KR100951903B1

KR100951903B1 - 중공사막 한외여과를 이용한 미생물 채집 및 검출방법

Info

Publication number: KR100951903B1
Application number: KR1020080003944A
Authority: KR
Inventors: 고광표; 김희연; 조재창; 이규호; 김건수; 조유희; 양재명; 박순정; 성문희
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2008-01-14
Filing date: 2008-01-14
Publication date: 2010-04-09
Also published as: WO2009091110A1; KR20090078136A

Abstract

본 발명은 중공사막을 이용한 식품에서 미생물의 채집방법, 농축방법 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 크기가 매우 작은 바이러스, 및 박테리오파지 등을 비롯한 여러 가지 미생물을 식품에서 신속하고 정확하게 검출할 수 있어, 식품위생에 중요하며, 산업화가 용이하며, 검출의 자동화 등에 기여한다.

중공사막, 미생물, 채집, 검출

Description

중공사막 한외여과를 이용한 미생물 채집 및 검출방법{METHOD OF CONCENTRATING AND DETECTING VARIOUS MIOCROORGANISMS IN FOOD BY USING HOLLOW-FIBER ULTRAFILTER}

본 발명은 중공사막을 이용한 식품중 미생물의 채집방법, 농축방법 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 미생물 채집방법 및 검출방법에 의하면 크기가 매우 작은 바이러스, 및 박테리오파지 등을 비롯한 여러 가지 미생물을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

과학기술의 발달에도 불구하고 식중독을 완전히 예방하는 것은 여전히 어려운 일이다. 미생물에 의한 식중독의 경우 미생물의 음식물에의 혼입 내지는 번식이 일반적으로 육안으로 관찰되지 않고 전문적인 방법에 의하지 않고는 검출이 매우 곤란하기 때문에 가장 예방하기 어려운 식중독이라고 할 수 있다.

식품매개로 인하여 사람에서 문제가 되는 질병은 250 여종 이상이 알려져 있으며, 이 중에서 축산물과 관련된 질환이 큰 부분을 차지하고 이와 관련된 주요한 병원체는 약 25종 정도가 알려져 있다. 축산물을 매개로 전파되는 중요한 병원체는 살모넬라 속 균주, 대장균O157, 리스테리아 모노사이토게네스, 캠필로박터 제주 니, 스타필로코커스 아우레우스, 클로스트리디움 퍼프리젠스 등이 사람에게서 식중독을 유발시키는 것으로 보고되었다.

매년 세균성 및 바이러스성 식품 매개 위장관 감염질환 및 식중독 환자는 꾸준히 증가하고 있으며, 이로 인한 사회 경제적 비용이 매우 증가하고 있음에도 불구하고 원인 바이러스나 원인식품에 대한 명확한 역학적 연구 분석이 부족하여 효율적인 식품 매개성 감염질환 관리에 어려움을 겪고 있다. 특히 집단적으로 발생하는 전염병의 경우 질병의 확산과 피해를 저해하기 위해 그 진단과 치료에 있어서 신속함과 정확성이 요구된다.

세균성 식중독은 그 발병 형태에 따라 감염형, 독소형으로 분류된다. 감염형 식중독은 세균에 오염된 식품의 섭취시 세균이 장관내에서 증식하여 일으키는 식중독으로, 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio paraheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7) 등이 주된 원인균이다. 독소형 식중독의 원인균으로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridium botulinum) 등을 들 수 있다.

상기 미생물학적 검사와 관련하여, 단시간에 집단적으로 발병할 수 있는 세균성 식품매개질환 특히, 세균성 식중독의 원인균을 조기에 발견하여 예방하고 집단발병의 확대를 막을 수 있는 관리시스템의 개발은 매우 중요한 문제이다.

식중독의 정확한 원인균의 동정을 위해서 오염된 가검물이나 식품을 배양하여 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용 되고 있기는 하지만 원인병원체를 파악하고 역학조사를 완료하기 전에 이미 식중독이 집단적으로 확산될 가능성이 매우 높다. 일예로, 현재 사용되는 살모넬라균 검출방법은, 완충성 펩톤수(BPW; Buffered Peptone Water)에서 전 배양하고 이를 선택배지에서의 배양하여 1차 검증한 다음 생화학적, 혈청학적 분석을 통하여 확인하는 방법이며, 통상 약 5일에서 6일이 소요된다.

