놀을 넣고 원심분리하여 침전된 RNA를 얻고, 염기 제거를 위해 70% 에탄올로 침전된 RNA를 세척하였다.
<실시예 3.마이크로어레이 실험 및 데이터 분석>
14,000 개의 인간 전사체가 집적된 올리고마이크로어레이 (Gaiagene, seoul, Korea)를 사용하였다. 이 마이크로어레이 상에는 13,376 유전자와 704 개의 대조군 유전자가 집적되어 있다. 상기 채취한 RNA 20 μg으로부터 아미노-알릴 cDNA 라벨링 키트(Camino-allyl cDNA labeling kit) (Ambion, Austin, Texas, USA)를 이용하여 형광 염색된 cDNA 프로브를 제작하였다. 구체적으로는, 처리군 1의 RNA 시료, 처리군 2의 RNA 시료 및 음성대조군의 RNA 시료로부터 각각 Cy5, Cy3로 표지된 cDNA 프로브를 제작하였다. 3, 6, 12, 24, 48 시간 경과 후에 각 시간대별로 마이크로어레이 실험을 수행하였고, 염료(dye)에 의한 편차를 제거하기 위해 3번씩의 염료 스와핑(dye-swapping)을 수행하였다. Cy5와 Cy3 로 염색된 프로브는 16 시간 동안 55℃에서 혼성화를 수행한다.
마이크로어레이 이미지 분석을 위해 ImaGene 4.2 (Biodiscovery, Los Angeles, CA, USA)와 MAAS (Gaiagene, Seoul, Korea)를 사용하였고 SAM을 이용하여 통계적으로 유의미한 변화를 보이는 유전자를 선택하였다. 그 결과 여성호르몬에 의해 의미 있는 변화를 보이는 유전자를 추출한 것이 상기 표 1 및 표 2의 유전자들이고, 이들 유전자를 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분류 체계에 따라 기능별로 분류한 그림이 도 3이다. 또한 클러스터 프로그램을 이용하여 발현 패턴 별로 분류하였는데, 구체적으로는 여성호르몬 수용체 길항제인 ICI-182780 처리에 의해 발현 패턴 변화에 영향을 받는지 여부에 따라 여성호르몬 수용체 의존적, 비의존적 전사반응을 분류하였다. 도 4에는 상기 클러스트링 분석 결과가 도시되어 있다.
<실시예 4. Real-Time PCR 분석을 통한 마이크로어레이 결과의 검증>
폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 사이클로덱스트린에 포집된 수용성 여성호르몬 10 nM을 첨가하고 3, 6, 12, 24 경과 후 RNA를 분리하였다. RNA 1 ㎍을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 40유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT)16의 프라이머와 200유닛 수퍼스크립트 II<SuperScript II, GiboBRL>의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq)DNA 중합효소 0.04U (Perkin Elmer, Shelton, CT), 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl2, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액(Molecular Probes, Eugene, OR)이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 하기 표 4의 10μM의 프라이머 센스 및 안티센스를 첨가하여 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분인 사이클을 30사이클을 수행하였다.
유전자 기호 프라이머 종류 프라이머 서열
ARPP-19 센스(서열번호1) AAAGCCTGGAGGTTCAGATTTC
안티센스(서열번호2) GCAGTAGGAAGTTGCTTGTTCT
INSIG1 센스(서열번호3) CCTGGCATCATCGCCTGTT
안티센스(서열번호4) AGAGTGACATTCCTCTGGATCTG
SFN 센스(서열번호5) AGGCCGAACGCTATGAGGA
안티센스(서열번호6) CCTCGTTGCTTTTCTGCTCAA
STIP1 센스(서열번호7) CAAGGGCTATTCACGAAAAGCA
안티센스(서열번호8) TTTCAGTTGAGGGTTATTTGCCT
FDFT1 센스(서열번호9) ATGGAGTTCGTGAAATGCCTT
안티센스(서열번호10) TGCGACTGGTCTGATTGAGATA
CDKN1A 센스(서열번호11) GTCACTGTCTTGTACCCTTGTG
안티센스(서열번호12) CGGCGTTTGGAGTGGTAGAAA
CTNNB1 센스(서열번호13) GCTACTCAAGCTGATTTGATGGA
안티센스(서열번호14) GGTAGTGGCACCAGAATGGATT
TRIB3 센스(서열번호15) AAGCGGTTGGAGTTGGATGAC
안티센스(서열번호16) CACGATCTGGAGCAGTAGGT
CYR61 센스(서열번호17) ACCGCTCTGAAGGGGATCT
