KR101317024B1 - 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
여성 호르몬에 의해 피부 각질형성세포에서 발현 패턴이 변화하는 유전자를 확인하고, 그 정보를 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성의 피부 노화를 억제할 수 있는 노화 억제제 스크리닝에 이용하는 방법을 개시한다.
Description
본 발명은 노화 억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
사람의 유전체는 3x109개의 염기쌍으로, 대략 5 만개의 유전자를 가지고 있는 것으로 추측되며, 하나의 세포에서 발현되는 기능성 유전자의 개수는 대략 10,000개 정도로 추정된다. 즉 50,000개의 유전자로부터 약 10,000개의 단백질만을 선택적으로 만들어내고 있으며, 어떤 단백질을 발현하느냐에 따라 그 세포의 기능적 특성이 결정된다. 세포의 유전자 발현 특성의 차이는 단지 서로 다른 세포 간에서만 나타나는 것이 아니며, 동일한 세포의 병적인 상황, 예를 들면 젊은 세포와 노화된 세포 간에도 유전자 발현 특성의 차이가 나타난다. 종래의 생명과학은 이러한 유전자 발현의 변화를 일대일의 관계로부터 찾았으나, 특정 단백질의 작용은 하나의 단백질에만 국한되는 것이 아니라 다양한 단백질의 발현에 관여하며, 세포의 특성 또한 하나의 특정 단백질에 의하여 결정되는 것이 아니라 다양한 단백질들의 특성이 총체적으로 조화를 이룸으로써 결정된다는 점을 생각할 때 종래의 접근은 매우 제한적일 수밖에 없다.
피부의 노화 과정 또한 다른 생리 현상과 비슷하게, 외부 자극(UV, ROS 등)과 세포 내에 내재적으로 존재하는 인자(유전자, 단백질)의 상호 작용에 의해 결정되므로 이런 여러 인자들을 아울러 관찰할 필요가 있다. 하지만 지금까지 피부 노화에 대한 연구는 노화를 유도하는 외적 인자에 의한 세포/조직 내의 내적 인자의 변화를 모니터하는 것이었으므로, 연령 증가에 따른 내재적 노화를 이해하는데 한계가 있었다. 또한, 피부 노화의 여러 현상과 노화 사이의 인과 관계가 명확하지 않기 때문에 효과적인 노화 조절 방법이 개발되지 못하고 있고, 노화 피부 세포의 특성을 총체적으로 이해하기 위해 다양한 단백질들의 특성을 이해하려는 시도 또한 효능 물질(RA, 진세노사이드 등) 이나 자극원(UV, ROS)을 세포에 처리한 배양 시스템 연구에 국한되어 그 한계를 가지고 있다.
연령 증가에 따른 여성 피부의 내재적 노화와 관련하여, 폐경기 즈음 여성이 경험하게 되는 매우 갑작스런 피부 변화를 근거로 여성 호르몬의 결핍이 하나의 원인으로 지목되고 있다. 특히, 활성을 가지는 여성 호르몬인 17 베타-에스트라디올(E2)은 피부에서 콜라겐의 함량과 질을 개선시키고, 피부의 두께를 증가시키며, 혈관 형성을 촉진시킨다고 알려져 있다. 또한, 여성 호르몬은 여성의 표피에서의 세포분열 및 피부의 상처 치유 속도 및 정도를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
그러나 이와 같이 여성 호르몬이 피부에 미치는 여러 영향에 대한 중요성이 부각되고 있음에도 불구하고, 여성 호르몬의 피부에서의 작용점이나 작용 기작에 대한 세포 수준, 또는 세포 하위 수준에서의 연구는 매우 미흡하다. 또한 표피의 미세 환경에서의 여성 호르몬 작용 기작에 대한 연구는 충분히 진행되지 못하였다. 그리고 E2에 의한 특정 유전자 개개의 발현 조절에 초점이 맞추어진 최근의 연구는 E2에 대한 각질 세포의 반응을 전체적으로 설명하기에 한계가 있다.
E2의 작용은 핵에 존재하는 특정 수용체(estrogen receptors)를 경유하는 과정과 세포막에서 시작되는 신호 전달 과정(membrane-initiated signal transduction pathways)으로 크게 나누어지고 이 과정에 참여하는 수 많은 인자들 간의 상호 작용이 복잡하게 얽혀 있는 것으로 밝혀지고 있다.
본 발명자들은 폐경기 여성의 피부 조직으로부터 분리한 각질형성세포에서 여성 호르몬에 의해 그 발현 패턴이 변화되는 유전자 및 이들 유전자의 발현을 조절하는 전사인자 유전자를 생물정보학 기법으로 추출하여, 이를 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부의 내재적 노화 진단을 위한 분자 표적으로 새로이 규명하였다. 이를 통해 본 발명은 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 개발을 위한 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계를 포함하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 시험 화합물 처리 후 세포 내 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지 확인하는 단계를 포함하는 노화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 SREBF1(SREBP1), LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR), IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), TBP, SP1, HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1(AML1) 및 ZEB1 (AREB6) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 및 유니버설(universal) 프로모터를 포함하는 플라스미드, 및 상기 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전사인자가 결합하는 DNA 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 세포에 트랜스펙션시키는 단계; 상기 세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 시험 화합물이 상기 리포터 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 노화 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 여성 호르몬에 의해 피부 유래 각질형성세포에서 기준치 이상으로 발현이 증가되는 유전자와 발현이 감소되는 유전자, 및 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자 유전자를 여성 호르몬의 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화에 대한 마커 유전자로 하여, 시험 화합물이 상기 유전자들의 발현 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인함을 통해 노화 억제제로 이용 가능한지 알 수 있게 한다. 또한 상기 유전자들을 이용하여 피부 노화 정도를 빠르게 진단할 수 있게 하며, 이들 유전자를 피부 노화 억제제 개발을 위한 유전자 타겟으로 활용하고, 개발된 피부 노화 억제제를 평가하는 방법으로 활용할 수 있다.
도 1은 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬 처리(처리군 1), 여성 호르몬과 여성 호르몬의 길항제인 ICI-182780 처리(처리군 2), 무처리(음성 대조군) 후 24시간 경과 시점의 세포의 모습이다.
도 2는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리했을 때 세포 분열이 증가함을 보여주는 형광 유세포분석 결과이다.
도 3은 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬 처리(처리군 1), 여성 호르몬과 여성 호르몬의 길항제인 ICI-182780 처리(처리군 2), 무처리(음성 대조군) 후의 유전자 발현 패턴 클러스트링 분석 결과이다.
도 4는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리한 후 발현이 변화된 유전자를 유전자 온톨로지(Ontology) 분류 체계에 따라 기능별로 분류한 그림이다.
