KR100947911B1

KR100947911B1 - Ｈｃｖ 감염에 유용한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR100947911B1
Application number: KR20037012663A
Authority: KR
Inventors: 퀑앤; 바이른랜달; 레이드로라엠.
Original assignee: 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2001-03-27
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2010-03-17
Also published as: CN100362095C; ATE431396T1; EP1381673A4; ZA200307373B; KR20040012739A; NZ528462A; EP1381673B1; JP4499990B2; JP2010142249A; MXPA03008882A; US20020142449A1; DE60232322D1; US7879606B2; CA2441688C; HK1063334A1; NO20034278D0; NO20034278L; WO2002077206A1; CN1511190A; US20130071834A1

Abstract

본 발명은 HCV 감염후 HCV을 효과적으로 생성할 수 있는 세포를 포함하는 조성물, 상기 세포를 배양하기 위한 조성물, 상기 조성물을 제조하는 방법 및 상기 조성물중 세포에 HCV를 주입시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 HCV 생성을 분석하는 방법과 HCV를 생성시키는 화합물을 평가하는 방법을 제공한다.

Description

ＨＣＶ 감염에 유용한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR HCV INFECTION}

본 출원은 2001년 3월 27일자 출원된 미국 가명세서 출원 제60/279,174호의 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 HCV 바이러스감염에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

C 형 간염 바이러스(HCV)는 감염된 인간에서 활발히 복제를 하지만, 배양된 세포에서의 성장 방식은 그다지 완벽하지는 못하다. 감염성 혈청이 생체내 배양된 인간 간 세포를 감염시키는데 사용될때, 소량의 HCV만이 복제를 하며, 이는 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해서만 확인할 수 있다.

HCV로 배양 세포 예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포, 인간 B 및 T 세포, 인간 간세포주와, 인간 태아 및 성인 세포를 감염시키려는 시도가 행하여져 왔다. 그러나, 그 결과는 희망적이지 못하였다. 종종 바이러스 복제율은 매우 낮아서 감염된 세포 군집으로부터 생성된 HCV는 RT-PCR에 의해서만 확인 가능하며, 소수의 HCV RNA 복사체만을 관찰할 수 있다. 뿐만 아니라, 바이러스는 동일한 바이러스 및 세포를 보유하는 웰에서 동일 또는 이일에 산발적이고 비복제적으로 생성된다. 또한, 바이러스를 투여한후 적어도 1개월 경과한 때에 조차도 감염 피크를 관찰하는데에는 수일이 걸린다[예를 들어, Iacovacci 등, Hepatology 26(5):1328-1337(1997)]. 이러한 문제점으로 인하여 HCV 감염 환자의 치료 및/또는 HCV 감염에 관한 연구에 유용할 수 있는 화합물의 동정 및 신속한 스크리닝에 지장을 주게 된다.

그러므로, 세포 배양액중에서 HCV를 감염 및 복제시키는 방법이 필요하다. 또한 배양액중 HCV 생성을 억제시키는 화합물을 확인하는 신속하고도 효율적인 방법이 필요하기도 하다. 본 출원은 HCV를 효과적으로 복제시킬 수 있는 세포를 포함하는 조성물과, 세포의 조성물을 제조하는 방법, 세포를 배양하는 배지, 세포를 HCV으로 감염시키는 방법, HCV 감염을 분석하는 방법 및 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 화합물이 HCV의 생성에 영향을 미치는 능력을 평가하는 방법을 제공함으로써, 이러한 문제점을 해결하는데 목적이 있다.

발명의 개요

본 발명은 HCV를 다량 생성하는 배양 세포를 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 HCV에 효과적이며 효율적으로 감염될 수 있는, 수태된지 3개월 이상이 된 인간 간 세포로부터 얻어진 세포를 함유하는 세포 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의하여 제조된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알파 태아 단백질을 발현하는 세포, 알부민을 발현하는 세포, 글리코포린을 발현하는 세포를 함유하는 세포 혼합물을 포함하되, CD34 단백질을 발현하는 세포는 실질적으로 존재하지 않는다. 본 발명의 다른 구체예에서, 세포 혼합물중 세포들은 크기 약 40 ㎛인 필터를 통과할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 조성물은 공급자 세포(feeder cell)와 연계되어 사용되거나 또는 이를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 공급자 세포는 STO(Reid-99) 세포이다.

본 발명은 세포 배양용 조성물을 제공한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 세포 배양용 조성물은 칼슘, 유리 지방산(FFA), 고밀도 리포단백질(HDL), 니코틴아미드, 미량 원소, 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 함유하는 무혈청 배지를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 조성물은 저밀도 리포단백질을 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 조성물은 다음의 성분들 즉, 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자중 임의의 하나, 이들의 조합물 또는 이들 모두를 추가로 포함한다.

본 발명은 HCV를 본 발명의 조성물에 투여함으로써 세포 혼합물을 감염시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 상기 HCV는 RNA898이다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, HCV 바이러스는 처음에 24시간 동안 약 37℃에서 약 0.52㎖/㎠ 부피의 조성물(접종물)과 함께 항온처리된후 이 조성물중에서 세포를 세척하거나 또는 접종물과 세포 배양 배지를 교체한다.

본 발명은 본 발명의 조성물을 공급자 세포와 함께 항온처리하고, 조성물중 세포를 HCV와 접촉시키며 ; 세포 및/또는 세포가 배양된 배지와 결합된 HCV를 측정하는 HCV 감염 분석 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 공급자 세포와 함께 항온처리하는 단계, 조성물중 세포를 HCV 바이러스와 접촉시키는 단계 및 상기 HCV와 접촉시키기 이전 또는 이후에 화합물을 투여하는 단계를 포함하여, 화합물이 HCV를 생성시키는 능력 즉, 세포 조성물이 더욱 많은 양의 HCV를 생성시키는 능력을 평가하는 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 HCV 생성을 억제하는 세포를 스크리닝하는데 사용된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 화합물이 HCV 생성을 억제하는 능력에 대하여 다수의 화합물을 동시에 스크리닝하는데 사용된다.

다른 구체예에서, HCV의 존재는 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의하여 HCV RNA를 정량함으로써 측정된다. 하나의 구체예에서, 샘플중 HCV RNA는 내부 대조군으로서 사용되는 제2 바이러스로부터 얻은 RNA 양과 비교된다. 추가의 구체예에서, 제2 바이러스는 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus ; BVDV)이다.

도 1은 배양 상청액에 존재하는 HCV RNA의 수준에 의하여 측정된, RNA898 감염후 인간 태아 간 세포의 감염(- □-) 또는 무혈청 대조군(- ●-)에 대한 경시적 분석 결과를 나타내는 것이다. 상청액 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 600 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 3개의 배양액으로부터 얻은 평균 HCV RNA/㎖ 값과 이의 표준 편차를 제시하였다.

도 2는 배양 상청액에 존재하는 HCV RNA의 수준에 의하여 측정된, RNA898 감염후 인간 태아 간 세포의 감염(- □-) 또는 음성 대조군 혈청(- X -)에 대한 경시적 분석 결과를 나타내는 것이다. 음성 대조군 혈청은 HCV 감염되지 않은 환자로부터 얻었다. 상청액 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 600 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 3개의 배양액으로부터 얻은 평균 HCV RNA/㎖ 값과 이의 표준 편차를 제시하였다.

도 3은 배양 상청액에 존재하는 HCV RNA의 수준에 의하여 측정된, RNA898 감염후 인간 태아 간 세포의 감염(- □-) 또는 음성 대조군 혈청(- X -)에 대한 경시적 분석 결과를 나타내는 것이다. 음성 대조군 혈청은 HCV 감염되지 않은 환자로부터 얻었다. 상청액 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 600 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 3개의 배양액으로부터 얻은 평균 HCV RNA/㎖ 값과 이의 표준 편차를 제시하였다.