안티센스(서열번호18) ACTGATGTTTACAGTTGGGCTG
HNRPMa 센스(서열번호19) CTCTTAATGGACGCTGAAGGAAA
안티센스(서열번호20) GTAGCCATCACCTTTTGCATTG
HNRPMb 센스(서열번호21) GCGGCGACGGAGATCAAAA
안티센스(서열번호22) CCTCTTCTCATTCTGAGCAGGT
ITGB1BP1 센스(서열번호23) CGGATGGTGTGTTACGATGAC
안티센스(서열번호24) TGATAAACCCACAGGCTGTATTC
ARHGEF2 센스(서열번호25) ATGTCTCGGATCGAATCCCTC
안티센스(서열번호26) ACATGGTCATGCCTGAAACTG
BCL2L1 센스(서열번호27) CTGTGCGTGGAAAGCGTAGA
안티센스(서열번호28) TGCTGCATTGTTCCCATAGAG
KLF5 센스(서열번호29) TCAGTCGTAGACCAGTTCTTCA
안티센스(서열번호30) GTAGAGGCCAGTTCTCAGGTG
ARPC4 센스(서열번호31) AACGACACAACAAGCCGGAA
안티센스(서열번호32) TGGAGCCCTCAATCAGAACCT
PCNA 센스(서열번호33) GGCTCCATCCTCAAGAAGGTG
안티센스(서열번호34) GGGACGAGTCCATGCTCTG
NCOA4 센스(서열번호35) CTGGCTCCTCAAGAGTGAAAAA
안티센스(서열번호36) GCCAATCTGATAGGTCCATCTCA
PRDX1 센스(서열번호37) CGGAGATCATTGCTTTCAGTGA
안티센스(서열번호38) AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT
PSMD11 센스(서열번호39) GAAGAGGCAGTGCAAGTCAAA
안티센스(서열번호40) GGGTCGTACATACTTCAGGAGTC
CES2 센스(서열번호41) GATGATGGCGGACTCCATGTT
안티센스(서열번호42) TGTAGTTGCCCCCAAAGAAAC
PLAU 센스(서열번호43) GCTTGTCCAAGAGTGCATGGT
안티센스(서열번호44) AGGGCTGGTTCTCGATGGT
상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하여 도 5에 나타내었다. 대조군을 기준 1로 정한 후 각 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 측정하였다. 도 5에 의하면 Real-time PCR 결과는 마이크로어레이 결과와 일치함을 알 수 있다.
< 실시예 5. 프로모터 분석 및 전사 인자 검증>
NCBI Accession No. 기준으로 변화된 유전자의 프로모터 서열을 수집하였다. 업스트림 유전자 서열을 Ensembl genome database 로부터 확보한 후 전사개시 사이트로부터 2000 bp 업스트림 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다. 그리고 MatInspector (Quandt et al., 1995)와 Transfac (Knuppel et al., 1994)같은 motif를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용해 전사인자 결합 부위 (transcription factor binding site, TFBS)를 검색하였다. 검색된 전사인자 결합 부위 중 Fisher 통계, Z 통계, 하이퍼지오메트리 통계, Audic 통계 방법으로 프로모터 부위에 과다 출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 이렇게 선별된 전사인자 결합 부위가 상기 표 3에 나열되어 있다. 도 6은 여성 호르몬에 의해 발현 변화를 보이는 유전자 클러스터와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되어진 전사인자 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 추출하여 히트맵으로 시각화한 것이다.
<실시예 6. 여성 호르몬의 작용 과정에서 전사인자들의 중요성 확인>
상기 생물정보학 방법으로 추출된 전사인자들이 실제로 E2의 작용 과정에서 어떠한 중요성을 갖는지 확인하기 위하여, 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 여성호르몬을 처리했을 때 상기 전사인자들의 발현량을 보여주는 real-time PCR을 수행하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 실시예 4의 방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 사용한 프라이머는 하기 표 5에 정리하였다. XBP1의 경우는, 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 여성호르몬을 처리했을 때 mRNA양은 감소하나, 도 8c에서 확인할 수 있는 바와 같이 단백질 양은 증가한다.