도 5 내지 도 9는 여성 호르몬에 의한 유전자들의 발현 변화를 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 여성 호르몬에 의해 변화한 유전자와 이를 조절하는 전사인자 간의 상호 작용을 보여주는 매트릭스 맵이다.
도 11은 여성 호르몬에 의한 전사인자들의 발현 변화를 보여주는 실시간(real-time) PCR 결과이다.
도 12 내지 17은 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 세포 분열 지표인 사이클린 D2의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 18은 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 노화 지표인 p21의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 19 내지 21은 전사인자의 발현을 shRNA로 억제시켰을 때 여성 호르몬에 의한 전사 반응의 변화를 보여주는 그림이다.
도 2는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리했을 때 세포 분열이 증가함을 보여주는 형광 유세포분석 결과이다.
도 3은 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬 처리(처리군 1), 여성 호르몬과 여성 호르몬의 길항제인 ICI-182780 처리(처리군 2), 무처리(음성 대조군) 후의 유전자 발현 패턴 클러스트링 분석 결과이다.
도 4는 폐경기 여성의 피부에서 유래한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리한 후 발현이 변화된 유전자를 유전자 온톨로지(Ontology) 분류 체계에 따라 기능별로 분류한 그림이다.
도 5 내지 도 9는 여성 호르몬에 의한 유전자들의 발현 변화를 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 여성 호르몬에 의해 변화한 유전자와 이를 조절하는 전사인자 간의 상호 작용을 보여주는 매트릭스 맵이다.
도 11은 여성 호르몬에 의한 전사인자들의 발현 변화를 보여주는 실시간(real-time) PCR 결과이다.
도 12 내지 17은 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 세포 분열 지표인 사이클린 D2의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 18은 전사인자의 발현을 억제시켰을 때 노화 지표인 p21의 발현 변화를 보여주는 그림이다.
도 19 내지 21은 전사인자의 발현을 shRNA로 억제시켰을 때 여성 호르몬에 의한 전사 반응의 변화를 보여주는 그림이다.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 여성 호르몬에 의해 피부에서 유래한 각질형성세포에서 기준치 이상으로 발현이 증가되는 91종의 유전자와 발현이 감소되는 76종의 유전자, 이들 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 전사인자 결합 부위로부터 생물정보학 기술을 이용해 추출한 전사인자 유전자 27종을 발굴하였으며, 이들이 폐경기 여성의 피부 노화와 관련이 있다는 사실은 아직까지 보고된 바 없다.
하기 표 1은 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성 호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 증가한 유전자, 표 2는 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성 호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 감소한 유전자를 나열한 것이다. GBAcc는 NCBI의 genebank accession ID를 의미한다.
GBAcc | 유전자 이름 | 공식유전자심볼 |
BM759549 | Aldolase C, fructose-bisphosphate | ALDOC |
BM788742 | Armadillo repeat containing 6 | ARMC6 |
BM766969 | Actin related protein 2/3 complex, subunit 4, 20kDa | ARPC4 |
BM795885 | BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 1 | BNIP1 |
BM792946 | Chromosome 1 open reading frame 122 | C1orf122 |
BM754866 | Chromosome 20 open reading frame 19 | C20orf19 |
BM762306 | Chromosome 3 open reading frame 1 | C3orf1 |
BM740544 | Chromosome 9 open reading frame 88 | C9orf88 |
AI796642, BM743084 | CAP, adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast) | CAP1 |
BM790712 | Cyclin D2 | CCND2 |
BM754343 | Chaperonin containing TCP1, subunit 5 (epsilon) | CCT5 |
BM750659 | CD47 molecule | CD47 |
AB014522 | Cytoplasmic linker associated protein 1 | CLASP1 |
BM750709 | Chloride intracellular channel 5 | CLIC5 |
BM748783 | CSE1 chromosome segregation 1-like (yeast) | CSE1L |
BM786046 | Catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa | CTNNB1 |
BM794137 | Chromosome X open reading frame 26 | CXorf26 |
BM782578 | Cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 | CYR61 |
BM791387 | DEP domain containing 6 | DEPDC6 |
BM979081 | Der1-like domain family, member 3 | DERL3 |
BM782883 | DiGeorge syndrome critical region gene 6-like | DGCR6L |
BM749552 | DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9 | DHX9 |
BM759512, BM770073 | Desmoplakin | DSP |
BM737612 | Echinoderm microtubule associated protein like 3 | EML3 |
BM785896 | Family with sequence similarity 8, member A1 | FAM8A1 |
BM781868 | Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1 | FDFT1 |
BM791018 | Farnesyl diphosphate synthase (farnesyl pyrophosphate synthetase, dimethylallyltranstransferase, geranyltranstransferase) | FDPS |
BM738725 | GIPC PDZ domain containing family, member 1 | GIPC1 |
BM792998 | Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 | HNRPA3 |
BM745313 | Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M | HNRPM |
BM739441 | HtrA serine peptidase 1 | HTRA1 |
BM772782 | IMP3, U3 small nucleolar ribonucleoprotein, homolog (yeast) | IMP3 |
BM794327 | Insulin induced gene 1 | INSIG1 |
BM786790 | Iroquois homeobox protein 2 | IRX2 |
BM792931 | Integrin beta 1 binding protein 1 | ITGB1BP1 |
BM754695 | Kinesin family member 15 | KIF15 |
BM770718 | Lactate dehydrogenase A | LDHA |
BM743834 | LEM domain containing 2 | LEMD2 |
BM773111 | Lamin B2 | LMNB2 |
BM759079 | Similar to hypothetical protein MGC27019 | LOC389833 |
CB104921 | Similar to bK246H3.1 (immunoglobulin lambda-like polypeptide 1, pre-B-cell specific) | LOC91316 |
BM767087 | Lymphocyte antigen 6 complex, locus D | LY6D |
BM788702 | Macrophage erythroblast attacher | MAEA |
BM753075 | Midnolin | MIDN |
BM751644 | Microphthalmia-associated transcription factor | MITF |
BM049852, BM792810 | Mevalonate kinase (mevalonic aciduria) | MVK |
BM768333 | Myeloma overexpressed 2 | MYEOV2 |
BM767045 | Nuclear receptor coactivator 4 | NCOA4 |
BM783408 | Neuroepithelial cell transforming gene 1 | NET1 |
BM795368 | Nuclear distribution gene C homolog (A. nidulans) | NUDC |
BM792605 | Platelet-activating factor acetylhydrolase, isoform Ib, alpha subunit 45kDa | PAFAH1B1 |
BM782132 | Proliferating cell nuclear antigen | PCNA |
BM748943 | Pelota homolog (Drosophila) | PELO |
BM792234 | Pescadillo homolog 1, containing BRCT domain (zebrafish) | PES1 |
