KR100965247B1

KR100965247B1 - 신규한 아릴설포닐이미다졸론 유도체 화합물 및 그화합물을 함유한 항암제 조성물

Info

Publication number: KR100965247B1
Application number: KR1020080013100A
Authority: KR
Inventors: 정상헌; 방성철; 강재훈; 유정수; 김영재
Original assignee: 일동제약주식회사
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2010-06-22
Also published as: KR20090087697A

Abstract

본 발명은 구조식 I로 표시되는 신규한 아릴설포닐이미다졸론계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법 및 이를 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다:

[구조식 I]

상기 식에서, R은

이고, 여기에서

a는 0 또는 1이고,

b는 1, 2, 3, 또는 4이며,

Gly은 -NH-CO-CH₂-이고,

AA는

또는

이며,

여기에서, X는 -COOH 또는

이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다.

본 발명의 화합물은 수용성의 증가로 주사제 사용이 가능하다.

아릴설포닐이미다졸론, 항암제

Description

신규한 아릴설포닐이미다졸론 유도체 화합물 및 그 화합물을 함유한 항암제 조성물{Novel arylsulfonylimidazolone derivatives and an anti-cancer pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 항암 효과가 탁월한 하기 구조식 I의 신규한 아릴설포닐이미다졸론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 그의 제조방법 및 이를 활성 성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다:

[구조식 I]

상기 식에서, R은

이고, 여기에서

a는 0 또는 1이고,

b는 1, 2, 3, 또는 4이며,

Gly은 -NH-CO-CH₂-이고,

AA는

또는

이며,

여기에서, X는 -COOH 또는

이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다.

암은 현대의학의 발달에도 불구하고 불치의 병으로 여겨지고 있으며, 암퇴치를 위한 인간의 연구는 계속되고 있으나 아직도 확실한 항암제를 찾아내지 못하고 암에 의한 사망은 계속 증가하고 있다.

1980년대 고형암 치료 약물을 찾기 위하여 쥐의 고형암 모델을 이용해서 여러 종류의 화합물에 대해 검색을 실시한 결과, 디아릴설포닐유레아 (diarylsulfonylurea, DSU)를 찾아내었다. 이 화합물은 기존 항암제에 의해 치료가 잘 되지 않는 고형암 모델에 대해서도 현저한 활성을 발현하였고, 그 후 이 화합물의 구조를 변형시켜 더욱 뛰어난 설로페누어(sulofenur, LY186641)를 발명하게 되었다. 이 화합물은 대장암 이종 조직 이식 (advanced colon adenocarcinoma xenograftes)이나 유년횡문근육종 이종 조식 이식 (childhood rhabdomyosarcoma cell line xenografts)에 탁월한 항암효과를 발휘하였으나, 메트헤모글로빈혈증 (methemoglobinemia)이나 용혈 빈혈(hemolytic anemia)같은 부작용으로 인하여 DSU계 항암제의 개발이 중단되었는데, 이 부작용의 원인은 DSU계 물질의 대사산물인 ρ-클로로아닐린(ρ-chloroaniline) 유도체 때문인 것으로 밝혀졌다.

우수한 항암효과를 가지고 있음에도 불구하고, 그 부작용으로 인하여 그 개발이 중단된 DSU계열 항암제 개발을 위하여, 아릴설포닐이미다졸론계 화합물을 처음으로 설계, 다종의 유도체를 합성하였다. 아릴설포닐이미다졸론계 화합물들은 미세소관형성(tubulin polymerization)을 저해, 세포주기를 G2/M기에 휴지시킴으로써 독성을 발현하는 항세포분열제(antimitotic agent)이며, 또한, 이들 화합물들은 다양한 암세포 (HCT116, A-549, NCI-H460)에 대하여 우수한 세포독성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 일부 유도체는 현재 임상에 사용되고 있는 파클리탁셀이나 빈카 알칼로이드계 항암제가 가지고 있는 다재내성을 발현하지 않은 것으로 밝혀졌다 (참고실험예 참조).

아릴설포닐이미다졸론계 화합물들 중에서 특히 하기 화합물은 우수한 항암효과를 나타내나, 전임상단계에서 비글독(beagle dog)을 이용한 독성시험결과 장 독성 (투여 약물의 상당부분이 장에 침착)이 나타나 신약으로서의 개발이 중단되었다. 즉, 상기 화합물의 물에 대한 용해도는 23μg/mL로 매우 난용성이어서, 정맥 투여가 가능하기 위해 요구되는 수용해도에 미치지 못하여 정맥주사제로 사용이 불가능하고, 장내 약물의 용해와 흡수가 원활하지 않아 장독성이 계속되는 등의 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 아릴설포닐이미다졸론계 화합물의 물에 대한 난용성 문제를 해결하여, 정맥 투여가 가능하고, 따라서 정맥 투약 후 바로 전신순환기계를 통한 신속한 약물전달을 가능케 하여 생체이용률을 극대화시킴으로써 장독성 위험이 없는 하기 구조식 I로 표시되는 아릴설포닐이미다졸론 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하는 것이다:

[구조식 I]

상기 식에서, R은

이고, 여기에서

a는 0 또는 1이고,

b는 1, 2, 3, 또는 4이며,

Gly은 -NH-CO-CH₂-이고,

AA는

또는

이며,

여기에서, X는 -COOH 또는

이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다.

[구조식 I]

상기 식에서, R은

이고, 여기에서

a는 0 또는 1이고,

b는 1, 2, 3, 또는 4이며,

Gly은 -NH-CO-CH₂-이고,

AA는

또는

이며,

여기에서, X는 -COOH 또는

이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다.

본 발명의 다른 측면으로서, 치료적 유효량의 상기 구조식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함을 특징으로 하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명 화합물 (I)의 대표적인 화합물 또는 그의 염의 R기는 다음과 같다:

상기 식에서, c는 1 또는 2이고,

d는 1, 2, 3, 또는 4이며;

상기 식에서, e는 0, 1 또는 2이고;

상기 식에서, f는 1 또는 2이고,

g는 3 또는 4이며;

; 또는,

이다.

본 발명 화합물 (I)은 하기 구조식 II의 화합물의 아로마틱 아민기에 하기 구조식 III의 3-[2-옥시-4,6-디메틸페닐]-3,3-디메틸프로피오닐기를 도입하고, 여기에 다양한 R기 예컨대, L-알라닐 또는 글리신-알라닐기를 도입시킨 후, 알라닐 또는 글리실의 N-말단 아미노기를 활용하여 다양한 극성 아미노산과 펩티드 커플링 반응을 통해 연결시킴으로써 현저하게 수용성을 증가시켜 정맥투여가 가능하도록 제조한다.

[구조식 II]

[구조식 III]

따라서, 본 발명의 신규한 아릴설포닐이미다졸론 화합물은 우수한 수용성을 나타내어 주사제로 제조함으로써 종래 이 계통 항암제의 문제점인 장내독성의 우려가 없어지고, 전신투여된 구조식 I의 화합물은 생체내에서 여러 효소들 (예컨대, 에스테라제, 펩티다제 등)에 의해 빠르고 정량적으로 생변환 (reconversion)되어 우수한 항암효과를 발휘할 수 있게 되었다.

본 발명의 화합물 (I)은 하기 반응식 1에 도시한 바와 같이, 생체 내에서 에스테라제 가수분해반응을 거치면서 불안정한 구조식 2의 중간체를 생성시키고, 이 중간체는 다시 프로모이어티(promoiety) 구조의 트리메틸 자물쇠 시스템(trimethyl lock system)에 의해 분자내 락톤화(lactonization) 반응이 가속화되어 강력한 항 암효과를 나타내는 구조식 II의 화합물을 방출시킨다.

[반응식 1] 설계된 전구약물의 활성화 기전

이렇게 전구물질 형태로 제조된 화합물은 생체내에서의 물리화학적(예컨대, 용해도, 친유성) 또는 생물학적(예컨대, 생체이용률) 한계를 극복하는데 유용한 방법이다. 전구약물을 설계하는데 있어서는 목적하는 전구약물의 합성이 가능하고, 합성된 전구약물이 상온이나 in vitro에서 좋은 안정성 (예컨대 우수한 반감기 등)을 가지고 있으며, in vivo에서는 시의 적절하고 완벽하게 모약물(parent drug)로 변환 할 수 있을 것을 요한다. 또한, 전구약물이 생체내에서 변화되어 생성된 중간체는 그 자체로 매우 큰 화학적 반응성을 가지고 있어서 생리적 조건 (physiological condition)하에서 자발적 반응을 통해 모약물을 생산해낼 수 있게된다. 전구약물은 상기한 조건을 모두 만족시키기 위해 보통 생체 내에서 효소 반 응에 의해서만 생성되도록 주로 된다.

본 발명의 화합물 (I)은 모약물인 구조식 II의 화합물의 수용해도의 약 3배 내지 100배 이상의 우수한 수용해도를 가지며, 생리적 조건하에서 생체 내의 효소 반응에 의해 모약물을 생산해낼 수 있다.

본 발명의 화합물은 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 나팔관암종, 난소암, 질암종, 음문암종, 간암, 위암, 식도암, 소장암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 비소세포성폐암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 호지킨병, 내분비선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 중추신경계 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종과 같은 암의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 바람직하게는 폐암, 대장암, 직장암, 자궁암, 난소암, 또는 백혈병의 치료를 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 기존 항암제에 내성을 갖는 암세포로 인한 모든 암질환의 치료를 위해서도 사용될 수 있다.

본 발명에서 "약제학적으로 허용가능한 염"이란 소디움, 트리플루오르산, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 아세테이트, 말레에이트, 푸마레이트, 옥살레이트, 락테이트, 타트레이트, 사이트레이트, 글루코네이트, 메탄설포네이트, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 콜린, 에탄올아민과 같은 제약분야에서 통상 사용되는 염을 말하며, 특히 소디움, 트리플루오르산염이 바람직하다.

본 발명의 화합물에는 하나 이상의 비대칭 탄소원자가 존재하므로, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체를 포함한다는 것을 당업자들은 알 것이다. 부분입체이성질체 혼합물은 공지된 방법, 예컨대 크로마토그래피, 재결정 또는 분별결정 등의 방법에 의해 그들의 물리화학적 차이를 기준으로 개별적 부분입체이성질체로 분리될 수 있으며, 거울상이성질체는 거울상이성질체 혼합물을 적절한 광학 활성 화합물과 반응시켜 부분입체이성질체 혼합물로 전환시키고, 부분입체이성질체를 분리하고 각각의 부분입체이성질체를 상응하는 순수 거울상이성질체로 전환시키는 통상적인 방법으로 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 그들의 혼합물은 본 발명의 일부로 간주되며, 구조식 I에서, 이미다졸리디논에 페닐이 붙은 위치는 S 배열 (S configuration)이고, 아미노산은 모두 L-아미노산인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 수용액 또는 분말 그 자체일 수 있거나, 필요에 따라 부형제, 결합제 또는 윤활제 같은 공지의 첨가제를 사용하여 제조된 적절한 제형의 의약 조성물일 수 있다.

본 발명의 일구체예로, 주사제 제조시, 일반 구조식 I의 화합물을 유효성분으로 포함하는 분말은 증류수 또는 염화나트륨 및 당류 (예: 글루코스, 만니톨, 이노시톨 등)를 사용하여 제조한 수성 등장액에 용이하게 용해된다. 용해 후, 유효성분을 함유하는 주사제는 치료될 질환에 대해 생체내에서 유효한 약물 농도로 기관에 정맥내, 근육내, 피하 투여되거나 종양 등의 병소 또는 종양 절단부에 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 예로서, 경구제 제조시, 정제, 캡슐제, 과립제, 미립제, 포합제, 액제 등으로 제조할 수 있다. 이들 제제의 제조시, 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 부형제, 윤활제, 분산제, 안정제, 착색제, 흡수 개선제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

또한, 수득된 분말의 특성(저장용기 또는 바이알에의 패킹력, 비용량 등)을 개선하기 위해, 당류, 방부제, 안정제, 정전기 방지제 등을 가할 수 있다.

상기 분말은 또한 통상의 방법에 따라 주사제 또는 경구제 이외의 제제로 제형화될 수도 있다. 이런 제제의 예로는 코, 구강, 설하부, 직장, 질 또는 자궁 등의 점막에 투여되는 제제, 경피제 및 이식제가 있다. 상기 각 제제는 각종 제어방출제 또는 표적 치료제로 성형될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 이런 제제의 원료로 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 구조식 I의 화합물은 종래의 아릴설포닐이미다졸론계 화합물의 물에 대한 난용성 문제를 해결하여, 정맥 투여가 가능하고, 따라서 정맥 투약 후 바로 전신순환기계를 통한 신속한 약물전달을 가능케 하여 생체이용률을 극대화할 수 있으며, 장독성을 발현하지 않아 생체에 대해 매우 안전하다. 따라서, 각종 제형, 예컨대 주사제, 경구제, 구강에 투여되는 제제 (예: 트로키제, 구강제 등), 설하제, 점안제, 시럽제, 피부에 투여되는 외용제, 경비제, 폐를 통해 투여되는 제제, 직장 좌제 또는 점막에 도포되는 제제로 약학 조성물 또는 수의학적 조성물에 매우 유용하고, 사람 또는 사람 이외의 포유동물 (예: 원숭이, 소, 개 등)에 사용되는 약물로서 유용하다.