도 4는 세포에 결합된 HCV RNA의 수준에 의하여 측정된, RNA898 감염후 인간 태아 간 세포의 감염에 대한 경시적 분석 결과를 나타내는 것이다. 음성 대조군 혈청 데이터는 나타내지 않았다. 접종후, 배양액중 세포를 세정하고 바이러스 투여후 1, 2, 3, 6 및 8일째에 수집하였다. 세포 결합 RNA 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 100 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 3개의 배양액으로부터 얻은 평균 HCV RNA/웰 값과 이의 표준 편차를 제시하였다.

도 5는 광범위한 농도의 항바이러스 제제, VRT-106866에 의한 인간 태아 간 세포의 HCV 감염 억제를 나타내는 것이다. 정량적 복합 HCV 특이적 RT-PCR 분석법을 이용하여 샘플중 HCV RNA를 측정하였다. 세포 결합 RNA 샘플에 대한 상기 RT-PCR 분석법의 정량 한계는 100 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 결과는 3개의 배양액으로부터 얻은 "대조군 HCV RNA %"(샘플 값/양성 대조군 값의 평균)의 평균 및 표준 편차로 제시하였다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 조성물은 수태후 3개월 이상된 인간의 간으로부터 유래한 세포를 함유하는 세포 혼합물을 포함한다. 하나의 구체예에 따르면, 여기서의 인간은 수태후 3개월∼출생후 1년된 인간이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 인간은 수태후 3 내지 6개월된 인간이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 인간은 수태후 18∼22주된 인간이다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 세포는 태아 간 및 조혈 세포를 포함한다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 간 및 조혈 세포는 알파 태아 단백질 세포, 알부민 및/또는 글리코포린을 발현시킬 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 성인 인간의 경우, 인간 간은 건강한 상태의 것이다.

다른 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 알파 태아 단백질을 발현할 수 있는 세포, 알부민을 발현하는 세포 및 글리코포린을 발현하는 세포를 포함하되, CD34 단백질을 발현하는 세포는 실질적으로 존재하지 않는다. 세포 혼합물중 세포는 알파 태아 단백질, 알부민 또는 글리코포린에 대하여 특이적으로 유도된 항체로 면역 염색 가능(immunostable)하지만, 세포 혼합물은 CD34 단백질에 대하여 특이적으로 유도된 항체로 면역 염색가능한 세포가 실질적으로 존재하지 않는다. 본 발명에 따르면, "CD34 단백질을 발현하는 세포가 실질적으로 존재하지 않는"이란 용어는, 알칼리성 포스파타제-염료 검출 시스템을 이용하여 면역 결합을 검출할때, 세포 혼합물중 세포가 CD34 항체로 인한 면역 염색을 거의 관찰할 수 없거나 또는 전혀 관찰할 수 없는 경우를 의미한다[예를 들어, Harlow 등, Antibodies:A Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory, pp.349, 406-407 ; LSAB2 kit of DAKO Corporation]. 본 발명의 조성물의 하나의 구체예에 따르면, 세포 혼합물의 세포 군집중 2% 미만은 항CD34 특이적 항체로 염색될 수 있다. 다른 구체예에 따르면, 세포 혼합물의 세포 군집중 1% 미만은 항CD34 특이적 항체로 염색될 수 있다.

본 발명은 HCV 바이러스인, RNA898(이하, "RNA898"이라 칭함)의 감염 및 복제에 대하여 상당히 양호한 숙주 세포인 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. RNA898은 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 20110-2209 마네사스 유니버시티 불레바드 10801에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소("ATCC")에 2001년 3월 27일자로 기탁(ATCC 기탁 번호 PTA-3237)되었다. 하나의 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상기 조성물중 4 ×10⁵개의 세포가 존재하는 경우 바이러스를 투여한후 72시간 경과한 배지중에서 약 5000 복사체 이상, 약 10,000 복사체 이상, 또는 약 50,000 복사체 이상의 C형 간염 바이러스 RNA를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라서 제조되어 실시예 2 및 4에 기술된 방법에 의하여 분석된 조성물은 바이러스를 투여한후 72시간 경과한 배지중에서 약 5000 복사체 이상, 약 10,000 복사체 이상, 또는 약 50,000 복사체 이상의 C형 간염 바이러스 RNA를 생성할 수 있다.

당업자는 상기 조성물중 세포의 수가 4 ×10⁵개 세포 이상이면, 생성되는 바이러스 RNA 복사체의 총 수는 조성물중 세포 수가 증가되는 정도의 양까지 증가할 것이라는 사실을 용이하게 이해할 것이다. 이와 유사하게, 당업자는 조성물중 세포의 수가 4 ×10⁵ 세포 이하이면, 생성되는 바이러스 RNA 복사체의 총 수는 조성물중 세포의 수가 감소하는 정도의 양까지 감소할 것이라는 사실을 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 4 ×10⁵ 세포 이상 또는 이하를 함유하며 HCV RNA의 복사체 수만큼 비례적으로 세포를 생성하는 조성물을 고려하게 된다. 본 발명의 조성물은 상기 조성물에 바이러스를 투여한후 72 시간 경과시 HCV RNA를 5,000∼55,000 복사체 ; 10,000∼55,000 복사체 ; 및 25,000∼55,000 복사체만큼 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 면역 염색에 유용한 항체의 예는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 캘리포니아 카핀테리아 소재 DAKO Corporation에서 시판중인 항알파 태아 단백질 항체, 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재 PharMingen에서 시판중인 항글리코포린 항체(32591), 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재 PharMingen에서 시판중인 항인간 CD34 항체(34371A) 및 미국 뉴욕 웨스트베리 소재 Accurate Chemical Corp.에서 시판중인 항알부민 항체(YM5024)가 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물중 세포 혼합물은 크기 약 40 ㎛인 필터를 통과할 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 공급자 세포와 연계되어 사용되거나 또는 이를 추가로 포함한다. 공급자 세포는 세포외 매트릭스 및 융합 가능한 인자 예컨대, 성장 인자를 제공한다. 하나의 구체예에서, 공급자 세포는 HCV로 거의 감염되지 않거나 전혀 감염되지 않는다. 다른 구체예에서, 공급자 세포는 섬유아세포이다. 다른 구체예에서, 공급자 세포는 배아 제대혈 섬유아세포이다.

본 발명에 따른 공급자 세포의 예는 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 예컨대, STO 세포 및 래트 배아 섬유아세포(REF)이다[예를 들어, Brigid Hogan 등, Manipulating The Mouse Embryo : A Laboratory Manual, 2nd ed. Plainview, N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 ; Robertson, E.J.(1987), Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, ed. Robertson, E.J.(IRS, Oxford), pp.71-112]. STO(Reid-99) 세포는 유용한 공급자 세포의 한 유형이다. STO(Reid-99) 세포는 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 마네사스 유니버시티 불레바드 10801에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 기탁(ATCC 기탁 번호 PTA-3236)되었다. 공급자 세포를 배양 및 유지하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Methods for Tissue Engineering, Ed. Robert Lanza, Academic Press, NY(2002), pp.151-202를 참조하시오.

공급자 세포는 당업계에 공지된 방법에 의하여 그 성장이 정지될 수 있다. 예를 들어, STO 세포는 세포 배양 플레이트상에 2∼48 시간 동안 부착시킬 수 있다. 그 다음, 상기 STO 세포가 항온처리되는 배지를 제거하여 이것과 2 ug/㎖ Mitomycin C를 함유하는 배지를 교체한다. 이후 상기 STO 세포를 약 2 시간 동안 약 37℃에서 항온 처리한다. 항온 처리후, 상기 Mitomycin C를 함유하는 배지를 제거한다. 세포를 2회 세척한 다음, 상기 STO 세포 배양액을 본 발명의 세포 혼합물을 첨가할때 또는 0∼48 시간 이전에 유지시킨다.

본 발명에 의한 조성물의 세포 혼합물은 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있다.

a. EGTA를 함유하는 완충액중 수태된지 3 개월 이상된 인간의 간을 절개하는 단계 ;

b. 상기 절개된 간을 콜라게나제를 함유하는 완충액중에서 항온 처리하여 간으로부터 세포를 분리하는 단계 ;

c. 분리된 세포로부터 약 40 ㎛ 이상의 물질을 분리하는 단계 ;

d. 상기 세포 분리된 세포로부터 적혈구 세포를 분리하는 단계 ;

e. 상기 단계 (d)의 세포를 0.1∼0.6 mM의 칼슘, 소 혈청 알부민, 유리 지방산(FFA), 고밀도 리포단백질(HDL), 니코틴아미드, 미량 원소, 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 함유하는 무혈청 배지에 재현탁시키는 단계 ; 및

f. 세포를 상기 단계 (e)의 무혈청 배지에서 배양하는 단계.