BM763958 | Phosphatidylinositol glycan, class C | PIGC |
BM763943 | Phosphatidylinositol transfer protein, alpha | PITPNA |
BM785430 | Paired-like homeodomain transcription factor 1 | PITX1 |
BM751239 | Pyruvate kinase, muscle | PKM2 |
BM760618 | Polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide F | POLR2F |
BM770840 | Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 13 like | PPP1R13L |
BM790065 | Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2 | PPP4R2 |
BM786452 | Palmitoyl-protein thioesterase 1 (ceroid-lipofuscinosis, neuronal 1, infantile) | PPT1 |
BM791369 | Peroxiredoxin 1 | PRDX1 |
BC034545 | PRP8 pre-mRNA processing factor 8 homolog (yeast) | PRPF8 |
BM751738, BM787248 | Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 1 | PSMD1 |
BM791065 | Proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 11 | PSMD11 |
BM793399 | R3H domain and coiled-coil containing 1 | R3HCC1 |
BM744761 | Arginyl-tRNA synthetase | RARS |
BM741368 | Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 7 | RASSF7 |
BC005290 | RNA (guanine-7-) methyltransferase | RNMT |
BM741551 | Ribosomal protein L26 | RPL26 |
BM787845 | Ribonucleotide reductase M1 polypeptide | RRM1 |
BE928214 | R-spondin homolog (Xenopus laevis) | RSPO1 |
BM786739 | RUN and TBC1 domain containing 1 | RUTBC1 |
BM737849 | S100 calcium binding protein A2 | S100A2 |
BM790077 | Secretory carrier membrane protein 3 | SCAMP3 |
BM788902 | Stratifin | SFN |
BM767159 | Splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding protein associated) | SFPQ |
BM762738 | Splicing factor, arginine/serine-rich 1 (splicing factor 2, alternate splicing factor) | SFRS1 |
BM739117, BM789779, BM792207 | Splicing factor, arginine/serine-rich 2 | SFRS2 |
BM755276 | Stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing protein) | STIP1 |
BM755576 | TAR DNA binding protein | TARDBP |
BQ082251 | TBC1 domain family, member 4 | TBC1D4 |
BM789455 | Transferrin receptor (p90, CD71) | TFRC |
BM756004 | Triosephosphate isomerase 1 | TPI1 |
BM744635 | Tubulin, beta | TUBB |
BM773030 | Tubulin, beta 3 | TUBB3 |
BM771505 | Von Hippel-Lindau tumor suppressor | VHL |
BM792805 | WD repeat domain 74 | WDR74 |
BM749405 | Zinc fingers and homeoboxes 1 | ZHX1 |
BM770317 | Zinc finger protein 302 | ZNF302 |
GenBank | 유전자 이름 | 공식 유전자 심볼 |
BM740608 | Actin, beta | ACTB |
BM768621 | ADAM metallopeptidase domain 8 | ADAM8 |
BM749602 | Ankyrin repeat and IBR domain containing 1 | ANKIB1 |
BM765479, BM782554 | Rho/rac guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2 | ARHGEF2 |
BM794293 | ADP-ribosylation factor-like 16 | ARL16 |
BM762356 | Cyclic AMP phosphoprotein, 19 kD | ARPP-19 |
BM741157 | BCL2-like 1 | BCL2L1 |
BM793770 | Chromosome 17 open reading frame 40 | C17orf40 |
BM751046 | Calcium binding and coiled-coil domain 1 | CALCOCO1 |
BM757056 | Cyclin B1 interacting protein 1 | CCNB1IP1 |
BM749946 | CUB domain containing protein 1 | CDCP1 |
BM753145 | Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) | CDKN1A |
BM755133 | Carboxylesterase 2 (intestine, liver) | CES2 |
BM786965 | Chromodomain helicase DNA binding protein 2 | CHD2 |
BM752296 | Coatomer protein complex, subunit alpha | COPA |
BM787147 | Death associated protein 3 | DAP3 |
BM745250 | Dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) | DKK1 |
BM792504 | DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 11 | DNAJB11 |
BM755356 | Dynein, cytoplasmic 1, heavy chain 1 | DYNC1H1 |
BM790644 | Eukaryotic translation initiation factor 1 | EIF1 |
BM784466 | Eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 2 | EIF4A2 |
BM787313 | Eukaryotic translation initiation factor 5 | EIF5 |
BM790578 | Elongation factor, RNA polymerase II, 2 | ELL2 |
BM750932, BM754350 | Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase | EPRS |
AU280079 | Coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor) | F3 |
BM739071 | Family with sequence similarity 102, member B | FAM102B |
BM788839 | Family with sequence similarity 89, member B | FAM89B |
BM792813 | Hypothetical protein FLJ22795 | FLJ22795 |
BM759296 | CXYorf1-related protein | FLJ25222 |
BM761603 | FOS-like antigen 1 | FOSL1 |
BM751078 | Follistatin-like 3 (secreted glycoprotein) | FSTL3 |
BM751152 | Fragile X mental retardation, autosomal homolog 2 | FXR2 |
BM751418 | Golgi autoantigen, golgin subfamily a, 4 | GOLGA4 |
BM745177 | G protein-coupled receptor 56 | GPR56 |
BM788582 | Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor) | HIF1A |
BM746717 | Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like | HNRPDL |
BM763048 | Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 1 | HS3ST1 |
BM762289 | Interphase cyctoplasmic foci protein 45 | ICF45 |
BM773187 | Integrin, beta 4 | ITGB4 |
BM751795 | Kruppel-like factor 5 (intestinal) | KLF5 |
BM751030 | Kruppel-like factor 6 | KLF6 |
BM741864 | Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta | MAP1LC3B |
BM788834 | Mitogen-activated protein kinase kinase 3 | MAP2K3 |
BM784775 | MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2 | MKNK2 |
BM741311 | Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila) | MLL |
BM761778 | Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 4 | MLLT4 |
BM784915 | Mercaptopyruvate sulfurtransferase | MPST |
BM756630 | Nuclear receptor coactivator 3 | NCOA3 |