이하, 본 발명 화합물의 효과를 확인하기 위한 실험예 및 제조 실시예를 설명한다. 다만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

참고 실험예 : 아릴설포닐이미다졸론의 튜불린 중합 및 세포 증식의 저해 효과

하기 구조식 II 및 II′화합물의 튜불린 중합의 저해 및 하기 암 세포라인에 대한 GI값을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

표 1. 구조식 II 및 II′화합물의 튜불린 중합의 저해 및 암 세포라인에 대한 GI값 측정결과

^a ITP는 튜불린 중합의 저해를 나타낸다. 각 화합물에 대해 최소 2회의 측정을 독립적으로 수행하였다. IC₅₀은 37 ℃에서 30분 후 어셈블리 정도를 50% 저해하는 농도를 나타낸다.

^b모든 실험은 SRB 어세이를 사용하여 최소 3회 실시하였으며, GI₅₀은 용량-반응 곡선에 대해 비선형회귀분석(nonlinear regression analysis)을 하여 측정하였다.

^c 괄호안의 숫자는 1 μM일 때 중합(polymerization)을 저해 또는 유도하는 퍼센트 를 나타낸다.

^dGTP가 없는 조건에서, 37 ℃에서 30분 후, 튜불린 중합이 50% 유도되는 농도를 나타낸다.

표 2. in vitro에서 MDR 암세포라인의 성장에 미치는 영향

^a 모든 실험은 SRB 어세이를 사용하여 최소 3회 실시하였다.

^b MDR (-), 다제내성 없음.

^c MDR (+), 다제내성.

^d rF는 저항 지수(resistance factor)를 나타내며, MCF7/ADR에 대한 GI₅₀ 및 MCF7의 GI₅₀의 비율에서 측정된다.

이 중 구조식 II의 화합물에 대하여, 인간 대장 암종 이종이식 개시(human colon carcinoma (SW620) xenograft initiation) 및 퇴화 암 모델(regression tumor models)을 사용하여 항암효과를 측정한 결과, 65 mg/kg을 2일 간격으로 6회 경구 투여하였을 때, 몸무게 감소 없이 각각 98.0%와 87.0%에 달하는 매우 우수한 암 성장 억제효과를 발현하는 것으로 나타났다 (표 3).

표 3. 구조식 II의 화합물과 독소루비신의 NCI-H23 및 SW620 이종이식 라인(xenograft lines)에 대한 항암활성

^a 0일째에 SW620 세포 (2 X 10⁶/마우스) 및 NCI-H23 세포 (2 X 10⁶/마우스)를 피하내(s.c.) 주입하였다.

^b % TGI = 1 - (처치군의 최종 암 중량 평균/대조군의 최종 암 중량 평균) X 100.

^c 누드 마우스에 암을 피하내(s.c.)로 이식하고, 암이 50-100 mm³ (0일째)이 되었을 때 처치를 시작하였다. 구조식 II의 화합물을 1, 3, 5, 7, 9 및 11일째에 경구(p.o.)로 투여하였다. 독소루비신은 1, 3, 5, 7 및 9일째에 복강내(i.p.)로 투여하였다. 18일째에 마우스의 무게를 칭량하고 안락사하여 암을 잘라내고 그 무게를 칭량하였다.

^d TGI가 58-89 범위인 경우를 중간 활성(Moderate activity)으로, TGI가 ≥90%인 경우를 현저한 활성(significant activity)으로 각각 정의하였다.

^e 1일째 및 18일째 사이의 중량(g)의 차이.

^f 1일째 및 15일째 사이의 중량(g)의 차이.

^g 누드 마우스에 암을 피하내(s.c.)로 이식하고, 암이 50-100 mm³ (0일째)이 되었을 때 처치를 시작하였다. 구조식 II의 화합물을 0, 2, 4, 6, 8, 및 10일째에 경구(p.o.)로 투여하였다. 독소루비신은 0, 2, 4, 및 6일째에 복강내(i.p.)로 투여하였다. 15일째에 마우스의 무게를 칭량하고 안락사하여 암을 잘라내고 그 무게를 칭량하였다.

합성예 1. 중간체 7의 합성 (반응식 2)

구조식 II의 모약물과의 아미드 결합을 위하여 L-알라닌이 결합된 링커인 프로피온산 (6)의 합성을 수행하였다. tert-부틸디메틸 실릴(TBDMS)-보호된 디올 (4)을 출발물질로 하여 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 존재하에서 벤디팔라(Bendifallah) 등의 방법으로 합성한 BocNH-알라닌 무수물과 축합반응하여 구조식 5의 화합물을 81%의 수율로 합성하였다. 이렇게 합성된 물질들에 대하여 데실레이션(desilylation)과 두 단계의 산화반응 (피리디늄 클로로크로메이트, PCC 반응과 과망간산칼륨, KMnO₄)을 수행하였다. 알라닐기가 결합된 물질 6이 57%의 수율 (세 단계 이상)로 수득되었다. 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 존재하에서 EDCl (1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)을 커플링제로 사용하여 수득된 산 6과 모약물 (II)를 결합시켰으며, 그 결과 두 화합물이 아미드 결합으로 연결된 주요 중간체 물질인 구조식 7의 화합물 (S)-1-(1-(4-(3-(2-(BocNH-알라닐옥시)-4,6-디메틸페닐)-3,3-디메틸프로피오닐)아미노)벤조일)인돌린-5-설포닐)-4-페닐이미다졸리딘-2-온 (36%)을 성공적으로 합성하였다.

반응식 2. 주요 중간체 7의 합성

이렇게 합성된 구조식 7의 화합물을 이용한 극성 아미노산과의 펩티드 연결에 앞서, 이 물질이 실제 에스테라제에 의해 가수분해되어 모약물 (II)로 재변환 되는지 여부를 알기 위해 상업적으로 이용가능한 정제된 에스테라제 (porcine carboxylic-ester hydrolase; EC 3.1.1.1)를 이용한 약물속도(kinetics) 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 주요 중간체 7은 가파른 음(-)의 지수함수를 그리며 줄어드는 반면, 모약물 (II)의 양은 시간차를 두고 완만한 양(+)의 지수함수를 그리며 증가되었다. 이와 같은 현상은 이미 설계단계에서 에스테라제에 의해 작동되도록 설계한 모약물의 특성과 일치한다.

주요 중간체 7의 에스테라제에 의한 모약물 (II)의 생성 반응의 반감기 (t₁ _/2, half-life time)는 3시간 정도였으며, 에스테라제와 배양한지 24시간 경과시 90% 이상이 모약물 (II)로 재생되었다. 따라서 본 발명의 화합물 7은 전구약물로서의 특징 (parent drug releasing effect)을 가지고 있는 것으로 판단할 수 있었다.

구조식 I _a - I _f 의 화합물의 합성 (반응식 3)

구조식 7의 중간체를 이용하여 알라닐기의 N-말단 아미노기에 극성 아미노산(L-아스파르트산 또는 L-글루탐산)을 도입하여 수용성이 현저히 증대된 목적 화합물 구조식 I_a-I_f의 화합물을 합성하였다.

이들 화합물을 합성하는데 있어서 가장 중요한 것은 원하는 개수의 L-아스파르트산이나 L-글루탐산을 구조식 7의 화합물에 연결한 다음, C-말단 카르복실기나 N-말단 아미노기에 존재하는 보호기들은 합성시나 제거시 다른 결합부위가 절단되지 않도록 하는 보호기들을 선택하고, 그들을 탈보호하는 방법이다. 마지막 단계에서 만약 카르복실기나 아미노기에 붙어 있는 보호기들이 선택적으로 탈보호되면 극성이 증가되어 정제가 쉽지 않을 뿐만 아니라, L-아스파르트산이나 L-글루탐산의 구조상 환형성이 일어날 가능성을 있어 문제가 된다. 실제, C-말단 카르복실기에 가장 많이 도입되는 벤질옥시카르보닐(Cbz)기를 도입한 경우 모약물 (II)와의 연결 후, 이를 제거하여 원하는 물질만을 정제하는 일은 매우 어렵다. Pd/C를 촉매로 한 수소 기체하에서의 수소화분해(hydrogenolysis) 반응의 경우, 원하는 물질 이외에 TLC 상에서 비슷한 Rf 값을 가진 2-3개의 부산물들이 추가로 검출되었다. 따라서, 벤질옥시카르보닐(CBz)기는 본원 화합물의 보호기로 부적절하다.

또한, 마지막 단계의 탈보호 반응은 모든 보호기를 한번에 제거할 수 있는 간단한 단일반응이어야 하고, 에스테르 결합은 염기성 조건하에서 쉽게 가수분해될 수 있기 때문에 염기조건은 배제되는 것이 바람직하다.

이와 같은 여러 요소를 만족시키기 위해 N-말단 아미노기에는 tert-부톡시카르보닐 (t-Boc)기를, 모든 b 또는 g 위치의 C-말단 카르복실기에는 tert-부톡시기를 도입하여 쉽게 산성 조건(TFA/CH₂Cl₂ = 1:1 혼합용액)에서 제거 가능하도록 고안하였으며, 전체적인 합성 방법은 반응식 3과 같다.

반응식 3. L-아스파르트산 또는 L-글루탐산과 연결된 화합물 I _a - I _f 의 합성

반응식 4. 보호된 아스파르트산 또는 글루탐산 올리고머의 합성

먼저 반응식 4에 보는 바와 같이 보호된 아스파르트산 (8, 8-1, 14_a, 15_a)과 글루탐산(9, 9-1, 14_b, 15_b, 16)을 합성하였다. N-t-BocNH-L-아스파르트산-b-t-부틸 에스테르 (BocNH-Asp(Ot-Bu)-OH, 8)와 N-t-BocNH-L-글루탐산-b-t-부틸 에스테르(BocNH-Glu(Ot-Bu)-OH, 9)를 중요 중간체 7의 Boc기를 제거 (TFA/CH₂Cl₂ = 1:1, 과정 A)한 후에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDCl, 1.5 당량), 1-하이드록시 벤조트리아졸 (HOBt, 1.5 당량), N-메틸모르포린 (NMM, 2 당량)를 사용하는 펩티드 커플링 반응 (과정 C)으로 축합하여 단일 아미노산이 결합된 구조식 I_a 및 I_d의 화합물을 각각 27%와 16%의 수율로 합성하였다.

아미노산의 개수를 늘리기 위해 BocNH-Asp(Ot-Bu)-OH (8)는 t-Boc기가 제거된 L-아스파르트산 4-t-부틸-1-메틸 에스테르 하이드로클로라이드 (NH₂-Asp(Ot-Bu)-OCH_3·HCl, 8-1)와 축합반응을, BocNH-Glu(Ot-Bu)-OH (9)는 L-글루탐산 5-t-부틸-1-메틸 에스테르 하이드로클로라이드 (NH₂-Glu(Ot-Bu)-OCH₃ _·HCl, 9-1)와 축합반응을 각각 실시하여 보호된 다이머 구조식 14_a의 화합물 (BocNH-Asp(Ot-Bu)-Asp(Ot-Bu)-OCH₃, 81%) 및 구조식 14_b의 화합물 (BocNH-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-OCH₃, 84%)를 우수한 수율로 합성하였다.

이 다이머는 다시 aq. LiOH (1.2 당량, 과정 B)를 사용하여 탈메틸화 한 후, 동일 펩티드 커플링 반응을 거쳐 트리머인 구조식 15_a의 화합물 (BocNH-Asp(Ot-Bu)-Asp(Ot-Bu)-Asp(Ot-Bu)-OCH₃, 65%)과 구조식 15_b의 화합물 (BocNH-Glu(Ot-Bu)- Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-OCH₃, 79%)을 합성하였으며, L-글루탐산의 경우에 있어서는 구조식 16의 화합물 (테트라머, BocNH-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-OCH₃, 81%)까지 합성하였다.

이렇게 수득된 아미노산과 올리고머들은 반응식 3에서 보는 바와 같이 차례로 탈메틸화하고 구조식 7의 화합물과 축합반응시켜, L-아스파트르산이 축합된 구조식 I_a의 화합물과 L-아스파르트산 다이머와 트리머가 각각 결합된 물질 구조식 I_b의 화합물 (37%) 과 구조식 I_c의 화합물 (20%)를 수득하였고, L-글루탐산이 축합된 구조식 I_d의 화합물과 L-글루탐산 테트라머가 결합된 물질 구조식 I_e의 화합물 (46%)과 구조식 I_f의 화합물 (26%)을 합성하였다. 이렇게 합성된 총 6개의 물질 I_a-I_f 들은 과정 A를 거쳐 분자내 모든 Boc기가 제거된 모노머에서 테트라머까지의 아미노산들이 결합된 일반 구조식 I의 I_a-I_f로 변환하였다. 이들의 Na⁺염을 제조하기 위하여 탄화수소나트륨 (NaHCO₃, 1.1 당량)과 반응시킨 후, 동결건조 방법을 사용하여 각 물질에 대한 소디움 염 형태를 만든 결과, 구조식 I_c, I_e, I_f 의 화합물의 각각의 소디움 염 (I_j, I_k, I_l)을 정량적으로 얻었다. 그 나머지 물질 (I_a, I_b, 및 I_d)들은 물질의 일부가 가수분해되어 2-3개의 물질로 분해되는 현상이 TLC와 NMR 스펙트럼 상에서 관찰되었다.

