KR100946275B1

KR100946275B1 - 수 난용성 캄토테신 유도체의 미세 나노입자 및 그의제조방법

Info

Publication number: KR100946275B1
Application number: KR1020070095664A
Authority: KR
Inventors: 강혜원; 임은영; 서민효
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2010-03-08
Also published as: JP2010504960A; US20100008998A1; CA2663558A1; CN101516346B; CA2663558C; CN101516346A; WO2008038944A1; KR20080028289A; EP2086513A4; EP2086513B1; EP2086513A1; JP5027885B2

Abstract

본 발명은 캄토테신 유도체, 고상 폴리에틸렌글리콜, 및 회합방지제를 포함하는 나노입자 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 수난용성인 캄토테신 유도체를 폴리에틸렌글리콜에 고체분산시키고 회합방지제를 포함하는 수용액 중에 용해시킨, 캄토테신 유도체의 나노입자를 포함하는 조성물을 제조함으로써, 체액에서 캄토테신 유도체의 락톤 형태를 안정하게 유지시켜 효과적인 항암 활성을 나타낼 수 있다.

캄토테신 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 나노입자

Description

수 난용성 캄토테신 유도체의 미세 나노입자 및 그의 제조방법 {Submicron nanoparticle of poorly water soluble camptothecin derivatives and process for preparation thereof}

본 발명은 캄토테신 유도체, 고상 폴리에틸렌글리콜, 및 회합방지제를 포함하는 나노입자 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수 난용성인 캄토테신 유도체를 고상 폴리에틸렌글리콜에 고체분산시키고, 회합방지제를 포함하는 수용액 중에 용해시켜 캄토테신 유도체의 나노입자를 포함하는 조성물을 제조함으로써, pH 4 내지 7 수용액에서 생리 활성을 갖는 캄토테신 유도체의 락톤 형태를 안정하게 유지시켜 항암제 및 세포분열과 관련된 질환의 치료에 사용하는 것에 관한 것이다.

7-에틸-10-히드록시캄토테신은 SN-38로 알려진 물질로서, 시판중인 항암제 이리노테칸 (CPT-11)의 활성 대사체이고, 세포분열 과정에 관여하는 효소 토포아이소머라제 I 과 결합하여 세포분열 과정 중의 DNA 합성을 억제하여 세포를 사멸시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

그러나 SN-38은 물에 대한 용해도가 10 μg/ml 이하로 임상제품으로 개발하기 어렵다. 이와 같은 이유로 SN-38을 프로드럭화 하여 물에 대한 용해도를 높인 CPT-11이 개발되어 상품화되었다. CPT-11은 인체에 투여된 후 간 또는 암세포 내에서 효소 카르복시에스터라제에 의해서 대사되어 생리활성을 갖는 SN-38로 전환됨으로써 항암효력을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 그러나, CPT-11이 인체 내에서 활성을 갖는 SN-38로 전환되는 비율은 10% 이내에 불과한 것으로 알려져 있다.

한편 SN-38은 CPT-11보다 토포아이소머라제 I을 억제하는 활성이 약 1,000배 이상 높고, In vitro 세포독성도 2,000 배 이상 우수한 것으로 알려져 있다.

또한, SN-38은 수용액에서 pH에 따라서 산성 조건에서는 활성을 갖는 락톤 형태로 존재하나 염기성 조건에서는 비활성인 카르복시 음이온 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 다만, SN-38의 카르복시 음이온 형태는 물에 4 mg/ml 이상 녹을 수 있으나 활성형인 락톤 형태는 물에 대한 용해도가 10 μg/ml 이하 인 것으로 알려져 있다.

따라서 SN-38을 임상적으로 유의한 농도 이상으로 가용화할 수 있으면, 매우 우수한 항암제로 개발될 수 있다. 이와 같은 이유로 SN-38을 인체내에 투여하기 위한 SN-38 함유 조성물에 대한 연구가 수행되었다.