상기 단계 (e) 또는 (f)의 배지는 필요에 따라서, 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자중의 어느 하나, 이들의 조합물 또는 이들 전부를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 배지는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 배지는 저밀도 리포단백질(LDL)을 포함하지 않는다.

하나의 구체예에서, 상기 EGTA 완충액은 0.1 ∼ 1.0 mM의 에틸렌 글리콜 비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세테이트(EGTA)를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 EGTA의 농도는 0.5 mM이다.

하나의 구체예에서, 콜라게나제 완충액은 콜라게나제를 0.1∼5.0 ㎎/㎖ 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 콜라게나제의 농도는 2 ㎎/㎖이다.

본 발명에 따른 크기 배제 단계(size exclusion step)는 크기 약 40 ㎛인 필 터를 통과할 수 없는 목적물 예컨대, 조직, 세포 조각 및 세포 응집체를 제거하는 것을 의미한다. 그러므로, 예를 들어, 크기 약 40∼100 ㎛인 필터를 사용하는 것과 크기 40 ㎛ 이상인 세포 조각을 제거하는 다른 방법이 고려된다. 하나의 구체예에서, 여과 단계는 필터를 통과할 수 없는 크기 약 40 ㎛ 이상인 목적물을 제거한다. 본 발명에 따른 필터의 예로서는 나일론 필터(예를 들어, "세포 여과기(Cell strainer), Falcon사(카타로그 번호 2034, 2350 또는 2360)을 포함한다.

본 발명의 조성물을 제조하는 방법은 세포 혼합물로부터 적혈구 세포를 분리하는 것을 포함한다. 상기 적혈구 세포는 제조 과정중 간으로부터 세포를 분리한후임의의 단계에서 분리될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 적혈구 세포를 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 적혈구 세포는 원심분리에서 연속적 저속 스핀법에 의하여 제거된다. 예를 들어, 필터를 통과하는 분리된 세포는 50 ×g(450 rpm)에서 4 분 동안 스핀될 수 있으며, 이때 세포 펠렛은 재현탁되고 동일한 방법을 수 회 반복할 수 있다.

동물 또는 인간의 1차 세포, 세포주 및 조직은 본 발명의 배지와 함께 배양될 수 있다. 하나의 구체예에서, 배양 배지는 무혈청 배지, 칼슘, FFA, HDL, 니코틴아미드, 미량 원소, EGF, 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 포함한다. 다른 구체예에 따르면, 배양 배지는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자와 같은 성분들중 어느 하나, 이들의 조합물 또는 이들 모두를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 배양 배지는 저밀도 리포단백질(LDL)을 포함하지 않는다.

상기한 방법에 따라서 세포 혼합물을 제조한 이후, 세포는 세포, 필요에 따라서는 공급자 세포를 유지시키기 적합한 배지내에서 배양되어야 한다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, 상기 배지는 HCV 감염에 사용되는 세포 혼합물에 대하여 최적화된다. 이러한 목적으로 유용한 하나의 배지는 무혈청 배지(예를 들어, 칼슘, 소 혈청 알부민(BSA), 유리 지방산(FAA), 고밀도 리포단백질(HDL), 니코틴아미드, 미량 원소, 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 트랜스페린, 히드로코르티손을 함유하며, 필요에 따라서는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자와 같은 성분들중 어느 하나, 이들의 조합물 또는 이들 전부를 함유하는 Dulbecco 개질 Eagle 배지(DMEM)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 배양 배지는 저밀도 리포단백질(LDL)을 포함하지 않는다.

하나의 구체예에서, 배양 배지중 칼슘의 농도는 0.1∼0.6 mM이다. 다른 구체예에서, 칼슘 농도는 약 0.5 mM이다. 하나의 구체예에서, BSA의 농도는 500 ug/㎖이다. 다른 구체예에서, 상기 니코틴아미드의 농도는 5 mM이다. 하나의 구체예에서, 상기 인슐린의 농도는 10 ng/㎖이다. 하나의 구체예에서, 유리 지방산의 농도는 7.6 uEq/ℓ이다. 하나의 구체예에서, EGF의 농도는 100 ng/㎖이다. 하나의 구체예에서, 간 성장 인자의 농도는 20 ug/㎖이다. 하나의 구체예에서, 에탄올아민의 농도는 10^-6 M이다. 하나의 구체예에서, 티로트로핀 방출 인자의 농도는 10^-6 M이다. 하나의 구체예에서, HDL의 농도는 5 ug/㎖이다. 하나의 구체예에서, 히드로코르티손의 농도는 10^-6 M이다.

하나의 구체예에서, 배지는 IM-HDM 배지로서, DMEM(고 글루코즈), 500 ug/㎖ BSA, 7.6 uEq/ℓ의 유리 지방산(FAA), 5 ug/㎖ HDL, 5 mM 니코틴아미드, 1 ×미량 원소[1 ×10^-7 M 구리, 5 ×10^-5 M 아연, 3 ×10^-10 M 셀레늄], 100 ng/㎖ EGF, 10 ng/㎖ 인슐린, 5 ug/㎖ 트랜스페린, 10^-6 M 히드로코르티손, 2 ug/㎖ 글루카곤, 20 ug/㎖ 간 성장 인자, 10^-6 M 에탄올아민, 10^-6 M 티로트로핀 방출 인자를 포함한다. 하나의 구체예에서, 7.6 uEq/ℓ의 전체 FFA는 2.36 uM 팔미트산(16:0), 0.21 uM 팔미톨레산(cis-16:1n-7), 0.88 uM 스테르산(steric acid)(18:0), 1.02 uM 올레산(cis-18:1 n-9), 2.71 uM 리놀레산(cis-18:2 n-6) 및 0.43 uM 리놀렌산(cis-18:3 n-3)의 혼합물을 포함한다. 배지는 또한 박테리아 성장을 억제하는 항생제 예를 들어, 1 ×페니실린/스트렙토마이신도 포함한다.

본 발명의 조성물의 세포 혼합물은 세포외 매트릭스로 코팅된 플라스틱 기판상에 도말될 수 있다. 세포외 매트릭스 성분의 예로서는 콜라겐 예컨대, 콜라겐 Ⅳ형, 또는 부착 단백질, 피브로넥틴 및 라미닌, 또는 Matrigel(ICN Biochemicals Inc.) 를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 콜라겐은 단독으로 사용되거나, 라미닌 또는 피브로넥틴과 함께, 또는 프로테오글리칸과 함께, 또는 세포외 매트릭스 물질이 보강된 조직 추출물과 함께 사용될 수 있다. 세포외 매트릭스는 또한 전술한 공급자 세포에 의하여 제공될 수도 있다. 이러한 세포 혼합물 및 세포외 매트릭스 조합물은 본 발명에 의한 HCV 분석법에서 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 RNA898 또는 RNA898의 HCV 감염성 균등물과 접촉될 수 있다. 상기 RNA898 감염성 균등물은 HCV 균주로서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 조성물의 4 ×10⁵ 세포와 상기 HCV 바이러스를 접촉시킨 이후 72 시간 경과시 HCV RNA를 약 5,000 복사체 이상, 약 10,000 복사체 이상 또는 약 50,000 복사체 이상 생성할 수 있는 RNA898을 제외한 것이다. 하나의 구체예에 따르면, 세포는 본 발명의 조성물과 RNA898 또는 이의 감염성 균등물을 약 0.52 ㎖/㎠의 부피로 약 37℃에서 약 24 시간 동안 접촉시킴으로써 감염된다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, HCV로 감염된 세포를 세포외 매트릭스와 함께 배양시킨다. 본 발명의 다른 구체예에서, 세포외 매트릭스는 공급자 세포(예를 들어, STO-(Reid-99) 세포)에 의하여 제공된다.