구아니딘기가 도입된 구조식 I_g, I_h, I_i, I_m 및 I_n의 화합물의 합성은 반응식 5와 반응식 6에서 보는 바와 같다. 먼저, 반응식 5에서는 기본적으로 선형(linear) 구아니디늄기를 가진 아미노산을 도입하기 위해, L-글리신 (11), b-알라닌 (12), 그리고 g-아미노 부티르산 (13)을 출발물질로 하여 N,N'-디-Boc-N'-트리플루오로메탄설포닐 구아니딘을 사용하여 N-말단 아미노기에 구아니디늄기가 도입된 구조식 18_a의 화합물 (네 단계를 거친 후 33.6%), 구조식 18_b의 화합물 (네 단계를 거친 후 25.2%), 및 구조식 18_c의 화합물 (네 단계를 거친 후 39.9%)을 합성하였다. 이렇게 합성된 선형 아미노산들을 Boc기가 제거된 물질 (7)과 펩티드 결합시켰다. 이때, 구조식 18_b의 화합물과 구조식 18_c의 화합물과의 연결은 구조식 18_a의 화합물과 달리 기존 과정 C (EDCl, HOBt, 및 NMM)방법으로는 성공할 수 없었으나, 또 다른 펩티드 커플링제인 HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 유로늄 헥사플루오로포스페이트 (tetramethyl uronium hexafluorophosphate, 1.2 당량)를 사용하여 합성할 수 있었다. 따라서, 이 두 펩티드 커플링 반응조건을 이용하여 구아니디늄기를 가진 선형 아미노산이 도입된 구조식 19_a (두 단계를 거친 후 36%), 19_b (두 단계를 거친 후 71%) 및 19_c의 화합물(두 단계를 거친 후 42%)을 합성하였으며, 이들은 다시 과정 A를 통해 TFA 염 형태의 최종 목적화합물인 구조식 I_g (45%), I_h (95%), 그리고 및 I_i의 화합물(97%)로 각각 변형되었다.

반응식 5. 구아니디늄기를 갖는 선형 아미노산이 연결된 에스테라제 -민감성 화합물 I _g , I _h , I _i 의 합성과정

반응식 6에서 보는 바와 같이 구아니디늄기를 가지고 있는 L-아르기닌과 연결된 구조식 I_m 및 I_n의 화합물을 합성하였다. 이를 위해, 상업적으로 이용 가능한 BocNH-Orn(Z)-OH (20_a)를 출발물질로 하여 d-아민의 벤질옥시카르보닐(Cbz)기를 수소화로 제거하고 N-메틸-N-트리메틸실릴-트리플루오로아세트아미드와 N,N'-디-Boc-N'-트리플루오로-메탄설포닐 구아니딘을 사용하여 구아니딜화(guanidinylation)를 실시, 백색 무정형 고체인 구조식 20_b의 화합물 (L-BocNH-ω,ω'-디-Boc-아르기닌-OH)을 합성하였다(59% 수율). 구조식 20_a의 화합물과 구조식 7의 화합물을 축합하여 구조식 I_m의 화합물 (두 단계를 거친 후 24.1%)을, 구조식 7의 화합물에 글리신을 결합시킨 후 구조식 20_b의 화합물과 반응시켜 구조식 I_n의 화합물 (세 단계를 거친 후 29.5%)을 각각 합성하였다.

반응식 6. 구아니디늄기를 갖는 L-아르기닌이 연결된 에스테라제 -민감성 화합물 I _m 및 I _n 의 합성 과정

반응식 5와 6을 통해 트리플루오르산 염 형태의 구아니디늄기를 갖는 아미노산들과 연결되어 있는 5개의 목적 화합물인 구조식 I_g, I_h, I_i, I_m 및 I_n의 화합물을 합성하였다.

용해도 측정

일반 구조식 I의 화합물 중 구조식 I_a-I_f의 화합물에 대한 물에 대한 용해도 (수용해도, mg/mL)를 측정하였다.

표 1 에서 보는 바와 같이, 구조식 I_d, I_f의 화합물의 경우, 모약물 (II)에 비하여 약 3배 내지 4배 증가된 용해도를 나타냈으며, L-글루탐산의 트리머와 테트라머가 결합되어 있는 화합물 I_k와 I_l의 (증류수 중의) 용해도는 5.0 mg/mL 이상으로 수용성이 크게 증가되었다. L-아스파르트산의 트리머가 결합되어 있는 I_j의 경우에는 출발물질 I_c에 비해 26배 이상 용해도가 상승되었다. (증류수 중의 용해도< 1.0 mg/mL).

표4. 아미노산과 결합하고 있는 구조식 I_d-I_f, I_j-_l의 화합물의 용해도

화합물	용해도 (mg/mL)^a
II	0.0235
I_d	0.0906
I_e	0.0238
I_f	0.0840
I_j	0.5437
I_k	> 5.0^b
I_l	> 5.0^b

^a용해도는 25 ℃에서 증류수 중에 용해시켜 측정하였으며, Casini 등에 기재된 방법에 따랐다 (Casini, A.; Scozzafava, A.; Mincione, F.; Menabuoni, L.; Ilies, M. A.; Supuran, C. T. Carbonic Anhydrase Inhibitors: Water-Soluble 4-Sulfamoylphenylthioureas as Topical Intraocular Pressure-Lowering Agents with Long-Lasting Effects. J. Med. Chem. 2000, 43, 4884-92)

^b 매우 잘 용해됨(Very soluble).

표 5. 구아니디늄 기를 갖는 아미노산이 연결된 에스테라제-민감성 구조식 I_g-I_i, I_m 및 I_n의 화합물의 용해도

화합물	용해도 (mg/mL)^a
II	0.0235
I_g	0.2512
I_h	0.5142
I_i	0.2363
I_m	2.7^b
I_n	8.0^b

^b 정확도를 위하여, 그 용해도는 HPLC를 사용하여 반복 측정하여 결정되었다.

표 5 에서 보는 바와 같이, 구아니디늄기를 가진 아미노산들의 도입은 비극성 프로모이어티 (3-[2'-알라닐-4',6'-디메틸페닐]-3,3-디메틸프로파닐기)의 추가에도 불구하고 모약물 (II)에 비해 10배 이상의 용해도를 나타내었다. 특히, L-아르기닌이 도입된 구조식 I_m과 I_n의 화합물의 경우 100배 이상의 현격한 용해도 상승효과를 나타내었다. 이와 같은 실험결과는 구조식 I_j, I_k,I_l,I_m 및 I_n의 화합물은 주사제로서의 개발 가능한 수용성을 갖고 있다는 것을 나타낸다.

과정 A: Boc -아미드의 탈보호

Boc-아미드 (1.0 mmol)를 TFA/CH₂Cl₂ (1:1, 70 mL)에 녹이거나 에틸아세테이트(EtOAc, 100 mL)에 녹여 각각 출발물질이 TLC 상에서 완전히 사라질 때까지 상온에서 교반하거나 HCl (H₂SO₄ + NaCl) 버블링 하였다. 원하는 de-Boc-아미드는 용매를 완전히 감압건고 (Ether 100 mL X 3)하여 그대로 다음 반응에 사용하거나, 소량의 에테르를 사용하여 응고시켜 얻었다.

과정 B: 메틸 에스테르의 탈보호

메틸 에스테르 (1.0 mmol)를 THF/H₂O (1:1, 50 mL) 혼합용액에 녹인 후, 이를 0 ℃ (아이스 배쓰)까지 냉각하였다. 이 반응용액에 리튬 하이드록시드 (LiOH, 1.5 mmol)을 첨가한 후 0 ℃에서 10분간, 상온에서 3-4 시간 더 교반하였다. 출발물질이 완전히 사라지면 교반을 멈추고 용매의 일부 (THF)를 감압 하에서 제거 (물중탕, ≤40 ℃)한 후, 이를 과량의 물 (100 mL)을 사용하여 희석하였다. 희석된 수용액은 0.1 N HCl 수용액을 사용하여 다시 산성화 (acidification, pH 3-4)시키고, 과량의 EtOAc (150 mL X 3)로 추출하였다. 이렇게 얻은 유기층은 염수 세척하고 무수 망초 (anhydrous Na₂SO₄)로 탈수한 후, 감압농축하여 그대로 다음반응에 사용하였다.

과정 C: 아미드 커플링

질소기체하에서, 보호된 아미노산(1.0 mmol)을 무수 CH₂Cl₂ (30 mL) 또는 무 수 DMF (30 mL)에 녹인 후, 이 반응용액을 -40 ℃까지 냉각하였다. 이 반응용액에 N-메틸모르폴린 (NMM, 2.0 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt 은 < 5%의 물을 함유, 1.5 mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드(carbodimide) ·하이드로클로라이드 염 (EDCl, 1.5 mmol)을 차례로 넣은 후, 이 온도에서 10분 더 교반하였다. 여기에 아민 (1.0 mmol)을 동일 용매 (CH₂Cl₂ 또는 DMF, 15 mL)에 녹여 30분에 걸쳐 적가하고, 동일온도에서 1시간을 더 교반하였다. 반응용기의 온도가 서서히 상온에 도달할 수 있도록 방치하면서 12 내지 24시간 동안 더 교반한 다음, TLC를 통해 반응이 완결되었음을 확인한 후에 5% KHSO₄ (150 mL)을 첨가하여 반응을 종결하였다. 이를 다시 과량의 EtOAc (150 mL X 3)로 추출하고, 그 유기층을 합하여 염수 (50 mL X 2), 증류수 (100 m X 2)로 세척, 그 유기층을 무수망초로 탈수, 감압농축하였다. 이렇게 얻은 조생성물을 실리카겔 컬럼을 사용하여 분리정제하여 원하는 생성물을 얻었다.

과정 D: 벤질 에스테르의 탈보호화

벤질 에스테르 (1.0 mmol)를 무수 MeOH (200 mL)에 녹이고, Pd/C (10% Pd, 0.01 mmol)와 함께 현탁액을 만든 후 H₂ (풍선: 1 기압 또는 수소화 기구 (Parr co. Ltd. Illinois): 30 psi)를 주입하여 상온에서 출발물질이 완전히 사라질 때까지 교반하였다. 반응이 완결되면, Pd/C은 셀라이트를 사용하여 제거하고, 그 용매는 감압 하에서 제거한 후 얻어진 생성물은 더 이상의 정제과정 없이 다음 반응에 그대로 사용하였다.

( 실시예1 ) 1-O- tert - 부틸디메틸실릴 -3-(2- Boc - 알라닐옥시 -4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로판올

Boc-Ala-OH (12.0 g, 63.42 mmol)을 무수 CH₂Cl₂ 250 mL에 녹이고 DCC (7.85 g, 38.1 mmol)를 첨가하여 30분간 교반하였다. 생성된 불용성 유레아는 필터하여 제거하고 그 여과액을 합하여 TBDMS-디올 (7.16 g, 22.2 mmol)이 녹아있는 무수 CH₂Cl₂ 30 mL 용액에 첨가 후, DMAP (775 mg, 6.34 mmol)와 함께 12시간 동안 환류교반 하였다. 출발물질이 완전히 사라지면, 반응용액을 sat. NaHCO₃ (50 mL X 2), 염수 (50 mL X 2), 및 증류수 (100 m X 2)를 사용하여 차례로 세척하고, 그 유기층을 무수망초로 탈수한 후 감압농축하였다. 이렇게 얻은 조생성물을 실리카겔 컬럼에서 cHx:EtOAc = 20:1 → 10:1의 혼합용매로 분리, 무색 시럽인 표제 화합물 (7.11 g, 64.8%)을 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.84 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.18 (m, NH), 4.55 (m, 1H), 3.47 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 2.07-2.03 (m, 2H), 1.59 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.49 (s, 15H), 0.87 (s, 9H), 0.00 (s, 6H). ESIMS: m/z = 494.8 [M + 1]⁺.

( 실시예2 ) 3-(2- Boc - 알라닐옥시 -4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디메틸프로피온산

실시예 1에서 수득된 화합물 (Boc-Ala-TBDMS 디올, 5.0 g)을 THF-H₂O-HOAc (1:1:3, 100 mL) 혼합용액에 녹인 후, 상온에서 1시간동안 교반하였다. 출발물질이 완전히 사라진 것을 확인한 후, 이 반응물의 용매를 에테르와 함께 2-3회 반복 감압건고하여 완전히 제거하였다. 여기서 수득된 무색 오일형태의 잔사 (3-(2'-Boc-알라닐-하이드록시-4',6'-디메틸페닐)-3,3-디메틸프로판올, 4.8 g)를 더 이상의 정제과정 없이 다음 반응에 사용하였다.

피리디늄 클로로크로메이트 (PCC, 4.38 g, 20.26 mmol)이 녹아 있는 무수 CH₂Cl₂ (200 mL)용액에 상기에서 수득한 화합물 4.8 g을 무수 CH₂Cl₂ (100 mL)에 녹여 천천히 적가한 후, 상온에서 1시간동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 셀라이트를 사용하여 불용물을 제거하고, 여과액은 감압건고한 후 짧은 실리카겔 컬럼에서 cHx:EtOAc = 6:1 → 4:1 의 혼합용매로 분리, 연노란색 오일 형태의 생성물(3-(2'-Boc-알라닐-4',6'-디메틸페닐)-3,3-디메틸프로핀알데히드, 3.282 g, 85.8%)을 얻었다.

이렇게 얻은 생성물은 아세톤 40 mL 에 녹인 후, 과망간산칼륨 (KMnO₄, 1.54 g, 10.4 mmol)이 녹아 있는 아세톤-H₂O (1:1, 40 mL) 혼합용액에 천천히 적가하였다. 이 반응물은 상온에서 17시간동안 교반한 후, 용액중의 아세톤은 감압하에 제거하고 남은 불용물은 역시 셀라이트를 사용하여 제거하였다. 이렇게 얻은 여액은 0.1 N HCl 수용액을 사용하여 pH 3까지 산성화시키고, 과량의 EtOAc (200 mL X 3)로 추출 후, 그 유기층을 합하여 무수망초로 탈수, 감압농축하여 백색 고체인 표제의 화합물 (3.11 g, 77.9%)을 얻었다.

mp 107-109 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.83 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.16 (br, d, NH), 4.53 (m, 1H), 2.88 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.67 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.61-1.55 (m, 9H), 1.45 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3370, 2980, 1745, 1718, 1510, 1170, 1070; FABMS: m/z = 394.5 [M + 1]⁺.