BM786674 | NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 3, 10kDa | NDUFV3 |
BM749562, BM753935, BM787950 | Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 | NFE2L2 |
BM745221 | Notch homolog 1, translocation-associated (Drosophila) | NOTCH1 |
BM786385 | Niemann-Pick disease, type C1 | NPC1 |
AK000933 | Opsin 3 (encephalopsin, panopsin) | OPN3 |
BM771495 | Origin recognition complex, subunit 4-like (yeast) | ORC4L |
BM790345 | Poly(A) binding protein, cytoplasmic 1 | PABPC1 |
BM769219 | Phosphatidylinositol glycan, class H | PIGH |
BM761640, BM781963 | Plasminogen activator, urokinase | PLAU |
BM773147 | Protein kinase D2 | PRKD2 |
BM794592 | Protease, serine, 8 (prostasin) | PRSS8 |
BM762848 | Phosphoserine aminotransferase 1 | PSAT1 |
BM761644 | PTK6 protein tyrosine kinase 6 | PTK6 |
BM787956 | Protein tyrosine phosphatase type IVA, member 1 | PTP4A1 |
BM745237 | Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 12 | PTPN12 |
BM744521 | Phosphorylase, glycogen; brain | PYGB |
BM787758 | Reticulon 3 | RTN3 |
BM742646 | RuvB-like 1 (E. coli) | RUVBL1 |
BM744942 | Seryl-tRNA synthetase | SARS |
BM759590 | SEC24 related gene family, member D (S. cerevisiae) | SEC24D |
BM790371 | Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1 | SLC2A1 |
BM787478 | Solute carrier family 38, member 2 | SLC38A2 |
BM756519 | Solute carrier family 3 (activators of dibasic and neutral amino acid transport), member 2 | SLC3A2 |
BM786054 | Thrombospondin 1 | THBS1 |
BM773292 | Tribbles homolog 3 (Drosophila) | TRIB3 |
BM753459 | Tyrosyl-tRNA synthetase | YARS |
BM741902 | Zinc finger protein 36, C3H type, homolog (mouse) | ZFP36 |
CB104867 | Zinc finger protein 337 | ZNF337 |
이상의 폐경기 여성 피부에서 유래한 각질형성세포에서 여성 호르몬에 의해 기준치 이상으로 발현이 증가하거나 감소한 유전자에 대하여 프로모터 염기 서열을 분석한 결과, 통계값(fisher 통계, Z 통계, 하이퍼지오메트리(Hypergeometric) 통계, Audic 통계)을 기준으로 과다 관찰되는 전사인자 결합 영역(TRE)을 추출하고 그 출현 빈도 및 그에 결합되는 전사인자를 표기한 것이 하기 표 3이다.
TRE | TFs |
TFs
의
Accession ID |
프로모터에서 관찰되는 빈도(%) | |
증가유전자군 | 감소유전자군 | |||
V$SREBP1_Q6 | SREBF1(SREBP1) | AB209609 | 66 | 0 |
V$LMO2COM_01 | LMO2 | NM_005574 | 52 | 0 |
V$AP2_Q6_01 | TFAP2A | NM_001032280 | 62 | 0 |
F$XBP1_Q2 | XBP1 | AK093842 | 60 | 0 |
V$MEF2_Q6 | MEF2A | AL831995 | 74 | 0 |
V$LEF1_Q2 | LEF1 | AK128255 | 64 | 0 |
V$OSF2_Q6 | RUNX2 (OSF2) | NM_004348 | 40 | 0 |
V$MAZR_01 | PATZ1 (MAZR) | NM_014323 | 40 | 0 |
V$AREB6_03 | ZEB1 (AREB6) | BX647794 | 18 | 0 |
V$HNF4_Q6 | HNF4A | NM_000457 | 72 | 52 |
V$AP2REP_01 | KLF12(AP2REP) | NM_007249 | 66 | 64 |
V$TTF1_Q6 | NKX2-1 (TTF1) | NM_003317 | 76 | 78 |
V$MYOD_Q6 | MYOD1 | NM_002478 | 74 | 78 |
V$AML1_01 | RUNX1(AML1) | NM_001001890 | 66 | 60 |
V$LYF1_01 | IKZF1(LYF1, ZNFN1A1) | AF432219 | 0 | 24 |
V$T3R_Q6 | THRA | AB209346 | 0 | 68 |
V$PITX2_Q2 | PITX2 | AK127829 | 0 | 24 |
V$NKX25_01 | NKX2-5 | BC025711 | 0 | 46 |
V$SOX5_01 | SOX5 | NM_152989 | 0 | 66 |
V$MYOGENIN_Q6 | MYOG | NM_002479 | 0 | 64 |
V$MEIS1_01 | MEIS1 | CR749827 | 0 | 64 |
V$IRF1_Q6 | IRF1 | AB209624 | 0 | 66 |
V$GATA3_01 | GATA3 | NM_001002295 | 0 | 78 |
V$TBX5_02 | TBX5 | NM_000192 | 0 | 48 |
V$AP1FJ_Q2 | AP1(FOS/JUN) | BX647104/ NM_002228 |
0 | 46 |
V$AREB6_02 | ZEB1 (AREB6) | BX647794 | 0 | 66 |
V$TBP_01 | TBP | BC110341 | 0 | 52 |
V$SP1_Q2_01 | SP1 | BQ774060 | 0 | 84 |
본 발명의 일측면은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및
상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 기준치 이하이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편으로서 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드,
또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드; 및
상기 폴리뉴클레오티드를 표면에 결합시킨 고상 지지체를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포의 전사체 중에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 전사체의 양이 기준치 이상이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일측면은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 기준치 이하이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및
상기 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 단편으로서 18-22개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 폴리뉴클레오티드들을 프라이머로 하여 증폭된 DNA 양이 기준치 이상이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일측면은 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양이 기준치 이하이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 하나 이상의 모노클로날 항체를 포함하며,
진단 대상 피부 유래 각질형성세포에서 상기 항체에 결합된 항원의 양이 기준치 이상이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일측면은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서,
진단 대상 각질형성세포에서 R3HCC1, INSIG1, RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 기준치 이하이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 피부의 노화를 진단하는 방법으로서,
진단 대상 각질형성세포에서 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 기준치 이상이면 여성 호르몬 결핍에 따른 노화 피부로 진단하는 피부 노화 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 키트에서 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 여성 호르몬에 의해 발현이 증가하거나 감소하는 마커 유전자의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 단편의 길이는 10개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직한데, 이는 프로브의 길이가 10bps이하이면 비특이적으로 결합되기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에서 프라이머로 사용되는 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 18-22개인 것이 바람직하다. 이는 프라이머의 길이가 18bps미만이면 비특이적으로 결합되고, 22bps를 초과하면 프라이머끼리 자체 결합하여 효율성이 떨어지며, 제작시에도 비용과 기술적인 면에서 비효율적이기 때문이다.
본 발명의 진단 키트에 포함된, 마커 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 일반적인 모노클로날 항체 제조 방법으로 제조된다.