세균성 식중독에 대한 원인균 분석과 배양은 비교적 용이한 반면, 바이러스성 식중독은 그 크기가 매우 작아 현미경 관찰이 어렵고, 배양 또한 매우 까다로워 신속한 진단이 불가능하며, 보통 혈청면역학적 방법으로는 바이러스의 다양한 변이를 잡아낼 수 없다. 아스트로바이러스(Astrovirus) 및 로타바이러스(Rotavirus)에 의한 감염과 장염이었으며, 최근에는 계절과 상관없이 노로바이러스(Norovirus)에 대한 감염 발표가 증가하고 있다. 노로바이러스는 인간 캘리시바이러스 과의 멤버이며 염기수가 약 7000여개인 일본쇄 RNA로 이루어지는 게놈을 갖는다. 노로바이러스는 또한, 소형구형(小型球形)(SRSV) 바이러스로도 불린다. 노로바이러스는 주요 감염원은 식품이며, 유아들의 (산재성) 급성 위장염에서도 검출되며, 사람에서 사람으로의 전파 가능성이 시사되었다. 따라서 노로바이러스에 대한 시험은 국민 건강과 식품 품질관리 차원에서 볼 때 중요한 현안이므로, 유전자 증폭 과정을 이용하여, 서브타입의 전부 또는 대부분을 검출할 수 있는 고감도, 고속 시험법의 개발이 필요한 실정이다

로타바이러스(Rotavirus)는 레오비리데(Reoviridae)과에 속하는 바이러스로서, 영유아에게 발생하는 급성 설사증과 위장염을 일으키는 주요 원인이며 선진국 이나 개발도상국 모두에서 지속적으로 발병하고 있다. 구토 및 설사에 의해 소실된 수분과 전해질을 보충해줌으로써 로타바이러스에 의한 장염의 치료는 가능하지만 현재까지 효과적인 로타바이러스 백신은 개발되어 있지 않은 상태다.

특히 두 가지 이상의 바이러스가 혼합 감염되었을 경우 정확한 확인을 요구하므로, 분자생물학에 기초한 유전자 진단을 통한 동정법 개발을 통하여 신속하고 특이적인 진단 시스템 개발이 확립되어야 한다. 최근에는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 역전사 중합효소연쇄반응(Reverse Transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 이러한 병원성 바이러스 검출하는 검사법이 개발 및 사용되고 있다.

이러한 병원성 식중독의 원인균을 조기에 발견하여 예방하는 것이 절실히 필요하다고 할 수 있다. 세균성 식중독의 원인균을 검출·확인하는 방법으로는, 채취한 검체를 선택 배지를 이용하여 배양하고, 배지에 형성된 콜로니를 육안으로 관찰하거나, 기타 탐지확인 수단을 이용하여 확인하는 방법 등이 있으며, 최근에는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 검사법이 개발 및 사용되고 있다. 그러나, 기존에 사용된 중합효소연쇄반응법의 경우, 분석 가능한 균체량을 얻기 위하여 배양과정을 수행하고 있는 바 분석에 하루 이상이 소요된다는 문제점이 있으며, 더불어 유전자 증폭과정 후 확인 및 판정을 위하여 전기영동과 염색과정을 거치는 번거로움이 상존한다.

전통적인 미생물의 검출방법은 배양에 의존하기 때문에 과도한 시간 (4 내지 7일)이 요구되고 실험실의 다양한 배양조건에서도 배양이 불가능한 미생물들이 많 기 때문에 오염된 식품이나 감염된 환자들로부터 검출되지 않는 미생물이 많을 뿐만 아니라, 형태학적 구분이 모호하여 현미경에 의한 검출도 그 한계를 나타내고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 개발된 검출방법으로 현재 상용화되고 있는 소형화된 생화학 키트 및 DNA/RNA 또는 면역반응 (ELISA)에 근거한 테스트, 그리고 종래의 방법을 개량한 자동화된 방법 등이 사용되고 있으나, 식품 종류에 따른 미생물 범위의 한계와 생화학적 또는 면역학적 반응으로 인한 형광을 판정해야 하는 등 정량적인 분석보다는 정성적인 분석에 치우쳐 그 판정이 어려운 경우가 많다 (W. E. Hill 등, Bacteriological Analytical Manual 8th ed., 1998; S. Brunelle, IVD Technology 6월호: 55-61, 2001; M. A. Pfaller, Emerging Infectious Diseases 7: 312-318, 2001). 뿐만 아니라, 이들 방법들은 여전히 분석 전에 미생물의 배양이 선행되어야 하기 때문에 종래에 가졌던 문제점을 그대로 내포하고 있다 (W. E. Hill 등, Bacteriological Analytical Manual 8th ed., 1998). 또한, 종래 병원성 세균검사의 비정확성 및 많은 시간과 경비가 소요되는 단점을 보완하기 위하여 새롭게 개발된 검출 장치들이라 해도 가격뿐만 아니라 커다란 부피가 사용자에게 부담을 주고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하고 실제 적용시 올바른 검출 및 진단이 가능한 새로운 방법이 요구되고 있는 실정이다.

현재까지 식중독을 야기하는 미생물의 종류에 따라 미생물 농축 및 정제 방식을 다르게 사용하여 미생물 분석의 시간상 및 기술적인 장애가 되어왔다. 이에 식품으로부터 식중독 원인균의 배양과정이 생략된, 신속한 식중독 원인균 검출 방법의 개발이 요구되고 있다.