본 발명의 조성물중 세포로부터 생성된 HCV의 양은 예를 들어 HCV 단백질 또는 핵산 생성을 정량함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포와 결합된 상태(즉, 세포내 존재하거나 또는 세포에 부착된 상태)로 발견되고/되거나 세포가 배양된 배지중에서 발견되는 HCV RNA 복사체의 수를 정량할 수 있다. HCV 단백질 또는 핵산 분자가 생성되었는지를 관찰하는데 사용될 수 있는 기법들이 당업계에 다수 공지되어 있다. 예를 들어, HCV 단백질에 대하여 유도된 항체로 프로빙된 단백질의 웨스턴 블롯팅 방법 또는 HCV 핵산 서열과 상보적인 표지화된 핵산 분자로 프로빙된 겔의 블롯팅 방법이 그것이다. 단백질 및 핵산 분자를 세포 및 세포 배양 배지로부터 추출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 목적의 키트는 시판중에 있다.

본 발명에 의하여 생성된 HCV 입자의 복사체 수를 더욱 정확하게 정량하기 위해서는, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 유용하다. 본 발명의 하나의 구체예에 따르면, RT-PCR법은 변형되어 제2 바이러스 또는 제2 핵산 분자의 형태로 분석되는 세포, 세포 추출물 및/또는 배지 샘플에 가하여진 공지의 양의 제2 핵산 분자의 수와 HCV RNA 복사체의 수를 비교함으로써 상기 HCV RNA 복사체의 수를 측정하는데 사용된다. 제2 바이러스가 HCV와 밀접하게 관련되어 있거나, 또는 제2 핵산 분자가 HCV RNA와 밀접하게 관련되어 있는 것[예를 들어, 길이, 핵산 조성 및 바이러스 캡시드 구조가 유사한 것]이 바람직하다. 하나의 구체예에서, 제2 핵산 분자는 플라비바이러스(flavivirus) 캡시드에 존재하는 것이다. 하나의 구체예에서 제2 RNA 분자는 소 바이러스성 설사 바이러스("BVDV") 예를 들어, BVDV NADL 균주(ATCC 기탁 번호 : VR-534)로부터 얻은 RNA이다.

제2 바이러스 또는 핵산 분자가 존재하는지 여부는 이것이 제1 핵산 분자의 정량에 있어서 내부 대조군으로서의 역할을 한다는 점에서 유리하다. 이러한 내부 대조군은 랜덤한 방황변이 및 분석 변이성을 모니터 및 보정하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 방법을 제공한다.

(a) 상기 HCV를 공지의 양의 소 바이러스성 설사 바이러스("BVDV")와 혼합시키는 단계로서, 상기 BVDV는 제2 핵산 분자와 본 발명의 조성물을 함유하는 단계 ;

(b) 조성물 또는 세포가 배양된 배지의 세포로부터 HCV로부터 유래된 제1 핵산 분자와 BVDV로부터 유래된 제2 핵산 분자를 추출하여 혼합 핵산 추출물을 형성 하는 단계 ;

(c) 상기 혼합된 핵산 추출물에 제1 핵산에 특이적인 검출 가능한 제1 프로브와, 제2 핵산에 특이적인 검출 가능한 제2 프로브를 첨가하는 단계 ;

(d) 상기 혼합된 핵산 추출물을 PCR 방법에 의하여 증폭시키는 단계 ;

(e) 증폭시 다양한 사이클에서 상기 검출 가능한 제1 프로브 및 검출 가능한 제2 프로브로부터 독립적으로 검출 가능한 시그널을 정량하는 단계 ;

(f) 단계 (e)의 결과를 외삽하여 상기 HCV 중 상기 제1 핵산 분자의 양과 BVDV중 상기 제2 핵산 분자의 양을 계산하는 단계 ; 및

(g) 단계 (f)중 제2 핵산의 계산된 양과 단계 (a)에 사용된 제2 핵산의 공지된 양을 비교함으로써 단계 (f)에서 측정된 상기 제1 핵산 분자의 계산된 양의 정밀성을 평가하는 단계.

다른 구체예에 따르면, 전술한 방법은 단계 (f)에서 측정된 제1 핵산의 계산된 양을 단계 (f)의 제2 핵산의 계산된 양과 단계 (a)에서 사용된 제2 핵산의 공지된 양을 비교하여 결정된 팩터(factor)로 맞추는 추가의 단계를 포함한다.

다른 구체예에 의하면, 본 발명은 HCV의 생성에 대한 화합물의 영향력을 측정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 조성물에 HCV를 투여하기 이전 또는 이후에 화합물을 첨가하는 단계 및, 그후 조성물 및/또는 감염된 세포가 배양된 배지중 세포와 결합된 HCV의 존재를 측정하는 단계를 포함한다. 화합물이 HCV과 조성물이 접촉된 이후에 투여되는 것이 바람직하면, HCV와 조성물이 접촉된후 10일 이내에 상기 화합물을 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하여 시험되는 화합 물은 HCV의 생성을 억제하거나 또는 촉진한다. 따라서, 화합물은 HCV의 라이프 사이클중 임의의 단계를 억제하여 그 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 화합물의 예로서는 합성 또는 정제된 화학적 화합물, 단백질 및 핵산 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 화합물이 첨가되는 샘플은 동일하되 화합물에 노출되지 않거나 또는 HCV 생성에 약간 영향을 미치거나 또는 거의 영향을 미치지 않는 다른 화합물에 노출되는 조건하에서 처리되는 다른 샘플과 비교될 수 있다.

하나의 구체예에 따르면, 전술한 방법은 HCV 생성에 대하여 복수개의 화합물이 미치는 영향을 동시에 스크라낭하는데 사용된다. 예를 들어, 96 웰 평판의 각각의 웰은 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝된 상이한 화합물을 함유할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 방법은 HCV의 생성을 억제하는 화합물을 확인하는데 사용된다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머 및 프로브는 HCV 균주의 가장 보존된 영역을 기초로 하여 디자인된다. 프로브는 또한 다음의 추가의 기준에 기초하여 구성될 수도 있다. 즉, a) 프로브의 용융점은 프라이머의 용융점보다 8∼10℃ 높고 ; b) 5' 말단에 G가 존재하지 않으며 ; c) 4개 이상의 G 연신체가 존재하지 않고/않거나 d) 프로브가 용융점이 높은 내부 구조를 형성하지 않거나 또는 프로브 상호간에 또는 임의의 프라이머와 이중체를 형성하지 않음. 하나의 구체예에서, 전체 PCR 영역의 길이는 약 150 염기쌍이다.

BVDV의 5' UTR에 유용한 프라이머 및 프로브는 동일한 기준을 기초로 하여 디자인될 수 있다. 또한, HCV의 프라이머 또는 프로브가 BVDV의 프라이머 또는 프 로브와 최소의 상동성을 갖는 것을 확인하는데 주의를 기울여야 한다. 프라이머 및 프로브는 변형된 핵산 분자를 합성하여 제조하는 시판중인 공급원(예를 들어, Oligo 및 PE Applied Biosystems)으로부터 얻을수 있다. BVDV는 MDBK 세포의 감염에 의하여 유지될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 2개의 상이한 이중 표지화된 형광발생 프로브가 사용되며, 이때 상기 프로브 각각은 HCV 핵산 분자 및 제2 핵산 분자중 하나에 특이적이되 다른 하나에 대하여는 특이적이지 않다. 추가의 구체예에서, 각각의 형광 발생 프로브는 통상적으로 5' 말단에는 리포터 염료를, 그리고 3' 말단에는 급랭 염료(quencher dye)를 보유한다. 상기 2개의 상이한 형광 발생 프로브는 2개의 피크간 교차 간섭이 발생되지 않도록 검출될 수 있는 검출 가능한 특유의 형광 피크를 나타내는 것으로 선택된다. 예를 들어, 상기에서 논의한 바와 같이, 검출 가능한 제1 프로브의 5' 말단은 리포터 염료 예컨대, 6-카르복시-플루오레세인("6-FAM")으로 표지화될 수 있으며, 검출 가능한 제2 프로브의 5' 말단은 리포터 염료 예컨대, VIC로 표지화될 수 있다. 상기 검출 가능한 양 프로브의 3' 말단은 급랭 염료 예컨대, 6-카르복시메틸-로다민("6-TAMRA")으로 표지화될 수 있다. 따라서, 제1 핵산 및 제2 핵산에 결합될때, 프로브의 3' 말단상 급랭 염료에 5' 말단상 리포터 염료가 근접하게 되므로, 형광성이 억제된다. 증폭중, Tth 중합효소사 핵산 서열을 따라서 이동할때, 급랭제는 5'-3' 엑소의 작용으로 프로브로부터 제거되며, 이로써 형광 발생 프로브가 분해된다. 그 결과 형광이 발광되는데, 이는 증폭 사이클의 함수로서 기록된다. 그러므로, 형광 발광을 모니터함으로써 실시간 증폭 동력 학을 측정하는 기초가 된다.