또한 폐경기 여성의 피부 각질형성세포에서 여성 호르몬 처리에 의해 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 SREBF1(SREBP1), LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR); 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에 과다 관찰되는 전사인자인 IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), TBP, SP1; 및 발현이 증가하는 유전자와 감소하는 유전자에서 동시에 과다 관찰되는 전사인자인 HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1(AML1), ZEB1 (AREB6)의 전사조절 활성을 측정하여 피부 노화 억제제를 스크리닝하는 방법은 일반적인 분자생물학 기법에 따라 제조된 리포터 유전자 벡터를 이용할 수 있다.
구체적으로는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터에 SREBF1(SREBP1), LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR), ZEB1(AREB6), HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1 (AML1), RUNX1(AML1), IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, TBX5, AP1(FOS/JUN), ZEB1(AREB6), TBP 및 SP1 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 1), 및 상기 전사인자들이 결합하여 전사를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열인 TRE(Transcription Response Element)를 가지는 프로모터에 리포터 역할을 하는 반딧불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(플라스미드 2)를 사용한다. 플라스미드 2의 TRE 서열은, MatInspector (Quandt et al., 1995) 및 Transfac(Knuppel et al., 1994)과 같은, 모티프(motif)를 예측, 발견, 분석하는 프로그램에 표 1 및 2의 유전자들의 accession ID를 입력하여 서열을 검색한다. 플라스미드 1의 전사인자 유전자 부분은 표 3의 유전자들의 accession ID를 참고하여 준비한다. COS7 세포에 상기 전사인자 유전자를 지닌 플라스미드 1과 해당 TRE 프로모터-리포터 플라스미드 2를 동시에 트랜스펙션시킨 후 24시간 경과 시점에 피부 노화 억제제 후보 약물을 처리하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하면, 피부 노화 억제제 후보 약물이 상기 전사인자의 활성에 미치는 영향을 확인할 수 있다. 여성 호르몬 처리에 의해 발현이 증가하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 증가했을 때 효과적인 피부 노화 억제제라고 판단할 수 있고, 발현이 감소하는 유전자의 프로모터에서 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 세포의 루시퍼라제 활성이 감소했을 때 효과적인 피부 노화 억제제라고 할 수 있을 것이다. 발현이 증가, 감소하는 유전자의 프로모터에서 모두 과다 관찰되는 전사인자의 경우에는 보조적인 스크리닝 방법으로 활용될 수 있다.
이하, 구체예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 구체예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 한정하기 위한 것은 아니다.
[실시예 1] 인체 세포의 획득 및 여성 호르몬 처리 후 형광 세포 유속기 분석
55세 이상의 연령에 해당하는 한국인 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포(NHEKs)를 1 ml 당 0.5 μg 하이드로코티손, 5 ng 표피성장인자, 5 μg 인슐린, 0.5% 우태아 뇌하수체 추출물을 함유한 무혈청 각질세포배양 배지(Clonetics, Walkersville, MD)에서 배양한다. 실험에 사용된 모든 세포는 3차례 계대 배양된 것으로 한다. 여성 호르몬을 처리(이하, 처리군 1)하거나 여성 호르몬 수용체 길항제인 ICI를 여성 호르몬과 동시에 처리(이하, 처리군 2)한 후 각 시간대별로 변화된 유전자를 검색하였다. 구체적으로는, 각질형성세포를 우태아 뇌하수체 추출물을 함유하지 않은 각질세포 배양액에서 4 일간 키운 후 사이클로덱스트린에 포집된 수용성 여성 호르몬 10 nM을 첨가(처리군 1) 또는 여성 호르몬 10 nM과 ICI-182780 100 nM을 동시 처리(처리군 2)하였다. 에탄올을 용매로 사용하지 않고, 사이클로덱스트린에 포집된 여성 호르몬을 사용한 이유는 여성 호르몬 수용체 신호전달 과정에 에탄올이 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 음성 대조군으로는 여성 호르몬 또는 ICI-182780 없이 동일한 양의 사이클로덱스트린만을 처리한 각질형성세포를 준비하였다. 각 물질 처리 후 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 경과한 시점에서 시료를 얻는다. 24시간 경과 시점의 세포의 모습을 나타낸 도 1에 의하면, 특별한 세포 독성은 관찰되지 않았다.
그 다음, 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. 이는 FACStarPLUS(Becton Dickinson) 세포 분석기를 이용하여 세포 내 DNA 양을 측정하여 각 세포 주기에 따른 DNA 양의 차이를 이용함으로써, G0/G1, S, G2/M에 해당하는 세포 수를 측정하는 방법이다. 구체적으로는, 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(Dulbeco's Phosphate-buffered saline)(pH 7.2)에 DNA에 대한 형광 염료인 요오드화 프로피디움(propidium iodide, PI)(Sgma) 20 g/ml, RNase(Boehringer Mannheim) 2.2 mg/ml, 노니데트(Nonidet) P40(Signa) 0.5 % v/v, EDTA 0.5 mM를 용해시킨 DNA 염색 용액을 15분간 세포에 처리한 후, FACStarPLUS(Becton Dickinson) 세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 488 nm 아르곤레이져를 사용하였고, 620 nm에서 요오드화 프로피디움의 적색 형광을 측정하여 세포 내 DNA 양을 측정하였다. 도 2의 형광 유세포분석 결과에 의하면, 여성 호르몬 처리에 의해(처리군 1) 세포 주기상의 G0/G1에 해당하는 세포의 비율이 72.92 %에서 67.77 %로 감소하였고, S기와 G2/M기에 해당하는 세포의 비율이 각각 7.93 %, 16.84 %에서 8.32 %, 20.31 %로 증가하여 세포 분열이 증가하였음을 알 수 있다.
[실시예 2] 인체 세포로부터 RNA 채취
3차례 계대 배양한 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 트리졸(trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가해 세포를 분쇄시킨 후 클로로포름을 넣어 상층액의 RNA를 분리하였다. 얻어진 상층액의 RNA를 농축하기 위해 동량의 이소프로파놀을 넣고 원심 분리하여 침전된 RNA를 얻고, 염기 제거를 위해 70% 에탄올로 침전된 RNA를 세척하였다.
[실시예 3] 마이크로어레이 실험 및 데이터 분석
14,000 개의 인간 전사체가 집적된 올리고마이크로어레이(Gaiagene, seoul, Korea)를 사용하였다. 이 마이크로어레이 상에는 13,376 유전자와 704 개의 대조군 유전자가 집적되어 있다. 상기 채취한 RNA 20 μg으로부터 아미노-알릴 cDNA 라벨링 키트(Camino-allyl cDNA labeling kit)(Ambion, Austin, Texas, USA)를 이용하여 형광 염색된 cDNA 프로브를 제작하였다. 구체적으로는, 처리군 1의 RNA 시료, 처리군 2의 RNA 시료 및 음성 대조군의 RNA 시료로부터 각각 Cy5, Cy3로 표지된 cDNA 프로브를 제작하였다. 3, 6, 12, 24, 48 시간 경과 후에 각 시간대별로 마이크로어레이 실험을 수행하였고, 염료(dye)에 의한 편차를 제거하기 위해 3번씩의 염료 스와핑(dye-swapping)을 수행하였다. Cy5와 Cy3로 염색된 프로브는 16 시간 동안 55℃에서 혼성화를 수행한다.