식품에서 저농도로 존재하는 노로바이러스 등의 병원성 미생물의 검출법의 확립에 핵심적인 기술이다. 식품에서 식중독 미생물의 신속하고 정확하며 감염성을 알 수 있는 분석방법의 개발은 식품위생에 매우 중요한 원천기술이다. 이러한 기술은 산업화에 매우 용의하며 검출의 자동화 등에 필수적인 요소이다.

본 발명은 중공사막을 이용한 여과법(hollow fiber ultrafiltration)으로 다양한 종류의 미생물을 적은 양의 샘플로도 식품에서 동시에 효과적으로 농축하여 분석 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 노로바이러스와 같은 식중독미생물의 신속하고 정확한 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 다양한 병원성 미생물의 동시 샘플, 농축, 정제 방법의 구축은 식품에서 낮은 농도로 존재하는 식중독미생물 분석의 시간과 비용을 크게 절감할 수 있는 식품의 미생물 회수 및 농축방법에 관한 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하고자, 본 발명은 식품을 처리한 미생물 채취용액을, 중공사막을 이용한 한외여과방법으로 여과하는 단계를 포함하는, 식품에서 미생물을 회수 및 농축하는 방법을 제공한다.

상기 미생물은 박테리오파지, 바이러스, 세균, 원핵생물 및 포자로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것일 수 있으며, 특히 상기 바이러스는 로타바이러스 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것일 수 있다. 상기 미생물은 다양한 농도로 식품에 존재할 수 있으나, 예를 들면 저농도 1 내지 1x10² CFU 또는 PFU 고농도; 1x10² 내지 1x10⁶이상으로 식품에 존재하며, 특히 본원발명은 저농도로 존재하는 경우에 더욱 유용하다.

또한, 본 발명은 상기 회수 및 농축방법으로 얻어진 미생물 시료를 중합효소연쇄반응을 이용하여 대상 미생물을 유무를 탐지하는 단계를 포함하는 식품에 존재하는 미생물의 검출방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 식품에 저농도로 존재하는 다양한 미생물을 회수 및 농축하는 방법에 관한 것이다.

상기 미생물 채취용액은 증류수, 쇠고기 육즙(Beef extract) 용액, 글리신과 NaCl의 혼합용액, 류신(leucine) 용액 및 Tris-HCl 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용액으로 식품을 처리한 것이다. 식품에서 저농도로 존재하는 병원성 미생물을 채취하기 위해 채취용액을 여러 가지를 사용할 수 있으며 그 일예를 하기 표 1에 기재하였으며, 바람직하게는 0.05 내지 0.5M 농도의 글리신과 NaCl 혼합용액, 또는 1중량% 내지 5 중량%의 쇠고기 육즙 용액이다.

[표 1]

본 발명에서 검출가능한 미생물은 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 포자, 원핵세균 등을 포함한다. 본 발명은 다양한 바이러스도 채집가능하며, 예를 들면 노로바이러스 및 로타바이러스등이나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 식중독을 일으키는 세균으로는 살모넬라(Salmonella spp), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio paraheamolyticus), 대장균 O157(Escherichia coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보튤리넘(Clostridium botulinum) , 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 및 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii) 등을 검출할 수 있다.

중공사막은 polysulfone 등의 재질 (또는 equivalent)로 구성된 hollow fiber ultrafiltration을 이용한 다양한 미생물의 샘플링 및 농축 방법을 개발할 것이다. 일반적으로 hollow fiber ultrafiltration은 신장환자 등에서 이온의 조절의 haemodialysis의 목적으로 사용되었으며 Cryptosporidium과 같은 원핵생물의 수질샘플링에 이용되었다.

한외여과용 중공사막이란 일반적으로 0.2~1.0㎜(내경)/0.3~1.5㎜(외경)의 단면구조를 갖는 원형 분리막으로서, 기공 크기에 따른 분리막 구분에서 정밀여과막(MF)과 역삼투막(RO) 사이에 위치하고 분리막 사이의 압력차에 의해서 물질의 분리가 이루어지는 분리막이다. 일반적으로 대칭형(Symmetric)의 기공구조를 갖는 정밀여과막과 달리, 한외여과막은 막의 분리성능과 투과유량을 좌우하는 1㎛이하인 치밀한 구조의 활성층(Active Layer)과 용매투과가 자유로운 지지층(Support Layer)으로 구성된 비대칭형(Asymmetric) 기공구조를 갖으며, 단위 부피당 막면적 또는 충진밀도를 높이기 위하여 섬유형태의 중공사형(Hollow Fiber) 모듈 형태로 제작되고 있다.

한외여과막의 재질은 폴리술폰, 셀룰로스 아세테이트(Cellulose Acetate, CA), 재생 셀룰로스(Regenerated Cellulose), 폴리아미드, 폴리비닐리덴플루오라이드(Polyvinylidenefluoride, PVDF), 폴리아크릴로니트릴(Polyacrylonitrile, PAN) 등이 사용되고 있으며, 특히 내산, 내염기성, 내가수분해성, 내약품성이 우수한 Polysulfone계 한외여과막은 그 물질적 우수성 때문에 첨단산업분야에서부터 의료용, 가정용까지 폭넓게 사용되고 있다.