유용한 프라이머 및 HCV 유전자형 1에 대한 프로브의 예로서는 다음의 서열이 있다 : (서열 번호 1) 5'-CCATGAATCACTCCCCTGTG-3'(전방향 프라이머), (서열 번호 2) 5'-CCGGTCGTCCTGGCAATTC-3'(역방향 프라이머), 및 HCV 프로브(서열 번호 5) 5'-6-FAM-CCTGGAGGCTGCACGACACTCA-TAMRA-3'. BVDV에 대한 프라이머 및 프로브는 전방향 프라이머인 (서열 번호 3) 5'-CAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCG-3', 역방향 프라이머인 (서열 번호 4) 5'-GGCCTCTGCAGCACCCTATC-3' 및 프로브인 5'-VIC(서열 번호 6) CCCTCGTCCACGTGGCATCTCGA-TAMRA-3'를 포함한다.

RT 및 PCR 반응은 캡이 장착되어 있는 96 웰 평판 광학 트레이(미국 캘리포니아 포스터시 소재 PE Applied Biosystems)의 동일한 웰에서 수행될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 복합 RT-PCR 반응이 사용된다(즉, 2개의 상이한 종류의 RNA 예를 들어, HCV RNA 및 BVDV RNA를 동일한 튜브내에서 동시에 증폭 및 측정하는 RT-PCR 반응). 상기 복합 반응은 수행자가 HCV 음성 결과가 배양액이 진짜 음성인 것인지 또는 추출 또는 RT-PCR 단계에서 몇몇 기술적 결함으로 음성의 결과가 얻어진 것인지의 여부를 결정할 수 있도록 하는 이점을 갖는다.

10 또는 20 uℓ의 바이러스 RNA 또는 RNA 기준은 1XTaqman EZ 완충액(PE Applied Biosystems), 3 mM 아세트산망간, 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP 300 mM, Tth 중합효소(Epicentre) 5 유닛, 4.0% 인핸서(Epicenter), 프로브 및 프라이머의 일부 농축물을 사용하여 50 uℓ의 RT-PCR 반응물에서 증폭될 수 있다. Taqman RT-PCR 분석법은 60℃(RT)에서 25분 동안 그리고 95℃에서 5분 동안 수행된후, 2 단계 PCR 반응(60℃에서 1분 및 95℃에서 15초)이 45 사이클 수행될 수 있다. HCV 및 다른 핵산(복합 Taqman 분석법)을 사용한 분석법에서, HCV 및 BVDV 프라이머의 양은 프라이머의 양 세트를 다양한 농도로 함유하는 매트릭스 혼합물을 사용하여 최적화될 수 있다. 최종 분석 조건은 200 nM의 6-FAM-표지화된 HCV 프로브 및 VIC-표지화된 BVDV 프로브, 400 nM HCV 프라이머 및 45 nM의 양 BVDV 프라이머를 포함한다.

본 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위를 통하여 "포함한다" 또는 이의 변형어인 "포함" 또는 "포함하는"이란 용어는 언급한 정수 또는 정수의 군을 포함하되, 임의의 다른 정수 또는 정수군을 제외하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.

2001년 3월 27일자 출원된 미국 가명세서 출원 제60/279,174호 및 이에 언급된 문헌들은 본원에 참고 문헌으로 첨부되어 있다.

본 발명의 다양한 구체예가 제시되어 있으나, 기본적인 구성은 변형되어 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 다른 구체예를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 예시되어 있는 특정 구체예에 의해서라기 보다는 청구의 범위와 상세한 설명에 의하여 정의된다는 것을 이해할 것이다.

실시예 1

인간 태아 간 및 조혈세포의 분리 및 배양

수태후 18∼22주된 인간 태아로부터 얻은 간 조직을 얼음상의 RPMI에 보관한후 절개하였다. 이 조직을 PBS 용액으로 세정하였다. 이 조직을 절개 완충액[HBSS(Cellgro cat no. 21-022-cv), 0.5 mM EGTA, 0.2 mM MgSO₄, 10 mM HEPES] 50 ㎖중에서 잘게 썰었다. 썰어진 조직을 10분 동안 37℃의 수조에서 항온처리하였다. 상기 썰어진 조직으로부터 분리되어 현탁된 세포들을 제거하였다. 썰어진 조직을 37℃의 콜라게나제 용액(콜라게나제 완충액[HBSS, 1mM CaCl₂, 10 mM HEPES]중 2 mg/㎖ 콜라게나제(Sigma C-5138))중에서 30분 동안 항온처리하였다. 상기 썰어진 조직상에 현탁되어 있는 분리된 세포를 수집하고 이를 40 ㎛의 나일론 필터(Falcon nos.2034, 2350 또는 2360)를 통과시켰다. 썰어진 조직을 IM-세정 용액[DMEM(고 글루코즈 JRH-51444), 500 ug/㎖ BSA(Sigma A8806), 7.6 uEq/ℓ전체 유리 지방산(FAA), 1 ×Penn/Strep, 10 ng/㎖ 인슐린, 5 ug/㎖ 트랜스페린]으로 세정하였다.

상기 필터를 통과한 세포들을 함유하는 용액을 풀링한 다음 1000 rpm에서 8분 동안 스피닝시켰다. 이후 상청액을 폐기하였다. 펠렛을 50 ㎖의 IM-세정 용액에 재현탁시키고 50 ×g(450 rpm)에서 4 분 동안 스피닝시켰다. 상청액을 폐기하였다. IM-세정 용액중의 펠렛을 재현탁시키고, 이 재현탁액을 4분 동안 50 ×g에서 스피닝시키며 상청액을 폐기하는 방법을 2∼3회 반복 수행하였다. 이후 상기 펠렛을 20 ㎖의 IM-HDM 배지[DMEM(고 글루코즈 JRH-51444), 500 ug/㎖ BSA(Sigma A8806), 7.6 uEq/ℓ유리 지방산(FFAs)[2.36 uM 팔미트산(16:0, Sigma, P0500), 0.21 uM 팔미톨산(cis-16:1 n-7, Sigma, P9417), 0.88 uM 스테르산(18:0, Sigma, S4751), 1.02 uM 올레산(cis-18:1 n-9, Sigma, O1008), 2.71 uM 리놀레산(cis-18:2 n-6, Sigma, L1376) 및 0.43 uM 리놀렌산(cis-18:3 n-3, Sigma, L2376)], 5 ug/㎖ HDL(Sigma L2014), 5 mM 니코틴아미드(Sigma N0636), 1 ×Penn/Strep(Gibco 1 ×), 1 ×미량 원소[1 ×10^-7 M 구리(C8027), 5 ×10^-11 M 아연(Sigma 4750), 3 ×10^-10 M 셀레늄(Sigma S6663)], 100 ng/㎖ EGF(Peprotech 100-15), 10 ng/㎖ 인슐린(Sigma I5500), 5 ug/㎖ 트랜스페린(Sigma T0665), 10^-6 M 히드로코르티손(Sigma I5500), 2 ug/㎖ 글루카곤(Sigma G3157), 20 ug/㎖ 간 성장 인자(Sigma G1887), 10^-6 M 에탄올아민(Sigma E0135), 10^-6 M 티로트로핀 방출 인자(Sigma T9146)]에 재현탁시켰다.