유전자 기호 프라이머 종류 프라이머 서열
PITX2 센스(서열번호45) CACCATCCCCAGCCGTTAG
안티센스(서열번호46) CGCCCACGTCCTCATTCTT
TBX5 센스(서열번호47) GACCATCCCTATAAGAAGCCCT
안티센스(서열번호48) TGTGCCGACTCTGTCCTGTA
XBP1 센스(서열번호49) CCTACTGGATGCTTACAGTGACT
안티센스(서열번호50) AGTGTCCTCCCAAGAATGGTTTA
AP2C 센스(서열번호51) CTGTTGCTGCACGATCAGACA
안티센스(서열번호52) CAGGGACTGAGCAGAAGACCT
IKZF1 (LYF1,ZNFN1A1) 센스(서열번호53) GACGCACTCCGTCATTAAAGA
안티센스(서열번호54) CGACGTTACTTGCTAGTCTGTC
MYOG 안티센스(서열번호55) GCTGTATGAGACATCCCCCTA
센스(서열번호56) CGACTTCCTCTTACACACCTTAC
또한, 여성 호르몬에 의한 각질형성세포의 분열 반응에서 전사인자들의 역할을 확인하기 위하여, shRNA(small hairpin RNA) 기술을 이용하여 추출된 전사인자의 발현을 저하시킨 상태에서 여성 호르몬을 처리한 후, 세포 분열 지표인 사이클린 D2 (CCND2)및 노화지표 p21 (CDKN1A)단백질 (세포 분열을 억제하는 기능)의 발현 변화를 웨스턴 블로팅 기법으로 확인하였다.
구체적으로는, 우선 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 PITX2, TBX5, XBP1, TFAP2C, ZNFN1A1, MyoG의 shRNA를 생성하는 렌티바이러스 벡터(시그마 알드리치)를 처리하였다. 상기 렌티바이러스 벡터의 서열이 cDNA 서열형태로 하기 표 6에 기재되어 있다. 또한 생성된 shRNA 의 표적서열이 cDNA 서열형태 (발현을 저하시키고자 하는 유전자 mRNA에 대한 상보적인 cDNA 서열 형태)로 하기 표 6에 기재되어 있다.
유전자 올리고 서열 표적 서열
XBP1_#3 CCGGGAACAGCAAGTGGTAGATTTACTCGAGTAAATCTACCACTTGCTGTTCTTTTT (서열번호 57) GAACAGCAAGTGGTAGATTTA
(서열번호 58)
XBP1_#5 CCGGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATCTCGAGATTCGAGCCTTCTTTCGATCTTTTTT (서열번호 59) AGATCGAAAGAAGGCTCGAAT
(서열번호 60)
TBX5_#2 CCGGGCCGACGATCACAGATACAAACTCGAGTTTGTATCTGTGATCGTCGGCTTTTT (서열번호 61) GCCGACGATCACAGATACAAA
(서열번호 62)
TBX5_#4 CCGGGCTGCACAGAATGTCAAGAATCTCGAGATTCTTGACATTCTGTGCAGCTTTTT (서열번호 63) GCTGCACAGAATGTCAAGAAT
(서열번호 64)
PITX2_#2 CCGGCCCAGGCTATTCCTACAACAACTCGAGTTGTTGTAGGAATAGCCTGGGTTTTT (서열번호 65) CCCAGGCTATTCCTACAACAA
(서열번호 66)
PITX2_#3 CCGGCCAGTCTCAACAGCCTGAATACTCGAGTATTCAGGCTGTTGAGACTGGTTTTT (서열번호 67) CCAGTCTCAACAGCCTGAATA
(서열번호 68)
ZNFN1A1_#3 CCGGCCGTTGGTAAACCTCACAAATCTCGAGATTTGTGAGGTTTACCAACGGTTTTTG (서열번호 69) CCGTTGGTAAACCTCACAAAT
(서열번호 70)
ZNFN1A1_#4 CCGGGCCGAAGCTATAAACAGCGAACTCGAGTTCGCTGTTTATAGCTTCGGCTTTTTG (서열번호 71) GCCGAAGCTATAAACAGCGAA
(서열번호 72)
TFAP2C_#3 CCGGCCTATGTCTGTGAAGCCGAATCTCGAGATTCGGCTTCACAGACATAGGTTTTT (서열번호 73) CCTATGTCTGTGAAGCCGAAT
(서열번호 74)
TFAP2C_#4 CCGGGCCCAGCAACTGTGTAAAGAACTCGAGTTCTTTACACAGTTGCTGGGCTTTTT (서열번호 75) GCCCAGCAACTGTGTAAAGAA
(서열번호 76)
MYOG_#4 CCGGGTGTAAGGTGTGTAAGAGGAACTCGAGTTCCTCTTACACACCTTACACTTTTT (서열번호 77) GTGTAAGGTGTGTAAGAGGAA
(서열번호 78)
MYOG_#5 CCGGGCGCAGTGCCATCCAGTACATCTCGAGATGTACTGGATGGCACTGCGCTTTTT (서열번호 79) GCGCAGTGCCATCCAGTACAT
(서열번호 80)
렌티바이러스 벡터 처리 후 24시간 경과시점에 여성호르몬을 처리하고 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액 (PBS)로 세척하고, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mm DTT, 2M 티오우레아(thiourea), 2mM PMSF, 100mg/ml 류펩타인(leupeptine)이 함유된 단백질 추출 완충용액 500μl을 처리하고 10분간 상온에서 방치하였다. 그 후 4℃에서 10분간 15,000g의 중력가속도로 원심분리하고, 상층액을 수거한 후 바이오라드 프로테인 염색 시약(BIO-Rad Protein Dye Reagent ™)을 이용하여 단백질을 정량하였다.