본 발명의 구체적인 일예에서, 도 1에서 도시한 모형도와 같이 중곡사막을 이용한 한외여과 장치를 도시한다. 상기 장치의 연결에 사용된 모든 튜브는 살균하였고 압력계는 10% bleach solution으로 헹구었다. 중공사막의 종류로는 다음과 같은 것을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[표 2]

상기 한외여과단계를 수행하기 전에, 우아혈청(bovine calf serum), NaPP, 우태야 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 글리신이 첨가된 FBS, 쇠고기 육즙(Beef extract), 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 및 영양 배양액(nutrient broth)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 차단용액으로 상기 중공사막을 전처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 차단용액을 식품의 미생물 채취용액을 여과하기 전에 1시간 동안 필터를 차단하였다. 증류수로 필터에 결합되지 않은 차단물질을 제거한다. 본 발명에 사용가능한 차단액의 종류는 하기 표에 나타냈다.

[표 3]

한외여과의 역류세척이 미생물 농축의 효율에 얼마나 영향을 미치는 지 규명하기 위해 계면활성제의 조건을 달리하여 그 효과를 규명하였다. 계면활성제는 친수성 영역과 소수성 영역을 모두 가지는 것으로서 미생물과 ultrafilter의 surface간의 hydrophobic interaction을 최소화시킨다. 그 중 tween 80은 비이온계 계면활성제로서 미생물이 필터의 표면에 부착되는 것을 최소화시키는데 효과적이라는 보고가 있다. 다음과 같은 계면활성제를 사용하여 역류세척를 하였다. 역류세척용 계면활성제로는 트윈 20 0.01%, 0.5%, 1% 및 트윈 80 0.01%, 0.5%, 1%가 있다.

본 발명의 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 쌍을 이용한 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것이며, 바람직하게는 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 식품 위해 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것일 수 있다. 본 발명의 또다른 구체에에서, 본 발명은 상기 식품 위해 미생물 검출용 중합효소연쇄반응 프라이머, 반응완충액 및 중합효소를 포함하는 식품 위해 미생물 검출키트를 제공한다.

본 발명에 따른 식품 병원성 미생물은 상기 채집방법을 사용하여 채집한 시료를 준비하고, 검출대상 미생물에 대한 PCR용 프라이머쌍을 사용하여 역전사반응을 수행하여 전기영동하여 각 미생물 특이적 증폭산물의 존재를 확인하여 검출할 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응일 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응((Real time PCR)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응일 수 있다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응은 특정 DNA를 증폭한 후에, 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 중합효소연쇄반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 있다.

상기 미생물 검출방법에 사용되는 대상시료인 중합효소연쇄반응의 주형 DNA는 본 발명의 방법에 따라 채취된 미생물로부터 추출한 것일 수 있다. 상기 주형 DNA 즉, 시료 DNA의 추출은 통상의 DNA 추출법으로 수행할 수 있으며, 상기 DNA 추출법은 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으 며, 더욱 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method)일 수 있다. 또한, 상기 DNA 추출법을 수행하기 전에, 병원성 미생물이 발견될 수 있는 물질 즉, 대상 물질 또는 검체를 멸균수 또는 생리식염수를 가하고 균질기를 활용하여 파쇄한 후에, 그 여액을 취하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일예로서, 시료 DNA의 추출은 본 발명의 방법에 따라 식품으로부터 미생물을 회수 및 농축하는 단계; 이를 멸균수 또는 생리 식염수, 바람직하게는 0.85% 식염수에 현탁한 후, 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하는 단계 및 펠렛을 회수하고 DNA 추출법을 수행하는 단계를 포함하는 추출법으로 수행할 수 있다.

RT-PCR이란 특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나눠지며, 2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 상기 RT-PCR을 이용하여 병원성 RNA 바이러스를 검출하도록 역전사용 프라이머, PCR용 프라이머, 반응완충액, 역전사효소, 역전사효소완충액, Taq DNA 중합효소를 포함하는 병원성 미생물 검출키트일 수 있다.

상기 역전사용 프라이머는 로타바이러스(Rotavirus) 특이적 역전사용 프라이머, 아스트로바이러스 (Astrovirus) 특이적 역전사용 프라이머, 및 노로바이러스 (Norovirus genogroup Ⅰ,Ⅱ) 특이적 역전사용 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 RNA 바이러스 검출키트를 이용하여 수행할 수 있다. 또한 여러 가지 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 다중 역전사중합효소연쇄반응(multiplex RT-PCR)으로 동시 진단할 수 있다.