마이크로어레이 이미지 분석을 위해 ImaGene 4.2(Biodiscovery, Los Angeles, CA, USA)와 MAAS(Gaiagene, Seoul, Korea)를 사용하였고 SAM을 이용하여 통계적으로 유의미한 변화를 보이는 유전자를 선택하였다. 그 결과 여성 호르몬에 의해 의미 있는 변화를 보이는 유전자를 추출한 것이 상기 표 1 및 표 2의 유전자들이고, 이들 유전자를 유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분류 체계에 따라 기능별로 분류한 그림이 도 4이다. 또한 클러스터 프로그램을 이용하여 발현 패턴 별로 분류하였는데, 구체적으로는 여성 호르몬 수용체 길항제인 ICI-182780 처리에 의해 발현 패턴 변화에 영향을 받는지 여부에 따라 여성 호르몬 수용체 의존적, 비의존적 전사반응을 분류하였다. 도 3에는 상기 클러스트링 분석 결과가 도시되어 있다.
[실시예 4] Real-Time PCR 분석을 통한 마이크로어레이 결과의 검증
폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 사이클로덱스트린에 포집된 수용성 여성 호르몬 10 nM을 첨가하고 3, 6, 12, 24 경과 후 RNA를 분리하였다. RNA 1 ㎍을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 40유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT)16의 프라이머와 200유닛 수퍼스크립트 II(SuperScript II, GiboBRL)의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰다. 이후 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq) DNA 중합효소 0.04U(Perkin Elmer, Shelton, CT), 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl2, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액(Molecular Probes, Eugene, OR)이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 하기 표 4의 10μM의 프라이머 센스 및 안티센스를 첨가하여 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 1분인 사이클을 30 사이클 수행하였다.
유전자 기호 | 프라이머 종류 | 프라이머 서열 |
ARPP-19 | 센스(서열번호1) | AAAGCCTGGAGGTTCAGATTTC |
안티센스(서열번호2) | GCAGTAGGAAGTTGCTTGTTCT | |
INSIG1 | 센스(서열번호3) | CCTGGCATCATCGCCTGTT |
안티센스(서열번호4) | AGAGTGACATTCCTCTGGATCTG | |
SFN | 센스(서열번호5) | AGGCCGAACGCTATGAGGA |
안티센스(서열번호6) | CCTCGTTGCTTTTCTGCTCAA | |
STIP1 | 센스(서열번호7) | CAAGGGCTATTCACGAAAAGCA |
안티센스(서열번호8) | TTTCAGTTGAGGGTTATTTGCCT | |
FDFT1 | 센스(서열번호9) | ATGGAGTTCGTGAAATGCCTT |
안티센스(서열번호10) | TGCGACTGGTCTGATTGAGATA | |
CDKN1A | 센스(서열번호11) | GTCACTGTCTTGTACCCTTGTG |
안티센스(서열번호12) | CGGCGTTTGGAGTGGTAGAAA | |
CTNNB1 | 센스(서열번호13) | GCTACTCAAGCTGATTTGATGGA |
안티센스(서열번호14) | GGTAGTGGCACCAGAATGGATT | |
TRIB3 | 센스(서열번호15) | AAGCGGTTGGAGTTGGATGAC |
안티센스(서열번호16) | CACGATCTGGAGCAGTAGGT | |
CYR61 | 센스(서열번호17) | ACCGCTCTGAAGGGGATCT |
안티센스(서열번호18) | ACTGATGTTTACAGTTGGGCTG | |
HNRPMa | 센스(서열번호19) | CTCTTAATGGACGCTGAAGGAAA |
안티센스(서열번호20) | GTAGCCATCACCTTTTGCATTG | |
HNRPMb | 센스(서열번호21) | GCGGCGACGGAGATCAAAA |
안티센스(서열번호22) | CCTCTTCTCATTCTGAGCAGGT | |
ITGB1BP1 | 센스(서열번호23) | CGGATGGTGTGTTACGATGAC |
안티센스(서열번호24) | TGATAAACCCACAGGCTGTATTC | |
ARHGEF2 | 센스(서열번호25) | ATGTCTCGGATCGAATCCCTC |
안티센스(서열번호26) | ACATGGTCATGCCTGAAACTG | |
BCL2L1 | 센스(서열번호27) | CTGTGCGTGGAAAGCGTAGA |
안티센스(서열번호28) | TGCTGCATTGTTCCCATAGAG | |
KLF5 | 센스(서열번호29) | TCAGTCGTAGACCAGTTCTTCA |
안티센스(서열번호30) | GTAGAGGCCAGTTCTCAGGTG | |
ARPC4 | 센스(서열번호31) | AACGACACAACAAGCCGGAA |
안티센스(서열번호32) | TGGAGCCCTCAATCAGAACCT | |
PCNA | 센스(서열번호33) | GGCTCCATCCTCAAGAAGGTG |
안티센스(서열번호34) | GGGACGAGTCCATGCTCTG | |
NCOA4 | 센스(서열번호35) | CTGGCTCCTCAAGAGTGAAAAA |
안티센스(서열번호36) | GCCAATCTGATAGGTCCATCTCA | |
PRDX1 | 센스(서열번호37) | CGGAGATCATTGCTTTCAGTGA |
안티센스(서열번호38) | AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT | |
PSMD11 | 센스(서열번호39) | GAAGAGGCAGTGCAAGTCAAA |
안티센스(서열번호40) | GGGTCGTACATACTTCAGGAGTC | |
CES2 | 센스(서열번호41) | GATGATGGCGGACTCCATGTT |
안티센스(서열번호42) | TGTAGTTGCCCCCAAAGAAAC | |
PLAU | 센스(서열번호43) | GCTTGTCCAAGAGTGCATGGT |
안티센스(서열번호44) | AGGGCTGGTTCTCGATGGT |
상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하여 도 5 내지 도 9에 나타내었다. 대조군을 기준 1로 정한 후 각 시료의 상대적인 mRNA 레벨을 측정하였다. 도 5 내지 도 9에 의하면 Real-time PCR 결과는 마이크로어레이 결과와 일치함을 알 수 있다.