20μg의 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리하고, 50V로 12 시간 동안 PDF(바이오라드)막에 블랏팅(blotting)하였다. 이 블랏을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후 일차 항체로는 안티-Pitx2(Santa Cruz), 안티-XBP-1 (Abcam), 안티-TFAP2C (Santa Cruz), 안티-TBX5 (Santa Cruz), 안티-XBP-1 (Santa Cruz), 안티-Myogenin (Pharmingen), 안티-ZNFN1A1 (Abcam), 안티-p21 (Cell Signaling Technology) 또는 안티-cyclin D1 항체(Santa Cruz)를 사용하였고, 홀스래디쉬 퍼록시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 이차 항체(아메르샴, amersham)와 아메르샴 사의 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence, "ECL") 키트를 이용하여 웨스트 블랏을 수행하였다. 반응시킨 블랏은 X선 후지 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인, 분석하였고, 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8에 의하면, 상기 표 6의 shRNA 를 이용하여 해당 전사인자의 발현을 저하시켰을 때, 여성 호르몬에 의한 사이클린 D2의 발현 증가가 억제(XBP1, AP2C. MyoG1, PITX2, ZNFN1A1) 되거나 더 증폭(TBX5) 됨을 확인할 수 있었다.
도 9에 의하면, 상기 표 6의 shRNA 를 이용하여 해당 전사인자의 발현을 저하시킨 후, 세포 분열을 억제하는 기능을 가진 노화지표 p21 단백질의 여성 호르몬에 의한 발현 감소 현상이 사라짐을 확인하였다. 또한, 전사인자의 발현을 저하시킬 경우, 여성호르몬 처리 이전의 p21 단백질 양 자체도 증가됨을 확인할 수 있었다.
즉, shRNA 기술을 이용하여 추출된 전사인자의 발현을 억제시킬 경우, 여성 호르몬에 의한 유전자 발현에 교란이 일어나는 것을 확인할 수 있다. 이를 real-time PCR로 확인한 결과가 도 10에 나타나있다.
도 1은 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성호르몬 처리(처리군 1), 여성호르몬과 여성호르몬의 길항제인 ICI-182780 처리(처리군 2), 무처리(음성 대조군) 후 24시간 경과 시점의 세포의 모습이다.
도 2는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성호르몬을 처리했을 때 세포 분열이 증가함을 보여주는 형광유세포분석 결과이다.
도 3은 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성호르몬 처리(처리군 1), 여성호르몬과 여성호르몬의 길항제인 ICI-182780 처리(처리군 2), 무처리(음성 대조군) 후의 유전자 발현 패턴 클러스트링 분석 결과이다.
도 4는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성호르몬을 처리한 후 발현이 변화된 유전자를 유전자 온톨로지(Ontology) 분류 체계에 따라 기능별로 분류한 그림이다.
도 5a-e는 여성 호르몬에 의한 유전자들의 발현 변화를 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과이다.
도 6은 여성 호르몬에 의해 변화한 유전자와 이를 조절하는 전사인자 간의 상호작용을 보여주는 매트릭스 맵이다.
도 7은 여성호르몬에 의한 전사인자들의 발현 변화를 보여주는 실시간(real-time) PCR 결과이다.
도 8a-f는 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 세포 분열 지표인 사이클린 D2의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 9는 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 노화 지표인 p21의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 10a-c는 전사인자의 발현을 shRNA로 억제시켰을 때 여성 호르몬에 의한 전사 반응의 변화를 보여주는 그림이다.