미국특허 제5447936호, 제5859023호, 제5674874호, 제5958937호, 제5900419호 등에서 SN-38을 디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸이소소르비드 등의 극성 유기용매에 녹인 조성물을 개시하였다. 그러나, 이와 같은 극성 유기용매는 인체에 사용할 수 있는 양이 제한되어 있을 뿐 아니라, 물과 혼합시 약물이 석출되 는 문제점이 있어 혈관으로 주사하는 것도 극히 제한되어 있다. 또한 유기용매에 가용화된 조성물은 pH 7.4의 생체조건에 노출되면 즉시 SN-38의 활성에 필수적인 락톤이 카르복시 음이온 형태로 파괴되는 단점이 있다.

한편 미국특허공개 제20030215492호에서는 SN-38을 리피드와 착물을 형성시켜 리포좀 제제화한 조성물을 개시하고 있다. 상기 문헌에서는 pH 8~10 범위의 수용액에서 카르복시 음이온 형태의 SN-38을 형성시키고 이를 리포좀 제제화한 다음, pH를 산성조건으로 하여 락톤 형태의 SN-38을 제조하는 형태를 개시하고 있다. 또한 국제특허공개 제WO2002/58622호에서 SN-38을 함유하는 리포좀 조성물 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 미국특허공개 제2004/0009229호는 캄토테신 유도체를 고분자, 리피드 등의 안정화제와 복합체를 형성시킨 나노 입자 조성물을 개시하고 있다. 상기 문헌에서는 입자크기가 수십에서 수백 나노미터인 나노입자가 수용액 중에 안정하게 현탁되어 있는 조성물을 제공함에 있어서, SN-38을 가열 또는 분쇄하는 방법을 사용하지 않고, 고분자 또는 리피드와 SN-38의 복합체를 형성시켜 SN-38/고분자 또는 SN-38/리피드 복합체의 나노입자를 형성하였다. 그러나, 상기 개시된 문헌들에서는 캄토테신의 락톤이 안정하게 유지되는지에 관한 언급이 없고, SN-38을 고분자 또는 리피드 등과 복합체(착물)을 형성시켜야 하기 때문에 제조 공정이 매우 복잡한 문제점이 있다.

더욱이, 캄토테신 유도체, 특히 SN-38은 물에 대한 용해도가 매우 낮아서 제제화 하기 어려우며, 통상의 가용화 기술로 가용화 하였을 때, 체액 (pH 7.4)에서 쉽게 비 활성형인 카르복시 음이온형태로 변화되는 문제점이 있다.

이에 본 발명자는 캄토테신 유도체를 고상의 폴리에틸렌글리콜에 고온으로 용융시킨 후 급속 냉각시키고, 물에 용해시켰을 때, SN-38의 나노입자가 제조되어 체액에서 락톤형태가 안정하게 유지되는 것을 확인하고, 이에 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명은 캄토테신 유도체를 분쇄 또는 고분자 등과 복합체를 형성시키지 않고, 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜에 고체분산시킨 후 물에 폴리에틸렌글리콜을 용해시켜서 캄토테신 유도체의 나노입자를 수용액에서 효과적으로 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 캄토테신 유도체를 임상적으로 인체 적용 가능한 제제로 개발하는 것으로, 캄토테신 유도체를 미세 나노 입자화하여 혈관주사로 생체 투여하였을 때 극성 유기용매 또는 미셀 등으로 가용화시킨 종래의 조성물 보다 우수한 혈중 락톤 안정성을 보이는 것을 확인할 수 있다.