[실시예 5] 프로모터 분석 및 전사 인자 검증
NCBI Accession No. 기준으로 변화된 유전자의 프로모터 서열을 수집하였다. 업스트림 유전자 서열을 Ensembl genome database로부터 확보한 후 전사개시 사이트로부터 2000 bp 업스트림 영역을 포함하는 게놈 서열을 확보하였다. 그리고 MatInspector(Quandt et al., 1995) 및 Transfac(Knuppel et al., 1994)과 같은 motif를 예측, 발견, 분석하는 프로그램을 이용해 전사인자 결합 부위 (transcription factor binding site, TFBS)를 검색하였다. 검색된 전사인자 결합 부위 중 Fisher 통계, Z 통계, 하이퍼지오메트리 통계, Audic 통계 방법으로 프로모터 부위에 과다 출현하는 전사인자 결합 부위를 선별하였다. 이렇게 선별된 전사인자 결합 부위가 상기 표 3에 나열되어 있다. 도 10은 여성 호르몬에 의해 발현 변화를 보이는 유전자 클러스터와 그 유전자 클러스터를 조절한 것으로 예측되어진 전사인자 간의 조절 네트워크의 연결 고리를 추출하여 히트맵으로 시각화한 것이다.
[실시예 6] 여성 호르몬의 작용 과정에서 전사인자들의 중요성 확인
상기 생물정보학 방법으로 추출된 전사인자들이 실제로 E2의 작용 과정에서 어떠한 중요성을 갖는지 확인하기 위하여, 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리했을 때 상기 전사인자들의 발현량을 보여주는 real-time PCR을 수행하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 실시예 4의 방법과 동일한 방법을 사용하였으며, 사용한 프라이머는 하기 표 5에 정리하였다. XBP1의 경우는, 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 여성 호르몬을 처리했을 때 mRNA양은 감소하나, 도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이 단백질 양은 증가한다.
유전자 기호 | 프라이머 종류 | 프라이머 서열 |
PITX2 | 센스(서열번호45) | CACCATCCCCAGCCGTTAG |
안티센스(서열번호46) | CGCCCACGTCCTCATTCTT | |
TBX5 | 센스(서열번호47) | GACCATCCCTATAAGAAGCCCT |
안티센스(서열번호48) | TGTGCCGACTCTGTCCTGTA | |
XBP1 | 센스(서열번호49) | CCTACTGGATGCTTACAGTGACT |
안티센스(서열번호50) | AGTGTCCTCCCAAGAATGGTTTA | |
AP2C | 센스(서열번호51) | CTGTTGCTGCACGATCAGACA |
안티센스(서열번호52) | CAGGGACTGAGCAGAAGACCT | |
IKZF1 (LYF1,ZNFN1A1) | 센스(서열번호53) | GACGCACTCCGTCATTAAAGA |
안티센스(서열번호54) | CGACGTTACTTGCTAGTCTGTC | |
MYOG | 안티센스(서열번호55) | GCTGTATGAGACATCCCCCTA |
센스(서열번호56) | CGACTTCCTCTTACACACCTTAC |
또한, 여성 호르몬에 의한 각질형성세포의 분열 반응에서 전사인자들의 역할을 확인하기 위하여, shRNA(small hairpin RNA) 기술을 이용하여 추출된 전사인자의 발현을 저하시킨 상태에서 여성 호르몬을 처리한 후, 세포 분열 지표인 사이클린 D2(CCND2) 및 노화지표 p21(CDKN1A) 단백질 (세포 분열을 억제하는 기능)의 발현 변화를 웨스턴 블로팅 기법으로 확인하였다.
구체적으로는, 우선 폐경기 여성의 피부에서 분리한 각질형성세포에 PITX2, TBX5, XBP1, TFAP2C, ZNFN1A1, MyoG의 shRNA를 생성하는 렌티바이러스 벡터(시그마 알드리치)를 처리하였다. 상기 렌티바이러스 벡터의 서열이 cDNA 서열 형태로 하기 표 6에 기재되어 있다. 또한 생성된 shRNA의 표적 서열이 cDNA 서열 형태(발현을 저하시키고자 하는 유전자 mRNA에 대한 상보적인 cDNA 서열 형태)로 하기 표 6에 기재되어 있다.
유전자 | 올리고 서열 | 표적 서열 |
XBP1_#3 | CCGGGAACAGCAAGTGGTAGATTTACTCGAGTAAATCTACCACTTGCTGTTCTTTTT (서열번호 57) | GAACAGCAAGTGGTAGATTTA (서열번호 58) |
XBP1_#5 | CCGGAGATCGAAAGAAGGCTCGAATCTCGAGATTCGAGCCTTCTTTCGATCTTTTTT (서열번호 59) | AGATCGAAAGAAGGCTCGAAT (서열번호 60) |
TBX5_#2 | CCGGGCCGACGATCACAGATACAAACTCGAGTTTGTATCTGTGATCGTCGGCTTTTT (서열번호 61) | GCCGACGATCACAGATACAAA (서열번호 62) |
TBX5_#4 | CCGGGCTGCACAGAATGTCAAGAATCTCGAGATTCTTGACATTCTGTGCAGCTTTTT (서열번호 63) | GCTGCACAGAATGTCAAGAAT (서열번호 64) |
PITX2_#2 | CCGGCCCAGGCTATTCCTACAACAACTCGAGTTGTTGTAGGAATAGCCTGGGTTTTT (서열번호 65) | CCCAGGCTATTCCTACAACAA (서열번호 66) |
PITX2_#3 | CCGGCCAGTCTCAACAGCCTGAATACTCGAGTATTCAGGCTGTTGAGACTGGTTTTT (서열번호 67) | CCAGTCTCAACAGCCTGAATA (서열번호 68) |
ZNFN1A1_#3 | CCGGCCGTTGGTAAACCTCACAAATCTCGAGATTTGTGAGGTTTACCAACGGTTTTTG (서열번호 69) | CCGTTGGTAAACCTCACAAAT (서열번호 70) |
ZNFN1A1_#4 | CCGGGCCGAAGCTATAAACAGCGAACTCGAGTTCGCTGTTTATAGCTTCGGCTTTTTG (서열번호 71) | GCCGAAGCTATAAACAGCGAA (서열번호 72) |
TFAP2C_#3 | CCGGCCTATGTCTGTGAAGCCGAATCTCGAGATTCGGCTTCACAGACATAGGTTTTT (서열번호 73) | CCTATGTCTGTGAAGCCGAAT (서열번호 74) |
TFAP2C_#4 | CCGGGCCCAGCAACTGTGTAAAGAACTCGAGTTCTTTACACAGTTGCTGGGCTTTTT (서열번호 75) | GCCCAGCAACTGTGTAAAGAA (서열번호 76) |
MYOG_#4 | CCGGGTGTAAGGTGTGTAAGAGGAACTCGAGTTCCTCTTACACACCTTACACTTTTT (서열번호 77) | GTGTAAGGTGTGTAAGAGGAA (서열번호 78) |
MYOG_#5 | CCGGGCGCAGTGCCATCCAGTACATCTCGAGATGTACTGGATGGCACTGCGCTTTTT (서열번호 79) | GCGCAGTGCCATCCAGTACAT (서열번호 80) |
렌티바이러스 벡터 처리 후 24시간 경과 시점에 여성 호르몬을 처리하고 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액(PBS)로 세척하고, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mm DTT, 2M 티오우레아(thiourea), 2mM PMSF, 100mg/ml 류펩타인(leupeptine)이 함유된 단백질 추출 완충용액 500μl을 처리하고 10분간 상온에서 방치하였다. 그 후 4℃에서 10분간 15,000g의 중력가속도로 원심 분리하고, 상층액을 수거한 후 바이오라드 프로테인 염색 시약(BIO-Rad Protein Dye Reagent ™)을 이용하여 단백질을 정량하였다.