( 실시예 3) (S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸린 -2-온 (7)

질소기체 하에서, 실시예 2에 따른 구조식 6의 화합물 (1.014 g, 2.58 mmol), EDCl (570 mg, 3.0 mmol) 및 DMAP (121 mg, 0.99 mmol)을 차례로 무수 CH₂Cl₂ (20 mL)에 녹이고 냉욕상에서 10분간 교반하였다. 이 반응용액에 구조식 II의 화합물 (917 mg, CH₂Cl₂ 30 mL 중에 1.98 mmol)용액을 서서히 적가한 후 냉욕상에서 1시간, 그리고 상온에서 24시간 더 교반하였다. 반응완결 후, 과량의 CH₂Cl₂ (200 mL)을 사용하여 희석하고 그 유기층을 sat. NaHCO₃ (50 mL X 2), 염수 (50 mL X 2), 증류수 (100 mL X 2)로 세척하였다. 그 유기층은 다시 무수망초로 탈수하고 감압농축하여 실리카겔 컬럼에서 cHx:EtOAc = 3:1 → 1:1 → 1:1.5 의 혼합용매로 분리하여 연노란색 고체인 구조식 7의 표제의 화합물 (600 mg, 36.2%)을 수득하였다.

mp 145-147 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.90 (s, 1H), 7.74 (br, d, 1H), 7.46 (br, s, 4H), 7.37-7.36 (m, 3H), 7.27-7.24 (m, 3H), 6.80 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 4.77 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.55-4.51 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.17-4.09 (m, 2H), 3.66 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.16 (t, J = 8.18 Hz, 2H), 2.70 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 2.56 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.72 (d, J = 3.88 Hz, 6H), 1.65-1.61 (m, 3H), 1.43 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 3000, 1740, 1465, 1160, 1360, 1100, 1060, 760; ESIMS: m/z = 839.0 [M + 1]⁺.

( 실시예 4) BocNH - Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- COOCH ₃ (14 _a )

구조식 8의 화합물인 BocNH-Asp(OtBu)-OH (390 mg, 0.83 mmol)과 구조식 8-1의 화합물인 HCl·NH₂-Asp(OtBu)-OH (180 mg, 0.75 mmol)을 출발물질로 하여 과정 C를 거쳐 무색 오일인 구조식 14_a의 표제의 화합물 (384 mg, 81.0%)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.80-4.73 (m, 1H), 4.46 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.91-2.81 (m, 2H), 2.71-2.54 (m, 2H), 1.47-1.45 (m, 27H); ESIMS: m/z = 475.6 [M + 1]⁺.

( 실시예 5) BocNH - Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- COOCH ₃ (14 _b )

BocNH-Glu(OtBu)-OH (250 mg, 0.82 mmol)과 구조식 9-1의 화합물인 HCl·NH₂-Glu(OtBu)-OH (210 mg, 0.82 mmol)을 출발물질로 하여 과정 C를 거쳐 무색 오일 인 구조식 14_b의 표제의 화합물 (349 mg, 84.3%)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.61-4.4.53 (m, 1H), 4.15-4.09 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.44-2.27 (m, 4H), 2.17-2.05 (m, 2H), 1.98-1.90 (m, 2H), 1.47-1.46 (m, 27H); ESIMS: m/z = 503.6 [M + 1]⁺.

( 실시예 6) BocNH - Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- COOCH ₃ (15 _a )

구조식 14_a의 화합물인 BocNH-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-COOCH₃ (186 mg, 0.39 mmol)을 출발물질로 하여 과정 B를 거친 후, 이를 다시 구조식 8-1의 화합물인 HCl·NH₂-Asp(OtBu)-OH (93 mg, 0.39 mmol)와 함께 과정 C를 수행하여 무색 오일인 구조식 15_a의 표제의 화합물 (163 mg, 64.6%)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.81-4.74 (m, 2H), 4.45 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 2.93-2.83 (m, 3H), 2.73-2.55 (m, 3H), 1.46 and 1.45 (s 및 s, 36H); ESIMS: m/z = 646.7 [M + 1]⁺.

( 실시예 7) BocNH - Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- COOCH ₃ (15 _b )

구조식 14_b의 화합물인 BocNH-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOCH₃ (276 mg, 0.55 mmol)을 출발물질로 하여 과정 B를 거친 후, 이를 다시 구조식 9-1의 화합물인 HCl·NH₂-Glu(OtBu)-OH (157 mg, 0.61 mmol)와 함께 과정 C를 수행하여 무색 오일인 구 조식 15_b의 표제의 화합물 (293 mg, 78.6%)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.55-4.51 (m, 1H), 4.45-4.44 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.43-2.28 (m, 6H), 2.17-2.10 (m, 3H), 2.00-1.93 (m, 3H), 1.46-1.44 (m, 36H); ESIMS: m/z = 688.8 [M + 1]⁺.

( 실시예 8) BocNH - Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- COOCH ₃ (16).

구조식 15_b의 화합물인 BocNH-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOCH₃ (358 mg, 0.52 mmol)을 출발물질로 하여 과정 B를 거친 후, 이를 다시 구조식 9-1의 화합물인 HCl·NH₂-Glu(OtBu)-OH (110 mg, 0.43 mmol)와 함께 과정 C를 수행하여 백색 무정형 고체인 구조식 16의 표제의 화합물 (305 mg, 80.5%)을 얻었다.

mp 118-121 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.45 (m, 2H), 4.29 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.43-1.92 (m, 16H), 1.47-1.44 (m, 45H); IR (cm^-1, KBr) 3280, 2970, 1730, 1630, 1365, 1160, 850; ESIMS: m/z = 874.0 [M + 1]⁺.

(실시예 9)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Asp ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )-아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _a )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (100 mg, 0.12 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 구조식 8의 화합물 (62 mg, 0.12 mmol)과 함께 아미드 커플링 반응 (과정 C)을 수행하여 무색 시럽인 구조식 10_a의 표제의 화합물 (33 mg, 27.3%)을 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.87 (s, 1H), 7.75 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.45-7.24 (m, 10H), 7.79 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.76 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.71-4.68 (m, 1H), 4.28 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.17-4.09 (m, 2H), 3.66 (dd, J = 8.2 Hz, J' = 결정되지 않음. 1H), 3.14 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 2.84 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.59-2.46 (m, 6H), 2.22 (s, 3H), 1.78-1.64 (m, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.41 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3340, 2930, 1730, 1540, 1470, 1370, 1240, 1150, 760; ESIMS: m/z = 1010.2 [M + 1]⁺.

(실시예 10)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _b )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (96 mg, 0.115 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 이를 다시 메틸 에스테르인, 구조식 14_a의 화합물(65 mg, 0.138 mmol)을 탈메틸화 (과정 B)하여 얻은 아미노산과 아미노 커플링 반응 (과정 C)을 수행하여 무색 시럽인 구조식 10_b의 표제의 화합물 (50 mg, 36.9%)을 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.53-7.43 (m, 4H), 7.37-7.34 (m, 3H), 7.27-7.23 (m, 3H), 6.77 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.81-4.75 (m, 2H), 4.67 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.37-4.35 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.17-4.07 (m, 2H), 3.66 (dd, J = 9.2 Hz, J' = 7.0 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.04 (dd, J = 17.2 Hz, J' = 4 Hz, 1H), 2.79-2.73 (m, 2H), 2.60-2.56 (m, 2H), 2.52-2.46 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 1.73-1.67 (m, 9H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.42 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2975, 1720, 1595, 1510, 1480, 1370, 1150, 1080, 760; ESIMS: m/z = 1181.4 [M + 1]⁺.

(실시예 11)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디 메틸프로피 오닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _c )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (100 mg, 0.12 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 이를 다시 메틸 에스테르인, 구조식 15_a의 화합물(92 mg, 0.14 mmol)을 탈메틸화 (과정 B)하여 얻은 아미노산과 아미드 커플링 반응 (과정 C)을 수행하여 백색 무정형 고체인 구조식 10_c의 표제의 화합물 (32 mg, 20.0%)을 얻었다.

mp 115-117 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.87 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.51-7.41 (m, 4H), 7.38-7.34 (m, 3H), 7.25-7.24 (m, 3H), 6.77 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.81-4.75 (m, 2H), 4.67 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.15-4.08 (m, 2H), 3.66 (dd, J = 9.2 Hz, J' = 6.8 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.93-2.65 (m, 7H), 2.58 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 1.77-1.66 (m, 9H), 1.44 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.41 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2970, 1710, 1600, 1520, 1480, 1370, 1150, 760; ESIMS: m/z = 1352.6 [M + 1]⁺.

(실시예 12)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Glu ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메 틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _d )

질소기체하에서, 구조식 7의 화합물 (85 mg, 0.10 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 구조식 9의 화합물 (62 mg, 0.12 mmol)과 함께 아미드 커플링 반응 (과정 C)을 수행하여 백색 무정형 고체인 구조식 10_d의 표제의 화합물 (17 mg, 16.4%)을 얻었다.

mp 110-113 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.54-7.45 (m, 4H), 7.36-7.34 (m, 3H), 7.25-7.23 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 4.77 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.68 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.29 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.17-4.11 (m, 3H), 3.66 (dd, J = 9.2 Hz, J' = 6.8 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.76 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.56 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.40 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.90-1.88 (m, 2H), 1.74-1.66 (m, 9H), 1.41 (s, 9H), 1.40 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2970, 2930, 1720, 1590, 1520, 1480, 1370, 1340, 1250, 1160, 1075, 850, 760; ESIMS: m/z = 1024.2 [M + 1]⁺.

(실시예 13)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- Glu ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디 메틸프로피 오닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _e )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (132 mg, 0.16 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 이를 다시 메틸 에스테르 (130 mg, 0.19 mmol)를 탈메틸화 (과정 B)하여 얻은 아미노산과 아미드 커플링 반응시켜(과정 C), 백색 무정형 고체인 구조식 10_e의 표제의 화합물 (101 mg, 45.9%)을 수득하였다.

mp 112-115 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.57-7.44 (m, 4H), 7.36-7.34 (m, 3H), 7.25-7.23 (m, 3H), 6.75 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 4.77 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.67 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.28 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.16-4.09 (m, 3H), 3.91 (m, 1H), 3.66 (dd, J = 9.2 Hz, J' = 6.8 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 2.82 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.65 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H), 2.43-2.34 (m, 6H), 2.19 (s, 3H), 2.10-1.96 (m, 6H), 1.73-1.67 (m, 9H), 1.45-1.35 (m, 36H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2975, 1730, 1595, 1520, 1370, 1325, 1250, 1150, 1080, 850, 760; ESIMS: m/z = 1394.6 [M + 1]⁺.

(실시예 14)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Asp ( OtBu )- Asp ( OtBu )- 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (10 _f )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (90 mg, 0.11 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 이를 다시 메틸 에스테르인, 구조식 16의 화합물 (113 mg, 0.13 mmol)을 탈메틸화 (과정 B)하여 얻은 아미노산과 아미드 커플링 반응 (과정 C)을 수행하여 백색 무정형 고체인 구조식 10_f의 표제의 화합물 (44 mg, 25.9%)을 얻었다.

mp 111-114 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (s, 1H), 7.77 (br, s, 1H), 7.58-7.45 (m, 4H), 7.36-7.34 (m, 3H), 7.24-7.23 (m, 3H), 6.74 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 4.78 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.66 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.18-4.10 (m, 3H), 4.06 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 3.67 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.14 (t, br, 2H), 2.84 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.66 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.45-2.34 (m, 8H), 2.19 (s, 3H), 2.13-1.96 (m, 8H), 1.74-1.67 (m, 9H), 1.85-1.35 (m, 45H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2970, 1730, 1520, 1370, 1250, 1155, 1080, 850, 760; ESIMS: m/z = 1579.9 [M + 1]⁺.

(실시예 15)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Asp - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피 오닐 )-아미노) 벤조일 )- 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 TFA 염 ( I _a )

구조식 10_a의 화합물 (30 mg, 0.03 mmol)을 가지고 과정 A (Boc-아미드의 탈보호)를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_a의 화합물 (28 mg, 97.4%)을 얻었다.

mp 162-163 ^oC; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.23 (s, 1H), 7.83-7.76 (m, 2H), 7.72-7.62 (m, 2H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38-7.33 (m, 2H), 7.24 (d, J = 7.24 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.80 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.62 (m, 1H), 4.28 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 4.14-4.11 (m, 3H), 3.50 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.39 (m, overlap, 2H), 3.18 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.89 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 2.82 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.53 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 1.57-1.50 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2900, 1730, 1680, 1600, 1480, 1380, 1340, 1180, 1160, 1080, 760; ESIMS: m/z = 854.0 [M + 1]⁺.

(실시예 16)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Asp - Asp - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 TFA 염 ( I _b )

구조식 10_b의 화합물 (46 mg, 0.039 mmol)을 가지고 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_b의 화합물 (33 mg, 78.3%)을 얻었다.

mp 183-185 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.21 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.53 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 4.03-4.02 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.6 Hz, J' = 6.4 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 2.83 (s, 2H), 2.74-2.63 (m, 4H), 2.55 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 1.56-1.46 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2900, 1730, 1660, 1520, 1480, 1380, 1340, 1180, 1160, 1080, 830, 760; ESIMS: m/z = 969.0 [M + 1]⁺.

(실시예 17)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Asp - Asp - Asp - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _c )

구조식 10_c의 화합물 (31 mg, 0.023 mmol)을 가지고 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_c의 화합물 (21 mg, 76.5%)을 얻었다.

mp 181-184 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.21 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.59 (m, 2H), 4.52 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.01 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.6 Hz, J' = 6.4 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 2.84 (s, 2H), 2.79-2.60 (m, 6H), 2.55 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 1.56-1.46 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2920, 1730, 1600, 1520, 1475, 1370, 1250, 1150, 1070, 840, 760; ESIMS: m/z = 1084.1 [M + 1]⁺.