펠렛화된 세포들을 IM-HDM 배지에 밀도 3 ×10⁵ 세포/㎠로 도말하였다. 펠렛화된 세포들은 세포외 매트릭스에서도 잘 성장하였다. 펠렛화된 세포는 콜라겐으로 코팅된 평판상에서 성장할 수 있다. Salas-Prato, Invitro Cell. Dev. Biol. 24:230, 1988의 방법을 사용하여 상기 평판을 코팅하였다. 일반적으로 평판은 콜라겐 제Ⅰ형 스톡 용액(DMEM 30 ug/㎖중, 37℃, 30분 ∼ 1 시간, PBS로 2회 세정, PBS로 침지시킨후 사용시까지 PBS중에 보관함)에서 항온처리되었다.

대안적으로, 평판은 공급자 세포로 코팅된후 펠렛화된 세포가 첨가될 수 있다. 예를 들어, Mitomycin C 처리된 STO(Reid-99) 세포를 공급자 세포로 사용하였다. 상기 Mitomycin C는 STO 세포의 성장을 지연시키켰으나, 세포들은 생존한 상태로 남아 있어, 간 세포에 부착되기 위한 표면을 제공한다.

팔요에 따라서, STO 세포를 STO 정상 배지(RPMI-1640, 10% FCS)중 1.9 ㎠ 웰(1.2 ×10⁵/웰, 24 웰 평판용 ; 2.2 ×10⁴/웰, 96웰 평판용)에 도말하고, 2∼48 시간 동안 부착시켰다. 배지를 제거한후 이를 2 ug/㎖ Mitomycin C를 함유하는 배지와 교체한후 37℃에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 이후 배지를 제거하고, STO 세포를 정상의 STO 배지로 2회 세정하여, 배양액을 0∼48 시간 동안 유지시킨 다음 태아 세포를 첨가하였다.

24∼48 시간 후, 부착되지 않은 태아 세포를 가만히 피펫팅하여 제거하였다. 배지를 일반적으로 2∼7일에 한번씩 교체하였다. 상기 세포를 28일 이상 동안 고체 세포 부수태태인 양호한 세포 형태로 유지시켰다.

24 웰 평판 또는 96 웰 평판의 웰에서 HCV 감염후 11일 경과시 세포 혼합물의 면역 염색을 수행하였다. 알파-1 태아 단백질 항체 및 음성 대조군 항체를 미국 캘리포니아 카핀테리아 소재 DAKO Corporation(DAKO)로부터 입수하였다. 항인간 CD34(34371A) 및 항글리코포린(32591A) 마우스 모노클로날 항체는 미국 캘리포니아 샌 디에고 소재 PharMingen으로부터 입수하였으며, 이는 DAKO로부터 입수한 마우스 음성 대조군(N1537) 항체와 함께 사용하였다. 제조자의 지침에 따라서 DAKO의 LSAB2 또는 K0676(알칼리성 포스파타제) 키트를 사용하여 염색을 수행하였다. 면역염색 결과 세포 혼합물은 알파 태아 단백질을 발현시키는 세포, 글리코포린을 발현시키는 세포 및 알부민을 발현시키는 세포를 함유하되, CD34를 발현시키는 세포는 함유하지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 2

HCV 감염

96 웰 또는 24 웰 평판을 실시예 1의 STO(Reid-99) 공급자 세포로 코팅하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조한 세포를 24 웰 평판중 STO(Reid-99) 세포에 도말하였다. 상기 세포를 웰당 ProMed Dx로부터 입수한 C형 간염 바이러스 RNA898의 1 ㎖ 역가당 9.3 ×10⁶ Chiron bDNA Eq로 감염시켰다. 접종물을 웰중 최종 농도를 첨가 혈청의 20∼30%, 또는 1.2 ×10⁶∼2.8 ×10⁶ Chiron bDNA Eq/㎖가 되도록 선택하였다. 일반적으로 HCV 감염 및 복제를 20일의 기간 동안 관찰하였다. HCV 생성 여부를 분석하기 이전, 항온처리시에는 배지를 2∼3일마다 교체하였다. RT-PCR에 의하여 세포 및 배지중 HCV RNA 복사체의 수를 측정함으로써 HCV 감염 및 복제의 정도를 정량하였다.

RT-PCR 분석법

HCV RNA를 Rneasy-96 방법을 사용하여 세포로부터 추출하거나, 또는 QIAamp 96 Extraction 방법을 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 추출하였다[시약은 미국 캘리포니아 발렌시아 소재 Qiagen으로부터 입수]. 상기 양 방법은 카오트로픽 제제와 실리카 유리를 함께 사용하는 바이러스 RNA의 소규모의 분리 및 농축을 이용하는데, 여기서 상기 실리카 유리는 카오트로픽 염의 존재하에 핵산을 결합시킬 수 있다. 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 세포 용해물(약 10⁶ BVDV 복사체/샘플)에 첨가한후 카오트로픽 용액을 첨가하였다. 유리 섬유 컬럼을 96웰 포맷으로 배열하였다. 핵산 분자를 웰(약 70∼100 uls)로 무RNase 물을 사용하여 용리시켰다. 근 본적으로 BVDV는 ATCC(ATCC 기탁 번호 : VR-534)로부터 입수하였다. 상기 BVDV 대조군은 이러한 방법을 사용하는 분석법에서 일정하였다.

복합 RT-PCR 반응 즉, 2 이상의 상이한 종류의 RNA를 동일 튜브내에서 동시에 증폭 및 측정하는 RT-PCR 반응이 본 실험에 사용되었다. 본원에 사용된 HCV RT-PCR 분석법은 반응당 10개 미만의 복사체에 민감하였으며, 100∼10⁷ 복사체의 범위에서 직선적이었다. 추출된 HCV RNA 샘플 10∼20 ul을 각각의 RT-PCR 분석법에서 시험하였다.

시약 즉, EZ RT-PCR 코어 시약 키트(Applied Biosystems) ; 3M 아세트산망간 ; 각각의 dATP, dCTP, dGTP, dUTP 300 uM ; 400 nM HCV 전방향 프라이머(서열 번호 1) 5'-ccatgaatcactcccctgtg-3' ; 400 nM HCV 역방향 프라이머(서열 번호 2) 5'-ccggtcgtcctggcaattc-3' ; 45 uM BVDV 전방향 프라이머(서열 번호 3) 5'-cagggtagtcgtcagtggttcg-3' ; 및 45 uM BVDV 역방향 프라이머(서열 번호 4) 5'-ggcctctgcagcaccctatc-3' 및 0.1 U/ul Tth 중합효소(Epicentre)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 염료로 태깅되고 HCV RNA 및 BVDV RNA로부터 유래된 핵산 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 RT-PCR로부터 생성된 핵산 생성물[즉, 200 uM FAM HCV 프로브(서열 번호 5) 5'-FAM-cctggaggctgcacgacactca-TAMRA-3' 및 200 uM VIC BVDV 프로브(서열 번호 6) 5'-VIC-ccctcgtccacgtggcatctcga-TAMRA-3']에 대한 프로브로서 사용하였다. ABI 7700 열 순환기(thermal cycler ; Applied Biosystems)에서 동일한 웰에서 역전사효소 및 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 공지량의 HCV RNA 세트에 대해서 RT-PCR 분석법을 동시에 수행하여 샘플을 RT-PCR에 의해서 분석하였으며, 그 결과로부터 표준 곡선을 작성하였다.

각 실험을 위하여, 정량 한계를 결정하였다. 정량 한계는 RNA 최저 농도를 측정함으로써 결정하였으며, RT-PCR 방법에 있어서 추출 및 분석 이후, 표준 곡선의 직선 부분내에 있는 결과값을 얻어냈다. 일반적으로 모든 음성 대조군(즉, HCV를 거의 생성하지 않거나 또는 전혀 생성하지 않는 세포)은 LOQ 이하이어야 한다.