20μg의 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리하고, 50V로 12 시간 동안 PDF(바이오라드)막에 블랏팅(blotting)하였다. 이 블랏을 5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후 일차 항체로는 안티-Pitx2(Santa Cruz), 안티-XBP-1(Abcam), 안티-TFAP2C(Santa Cruz), 안티-TBX5(Santa Cruz), 안티-XBP-1(Santa Cruz), 안티-Myogenin(Pharmingen), 안티-ZNFN1A1(Abcam), 안티-p21(Cell Signaling Technology) 또는 안티-cyclin D1 항체(Santa Cruz)를 사용하였고, 홀스래디쉬 퍼록시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 이차 항체(아메르샴, amersham)와 아메르샴 사의 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence, "ECL") 키트를 이용하여 웨스트 블랏을 수행하였다. 반응시킨 블랏은 X선 후지 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인, 분석하였고, 그 결과를 도 12 내지 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 12 내지 도 17에 의하면, 상기 표 6의 shRNA를 이용하여 해당 전사인자의 발현을 저하시켰을 때, 여성 호르몬에 의한 사이클린 D2의 발현 증가가 억제(XBP1, AP2C. MyoG1, PITX2, ZNFN1A1) 되거나 더 증폭(TBX5) 됨을 확인할 수 있었다.
도 18에 의하면, 상기 표 6의 shRNA를 이용하여 해당 전사인자의 발현을 저하시킨 후, 세포 분열을 억제하는 기능을 가진 노화지표 p21 단백질의 여성 호르몬에 의한 발현 감소 현상이 사라짐을 확인하였다. 또한, 전사인자의 발현을 저하시킬 경우, 여성 호르몬 처리 이전의 p21 단백질 양 자체도 증가됨을 확인할 수 있었다.
즉, shRNA 기술을 이용하여 추출된 전사인자의 발현을 억제시킬 경우, 여성 호르몬에 의한 유전자 발현에 교란이 일어나는 것을 확인할 수 있다. 이를 real-time PCR로 확인한 결과가 도 19 내지 21에 나타나있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (5)
- 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제의 스크리닝 방법으로서,
세포에 시험 화합물을 처리하는 단계; 및
시험 화합물 처리 후 세포 내 INSIG1 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계를 포함하는, 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 시험 화합물 처리 후 세포 내 RSPO1, IMP3, FDFT1, SFPQ, PCNA, SFRS2, DERL3, PRPF8, STIP1, MVK, LOC389833, DGCR6L, SFN, ARPC4, RARS, C3orf1, PELO, NUDC, NCOA4, PSMD11, SFRS1, CTNNB1, CCT5, CYR61, HNRPM, LDHA, PRDX1, RUTBC1, TFRC, TUBB3, IRX2, ZHX1, LOC91316, PAFAH1B1, TARDBP, ZNF302, CXorf26, KIF15, ITGB1BP1, FAM8A1, NET1, CCND2, BNIP1, ARMC6, ALDOC, CAP1, CD47, CLIC5, RASSF7, C9orf88, CSE1L, LEMD2, CLASP1, DEPDC6, FDPS, C1orf122, MYEOV2, EML3, LY6D, MAEA, MITF, MIDN, PITX1, HTRA1, PPP1R13L, PPP4R2, PKM2, GIPC1, RRM1, RPL26, WDR74, S100A2, SCAMP3, TBC1D4, TUBB, PSMD1,TPI1, DSP, HNRPA3, PES1, POLR2F, RNMT, PITPNA, VHL, DHX9, LMNB2, PPT1, C20orf19 및 PIGC 유전자로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하는 단계를 더 포함하는, 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 시험 화합물 처리 후 세포 내 DKK1, ELL2, FOSL1, HNRPDL, PLAU, FAM89B, THBS1, ARHGEF2, PRKD2, TRIB3, CES2, F3, CDKN1A, EIF4A2, EIF5, HS3ST1, CALCOCO1, KLF5, KLF6, MLL, NPC1, ADAM8, BCL2L1, COPA, FLJ25222, DYNC1H1, FAM102B, MAP2K3, ARL16, ITGB4, MLLT4, NDUFV3, NFE2L2, FSTL3, PRSS8, PTK6, SLC2A1, SLC38A2, FLJ22795, ZFP36, ARPP-19, HIF1A, FXR2, CDCP1, CCNB1IP1, GOLGA4, ICF45, MPST, DNAJB11, EPRS, MKNK2, MAP1LC3B, NCOA3, ORC4L, PIGH, PSAT1, PABPC1, EIF1, RUVBL1, SARS, ZNF337, GPR56, C17orf40, OPN3, DAP3, PYGB, PTP4A1, PTPN12, RTN3, SEC24D, SLC3A2, YARS, ACTB, CHD2, NOTCH1 및 ANKIB1 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현이 억제되는지 확인하는 단계를 더 포함하는 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제의 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 시험 화합물 처리 후 세포 내 SREBF1(SREBP1), LMO2, TFAP2A, XBP1, MEF2A, LEF1, RUNX2(OSF2), PATZ1(MAZR), IKZF1(LYF1, ZNFN1A1), THRA, PITX2, NKX2-5, SOX5, MYOG, MEIS1, IRF1, GATA3, AP1(FOS/JUN), TBP, SP1, HNF4A, KLF12(AP2REP), NKX2-1(TTF1), MYOD1, RUNX1(AML1) 및 ZEB1 (AREB6) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 시험 화합물 처리 후 세포 내 TBX5 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 여성 호르몬 결핍으로 초래되는 여성 피부 노화 억제제 스크리닝 방법.
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