(실시예 18)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Glu - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _d )

구조식 10_d의 화합물 (48 mg, 0.047 mmol)을 가지고 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_d의 화합물 (45 mg, 98%)을 얻었다.

mp 166-168 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.21 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.62 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.86 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.2 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.88 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 2.82 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.40-2.29 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.00-1.93 (m, 2H), 1.55-1.50 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2900, 1730, 1595, 1520, 1480, 1380, 1340, 1160, 1080, 760; ESIMS: m/z = 868.0 [M + 1]⁺.

(실시예 19)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Glu - Glu - Glu - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _e )

구조식 9_e의 화합물 (90 mg, 0.0646 mmol)을 가지고 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_e의 화합물 (73 mg, 91.2%)을 얻었다.

mp 170-173 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.22 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.23 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.56 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.32 (m, 2H), 4.27 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.2 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.88 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.82 (d, J =15.2 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.38-2.25 (m, 6H), 2.15 (s, 3H), 1.91-1.78 (m, 6H), 1.54-1.47 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2950, 1730, 1640, 1600, 1370, 1250, 1150, 1080, 840, 760; ESIMS: m/z = 1126.2 [M + 1]⁺.

(실시예 20)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Glu - Glu - Glu - Glu - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디메틸프로피오닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _f )

구조식 10_f의 화합물 (44 mg, 0.0279 mmol)을 가지고 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_f의 화합물 (32 mg, 83.9%)을 얻었다.

mp 169-172 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.21 (s, 1H), 7.78-7.66 (m, 2H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.39-7.31 (m, 3H), 7.23 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 6.79 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.56 (m, 1H), 4.32 (m, 3H), 4.27 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 3.81 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.2 Hz, 1H), 3.14 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.88 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.82 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.36-2.20 (m, 8H), 2.15 (s, 3H), 1.91-1.70 (m, 8H), 1.54-1.47 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2950, 1730, 1650, 1360, 1160, 1080, 760; ESIMS: m/z = 1155.3 [M + 1]⁺.

(실시예 21)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Asp - Asp - Asp - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온·소디움염( I _j )

구조식 I_c의 화합물(16 mg, 0.013 mmol)을 아세톤/H₂O (1:1, 1 mL)에 완전히 녹이고 NaHCO₃ (5 mg, 0.054 mmol)를 첨가한 후, 용매는 감압하에서 완전히 제거하였다 (< 40 ^oC, 물중탕). 이렇게 얻은 점착성 고체 (gummy solid)를 다시 일정량의 증류수 (1 mL)에 녹인 후, 동결건조 (lyophilization)하여 연노란색 고체인 구조식 I_j의 화합물 (17 mg, 99 %)을 얻었다.

mp 265-267 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.76-7.68 (m, 3H), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.38-7.31 (m, 5H), 7.23 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.76 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 4.78 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.50 (m, 2H), 4.25 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.17-4.10 (m, 3H), 3.49 (dd, J = 9.6 Hz, J' = 6.4 Hz, 1H), 3.13 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 2.65 (s, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.52-2.43 (오버랩, 6H), 2.14 (s, 3H), 1.57-1.47 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2950, 1580, 1380, 1340, 1160, 760.

(실시예 22)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Glu - Glu - Glu - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온·소디움염( I _k )

구조식 I_e의 화합물(10 mg, 0.0081 mmol)을 아세톤/H₂O (1:1, 1 mL)에 완전히 녹이고 NaHCO₃ (2.7 mg, 0.032 mmol)를 첨가한 후, 그 용매를 감압하에서 완전히 제거하였다 (< 40 ℃, 물중탕). 이렇게 얻은 점착성 고체 (gummy solid)는 다시 일정량의 증류수 (1 mL)에 녹인 후, 동결건조 (lyophilization)하여 연노란색 고체인 구조식 I_k의 화합물(10 mg, 99 % 수율)을 얻었다.

mp 273-274 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.60 (s, 1H), 7.34 (br, s, 2H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.17-7.15 (m, 3H), 6.92 (m, 2H), 6.78 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 4.72-4.60 (오버랩, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.25 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 4.16-4.13 (m, 2H), 4.00 (br, s, 2H), 3.47 (br, s, 1H), 3.32 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 2.98 (m, 2H), 2.75 (s, 2H), 2.35 (s, 3H), 2.14-2.07 (m, 6H), 1.90-1.86 (m, 2H), 1.81-1.73 (m, 3H), 1.67-1.64 (m, 1H), 1.47-1.40 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 2950, 1680, 1600, 1380, 1180, 1140, 1070, 840.

(실시예 23)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( NH ₂ - Glu - Glu - Glu - Glu - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디메틸프로피오닐)-아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· 소디움염( I _l )

구조식 I_f의 화합물(12 mg, 0.0088 mmol)을 아세톤/H₂O (1:1, 1 mL)에 완전히 녹이고 NaHCO₃ (4 mg, 0.048 mmol)를 첨가한 후, 그 용매를 감압하에서 완전히 제거하였다 (< 40 ℃, 물중탕). 이렇게 얻은 점착성 고체 (gummy solid)는 다시 일정량의 증류수 (1 mL)에 녹인 후, 동결건조 (lyophilization)하여 연노란색 고체인 구조식 I_l의 화합물(12 mg, 99 % 수율)을 얻었다.

mp 276-279 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.63 (s, 1H), 7.42 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.20-7.19 (m, 3H), 6.95 (m, 2H), 6.82 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 4.75-4.72 (m, 1H), 4.54-4.52 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 4.18-4.11 (m, 2H), 4.06 (m, 3H), 3.57 (m, 1H), 3.33 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.06-2.97 (m, 2H), 2.77 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.15-2.09 (m, 8H), 2.06 (s, 3H), 1.94-1.75 (m, 6H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.49-1.42 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3400, 2950, 1700, 1580, 1400, 1340, 1160, 850.

( 실시예 24) BocNH - Gly - OBn (11-1)

구조식 11의 화합물인 L-글리신 (643 mg, 8.56 mmol)을 디옥산과 H₂O의 혼합용액 (1:1, 100 mL)에 녹인 후, 냉욕상에서 NaOH (1027 mg, 25.68 mmol)를 첨가하여 10분간 교반하였다. 여기에 di-t-부틸 디카르보네이트 (디옥산 10 mL 중에 (Boc)₂O, 2221 mg, 10.27 mmol)를 서서히 적가하고, 이 반응용액이 자연스럽게 상온이 될 수 있도록 하면서 12시간동안 더 교반하였다. 반응이 완결되면, 반응용액을 1N HCl 수용액으로 산성화 (pH 3-4)하여 충분량의 EtOAc (100 mL X 3)로 추출, 그 유기층을 합하여 탈수 (anh. Na₂SO₄), 감압농축하였다. 이렇게 얻은 무색 시럽은 더 이상 정제하지 않고 다음 단계 반응에서 사용하였다.

합성된 BocNH-Gly-OH (8.56 mmol)을 무수 THF (50 mL)에 녹이고, 냉욕상에서 NMM (1.13 mL, 10.27 mmol)과 DMAP (523 mg, 4.28mmol)를 첨가한 후 10분간 교반하였다. 여기에 벤질 클로로포르메이트 (1.446 mL, 10.27 mmol)을 서서히 적가한 다음, 출발물질이 완전히 사라질 때까지 3시간 더 교반하였다. 반응이 완결되면, 반응물을 과량의 H₂O (100 mL)을 사용하여 희석하고 그 혼합액을 충분량의 EtOAc (100 mL X 3)로 추출한 다음, 그 유기층을 합하여 sat. NaHCO₃ (50 mL X 2), 염수 (50 mL X 2), 증류수 (100 mL X 2)로 세척하였다. 그 유기층은 다시 무수망초로 탈수하고 감압농축하고, 실리카겔 컬럼에서 cHx:EtOAc = 5:1 → 3:1 의 혼합용매로 분리하여 무색 시럽인 구조식 11-1의 표제의 화합물 (1.998 mg, 88.0%) 을 얻었다. 이 물질에 대한 물리·화학적 데이터는 기존 문헌과 정확히 일치하였다 (Wiles, C.; Watts, P.; Haswell, S. J.; Pombo-Villar E. Solution phase synthesis of esters within a micro reactor. Tetrahedron. 2003, 59, 10173-9).

( 실시예 25) BocNH -b- Ala - OBn (12-1)

구조식 12의 화합물인 β-알라닌 (1.5 g, 16.84 mmol)을 출발물질로 하여 구 조식 11-1의 화합물과 동일한 과정을 수행, 백색 무정형 고체인 구조식 12-1의 표제의 화합물 (1.58 g, 33.6%)을 얻었다. 이 물질에 대한 물리·화학적 데이터는 기존 문헌과 정확히 일치하였다 (Guetzoyan, L.; Ramiandrasoa, F.; Dorizon, H.; Despresz, C.; Bridoux, A.; Rogior, C.; Pradines, B.; Perree-Fauvet, M. In vitro efficiency of new acridly derivatives against Plasmodium falciparum. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 3278-89).

( 실시예 26) BocNH -( CH ₂ ) ₃ - COOBn (13-1)

구조식 13의 화합물인 γ-아미노 부티르산 (1.5 g, 14.55 mmol)을 출발물질로 하여 구조식 11-1의 화합물과 동일한 과정을 수행, 백색 무정형 고체인 구조식 13-1의 표제의 화합물 (2.8 g, 65.5%)을 얻었다. 이 물질에 대한 물리·화학적 데이터는 기존 문헌과 정확히 일치하였다 (Reddy, P. G.; Pratap, T. V.; Kumar, G. D. K.; Mohanty S. K.; Baskaran, S. The Lindlar catalyst revitalized: A highly chemoselective method for the direct conversion of azides to N-(tert-butoxycarbonyl)amines. Eur. J. Org. Chem. 2002, 22, 3740-3).

(실시예 27)

N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노 - Gly - OBn (17 _a )

합성된 구조식 11-1의 화합물 (380 mg, 1.43 mmol)에 대하여 과정 A (Boc-아미드의 탈보호화)를 수행하여 얻은 백색 고체를 무수 CH₂Cl₂ (10 mL)에 녹인 후, 트리에틸아민 (TEA, 300 μL, 2.15 mmol)을 첨가하여 10분간 상온에서 교반하였다. 여기에 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로 메틸설포닐)-구아니딘 (616 mg, 1.57 mmol)을 넣은 후 출발물질이 완전히 사라질 때까지 4시간 더 교반하였다. 반응이 완결되면, 과량의 CH₂Cl₂로 반응물을 희석하고 2M NaHSO₄ (50 mL), 5% NaHCO₃ (50 mL X 2), 및 염수 (50 mL X 2)로 세척, 그 유기층을 합하여 무수망초로 탈수, 감압농축하였다. 이렇게 얻은 조생성물을 실리카겔 컬럼에서 cHx:EtOAc = 5:1 → 3:1 의 혼합용매로 분리하여 무색의 시럽인 구조식 17_a의 표제의 화합물 (530 mg, 91.0%)을 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.39-7.32 (m, 5H), 5.21 (s, 2H), 4.29 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 1.50 (s, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2980, 1730, 1650, 1320, 1100, 760; ESIMS: m/z = 407.5 [M + 1]⁺.

(실시예 28)

N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노 -β- Ala - OBn (17 _b )

합성된 구조식 12-1의 화합물 (328 mg, 1.17 mmol)을 출발물질로 하여 구조식 17_a의 화합물과 동일한 과정을 수행, 백색의 무정형 고체인 구조식 17_b의 표제의 화합물 (468 mg, 94.9%)을 얻었다.

mp 92-95 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.35 (s, 5H), 5.21 (s, 2H), 4.29 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 1.50 (s, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3320, 2970, 2925, 1730, 1630, 1580, 1320, 1100, 760; ESIMS: m/z = 422.5 [M + 1]⁺.

(실시예 29)

(4-[N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노아미노 ]) 부타노산 벤질 에스테르 (17 _c )

합성된 구조식 13-1의 화합물 (256 mg, 0.87 mmol)을 출발물질로 하여 구조식 17_a의 화합물과 동일한 과정을 수행, 무색의 시럽인 구조식 17_c의 표제의 화합물 (360 mg, 94.9%)을 얻었다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.35 (s, 5H), 5.21 (s, 2H), 4.29 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 1.50 (s, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2990, 1730, 1650, 1340, 1100, 760; ESIMS: m/z = 436.5 [M + 1]⁺.

(실시예 30)

N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노Gly - OH (18 _a )

합성된 구조식 17_a의 화합물 (650 mg, 1.60 mmol)을 출발물질로 하여 과정 D (벤질 에스테르의 탈보호화)와 산-염기 추출을 거쳐 백색 무정형 고체인 구조식 18_a의 표제의 화합물 (213 mg, 42.1%)를 얻었다.

mp 152-155 ℃, ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.46 (s, NH), 8.61 (s, NH), 3.96 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.38 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3340, 2975, 1730, 1660, 1640, 1240, 1160, 1100, 1060. 990, 800, 760; ESIMS: m/z = 318.3 [M + 1]⁺.

(실시예 31)

N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노 -β- Ala - OH (18 _b )

합성된 구조식 17_b의 화합물 (319 mg, 0.76 mmol)을 출발물질로 하여 과정 D (벤질 에스테르의 탈보호화)와 산-염기 추출을 거쳐 백색 무정형 고체인 구조식 18_b의 표제의 화합물 (196 mg, 78.2%)을 얻었다.

mp 135-137 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.46 (br, s, NH), 8.82 (s, NH), 3.67 (br, s, 2H), 2.72 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 1.50 (s, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2970, 2930, 1730, 1660, 1640, 1340, 1150, 1020, 880, 800, 780; ESIMS: m/z = 322.4 [M + 1]⁺.