상기 중합효소연쇄반응의 반응조건은 상기 중합효소연쇄반응의 종류, 중합효소연쇄반응용 기기의 종류 및 프라이머의 종류에 따라 통상의 반응조건을 선택하거나 적절하게 일부 변형된 조건을 선택될 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응의 종류는 일예로, 리얼타임 중합효소연쇄반응, 컨벤셔널 중합효소연쇄반응, nested 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응, 단일 중합효소연쇄반응 또는 마이크로 중합효소연쇄반응일 수 있다.

PCR을 이용한 병원성 미생물의 검출방법은, 검출하고자 하는 미생물의 특이 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR 반응으로 이를 증폭하고 전기영동등의 방법으로 이를 확인하게 되는데, 검출효율이 높아 검체 중에 미량으로 존재하는 병원성 미생물도 검출할 수 있다. PCR을 이용한 병원성 미생물 검출방법과 관련된 선행기술로는, 특허공개 제1999-65107호는 중합효소연쇄반응법을 이용하여 병원성 대장균(O157:H7)이 가지고 있는 특이 유전자 4종(베로톡신 2종, 장벽 부착 병원인자 및 효소 특이 유전자)을 검출할 수 있는 다종 유전자 동시 검출방법(multiplex-PCR)을 기술하고 있다. 또한, 특허공개 제1999-88425호는 EHEC 또는 VTEC의 베로독소 유전자 또는 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자와 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제조하여 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써 O157을 생산하는 균 및 베로독소를 생산할 수 있는 대장 균을 선택적으로 검출하는 방법에 관해 기술하고 있다.

본 발명에 따른 식품중 미생물의 검출방법에 사용되는 PCR 프라이머쌍은 검출대상에 특이적인 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있으며 알려진 것을 이용할 수 있다. 검출키트는 검출 대상 미생물에 특이적인 PCR 프라이머쌍과, PCR을 이용한 미생물 검출키트의 일반적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소 등)을 포함한다. 본 발 명의 바람직한 일 실시예에서 검출키트는 다음과 같이 구성된다.

(1) 검출 대상 미생물에 특이적인 PCR 프라이머쌍;

(2) 반응완충액(Reaction Buffer);

(3) Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase).

본 발명의 구체적인 일예에서, 검출 대상 미생물을 검출하는 구체적인 방법은 다음과 같다.

박테리오파지 MS2는 Single 아가 Assay(SAL, USEPA. 2001)에 의해 assay가 가능하다. MS2는 SAL plaque assay plate의 감염된 cell lysate로부터 정제한다. confluent lysis와 같은 양의 클로로포름을 넣고 4000g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 분주해서 냉동보관한다. 여기서 얻은 MS2의 농도는 SAL에 의해 측정한다.

500ml로 농축된 보유액에서 2.5㎕를 취해서 RT-PCR을 수행하였다. 계산된 RT-PCRU는 5L의 버퍼에 접종된 초기 농도로 나누어 100%로 환산해 회수율을 계산하였다. 각각의 검출대상 미생물의 예시적인 PCR용 프라이머쌍은 다음과 같다.

[표 4]

바이러스	서열	서열	서열번호
노로바이러스	5‘-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'	forward primer (GISKF)	1
노로바이러스	5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'	역방향 프라이머(GISKR)	2
노로바이러스	5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’	정방향 프라이머 (GⅡKF)	3
노로바이러스	5’ -CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT3’	역방향 프라이머 (GⅡKR)	4
로타바이러스	5‘- GCTGGCGTGTCTATGGATTCA-3'	정방향 프라이머	5
로타바이러스	5‘-CAAAACGGGAATGGGGAGC-3'	역방향 프라이머	6
바실러스포자	5‘-CTATGTAGGCCGTTGGTATGCCT3’	정방향 프라이머	7
바실러스포자	5‘-AGGCGATGTTGCTTCTTCTTGGTCTT-3’	역방향 프라이머	8

상기 표에서, 서열중 N은 A, T, G, C 모두 사용가능함을 나타낸다.

Salmonella enterica 은 500ml로 농축된 보유액에서 2.5㎕를 취해서 하기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산한다. 겔전기영동을 통해 살모넬라는 329bp에서 밴드가 관찰될 것이다.

정방향 프라이머(SEQ ID NO: 9)

5'-GCGCGAATTCAGCTTTTAATTACCGGTGGATGTGGCTTCC-3'

역방향 프라이머(SEQ ID NO: 10)

5'-GCGCGAATTCGCCGTACTGCCGCAAGTAAATTTAAAGTTC-3'

Vibrio cholera 은 500ml로 농축된 보유액에서 2.5㎕를 취해서 RT-PCR을 수행하였다. 계산된 RT-PCRU는 5L의 버퍼에 접종된 초기 농도로 나누어 100%로 환산해 회수율을 계산하였다. RT-PCR에는 하기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하였다. 젤 전기영동을 통해 살모넬라는 419bp에서 밴드가 관찰될 것이다.