본 발명은 캄토테신 유도체, 고상 폴리에틸렌글리콜, 및 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제 중에서 선택된 회합방지제를 포함하는, 캄토테신 유도체의 나노입자 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (a) 고상 폴리에틸렌글리콜에 캄토테신 유도체를 용융시키는 단계;

(b) 상기 (a)에서 얻은 용융액을 냉각시켜 고체분산체를 형성시키는 단계; 및

(c) 상기 (b)에서 얻은 고체분산체를 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제의 수용액에 용해시키는 단계를 포함하는 캄토테신 유도체의 나노입자 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 나노입자 조성물은, 난용성 캄토테신 유도체의 나노입자 현탁액으로, 주사용수 또는 생리 식염수와 같은 수용액으로 희석 또는 재 구성시 활성형의 락톤 형이 비 활성형으로 전환되는 것이 지연되는 특징이 있다. 또한 본 발명은 난용성 캄토테신 유도체의 가용화, 나노 크기의 입자 제조에 관한 기술 및 항암 치료의 새로운 제제 개발이라는 의미를 가진다.

이하에서, 본 발명에 따른 캄토테신 유도체 함유 나노입자 조성물 및 그의 제조방법에 관하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 나노입자 조성물은 1) 활성성분으로서 수난용성인 캄토테신 유도체, 2) 분산매로서 고상 폴리에틸렌글리콜, 및 3) 회합방지제로서 고상 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제를 포함한다.

본 발명에서, ‘나노입자’는 분산된 약물을 함유한 나노 크기의 작은 입자 로서, 크기가 작아 모세관이나 주사바늘에서 폐쇄가 일어나지 않으므로 정맥주사가 가능한 제제 형태이다. 본 발명에 따른 ‘캄토테신 유도체의 나노입자 조성물’은 캄토테신 유도체를 포함하는 나노입자가 수용액 상에 현탁된 형태의 조성물로, 이 때 나노입자의 입자크기는 바람직하게는 100 내지 1000 nm이다.

본 발명의 활성성분인 난용성의 캄토테신 유도체는 물에 대한 용해도가 10 μg/ml 이하로, 특별한 가용화 기법을 사용하지 않고는 임상적으로 사용이 불가능한 캄토테신 유도체로서 실질적으로 캄토테신의 락톤 형태를 갖는 화합물이다. 본 발명에 따른 캄토테신 유도체는 바람직하게는 캄토테신 또는 7-에틸-10-하이드록시캄토테신(SN-38) 이다.

본 발명의 고상 폴리에틸렌글리콜은 캄토테신 유도체를 분산시키기 위한 분산매로서 사용하는 것으로, 실온에서 고체 상태로, 녹는점이 40 ~ 60 ℃일 수 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜의 중량평균 분자량은 1,500 내지 20,000 달톤이고, 더욱 바람직하기로는 2,000 내지 10,000 달톤, 가장 바람직하기로는 2,000 내지 6,000 달톤이다. 여기서 폴리에틸렌글리콜의 중량평균 분자량이 1,500 이상이어야 실온에서 고체 상태로 존재할 수 있고, 중량평균 분자량이 20,000 달톤을 초과하게 되면 점도가 높아지는 문제가 있어 바람직하지 못 하다. 또한 폴리에틸렌글리콜은 선형 또는 브렌치 구조가 가능하나, 바람직하기로는 선형구조이며, 폴리에 틸렌글리콜의 양 말단기가 히드록시기, 알킬기, 바람직하게는 (C₁ _-4)알킬, 또는 아실기, 바람직하게는 알킬카보닐과 아릴카보닐(예를 들어, 아릴은 폐닐, 나프틸 등을 포함한다), 예를 들어 (C₁ _-18)아실로 보호된 것이 바람직하나, 더욱 바람직하기로는 히드록시기로 보호된 것이다. 특히 본 발명의 실시에 있어서 바람직한 폴리에틸렌글리콜은 수용액에서 pH가 4 내지 8 범위인 것이 바람직하고, pH가 8.0 초과인 것은 SN-38의 락톤을 카르복시기로 변화시키는 역할을 하기 때문에 바람직하지 못하다.