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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atggagttcg tgaaatgcct t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgcgactggt ctgattgaga ta 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtcactgtct tgtacccttg tg 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cggcgtttgg agtggtagaa a 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gctactcaag ctgatttgat gga 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtagtggca ccagaatgga tt 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagcggttgg agttggatga c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cacgatctgg agcagtaggt 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 accgctctga aggggatct 19 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 actgatgttt acagttgggc tg 22 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctcttaatgg acgctgaagg aaa 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gtagccatca ccttttgcat tg 22 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gcggcgacgg agatcaaaa 19 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cctcttctca ttctgagcag gt 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cggatggtgt gttacgatga c 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgataaaccc acaggctgta ttc 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atgtctcgga tcgaatccct c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acatggtcat gcctgaaact g 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctgtgcgtgg aaagcgtaga 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgctgcattg ttcccataga g 21 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tcagtcgtag accagttctt ca 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtagaggcca gttctcaggt g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aacgacacaa caagccggaa 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tggagccctc aatcagaacc t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ggctccatcc tcaagaaggt g 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gggacgagtc catgctctg 19 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ctggctcctc aagagtgaaa aa 22 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gccaatctga taggtccatc tca 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cggagatcat tgctttcagt ga 22 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aggtgtattg acccatgcta gat 23 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gaagaggcag tgcaagtcaa a 21 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gggtcgtaca tacttcagga gtc 23 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gatgatggcg gactccatgt t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 tgtagttgcc cccaaagaaa c 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gcttgtccaa gagtgcatgg t 21 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 agggctggtt ctcgatggt 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 caccatcccc agccgttag 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgcccacgtc ctcattctt 19 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gaccatccct ataagaagcc ct 22 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tgtgccgact ctgtcctgta 20 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cctactggat gcttacagtg act 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 agtgtcctcc caagaatggt tta 23 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctgttgctgc acgatcagac a 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cagggactga gcagaagacc t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gacgcactcc gtcattaaag a 21 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cgacgttact tgctagtctg tc 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gctgtatgag acatccccct a 21 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 cgacttcctc ttacacacct tac 23 <210> 57 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 57 ccgggaacag caagtggtag atttactcga gtaaatctac cacttgctgt tcttttt 57 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gaacagcaag tggtagattt a 21 <210> 59 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 59 ccggagatcg aaagaaggct cgaatctcga gattcgagcc ttctttcgat ctttttt 57 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 agatcgaaag aaggctcgaa t 21 <210> 61 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 61 ccgggccgac gatcacagat acaaactcga gtttgtatct gtgatcgtcg gcttttt 57 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gccgacgatc acagatacaa a 21 <210> 63 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 63 ccgggctgca cagaatgtca agaatctcga gattcttgac attctgtgca gcttttt 57 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gctgcacaga atgtcaagaa t 21 <210> 65 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 65 ccggcccagg ctattcctac aacaactcga gttgttgtag gaatagcctg ggttttt 57 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 cccaggctat tcctacaaca a 21 <210> 67 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 67 ccggccagtc tcaacagcct gaatactcga gtattcaggc tgttgagact ggttttt 57 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 ccagtctcaa cagcctgaat a 21 <210> 69 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 69 ccggccgttg gtaaacctca caaatctcga gatttgtgag gtttaccaac ggtttttg 58 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ccgttggtaa acctcacaaa t 21 <210> 71 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 71 ccgggccgaa gctataaaca gcgaactcga gttcgctgtt tatagcttcg gctttttg 58 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 gccgaagcta taaacagcga a 21 <210> 73 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 73 ccggcctatg tctgtgaagc cgaatctcga gattcggctt cacagacata ggttttt 57 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 cctatgtctg tgaagccgaa t 21 <210> 75 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 75 ccgggcccag caactgtgta aagaactcga gttctttaca cagttgctgg gcttttt 57 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gcccagcaac tgtgtaaaga a 21 <210> 77 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 77 ccgggtgtaa ggtgtgtaag aggaactcga gttcctctta cacaccttac acttttt 57 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 gtgtaaggtg tgtaagagga a 21 <210> 79 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 79 ccgggcgcag tgccatccag tacatctcga gatgtactgg atggcactgc gcttttt 57 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 gcgcagtgcc atccagtaca t 21

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  9. 여성 호르몬 결핍에 의한 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법으로서,
    세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및
    시험 화합물 처리 후 세포 내 R3HCC1 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계를 포함하는 여성 호르몬 결핍에 의한 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포 내 R3HCC1 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계에 부가하여,
    시험 화합물 처리 후 세포 내 IINSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1, TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계를 포함하는 여성 호르몬 결핍에 의한 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 세포 내 R3HCC1 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계에 부가하여,
    시험 화합물 처리 후 세포 내 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지 확인하는 단계를 포함하는 여성 호르몬 결핍에 의한 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
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