정방향 프라이머(SEQ ID NO: 11)

5‘-GCGCGAATTCTATATTGATCGCTTCGAAACTGAGTTTGCG-3’

역방향 프라이머(SEQ ID NO: 12)

5'-GCGCGAATTCATCGCCAAATGTACCTACCTACTTTTTTGCATT-3’

Cryptosporidium parvum oocyst(human and mouse strain AZ-I)는 U.S. Environmental Protection Agency method 1623을 통해 direct immunofluorescence assay에 의해 농도를 계산한다. RT-PCR을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산하고, 계산된 RT-PCRU는 5L의 버퍼에 접종된 초기 농도로 나누어 100%로 환산해 회수율을 계산한다. Cryptosporidium parvum용 프라이머쌍의 예는 다음과 같다.

정방향 프라이머 (SEQ ID NO: 13)

5‘-ACCGCTTCTCAACAACCATCTTGTCCTC-3'

역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 14)

5‘-CGCACCTGTTCCCACTCAATGTAAACCC-3'

본 발명자들은 중공사막을 이용한 여과법(hollow fiber ultrafiltration)으로 다양한 종류의 미생물을 적은 양의 샘플로도 동시에 효과적으로 농축하여 분석할 수 있으며, 특히 노로바이러스와 같은 식중독미생물의 신속하고 정확한 분석방법법을 제공하며, 다양한 병원성 미생물의 동시 샘플, 농축, 정제 방법의 구축은 식품에서 낮은 농도로 존재하는 식중독미생물 분석의 시간과 비용을 크게 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 목적일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의 도는 아니다.

실시예1 : 미생물 시료의 준비 및 회수율 분석방법

식품에 존재하는 여러 미생물을 검출하고자, 본 발명의 실시예에서는 다양한 미생물 시료를 준비하였다.

1.1. 박테리오파지 MS2 (ATCC 15597-B1):

MS2(ATCC 15597-B1)는 Single 아가 Assay(SAL, USEPA. 2001)에 의해 assay가 가능하다. MS2는 SAL plaque assay plate의 감염된 cell lysate로부터 정제한다. confluent lysis와 같은 양의 클로로포름을 넣고 4000g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 분주해서 냉동보관하였다. 여기서 얻은 MS2의 농도는 SAL에 의해 측정하였다.

Escherichia coli(ATCC 11775)를 숙주로 한 Single agar Layer assay(U.S. Environmental Protection Agency method 1602)를 통해 PFU(plaque forming unit)로 농도를 계산하였다.

1.2. 암피실린 저항성 있는 DH5 α

E.coli(ATCC 11775)를 암피실린에 저항성 있는 유전자를 가진 plasmid로 형질전환하여 암피실린저항성 E.coli DH5α를 만든다. LB broth에 암피실린을 50㎍/ml농도로 넣어 37℃에서 200rpm으로 16시간 키워 사용하였다.

암피실린이 포함된 LB 아가배지에 spreading하여 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)를 측정하여 5L 버퍼에 접종한 초기 DH5α-amp+로 나누어 회수율을 구하였다. 모든 실험과정은 인산 완충액(phosphate 완충액 saline, PBS)를 희 석에 사용하였다. 하기 서열목록에서 M은 A 또는 C이고, W는 A 또는 T를 나타내고, Y는 T 또는 C를 나타낸다.

정방향 프라이머 (SEQ ID NO: 15)

5'-GAG AGT TTG ATY MTG GCT CAG-3‘

역방향 프라이머 (SEQ ID NO: 16)

5'- GAA GGA GGT GWT CCA RCC GCA-3‘

1.3. 노로바이러스

노로바이러스는 한국 질병관리본부 (KCDC)에서 수여받았다.

정방향 프라이머(GISKF) (SEQ ID NO: 1)

5‘-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3'

역방향 프라이머(GISKR) (SEQ ID NO: 2)

5'-CCAACCCARCCATTRTACA-3'

정방향 프라이머(GⅡKF) (SEQ ID NO: 3)

5’-CNTGGGAGGGCGATCGCAA-3’

역방향 프라이머(GⅡKR) (SEQ ID NO: 4)

5’ CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT3’

Norovirus stool sample을 RT-PCR을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산하였다. Primer는 GISKF, GISKR, GIISKF, GIISKR를 사용하였다. Norovirus type에 따라 GISKF, GISKR와 GIISKF, GIISKR의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산하였다. 계산된 RT-PCRU는 5L의 버퍼에 접종된 초기 농도로 나누어 100%로 환산해 회수율을 계산하였다.

실시예 2: 용출액 조성에 따른 미생물 회수율

상기 미생물 시료는 실시예1에서 제조된 박테리오파지 MS2가 접종(MS2: 1010/100㎕)된 5L의 용출완충액을 제조하였다.

본 실시예에서 사용하기 위한 용출액은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 증류수(용출액 1), 3% Beef extract 용액(용출액 2), 0.05M Glycine-0.14M NaCl(pH 7.5)용액(용출액 3), 및 100mM Tris-HCl (pH 9.5) 용액(용출액 4)을 제조하여 사용하였다.