ABI 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)를 이용하여 형광성을 측정하였다. 모든 샘플중 대조군 RNA, BVDV의 존재는 분석법의 RNA 추출 및 RT-PCR 단계가 성공적임을 확인시켜주는 것이다. BVDV 결과는 양성이었다. 그러므로, 음성 HCV 결과를 확실히 확인할 수 있었다.

실시예 3

감염후 배양 배지중 HCV의 경시적 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 태아 세포의 배양액을 제조한후, Mytomycin C 처리된 공급자 STO(Reid-99) 세포층에 도말하였다. 도말된 세포의 수는 2 ×10⁵/웰이었다. HCV(RNA898) 감염된 인간 환자로부터 얻은 혈청을 ProMed Dx로부터 입수하였다. 대조군으로서, 시험될 다른 세포 샘플은 혈청을 함유하지 않았다. 300 uls 분취량의 HCV 환자 혈청을 첨가하여 배양 배지 0.7 ㎖를 분리하였다. 배양액을 바이러스와 함께 24 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 접종물을 제거하고, 상기 배양액을 1 ㎖ 배지로 세정한 다음, 신선한 배지중에서 배양하였다. 배 양 상청액을 샘플링한후 각 배지를 교체(2∼3일마다)하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 정량적 복합 HCV 특이적 RT-PCR 분석법을 사용하여 HCV RNA를 측정하였다. 상청액 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 600 HCV RNA 복사체/샘플이었다.

도 1은 세포 배양 상청액의 RT-PCR 분석법의 결과를 나타내는 것이다. 도 1은 RNA898로 다량 감염되었음을 나타낸다. 음성 대조군 혈청은 HCV RNA를 생성하지 않았다. 모든 음성 대조군은 LOQ 이하였다.

실시예 4

감염후 배양 배지중 HCV의 경시적 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 태아 세포의 배양액을 제조한후, Mytomycin C 처리된 공급자 STO(Reid-99) 세포층에 도말하였다. 도말된 세포의 수는 4 ×10⁵/웰이었다. HCV(RNA898) 감염된 인간 환자로부터 얻은 혈청 및 HCV로 감염되지 않은 인간 환자로부터 얻은 혈청(음성 대조군 혈청)을 ProMed Dx로부터 입수하였다. 200 ul 분취량의 HCV 환자 혈청을 첨가하여 배양 배지 0.8 ㎖를 분리하였다. 이는 약 1.9 ×10⁶ Chiron bDNA Eq/웰을 나타낸다. 세포 배양액을 바이러스와 함께 24 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 접종물을 제거하고, 상기 배양액을 1 ㎖ 배지로 세정한 다음, 신선한 배지중에서 배양하였다. 배양 상청액을 1 ㎖의 배지로 세정한 다음, 신선한 배지중에서 배양하였다. 배양 상청액을 샘플링한후 각 배지를 교체(2∼3일마다)하고 실시예 2에 기술된 바와 같은 정량적 복합 HCV 특이 적 RT-PCR 분석법을 사용하여 HCV RNA를 측정하였다. 상청액 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 600 HCV RNA 복사체/샘플이었다.

도 2 및 도 3은 세포 배양 상청액의 RT-PCR 분석법의 결과를 나타내는 것이다. 이는 RNA898로 다량 감염되었음을 나타낸다. 음성 대조군 배양액은 HCV RNA를 생성하지 않았다. 도 2 및 도 3은 이러한 HCV 분석법의 고수준 생산성의 일례로서, 유사한 HCV 분석법을 이용할 경우에는 얻을 수 없는 결과이다.

실시예 5

HCV 감염후 세포 결합 HCV RNA의 경시적 분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 태아 세포의 배양액을 제조한후, Mytomycin C 처리된 공급자 STO(Reid-99) 세포층에 도말하였다. 도말된 세포의 수는 4 ×10⁵/웰이었다. 이는 약 1.9 ×10⁶ Chiron bDNA Eq/웰을 나타낸다. 200 ul 분취량의 RNA898 혈청(또는 음성 대조군 혈청, 나타내지 않음)을 배양 배지 0.8 ㎖에 첨가하였다. 배양액을 바이러스와 함께 24 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 접종물을 제거하고, 상기 배양액을 1 ㎖ IM-세정 배지로 2회 세정한 다음, 배양액에 신선한 IM-HDM 배지를 공급하거나 또는 용해 완충액으로 파괴하여 수집하였다. 배양액을 유사하게 세정한 다음, 감염후 2일, 3일, 6일 및 8일째 되는 날에 공급 또는 수집하였다. Rneasy 방법(Qiagen)을 사용하여 저장된 용해물로부터 전체 RNA를 추출하였다. 정량적 복합 HCV 특이적 RT-PCR 분석법을 사용하여 HCV RNA를 측정하였다. 세포 결합 RNA 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계(----LOQ)는 100 HCV RNA 복사체/샘플이었다. 모든 음성 대조군 배양액은 HCV RNA가 없었다(데이터는 나타내지 않음).

도 4는 세포 결합 RNA의 RT-PCR 분석법의 결과를 나타내는 것이다. 감염후 2일 및 3일 경과후에 세포 결합 HCV RNA의 농도가 가장 높았으며, 상당량의 HCV RNA는 감염후 6일째에 여전히 존재하였다. 1∼3일째 되는 날에 외부 접종물을 제거하였을때 HCV RNA가 증가하였으며, 이는 상기 HCV가 세포내에서 복제하였음을 나타내는 것이다.

실시예 6

항바이러스성 제제 VRT-106866에 의한 인간 태아 간 세포의 HCV 감염의 억제

실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 태아 세포의 배양액을 제조한후, Mytomycin C 처리된 공급자 STO(Reid-99) 세포층에 도말하였다. 도말된 세포의 수는 4 ×10⁵/웰이었다. 200 ul 분취량의 RNA898 혈청(또는 음성 대조군 혈청, 나타내지 않음)을 배양 배지 0.8 ㎖에 첨가하고 이를 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 24 시간 경과후, 배지를 제거하고, 배양액을 세정한 다음, 배양 배지를 상이한 농도의 화합물 VRT-106866(0∼10 uM)을 함유하는 IM-HDM으로 교체하였다. 각각의 억제제 농축물을 3중으로 시험하였으며, 양성 대조군(억제제 불포함)은 6중으로 시험하였다. 억제제 존재하에 48 시간 동안 항온 처리한후, 상청액을 제거하고 동일한 농도의 억제제를 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. 3일 더 경과한후, 배양 배지를 분리하고, 배양액을 세정한 다음, 세포 단일층을 용해 완충액으로 파괴시키고 실시예 2에 기재한 바와 같이 Rneasy 방법(Qiagen)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 정량적 복합 HCV 특이적 RT-PCR 분석법을 사용하여 샘플중 HCV RNA를 측정하였다. 세포 결합 RNA 샘플에 대한 RT-PCR 분석법의 정량 한계는 100 HCV RNA 복사체/샘플이었다.

도 5는 3개의 배양액으로부터 얻은 "대조군 HCV RNA %"(샘플값/양성 대조군 값의 평균)의 평균 및 표준 편차를 그래프로 나타낸 것이다. 도 5는 VRT-106866이 HCV 감염의 효과적인 억제제임을 나타내는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> VERTEX PHARMACEUTICALS INCORPORATED <120> COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR HCV INFECTION <130> VPI/01-05 PCT <140> PCT/US02/09685 <141> 2002-03-27 <150> 60/279,174 <151> 2001-03-27 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 ccatgaatca ctcccctgtg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ccggtcgtcc tggcaattc 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 cagggtagtc gtcagtggtt cg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ggcctctgca gcaccctatc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 5 cctggaggct gcacgacact ca 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 6 ccctcgtcca cgtggcatct cga 23