(실시예 32)

(4-[N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노아미노 ]) 부타노산 (18 _c )

합성된 구조식 17_c의 화합물(343 mg, 0.79 mmol)을 출발물질로 하여 과정 D (벤질 에스테르의 탈보호화)와 산-염기 추출을 거쳐 백색 무정형 고체인 구조식 18_c의 표제의 화합물 (171 mg, 62.9%)을 얻었다.

mp 137-140 ℃, δ 11.56 (br, s, NH), 8.60 (s, NH), 3.51 (dd, J = 12.6 Hz, J' = 6.2 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.95-1.89 (m, 2H), 1.51 (s, 9H), 1.49 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3330, 2950, 1730, 1650, 1350, 1150, 1050, 880, 820, 770; ESIMS: m/z = 346.4 [M + 1]⁺.

(실시예 33)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노 - Gly - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (19 _a )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (54 mg, 0.065 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 구조식 18_a의 화합물(25 mg, 0.078 mmol)과 함께 아미드 커플 링반응 (과정 C)을 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 19_a의 표제의 화합물 (24 mg, 35.8%)을 얻었다.

mp 140-143 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (s, 1H), 7.76 (br, d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.40-7.33 (m, 4H), 7.25-7.23 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.77 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.67 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.17-4.11 (m, 4H), 3.67 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 7.0 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 2.77 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 2.58 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.46 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 1715, 1650, 1360, 1100, 760; ESIMS: m/z = 1038.2 [M + 1]⁺.

(실시예 34)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(N ^α -(N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노 -β- Ala -알라닐옥시)-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5-일설 포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (19 _b )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (30 mg, 0.036 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 구조식 18_b의 화합물(14 mg, 0.043 mmol)과 함께 아미드 커플링반응 (DMF 중에서 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 유라늄·PF6 (HATU, 16 mg) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 8 μL), 0 ℃-실온, 12 h)을 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 19_b의 표제의 화합물 (26 mg, 70.6%)을 얻었다.

mp 141-143 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.87 (s, 1H), 7.76 (br, d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.74 (br, d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.38-7.35 (m, 3H), 7.26-7.24 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 4.74 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.71 (m, 1H), 4.28 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.76-3.62 (m, 3H), 3.15 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.77 (d, J = 13.6 Hz, 2H), 2.64-2.59 (m, 3H), 2.52 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.72-1.66 (m, 9H), 1.50-1.44 (m, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3320, 2920, 1730, 1640, 1370, 1330, 1250, 1140, 1060, 840, 760; ESIMS: m/z = 1052.2 [M + 1]⁺.

(실시예 35)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(4-(N ^α (N, N' - 비스 - tert - 부톡시카르보닐 ) 아미디노아미노 )-부 탄아미도 - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 (19 _c )

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (27 mg, 0.032 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 구조식 18_c의 화합물(13 mg, 0.038 mmol)과 함께 아미드 커플링반응 (DMF 중에서, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸 유라늄·PF6 (HATU, 15 mg) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 5 μL), 0 ℃-실온, 12 h)을 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 19_c 의 표제의 화합물 (14 mg, 42.2%)을 얻었다.

mp 115-118 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (s, 1H), 7.75 (br, d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.38-7.35 (m, 3H), 7.26-7.24 (m, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 4.77 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.62 (m, 1H), 4.30 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.17 (m, 2H), 3.68 (dd, J = 9.5 Hz, J' = 7.1 Hz, 1H), 3.53 (m, 2H), 3.17 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.79 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.64 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.35 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.87 (m, 2H), 1.75-1.73 (m, 9H), 1.51-1.48 (m, 18H); IR (cm^-1, KBr) 3320, 2910, 1730, 1640, 1520, 1480, 1370, 1330, 1250, 1130, 1060, 840, 760; ESIMS: m/z = 1066.2 [M + 1]⁺.

(실시예 36)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(N ^α - 아미디노 - Gly - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _g )

질소기체 하에서, 구조식 19_a의 화합물(24 mg, 0.0231 mmol)로부터 과정 A (Boc-아미드의 탈보호)를 수행하여 연회색 무정형 고체인 구조식 I_g의 표제의 화합 물 (10 mg, 45.4%)을 얻었다.

mp 156-158 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.79 (s, 1H), 7.76 (br, d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.39-7.30 (m, 4H), 7.23 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.59 (m, 1H), 4.27 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.93 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.49 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.2 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 15.6 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 1.53 (s, 6H), 1.50 (d, J = 7.6 Hz, 3H); IR (cm^-1, KBr) 3330, 3240, 1730, 1650, 1510, 1460, 1240; EIMS: m/z = 838.0 [M + 1]⁺.

(실시예 37)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(N ^α - 아미디노 -β- Ala - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디메틸프로피오닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TF A 염 ( I _h )

질소기체 하에서, 구조식 19_b의 화합물(12 mg, 0.0117 mmol)로부터 과정 A를 수행하여 연회색 무정형 고체인 구조식 I_h의 표제의 화합물 (11 mg, 98.6%)을 얻었다.

mp 171-173 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.84 (s, 1H), 7.76 (br, d, 2H), 7.54 (br, s, 4H), 7.35-7.31 (m, 3H), 7.22-7.21 (m, 2H), 6.85 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 4.79 (dd, J = 8.8 Hz, J' = 6.4 Hz, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.32 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.18 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 10.0 Hz, J' = 6.0 Hz, 1H), 3.45 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.20 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 2.87 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.76 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.59 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.68-1.59 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 3250, 1730, 1660, 1500, 1470, 1380, 1250; EIMS: m/z = 852.0 [M + 1]⁺.

(실시예 38)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-(4-(N ^α - 아미디노아미노 ) 부탄아미도 - 알라닐옥시 )-4,6- 디 메틸페닐)-3,3-디메틸프로- 피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온·T FA 염 ( I _i )

질소기체 하에서, 구조식 19_c의 화합물(12 mg, 0.0116 mmol)로부터 과정 A를 수행하여 연회색 무정형 고체인 구조식 I_i의 표제의 화합물 (10 mg, 97.2%)을 얻었다.

mp 184-185 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.84 (s, 1H), 7.76 (br, d, 2H), 7.54 (br, s, 4H), 7.36-7.32 (m, 3H), 7.22-7.20 (m, 2H), 6.84 (s, 1H), 6.61 (s, 1H), 4.78 (t, J = H₂O 피크와 오버랩 되어 값을 결정할 수 없었음, 1H), 4.62 (m, 1H), 4.32 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 4.18 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 7.8 Hz, J' = 6.0 Hz, 1H), 3.22-3.14 (m, 4H), 2.89 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.53 (s, 3H), 2.37 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.86 (m, 2H), 1.69-1.59 (m, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3350, 1730, 1665, 1500, 1470, 1380, 1160, 1080; EIMS: m/z = 866.0 [M + 1]⁺.

(실시예 40)

BocNH -ω,ω'-디- Boc -아르기닌 (20 _b )

가스 제거된 무수 MeOH에서 아미노산, BocNH-Orn(Cbz)-COOH (20_a, 600 mg, 1.638 mmol)을 출발물질로 사용하여 과정 D (벤질 에스테르의 탈보호화)를 거쳐 얻은 백색 무정형 고체 (BocNH-Orn-COOH, 정량적 수율)를 더 이상의 정제과정 없이 다음 반응 (구아니딜화 반응)에 사용하였다.

질소기체하에서, 탈벤질화하여 얻은 BocNH-Orn-COOH을 무수 CH₂Cl₂ 50 mL에 녹여 현탁시킨 후 N-메틸-N-트리메틸실릴-트리플루오로아세트아미드 (668 μL, 3.60 mmol)를 첨가하여 용액이 투명해질 때까지 환류교반하고 이를 다시 상온으로 냉각시켰다. 반응용액에 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸설포닐)-구아니딘 (640 mg)과 트리에틸아민 (TEA, 460 μL)을 첨가하고 출발물질이 완전히 사라질 때까지 12시간동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완결되면, 과량의 CH₂Cl₂ (100 mL)로 희석하고 1 M NaHSO₄ (50 mL X 2), 5% NaHCO₃ (50 mL X 2) 그리고 증류수 (100 mL X 2)로 세척, 그 유기층을 무수망초로 탈수, 감압농축하였다. 이렇게 얻은 조생성물을 실리카겔 컬럼에서 CH₂Cl₂:MeOH = 30:1 → 20:1 → 10:1 의 혼합용매로 분리하여 무색 시럽인 구조식 20_b의 표제의 화합물 (460 mg, 59.2%)을 얻었다.

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) δ 4.32 (br, s, 1H), 3.42 (br, s, 2H), 1.97-1.86 (br, m, 1H), 1.75-1.61 (m, 3H), 1.52-1.43 (3 s, 27H); EIMS: m/z = 475.6 [M + 1]⁺.

(실시예 41)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH -ω,ω'- di - Boc - Arg - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3-디 메틸프로피 오닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온 ·TFA 염 (21)

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (30 mg, 0.036 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, 아미노산 20_b (20 mg, 0.043 mmol)와 함께 아미드 커플링반응 (과정 C)을 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 21의 표제의 화합물 (16 mg, 37.4%)을 얻었다.

mp 115-118 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (s, 1H), 7.76 (br, d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.47-7.40 (m, 3H), 7.37-7.34 (m, 3H), 7.25-7.23 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 4.77 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.29 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.67 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.9 Hz, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.15 (t, J = 8.3 Hz, 2H), 2.74 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.59 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.03 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.71-1.65 (m, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.42 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3310, 2970, 2900, 1730, 1650, 1510, 1380, 1250, 1160, 760; EIMS: m/z = 1195.4 [M + 1]⁺.

(실시예 42)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( Arg - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )-아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _m )

질소기체 하에서, 구조식 21의 화합물 (15 mg, 0.0126 mmol)로부터 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_m의 표제의 화합물 (9 mg, 65.3%)을 얻었다.

mp 154-157 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.79 (s, 1H), 7.76 (br, d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.50 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.39-7.30 (m, 3H), 7.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.82 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.61 (m, 1H), 4.27 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 9.2 Hz, J' = 6.4 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.06 (m, 2H), 2.91 (d, J = 14.8, 1H), 2.82 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 1.70 (m, 2H), 1.55-1.52 (m, 11H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 1680, 1530, 1370, 1200, 840, 740; EIMS: m/z = 895.0 [M + 1]⁺.

(실시예 43)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH - Gly - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노)벤조일) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온(22)

질소기체 하에서, 구조식 7의 화합물 (70 mg, 0.084 mmol)을 출발물질로 하여 과정 A를 거친 후, BocNH-Gly-OH (18 mg)와 함께 아미드 커플링반응 (과정 C)을 수행하여 백색 무정형 고체인 구조식 22의 표제의 화합물 (45 mg, 60.0%)을 얻었다.

mp 141-143 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.74 (br, d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.35-7.33 (m, 4H), 7.23-7.21 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.78-4.70 (m, 2H), 4.28 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.89-3.84 (m, 2H), 3.65 (dd, J = 9.3 Hz, J' = 7.1 Hz, 1H), 3.13 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.78 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.73-1.64 (m, 9H), 1.41 (s, 9H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2970, 2920, 1730, 1680, 1590, 1530, 1480, 1380, 1335, 1250, 1150, 1080, 840, 760; EIMS: m/z = 896.0 [M + 1]⁺.

(실시예 44)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( BocNH -ω,ω'-디- Boc - Arg - Gly - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오 -닐)아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온(23)

질소기체 하에서, 구조식 22의 화합물 (45 mg, 0.050 mmol)을 출발물질로 하 여 과정 A를 거친 후, 합성된 구조식 15-1의 화합물 (29 mg)과 함께 아미드 커플링반응 (과정 C)을 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 23의 표제의 화합물 (57 mg, 90.6%)을 얻었다.

mp 119-121 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.74 (br, d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61 (m, 1H), 7.54 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.35-7.32 (m, 3H), 7.24-7.22 (m, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.75 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.27 (t, J = 9.3 Hz, 1H), 4.22-4.08 (m, 4H), 3.83 (dd, J = 12.5 Hz, J' = 5.6 Hz, 1H), 3.66 (dd, J = 9.3 Hz, J' = 6.8 Hz, 1H), 3.37 (m, 2H), 3.14 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.61 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.82 (m, 2H), 1.73-1.64 (m, 11H), 1.48-1.41 (3 s, 27H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 2900, 1720, 1650, 1520, 1370, 1330, 1250, 1160, 1050, 760; EIMS: m/z = 1252.5 [M + 1]⁺.

(실시예 45)

(S)-1-(1-(4-(3-(2-( Arg - Gly - 알라닐옥시 )-4,6- 디메틸페닐 )-3,3- 디메틸프로피오닐 )아미노) 벤조일 ) 인돌린 -5- 일설포닐 )-4- 페닐이미다졸리딘 -2-온· TFA 염 ( I _n )

질소기체 하에서, 구조식 23의 화합물 (57 mg, 0.046 mmol)로부터 과정 A를 수행하여 연노란색 무정형 고체인 구조식 I_n의 표제의 화합물 (29 mg, 54.0%)을 얻었다.

mp 138-141 ℃; ¹H-NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.79 (s, 1H), 7.74 (br, d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.63-7.55 (m, 5H), 7.39-7.30 (m, 3H), 7.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.79 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.57 (m, 1H), 4.27 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 3.97-3.87 (m, 2H), , 3.85 (br, s, 1H), 3.49 (dd, J = 9.4 Hz, J' = 6.2 Hz, 1H), 3.15 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.09 (m, 2H), 2.85 (s, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 1.71-1.67 (m, 2H), 1.52- 1.47 (m, 11H); IR (cm^-1, KBr) 3300, 1680, 1530, 1520, 1480, 1380, 1250, 1200, 1180, 1070, 840, 720; EIMS: m/z = 952.1 [M + 1]⁺.