Fresenius Hemoflow F8HPS한외여과 장치를 사용하여, 미생물이 접종된 5L의 용출완충액 양이 500ml로 농축 될 때까지 여과하였다. Cole-Parmer model 7524-45 peristaltic pump를 사용하여 cross-flow 1700ml/min으로 실행하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하여 표준편차를 구하였다. 농축된 500ml의 보유액(보유액)에서 핵산을 추출하여 PCR과정을 거쳐 회수율을 구하였다. 회수율 계산은 Escherichia coli(ATCC 11775)를 숙주로 한 Single 아가 Layer assay(U.S. Environmental Protection Agency method 1602)를 통해 PFU(plaque forming unit)로 농도를 계산하였다.

[수학식 1]

상기 실험결과를 하기 표 5에 나타냈다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 용출완충액 4가지 중에서 0.05M Glycine-0.14M NaCl(pH7.5)이 가장 회수율이 높게 나왔다.

[표 5] 용출액의 종류에 따른 MS2 회수율(%)

실시예 3: 차단용액의 사용유무 및 용출액에 따른 대장균 채집율

본 실시예에 사용된 미생물 시료는 실시예 1에서 제조한 암피실린 저항성 있는 DH5α-amp+대장균 약 108/ml(DH5α는 항생제가 포함된 LB broth에 키운 상태에서 냉장 보관하여 실험을 할 때 1ml씩 사용하였다. 상기 대장균 1ml을 세 가지 용출액에 희석하여 5L 용출액을 제조하여 실험에 사용하였다.

한외여과 중공사막을 차단하는 경우에는, 차단용액으로서 5% beef extract 500mL을, 미생물이 접종된 용출완충액을 여과하기 전에 1시간 동안 필터를 차단하였다. 필터에 결합되지 않은 차단물질을 증류수로 제거하였다. 그런 후에 상기 미생물이 접종된 세 가지 용출액 시료를 사용하여 한외여과를 수행하였다. 한외여과는 상기 실시예 2와 같이 Fresenius Hemoflow F8HPS 한외여과 장치를 사용하여, 미생물이 접종된 5L의 용출완충액 양이 500ml로 농축될 때까지 여과하고, Cole-Parmer model 7524-45 peristaltic pump를 사용하여 cross-flow 1700ml/min으로 실 행하였다. 모든 실험은 3회 반복수행하여 표준편차를 구하였다. 회수된 대장균의 분석은 암피실린이 포함된 LB 아가 배지에 도말하여 CFU(colony forming unit)를 측정하여 5L 버퍼에 접종한 초기 DH5α-amp+로 나누어 회수율을 구하였다. 실험결과를 표 6에 표시하였다.

한외여과용 중공사막을 차단하는 전처리를 수행하지 않는 경우에는, 상기 차단용액으로 필터를 차단하는 것을 제외하고는, 상기 실험과 실질적으로 동일한 방법으로 한외여과를 수행하였다. 회수된 대장균의 분석은 암피실린이 포함된 LB 아가 배지에 spreading하여 CFU(colony forming unit)를 측정하여 5L 버퍼에 접종한 초기 DH5α-amp+로 나누어 회수율을 구하였다. 실험결과를 표 6에 표시하였다.

[표 6] DH5α-amp+의 회수율(%)

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 차단용액으로 5% beef extract를 사용하여 차단하지 않은 것과 회수율을 비교하였다. 전반적으로 필터를 차단한 후에 여과한 것의 회수율이 차다하지 않고 여과한 것의 회수율보다 높게 나왔다. 동일하게 차단처리를 한 경우에는 용출액이 0.05M Glycine-0.14M NaCl(pH7.5)인 경우 대장균 회수율이 가장 높게 나왔다.

실시예 4: 노로바이러스 및 대장균 동시 채집

실시예 1에서 제조한, DH5α-amp+E.coli(108/ml)와 노로바이러스 GⅠ-4의 농도 4x10⁸/ml로 1ml을 채집용 용출액으로서 0.05M Glycine-0.14M NaCl(pH7.5)에 희석하여 5L 용출액을 제조하여 실험에 사용하였다.

시료 용출액을 달리하는 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 한외여과를 수행하였다. 회수된 대장균의 분석은 암피실린이 포함된 LB 아가배지에 도말하여 CFU(colony forming unit)를 측정하여 5L 버퍼에 접종한 초기 DH5α-amp+로 나누어 회수율을 구하였다. Norovirus stool sample을 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산하였다. 프라이머는 GISKF, GISKR, GIISKF, GIISKR를 사용하였다. Norovirus 유형에 따라 GISKF, GISKR와 GIISKF, GIISKR의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 RT-PCRU로 농도를 계산하였다. 계산된 RT-PCRU는 5L의 버퍼에 접종된 초기 농도로 나누어 100%로 환산해 회수율을 계산하였다. 실험결과를 표 7에 표시하였다.