폴리에틸렌글리콜에 대한 캄토테신 유도체 약물의 함량이 높을수록 생성되는 나노입자의 크기가 증가하므로 나노입자의 입자크기를 100 내지 1000 nm로 유지시키기 위해서는 폴리에틸렌글리콜은 캄토테신 유도체의 중량에 대하여 50 내지 1000배로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 나노입자는 필수 성분으로 회합(association) 방지제를 포함한다. 상기 고상 폴리에틸렌글리콜에 캄토테신 유도체를 분산시킨 고체 분산체를 수용액에 현탁하여 방치하면, 나노입자의 회합(association)이 일어나서 입자크기가 증가하는 문제점이 있다. 이러한 나노입자의 회합을 방지하기 위해 본 발명에서는 회합 방지제가 필수적으로 사용된다.

이러한 회합 방지제로서 고상 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제가 바람직하다. 여기서, 고상 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제는 실온에서 고상이어야 하는데, 이는 장기 보관 시 안정성 유지를 위해 최종적으로 나노입자 조성물을 동결건조시키는 것이 바람직하고 이를 위해서는 회합방지제가 실온에서 고상이어야 하기 때문이다. 이들 회합 방지제는 바람직하게는 녹는점이 30 ℃ 이상이고, 물에 대한 용해도가 1 mg/ml 이상이며, 수용액에서 미셀을 형성하여야 하고, 인체 사용시 과민반응 등의 독성이 없어야 한다.

이와 같은 조건에 부합하는 양친성 블록 공중합체는 친수성 블록(A)의 중량평균 분자량이 1,000 내지 10,000 달톤이고, 소수성 블록(B)의 중량평균 분자량이 500 내지 10,000 달톤인 A-B형 이중 블록 공중합체인 것이 바람직하다. 각 블록의 중량평균 분자량의 하한치는 블록 공중합체가 미셀을 형성할 수 있는 최소한의 분자량이고, 각 블록의 중량평균분자량이 10,000 달톤을 초과할 경우 고점도로 인해 용액상태를 유지하기 어려울 뿐 아니라 인체에 투여 후 혈액 중에서 분해되는 시간이 장시간 소요되어 독성을 유발할 우려가 있어 바람직하지 못 하다.

상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)은 에스테르 결합에 의해서 A-B형태로 결합된 것이 특히 바람직하며, 친수성 블록(A) 대 소수성 블록(B)의 중량비는 10~90%:90~10%일 수 있다. 바람직하게는, 상기 친수성 블록(A)이 폴리에틸렌글리콜 또는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜이고, 소수성 블록(B)이 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리다이옥산-2-온, 및 락트산과 1,4-다이옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된다.

특히, 양친성 블록 공중합체 A-B의 소수성을 보다 증가시켜 캄토테신 유도체와의 친화성을 향상시키기 위하여 소수성 블록(B)의 말단에 라우릭산, 팔미토익산, 스테아릭산, 올레익산, 토코페롤 숙신산 및 콜레스테롤 숙신산으로 이루어진 군에서 선택된 하나가 에스테르 결합에 의해서 부가될 수 있으며, 바람직하게는 토코페롤 숙신산이 도입될 수 있다.

상기 양친성 블록 공중합체의 함량은 캄토테신 유도체의 중량에 대하여 1 내지 400 배가 바람직하며, 보다 바람직하기로는 10 내지 200 배인 것이다.

또한 상기 회합 방지제의 바람직한 일성분인 고상 계면활성제는 실온에서 고상인 비이온성 계면활성제로서, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 토코페롤 숙신산 에스테르(TPGS)이고, 상기 폴리에틸렌글리콜의 중량평균 분자량이 1,000 내지 5,000 달톤인 화합물이 적합하다. 여기서, 폴리에틸렌글리콜의 중량평균 분자량이 1,000 이상이어야 실온에서 고체 상태로 존재할 수 있고, 중량평균 분자량이 5,000 달톤을 초과하게 되면 점도가 높아지는 문제가 있어 바람직하지 못 하다. 따라서, 인체에 약리학적으로 사용 가능한 계면활성제로 일반적으로 사용되는 폴리소르베이트, 크레모포아 등은 모두 실온에서 액체상태이기 때문에 본 발명의 나노입자의 회합방지제로서 사용하기에 부적합하다.