용해도 테스트

합성된 물질들의 물 (distilled water)에 대한 용해도는 Casini 등의 방법에 의해 측정되었다 (Casini, A.; Scozzafava, A.; Mincione, F.; Menabuoni, L.; Ilies, M. A.; Supuran, C. T. Carbonic Anhydrase Inhibitors: Water-Soluble 4-Sulfamoylphenylthioureas as Topical Intraocular Pressure-Lowering Agents with Long-Lasting Effects. J. Med . Chem. 2000, 43, 4884-92).

정확히 측량된 각 물질 1 mg을 HPLC 용 MeOH (10 mL)에 완전히 녹여 표준시료 (standard sample solution)를 만든 후, 이 표준시료에 대한 UV 최대 흡광도 (UV absorption maxium, λ_max in UV spectrophotometer Mini 1240, Shimadzu, Japan)를 결정하였다. 소량의 증류수 (250 μL)를 사용하여 각 물질에 대한 포화 수용액을 만든 후, 불용물은 0.45 μm 주사기 필터 (PVDF syringe filter, Whatman, USA)를 통과시켜 제거하였다. 이렇게 준비된 포화 수용액은 표준시료를 이용하여 정해진 각 물질의 최대 흡수파장에서 스캔하여 그 흡광도를 정하였다. 각 물질의 물에 대한 용해도 (aqueous solubility)는 다음 식에 의해 결정하였다. 결과는 표 4과 5에서 보는 바와 같다.

C' = (A'X C) ÷ A

여기에서 C = 표준 용액의 농도 (mg/mL),

A = 표준 용액의 흡광도 (absorbance of standard solution),

A' = 포화 용액의 흡광도,

C' = 수용액의 농도(mg/mL)를 나타낸다.

정제된 에스테라제 재변환 테스트

본 발명 화합물 7 (MW 837.98)의 0.01 M 스톡 용액(DMSO 500 μL에 4.19 mg이 용해된 것)을 만든 후, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사로부터 구입한 정제된 돼지 간 에스테라제(purified porcine liver esterase, 카르복실릭 에스테르 가수분해효소 EC 3.1.1.1, 3.2 M (NH₄)₂SO₄, pH 8, Cat. No. E2884-1ku) 현탁액 50 μL을 인산 완충액 (phosphate buffer, 0.05 M, pH 7.4) 1 mL에 녹여 희석시켰다. 이 효소 용액 280 μL (70 μL X 4)을 동일 인산 완충액 3680 μL (920 μL X 4)에 첨가하여 완충액 + 효소 용액 (BPES)을 만들었다. 본 발명 화합물 7의 0.01 M 스톡 용액 40 μL (10 μL X 4)를 준비된 BPES에 첨가한 후, 이를 37 ± 0.5 ℃를 유지하면서 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator, VS-8480SFN, Vision scientific co., Ltd, Seoul, Korea)에서 배양하였다. 30분 경과할 때마다, 그 BPES 100 μL를 취하여 900 μL를 첨가하여 냉동실에서 24시간 동안 보관하였다. 침전된 에스테라제는 원심분리하여 제거하고 여액은 완전히 감압건고한 후, 그 잔사를 100 μL AtCN 에 완전히 녹여 분석용 시료를 제조하였다. 이렇게 제조한 시료를 RP-HPLC 을 이용하여 함량 분석하였다. 결과는 도 1과 같다.

인간의 암세포들에 대한 세포독성의 측정

11 종의 아미노산이 연결된 일반 구조식 I의 화합물 (I_a, I_b, I_j, I_d, I_k, I_l, I_g, I_h, I_i, I_m, I_n)들에 대하여, 네 가지 인간 암세포, 즉 폐암 (human lung carcinoma, A-549); 자궁암 (human ovary adenocarcinoma, SK-OV-3); 백혈병 (human bone merrow chronic myelogenous leukemia, K-562); 대장암 (human colorectal adenocarcinoma, SW620)을 대상으로 세포독성실험을 실시하였다.

MTT 분석방법에 의해 그 세포독성값 (IC₅₀, μM)을 측정하였다 (Ming, Z.; Lanrong, B.; Wei, W.; Chao, W.; Michele, B. F.; Jingfang, J.; Shiqi, P. Synthesis and cytoxic activities of β-carboline amino acid ester conjugates. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 6998-7010; Brij, B. S.; Lei, Z.; Meirong. H.; Eileen, K.; Meena, K.; Ozgur, O.; Arkadiy, B.; Premila, R. Boc-lysinated-betulonic acid: A potent, anti-prostate cancer agent. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 6349-6358). 배양액은 멸균 주사용 증류수에 L-글루타민이 포함된 DMEM 배지 한 봉지, 60 ℃ 수조에서 30분간 열처리에 의해 불활성화시킨 소혈청 (FBS) 100 mL, NaHCO₃ 3.7 g, 페니실린 (10000 unit/mL), 스트렙토마이신 (10 mg/mL)을 넣어 용해시킨 후, 0.1N 염산으로 pH를 조절하여 전체를 1 L가 되게 하고 세균여과하여 제조하였으며, 4 ℃에서 보관하면서 사용하였다. 세포는 3일에 한번씩 서브컬쳐하면서 유지하였으며, 세포를 부착면으로부터 분리하기 위하여 인산 완충 염수 (phosphate buffered saline) 용액에 트립신 (2.5 g/L)과 EDTA (0.38 g/L)를 녹인 용액을 사용하였다.

실험에 사용할 세포들을 트립신-EDTA 용액으로 부착면으로부터 분리시키고 96 웰 플레이트의 웰 당 5 X 10³ 의 세포를 씨딩(seeding) 한 후 5% CO₂ 배양기 (37 ℃)에서 24시간 배양하였다. 시료는 디메틸설폭시드 (DMSO)에 녹여 실험에 필요한 농도까지 실험용 배지 또는 3차 증류수로 희석하여 최종 DMSO의 농도가 0.2% 이하가 되도록 단계별로 희석하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 단계별 농도로 희석한 시료를 각각 2 μL씩 넣어준 다음 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 배양이 끝나면 웰당 20 μL MTT 용액 (티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로미드: PBS중에 5 mg/mL, Sigma M2128)을 가하여 4시간을 더 배양한 후 모든 배지를 제거하였다. 각각의 웰에는 다시 라이시스 완충액(lysis buffer, 0.01 N HCl 중 10% SDS) 100 μL씩을 첨가하여 하룻밤동안 세포를 사멸 (overnight cell lysis)시켜 생성된 포르마잔(formazan)을 완전히 용해시킨 후 마이크로플레이트 해독기(microplate reader, 570 nm, Tecan A-5082, Salzburg, Austria)를 사용하여 각 웰의 광학밀도 (O.D.)값을 측정하였다. 이 값을 이용하여 각 물질의 암세포에 대한 IC₅₀ (50% inhibitory dose)값을 엑셀 프로그램에서 결정하였다. 그 결과는 표 6에서 보는 바와 같다.

세포독성 결과 해석

표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명 화합물들은 모약물 (II)와 같이 우수한 세포독성을 나타냈다. 이와 같이 우수한 세포독성은 합성된 유도체들이 PBS 완충액에 장시간 (incubating time, 4320 min) 노출됨으로 인하여 모약물이 천천히 그 리고 지속적으로 방출 (releasing)되거나, 배지에 들어 있는 혈청내 효소들의 가수분해 작용으로 인하여 에스테르 결합이 가수분해되면서 모약물이 재생되어 나타나는 결과이다.

물질구조와 세포독성간의 상관관계를 살펴보면, L-아스파르트산과 L-글루탐산이 가용성 담체로서 결합되어 있는 구조식 I_a, I_b, I_j, I_d, I_k, 및 I_l의 화합물은 구아니딘 해드를 가용성 담체로 사용한 구조식 I_g-I_i, I_m, 및 I_n의 화합물보다 SK-OV-3이나 SW620 세포에 대하여 보다 선택적으로 작용하였다. 특히, SK-OV-3 세포에 대해서는 L-글루탐산을 가지고 있는 구조식 I_d, I_j, 및 I_l의 화합물은 L-글루탐산의 갯수에 상관없이 구조식 II의 화합물보다 10-15배 향상된 세포독성을 나타냈다. 또한, SW620 세포에 대해서도 이 계열 약물들은 모약물 (II)와 대동소이한 세포독성을 발휘하였다. 다른 약물에 비해 N^α-아미디노-글리신-과 L-아르기닌-글리신-이 도입된 구조식 I_g 및 I_k의 화합물은 구조식 II의 화합물보다 A-549 세포에 대하여 2배 이상 향상된 세포독성을 나타냈다. 이와 같은 세포독성의 증가는 용해도 증가가 주요 원인인 것으로 판단된다.

표 6. 합성된 11가지 아미노산과 연결된 일반식 I_a, I_b, I_j, I_d, I_k, I_l, I_g, I_h, I_i, I_m, 및 I_n의 화합물의 네 가지 인간 암 세포 라인(A-549, SK-OV-3, K-562, and SW620)에 대한 in vitro 세포독성.

화합물	IC₅₀ (μM)^a
화합물	A-549^b	SK-OV-3^c	K-562^d	SW620^e
I_a	0.87	0.05	0.11	0.04
I_b	0.73	0.03	0.10	0.06
I_j	0.70	0.16	0.19	0.02
I_d	0.67	0.03	0.09	0.05
I_k	0.87	0.02	0.09	0.03
I_l	0.75	0.02	0.19	0.14
I_g	0.29	0.79	0.12	0.06
I_h	2.16	0.34	0.65	0.59
I_i	0.92	0.08	0.39	0.44
I_m	0.79	0.19	0.19	0.11
I_n	0.30	0.46	0.47	0.08
II	0.61	0.30	0.05	0.03

^a 모든 실험은 상기 기재된 과정 거의 그대로 MTT 분석법을 사용하여 적어도 3번씩 수행되었다.

^b인간 폐암 세포(Human lung carcinoma cell)

^c 인간 난소 샘암종 세포(Human ovary adenocarcinoma cell)

^d 인간 골수 만성 골수성 백혈병 세포(Human bone marrow chronic myelogenous leukemia cell).

^e 인간 결장직장 샘암종 세포(Human colorectal adenocarcinoma cell).

인간 혈장 내에서의 모약물 ( II ) 재생 실험

구조식 II의 화합물을 모약물로 하여 합성된 총 11종의 아미노산이 연결된 본 발명 화합물 중, 주사제로 개발 가능한 정도의 용해도 (≥1 mg/mL in dil. water)를 가지는 것으로 밝혀진 구조식 I_k, I_m, 및 I_n의 화합물에 대하여 이들 약물 이 실제 혈장 내에서 모약물 (II)로 재생 (reconversion)되는지를 알아보기 위한 인간 혈장 동력학(human plasma kinetic)에 관한 발명을 실시하였다.

실험에 사용된 인간 혈장은 충남 국립 대학교 병원에서 공급받아 사용하였으며, 구조식 I_k, I_m, 및 I_n의 화합물에 대한 인간 혈장 중 재생 테스트 조건은 다음과 같다.

냉욕상의 인간 혈장 450 μL (0 ℃, 아이스 배쓰)에 미리 준비된 각 화합물의 스톡 용액 (1 mg/mL in DMSO, v/v) 중 50 μL을 섞은 후, 이 혈장 서스펜션을 지체없이 인큐베이터 (37 ℃)로 옮겨 배양하면서 정해진 시간 (0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 12 h, 및 24 h)에 이를 샘플링 (40 μL)하고 전처리하여 각 혈장 내의 구조식 II의 화합물의 함량을 HPLC로 측정하였다. 그 결과는 표 7 에서 보는 바와 같다. 각 화합물 1 mg이 모약물 (II)로 완전히 재생될 때의 함량에 대한 각 시간대 별 구조식 II의 화합물의 함량을 % 비율로 산출하였다.

RP - HPLC 작동 조건

검출기: UV-vis 검출기 (254 nm, SPD-10A VP, Shimadzu, Japan)

컬럼: 시메트리(Symmetry) C18 (3.9 X 150 mm, part No. WAT054205, Waters)

유속: 1 mL/min

주사 부피: 10 μL

이동상: AtCN 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 혼합액을 각각 사용한 이성분 그래디언트 용매 시스템(Binary gradient solvent system).