Claims

수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 간 세포 및 조혈 세포를 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV) 감염에 사용하기 위한 세포 혼합물로서, 상기 세포 혼합물의 각각의 성분은 40 ㎛의 필터를 통과할 수 있는 크기를 갖는 것인 세포 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 간 세포 및 조혈 세포는 수태후 3개월∼6개월이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 것인 세포 혼합물.
제1항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 알파 태아 단백질을 발현하는 세포, 알부민을 발현하는 세포, 및 글리코포린을 발현하는 세포를 추가로 포함하나, CD34 단백질을 발현하는 검출가능한 세포는 존재하지 않는 것인 세포 혼합물.
제3항에 있어서, 임의의 CD34 단백질의 존재는 면역형광 염색 또는 면역과산화효소 염색에 의하여 검출되는 것인 세포 혼합물.
칼슘, 유리 지방산(FFA), 고밀도 리포단백질(HDL), 니코틴아미드, 미량 원소, 상피 성장 인자(EGF), 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 포함하고, 필요에 따라서는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분들 중 임의의 하나를 추가로 포함하는 무혈청 배지, 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 혼합물을 포함하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 저밀도 리포단백질(LDL)을 포함하지 않는 것인 조성물.
무혈청 배지 및 세포 혼합물을 포함하는 HCV 감염에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 다음의 단계들에 의하여 제조되는 것인 조성물:

(a) 수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 세포로부터 크기 40 ㎛ 이상인 물질을 제거하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 세포로부터 적혈구를 제거하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)의 세포를 칼슘, FFA, HDL, 니코틴아미드, 미량 원소, EGF, 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 포함하고, 필요에 따라서는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분들 중 임의의 하나를 추가로 포함하는 무혈청 배지에 재현탁시키는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 단계.
다음의 단계들을 포함하는 HCV 감염에 사용하기 위한 세포 혼합물을 분리 및 배양하는 방법:

(a) 수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 세포로부터 크기 40 ㎛ 이상인 물질을 제거하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 세포로부터 적혈구를 제거하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)의 세포를 칼슘, FFA, HDL, 니코틴아미드, 미량 원소, EGF, 인슐린, 트랜스페린 및 히드로코르티손을 포함하고, 필요에 따라서는 글루카곤, 간 성장 인자, 에탄올아민 및 티로트로핀 방출 인자, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분들 중 임의의 하나를 추가로 포함하는 무혈청 배지에 재현탁시키는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 무혈청 배지에서 세포를 배양하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 적혈구는 현탁된 세포를 저속(50×g)으로 3∼4분 동안 원심분리시켜 더 큰 세포를 펠렛화시키고, 펠렛화된 세포를 세정하며, 상기 원심분리 및 세정 단계를 반복함으로써 제거되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 무혈청 배지는 저밀도 리포단백질(LDL)을 함유하지 않는 것인 방법.
a. 수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 간 세포 및 조혈 세포를 포함하는 세포 혼합물;

b. 세포외 매트릭스 및 확산성 인자를 제공할 수 있는 공급자 세포; 및

c. C형 간염 바이러스("HCV")

를 포함하는 HCV 감염에 사용하기 위한 조성물.
제11항에 있어서, 상기 간 세포 및 조혈 세포는 수태후 3개월∼6개월이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 것인 조성물.
제11항에 있어서, 상기 HCV는 RNA898인 조성물.
(a) 수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 간 세포 및 조혈 세포를 포함하는 세포 혼합물로서, 상기 세포 혼합물의 각각의 성분은 40 ㎛의 필터를 통과할 수 있는 크기를 갖는 것인 세포 혼합물; 및

(b) 세포외 매트릭스

를 포함하는 HCV 감염에 사용하기 위한 조성물.
(a) 수태후 3개월∼출생후 1년이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 간 세포 및 조혈 세포를 포함하는 세포 혼합물로서, 상기 세포 혼합물의 각각의 성분은 40 ㎛의 필터를 통과할 수 있는 크기를 갖는 것인 세포 혼합물; 및

(b) 세포외 매트릭스 및 확산성 인자를 제공할 수 있는 공급자 세포

를 포함하는 HCV 감염에 사용하기 위한 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 간 세포 및 조혈 세포는 수태후 3개월∼6개월이 경과한 인간의 간으로부터 유래된 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898("RNA898", 미국 버지니아 20110-2209 마네사스 유니버시티 불레바드 10801에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 2001년 3월 27일자로 기탁됨; ATCC 기탁 번호 PTA-3237) 투여 후 72 시간 후에 5,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 세포 혼합물.
제17항에 있어서, HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 10,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것인 세포 혼합물.
제17항에 있어서, HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 50,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것인 세포 혼합물.
제7항 또는 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 5,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제20항에 있어서, HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 10,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것인 조성물.
제20항에 있어서, HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 50,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포 혼합물에 HCV인 RNA898을 투여하는 단계를 포함하는 C형 간염 바이러스(HCV)로 세포를 감염시키는 방법으로서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 5,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항, 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물에 HCV인 RNA898을 투여하는 단계 또는 제13항의 조성물을 배양하는 단계를 포함하는, HCV로 세포를 감염시키는 방법으로서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 5,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 10,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 10,000 복사체 이상의 HCV RNA를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 50,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 세포 혼합물은 4×10⁵개의 상기 세포에 HCV인 RNA898 투여 후 72 시간 후에 50,000 복사체 이상의 HCV RNA가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, HCV인 RNA898이 세포 혼합물에 투여되고, 세포의 세정 전에 1 ㎠ 당 0.52 ㎖의 부피로 37℃에서 24 시간 동안 항온처리되는 것인 방법.
제24항에 있어서, HCV인 RNA898이 조성물에 투여되고, 세포의 세정 전에 1 ㎠ 당 0.52 ㎖의 부피로 37℃에서 24 시간 동안 항온처리되는 것인 방법.
HCV를 추가로 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포 혼합물 또는 제7항, 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
제31항에 있어서, 상기 HCV는 RNA898인 세포 혼합물 또는 조성물.
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포 혼합물 또는 제7항, 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 HCV로 감염시키거나, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 배양하는 단계;

(b) 세포, 세포가 배양된 배지, 또는 세포 및 배지 모두와 결합된 HCV RNA의 존재를 측정하는 단계

를 포함하는 HCV 감염 분석 방법.
제33항에 있어서, HCV RNA의 양은 (a) 세포 또는 세포가 배양된 배지와 결합하여 존재하는 HCV RNA의 양과 (b) 내부 대조군으로 사용된 비-HCV로부터의 바이러스 RNA의 양을 비교함으로써 측정되는 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 비-HCV는 소 바이러스성 설사 바이러스(Bovine Viral Diarrhea Virus; BVDV)인 방법.
다음의 단계를 포함하는 HCV의 생성에 영향을 주는 화합물의 능력을 평가하는 방법:

(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포 혼합물 또는 제7항, 제14항 또는 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 HCV로 감염시키거나, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 배양하는 단계;

(b) 세포가 HCV와 접촉하기 이전 또는 이후에 상기 세포 혼합물 또는 상기 조성물에 상기 화합물을 투여하는 단계; 및

(c) 세포, 세포가 배양된 배지, 또는 세포 및 배지 모두와 결합된 HCV의 존재를 측정하는 단계.
제36항에 있어서, 상기 화합물은 HCV 생성을 억제하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 다수의 화합물이 HCV 생성을 억제하는 능력에 대하여 동시에 스크리닝되는 것인 방법.
제36항에 있어서, 상기 단계 (c)의 측정 결과를 대조군 세포, 대조군 세포가 배양된 배지, 또는 대조군 세포 및 배지 모두와 결합된 HCV의 양과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법으로서, 상기 대조군 세포에 대해서 화합물이 투여되지 않거나 HCV를 억제하지 않는다고 공지된 화합물이 투여되는 것을 제외하고는 단계 (a)∼(c)를 수행하는 것인 방법.
제36항에 있어서, 상기 HCV의 존재는 세포 또는 세포가 배양된 배지와 결합된 HCV RNA의 양을 측정함으로써 측정되는 것인 방법.
제40항에 있어서, 상기 HCV RNA의 양은 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의하여 측정되는 것인 방법.
제41항에 있어서, 상기 HCV RNA의 양은 (a) 세포 또는 세포가 배양된 배지와 결합된 HCV RNA의 양과 (b) 내부 대조군으로 사용된 비-HCV로부터의 바이러스 RNA의 양을 비교함으로써 측정되는 것인 방법.
제42항에 있어서, 상기 비-HCV는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)인 방법.