[표 7] Norovirus GⅠ-4와 DH5α-amp+의 회수율(%)

GⅠ-4의 농도는 4x10⁸/ml이었고 1ml을 접종하여 50%의 회수율을 얻었다. 또 DH5α-amp+의 회수율은 34.8%로 DH5α-amp+만 추출한 실험의 회수율보다(표 6의 14.64% ) 높게 나왔다.

실시예 5: 식품시료에서 미생물 검출

GⅡ-4의 농도는 4x10⁴/ml이었고 과일의 표면에 GⅡ-4를 100㎕(4?103)접종하여 완전히 말린 후 용출액 3% Beef extract 100ml에 넣고 4시간 동안 용출하였다(200rpm, 상온). 불순물 제거를 위해 추출용액에 1/2 부피의 클로로포름을 넣고 4℃에서 2,000g로 10분간 원심분리 하였다. 이 후 상층액에 녹아있는 바이러스를 농축시키고 볼륨을 줄이기 위해 8% PEG 10,000을 넣고 완전히 녹인 후 최종 농도가 0.3M이 되도록 NaCl을 첨부하였다. 이는 염 농도를 맞추기 위함이다. 4℃에서 4시간 침전을 한 후 4℃에서 12,000g로 30분간 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 바이러스가 존재하는 pellet을 Phosphate buffered saline (PBS) 2ml로 resuspension하였다. 이 용액으로 RNA를 추출하여 RT-PCR과정을 거친 후 회수율을 계산하였다.

[표 8] 3% Beef extract를 사용시 과일별 회수율(%)

과실류의 종류	회수율
포도	60.06%
딸기	34.32%
복분자	85.8%

도 1은 중공사막 여과법을 이용한 식중독 미생물이 오염된 식품에서 미생물 추출, 농축 및 정제방법을 보여주는 공정 흐름도이다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD OF CONCENTRATING AND DETECTING VARIOUS MIOCROORGANISMS IN FOOD BY USING HOLLOW-FIBER ULTRAFILTER <130> DPP-2007-0258-KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer (GISKF) for Norovirus <400> 1 ctgcccgaat tygtaaatga 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer (GISKR) for Norovirus <400> 2 ccaacccarc cattrtaca 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer (GII KF) for Norovirus <400> 3 cntgggaggg cgatcgcaa 19 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer (GII KR) for Norovirus <400> 4 ccrccngcat rhccrttrta cat 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Rotavirus <400> 5 gctggcgtgt ctatggattc a 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for Rotavirus <400> 6 caaaacggga atggggagc 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for spore of B.subtilus <400> 7 ctatgtaggc cgttggtatg cct 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for spore of B.subtilus <400> 8 aggcgatgtt gcttcttctt ggtctt 26 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Salmonella enterica <400> 9 gcgcgaattc agcttttaat taccggtgga tgtggcttcc 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for Salmonella enterica <400> 10 gcgcgaattc gccgtactgc cgcaagtaaa tttaaagttc 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Vibrio cholera <400> 11 gcgcgaattc tatattgatc gcttcgaaac tgagtttgcg 40 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for Vibrio cholera <400> 12 gcgcgaattc atcgccaaat gtacctacct acttttttgc att 43 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Cryptosporidium parvum <400> 13 accgcttctc aacaaccatc ttgtcctc 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for Cryptosporidium parvum <400> 14 cgcacctgtt cccactcaat gtaaaccc 28 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E.coli <400> 15 gagagtttga tymtggctca g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for E.coli <400> 16 gaaggaggtg wtccarccgc a 21

Claims

1 내지 5 중량% 쇠고기 육즙(Beef extract) 용액, 0.5 M 류신(leucine) 용액 및 100 mM Tris-HCl 용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용액으로 식품을 처리한 미생물 채취용액을,

중공사막을 이용한 한외여과방법으로 여과하는 단계를 포함하는,

식품에서 미생물을 회수 및 농축하는 방법.

삭제

제 1 항에 있어서, 상기 한외여과단계를 수행하기 전에, 우아혈청(bovine calf serum), 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 피로인산나트륨(sodium pyrophosphate, NaPP), 글리신이 첨가된 우태아혈청, 쇠고기 육즙(Beef extract), 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 및 영양 배양액(nutrient broth)로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 차단용액으로 상기 중공사막을 전처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 박테리오파지, 바이러스, 세균, 원핵생물 및 포자로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것인 방법.

제 5 항에 있어서, 상기 바이러스는 로타바이러스 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 1종 이상 선택된 것인 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 1 내지 1x10² CFU 농도로 식품에 존재하는 것인 방법.

제1항, 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 회수 및 농축된 미생물 시료를 중합효소연쇄반응을 이용하여 대상 미생물을 유무를 탐지하는 단계를 포함하는 식품에 존재하는 미생물의 검출방법.