표 7. 이성분 그래디언트 용매의 시간 스케쥴:

시간 (min)	이벤트	측정값 (%, AtCN)
0.01 10.00 15.00 20.00 22.00 25.00 28.00	B.Conc B.Conc B.Conc B.Conc B.Conc B.Conc Stop	31.0 31.0 60.0 95.0 60.0 31.0 0.00

표 8. 인간 혈장에서, 아미노산이 연결된 일반식 I_k, I_m, 및 I_n로부터 재생되는 구조식 II의 화합물의 함량

화합물	시간 (분)	평균 피크 면적	함량 (μg/mL)	% 비율
I_k (II의 최대 함량: 9.71μg)	10	34120.33	4.08	42.0
	30	34549.67	4.13	42.5
	60	45784.67	5.47	56.4
	120	47484.00	5.68	58.5
	240	48954.67	5.85	60.3
	720	48888.00	5.85	60.2
	1440	37183.67	4.45	45.8
I_m (II의 최대 함량: 10.30 μg)	10	9706.667	1.16	11.3
	30	36347.33	4.35	42.2
	60	53339.00	6.38	61.9
	120	56688.00	6.78	65.8
	240	85232.33	10.19	98.9
	720	85888.33	10.27	99.7
	1440	69180.00	8.27	80.3
I_n (II의 최대 함량: 9.81 μg)	10	9148.333	1.09	11.2
	30	15339.67	1.83	18.7
	60	23163.00	2.77	28.2
	120	29293.00	3.50	35.7
	240	52312.67	6.26	63.8
	720	44566.33	5.33	54.3
	1440	40619.33	4.86	49.5
II 표준.	평균 피크 면적			함량
II 표준.	41816.25			5 μg/mL

구조식 I_k의 화합물은 인간 혈장과 섞인 후 10분 이내에 최대 함량의 42%, 1시간이 경과한 후에는 56%에 해당하는 모약물 (II)로 변환되었다. 720분 (12시간)까지 최대 함량의 60%까지 서서히 지속적으로 변환되었으며, 1440분 (24 시간) 경과 후에는 다소 그 함량이 감소되는 현상이 관찰되었다. 구조식 I_m의 화합물의 경 우 역시, 인간 혈장에 노출된 후, 1시간 내에 최대 함량의 61.9%까지 가파른 기울기를 가지며 모약물 (II)로 변환되었다. 놀라운 점은 240분 (4시간) 내에 거의 모든 화합물이 모약물 (II)로 변환되었으며, 그 함량은 720분 (12시간)까지 유지되었다. 역시, 24시간 경과 후에는 구조식 I_k의 화합물과 비슷한 양상으로 모약물 (II)가 소폭 감소하였다. 구조식 I_n의 화합물은 세 물질 중, 가장 완만한 곡선을 그리며 모약물 (II)로 변환되었는데 그 반감기는 약 3 시간 정도였다. 240분 (4시간)까지 최대 함량의 약 63.8%에 해당하는 모약물 (II)로 변환되었다.

세 가지 화합물 (I_k, I_m, 그리고 I_n) 모두는 인간 혈장 중에서 240분 이내에 60% 이상 모약물 (II)로 변환되었으며, 이 중 구조식 I_n의 화합물은 240분 (4시간)내에 최대 함량의 99%까지를 구조식 II의 화합물로 변환시킬 수 있는 우수한 전구약물의 조건을 가지고 있음이 확인되었다.

약물 동태 ( Pharmacokinetic , PK ) 실험

구조식 I_m의 화합물과 구조식 I_n의 화합물을 쥐의 체내에 투여하여 모약물 (II)로 변화 되는 속도를 다음과 같이 측정하였다.

가. 실험 동물: ㈜ 오리엔트 바이오 (Seongnam, Korea)에서 공급하는 Balb/c 암컷 7 주령 마우스를 사용하였다.

나. 약물 조제 및 투여: 구조식 I_m 및 I_n의 화합물은 염수에 녹여 20 mg/kg로 꼬리 정맥 내로 투여하였다.

다. 혈장 샘플 분리: 구조식 I_m 및 I_n의 화합물은 0, 5, 15, 30, 60, 120, 240, 360분에 채혈하여, 1000 rpm, 10 min, 4 ℃의 조건 하에서 원심분리 후 혈장 분리하였다. 분석시까지 -70℃에서 보관하였다.

라. HPLC 샘플 제조: 혈장 중에 존재하는 구조식 II의 화합물을 추출하기 위하여 메틸렌 클로라이드로 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 증발시킨 후, MeOH에 용해시켜 HPLC 샘플로 하였다.

마. HPLC 분석 조건 및 PK 파라미터 산출: HPLC 분석은 아래와 같은 조건으로 실시하였으며, LC 분석 후, 각 샘플의 LC 면적 값을 농도로 변환하여 위놀린(Winnolin) 5.0.1 이용하여 PK 파라미터를 구하였다.

표 9. RP-HPLC 작동 조건

HPLC:	피니간 서베이어(Finigan surveyor)
컬럼:	YMC ODS-A 250 X 4.6 mm
유속:	1.0 mL/min
흡광도:	312 nm
이동상:	MeOH / D.W. = 60 / 40

표 10. 구조식 I_m의 화합물 및 구조식 I_n의 화합물로부터 방출된 구조식 II의 화합물의 PK 파라미터

PK 파라미터	I_m로부터의 II화합물	I_n로부터의 II화합물
T₁ _/2 (min)^a	29.140	37.444
T_max (min)^b	5.000	5.000
C_max (μg/mL)^c	10.300	28.770
AUC: 0→360^d	224.125	290.675

^aT₁ _/2은 반감기;

^b T_max는 구조식 II의 화합물의 혈중 농도가 최대값일 때의 시간;

^c C_max은 구조식 II의 화합물의 최대 혈중 농도;

^d AUC: 0 → 360은 농도-시간 그래프에서 0 분 내지 360 분 범위에서의 면적의 적분 값.

화합물 I_m와 I_n은 쥐의 체내에서 1시간 이내에 효과적으로 구조식 II의 모약물을 방출하였다.

In vivo 항암효과 측정 실험

SW-620(대장암 세포주)를 종양주로 하여, 6~7주령 (18 내지 20 g) Balb/C 누드 마우스 (암컷, 오리엔트 바이오사 제공)로 화합물 I_n에 대한 in vivo 항암 시험을 2회 (1회당 6마리 사용) 실시하여 항암효과를 측정하였다.

동물에 SW-620을 2 X 10⁶ 세포/마우스의 양으로 이식하고, 종양이 50~150 mm³로 성장하면, 군 평균 종양 부피가 일정하도록 군을 분리하여 생리식염수 및 화합물 I_n을 각각 70 mg/kg의 용량으로, 1회/일, 5일 연속으로 정맥 투여하였다. 화합물 I_n은 멸균 식염수에 녹여 정맥으로 kg당 10 mL씩 투여하였다. 종양의 크기와 체중의 측정은 주 2회 실시하였다 (투여 후 1일, 4일, 7일 및 11일째에 측정).

그 결과, 투여기간 동안 종양의 성장을 크게 억제하는 것으로 나타났으며, 시험 종료일인 약물 투여 종료 3일 후인 D7에는 58%까지 생리식염수 투여군 대비 종양 억제율을 보였다

위와 같은 실험결과, 본 발명 화합물은 인체내에서 효과적으로 구조식 (II)의 항암제를 유리시키며, 경구투여시 문제되었던 장독성 우려없이 항암효과를 발휘할 수 있음이 확인되었다.

도 1은 주요 중간체 7이 pH 7.4인 인산 버퍼 + 돼지 간 에스테라제 EC 3.1.1.1에 의해 시간에 따라 감소하는 것을 도시한 것이다.

도 2는 생리 식염수 및 화합물 I_n을 SW-620 (대장암 세포주)를 이식한 마우스에 70 mg/kg의 용량으로 투여한 후 일자별 종양 부피의 변화를 측정하여 도시한 것이다.

Claims

하기 구조식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[구조식 I]

상기 식에서, R은
이고, 여기에서

a는 0 또는 1이고,

b는 1, 2, 3, 또는 4이며,

Gly은 -NH-CO-CH₂-이고,

AA는
또는
이며,

여기에서, X는 -COOH 또는
이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이다.
제1항에 있어서, R이

상기 식에서,

c는 1 또는 2이고,

d는 1, 2, 3, 또는 4인 화합물.
제1항에 있어서, R이

상기 식에서,

e는 0, 1 또는 2인 화합물.
제1항에 있어서, R이

상기 식에서,

f는 1 또는 2이고,

g는 3 또는 4인 화합물.
제1항에 있어서, R이

인 화합물.
제1항에 있어서, R이

인 화합물.
제1항에 따른 구조식 I의 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함 하는, 폐암, 대장암, 직장암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 나팔관암종, 난소암, 질암종, 음문암종, 간암, 위암, 식도암, 소장암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 비소세포성폐암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 호지킨병, 내분비선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 중추신경계 종양, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 그룹에서 선택된 질환의 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 암질환은 폐암, 대장암, 직장암, 자궁암, 난소암 및 백혈병으로 이루어진 그룹에서 선택된 질환의 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암질환은 기존 항암제에 내성을 갖는 암세포로 인한 모든 암질환임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기 구조식 7의 화합물:

[구조식 7]
하기 구조식 10의 화합물:

[구조식 10]

상기 식에서, h는 1 또는 2이고,

i는 1, 2, 3, 또는 4이다.
하기 구조식 19의 화합물:

[구조식 19]

상기 식에서 q는 0, 1 또는 2이다.
하기 구조식 21의 화합물:

[구조식 21]
하기 구조식 구조식 22의 화합물:

[구조식 22]
하기 구조식 23의 화합물:

[구조식 23]
하기 구조식 4의 tert-부틸디메틸 실릴-보호된 디올을 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 존재하에서 BocNH-알라닌 무수물과 축합반응시켜 하기 구조식 5의 화합물을 제조하는 단계;

구조식 5의 화합물을 데실레이션 시킨 후 두 단계의 산화반응을 거쳐 하기 구조식 6의 화합물을 제조하는 단계; 및

구조식 6의 화합물과 구조식 II의 화합물을 아미드 커플링시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 7의 화합물의 제조방법.

[구조식 4]

[구조식 5]

[구조식 6]

[구조식 II]

[구조식 7]
제16항에 있어서, 구조식 6의 화합물과 구조식 II의 화합물의 아미드 커플링 반응을 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) 존재하에서 EDCl (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드)을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기 구조식 7의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호한 후 하기 구조식 8 또는 9의 화합물과 아미드 커플링 시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 10의 화합물의 제조방법:

[구조식 7]

[구조식 8]

상기 식에서, j는 1이고,

[구조식 9 ]

상기 식에서, j는 2이며;

[구조식 10]

상기 식에서, h는 1 또는 2이고,

i는 1, 2, 3, 또는 4이다.
하기 구조식 14의 화합물, 구조식 15의 화합물, 및 구조식 16의 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 화합물의 메틸 에스테르를 탈보호한 후, 하기 구조식 7의 화합물과 아미드 커플링 시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 10의 화합물의 제조방법:

[구조식 14]

상기 식에서, ℓ은 1 또는 2이고;

[구조식 15]

상기 식에서, m은 1 또는 2이며;

[구조식 16]

상기 식에서 n은 2이고;

[구조식 7]

[구조식 10]

상기 식에서, h는 1 또는 2이며,

i는 1, 2, 3, 또는 4이다.
하기 구조식 10의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호하는 단계를 포함하는 하기 구조식 I의 화합물의 제조방법:

[구조식 10]

상기 식에서, h는 1 또는 2이고,

i는 1, 2, 3, 또는 4이며;

[구조식 I]

상기 식에서,

c는 1 또는 2이고,

d는 1, 2, 3 또는 4이다.
하기 구조식 7의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호시킨 후; 이 화합물을

(i) 하기 구조식 8 또는 9의 화합물과 함께 아미드 커플링 시키거나; 또는

(ii) 하기 구조식 14_a, 15 또는 16의 화합물의 메틸 에스테르를 탈보호시킨 후 이와 함께 아미드 커플링 시켜;

하기 구조식 10의 화합물의 제조방법:

[구조식 7]

[구조식 8 ]

상기 식에서, j는 1이고,

[구조식 9 ]

상기 식에서, j는 2이며;

[구조식 14_a]

[구조식 15]

상기 식에서, m은 1 또는 2이고;

[구조식 16]

상기 식에서 n은 2이며;

[구조식 10]

상기 식에서, h는 1 또는 2이고,

i는 1, 2, 3, 또는 4이다.
하기 구조식 7의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호시켜 제조된 화합물을 하기 구조식 18의 화합물과 함께 아미드 커플링 시키는 단계를 포함하는 구조식 19의 화합물의 제조방법:

[구조식 7]

[구조식 18]

상기 식에서, p는 0, 1 또는 2이고,

[구조식 19]

상기 식에서 q는 0, 1 또는 2이다.
하기 구조식 20_a의 화합물 구조중의 δ-아민의 벤질옥시카르보닐(Cbz)기를 수소화로 제거하는 단계;

N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드와 N,N'-디-Boc-N'-트리플루오로메-탄설포닐 구아니딘과 함께 구아니딜화시켜 하기 구조식 20_b의 화합물을 제조하는 단계; 및

하기 구조식 7의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호화시켜 수득된 화합물을 구조 식 20_b의 화합물과 함께 아미드 커플링 반응을 시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 21의 화합물의 제조방법:

[구조식 20_a]

[구조식 20_b]

[구조식 7]

[구조식 21]
하기 구조식 7의 화합물 화합물의 Boc-아미드를 탈보호화 시킨 후, BocNH-gly-OH와 함께 아미드 커플링 시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 22의 화합물의 제조방법:

[구조식 7]

[구조식 22]
하기 구조식 22의 화합물의 Boc-아미드를 탈보호시킨 후, 하기 구조식 20_b의 화합물과 아미드 커플링 반응시켜 하기 구조식 23의 화합물의 제조방법:

[구조식 22]

[구조식 20_b]

[구조식 23]
하기 구조식 I의 화합물을 아세톤/H₂O (1:1)에 용해시키고, NaHCO₃를 첨가한 후 동결건조시켜 하기 구조식 I_j, I_k, 또는 I_l의 화합물을 제조하는 방법:

[구조식 I]

상기 식에서,

c는 1 또는 2이고,

d는 1, 2, 3 또는 4이며;

[구조식 I_j]

상기 식에서, f=1, g=3이고;

[구조식 I_k]

상기 식에서, f=2, g=3이며;

[구조식 I_l]

상기 식에서, f=2, g=4이다.
제18항, 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Boc기를 제거하는 반응을 TFA/CH₂Cl₂이 1:1인 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항, 제18항, 제19항, 및 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드 커플링 반응을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDCl), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 N-메틸모르포린(NMM)의 존재 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.