상기 고상 계면활성제의 함량은 캄토테신 유도체의 중량에 대하여 1 내지 400 배가 바람직하며, 보다 바람직하기로는 10 내지 200 배인 것이다.

본 발명의 나노입자는 투여 목적으로 다양한 약제학적 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 나노입자를 약제학적으로 허용되는 담체와 밀접히 혼합하여 항암용 조성물의 제조가 가능하다. 이들 약제학적 조성물은 전신 작용, 또는 국부 작용을 위하여 경구, 비경구, 피하, 직장 또는 국소적으로 투여되는, 단위 투여형인 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체로서, 경구 액체 약제학적 제제의 경우에 예를 들어 물, 글리콜, 오일, 알콜 등의 보통 약제학적 매질이 이용될 수 있고, 경구 고체 약제학적 제제의 경우에 전분, 슈가, 카올린, 윤활제, 결합제, 붕해제 등과 같은 부형제가 이용될 수 있다. 주사 약제학적 조성물 경우, 담체는 예를 들어 용해도를 돕기 위하여 반극성 용매와 같은 다른 성분이 포함될 수 있지만, 적어도 상당 부분 멸균수를 포함한다. 주사 용액용 담체의 예는 염수 용액, 글루코즈 용액 또는 염수와 글루코즈의 혼합물을 포함한다. 주사 현탁제의 제조 경우, 적절한 액체 담체, 현탁화제 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자 조성물의 제조 방법은 (a) 고상 폴리에틸렌글리콜에 캄토테신 유도체를 용융시키는 단계;

(c) 상기 (b)에서 얻은 고체분산체를 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제의 수용액에 용해시키는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서, 난용성 캄토테신 유도체를 고상 폴리에틸렌글리콜과 혼합하고, 바람직하게는 60 ~ 180 ℃ 범위의 온도로 가열하면서 잘 교반하여, 캄토테신 유도체를 고상 폴리에틸렌글리콜에 용융시킨다. 이 때, 용융 온도가 60℃ 이상 이 되어야 고상 폴리에틸렌글리콜이 용융되고, 계속 교반함으로써 난용성 캄토테신 유도체가 폴리에틸렌글리콜에 용해될 수 있고, 180℃ 이하여야 캄토테신 유도체 및 폴리에틸렌글리콜이 분해되지 않고 안정한 상태로 용융될 수 있다. 폴리에틸렌글리콜에 대한 캄토테신 유도체의 용해도를 고려하여 캄토테신 유도체가 완전히 용해되는 비율로 고상 폴리에틸렌글리콜을 혼합하여야 하며, 바람직하게는 캄토테신 유도체 중량에 대하여 고상 폴리에틸렌글리콜 중량이 50 내지 1000 배가 되도록 혼합한다.

한편, 난용성인 캄토테신 유도체를 고상 폴리에틸렌글리콜에 효과적으로 용융시키기 위하여 상기 용융 단계 중에, 끓는점이 낮은 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 또는 아세토니트릴로부터 선택되는 유기용매를 임의적으로 처리할 수 있으며, 적량의 유기용매를 가하여 캄토테신 유도체와 고상 폴리에틸렌글리콜이 용해된 용액을 제조한 다음 감압하에서 유기용매를 제거할 수 있다. 이때 유기용매를 제거한 후에도 계속해서 60 ~ 180 ℃ 범위의 온도로 가열하면서 교반하여 캄토테신 유도체가 폴리에틸렌글리콜에 용융된 상태를 양호하게 유지하게 할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 상기 (a)에서 얻은 폴리에틸렌글리콜에 캄토테신 유도체가 용융된 용융액을 바람직하게는 0 ℃ 이하의 온도로 급속 냉각시켜 고체분산체를 형성시킨다. 이때 가능하면 빠른 속도로 냉각시키는 것이 바람직하며, 예를 들어 액체질소를 이용할 수 있다. 상기에서 천천히 냉각시키면, 폴리에틸렌글리콜이 결정화되면서 생성되는 난용성 캄토테신 유도체의 입자크기가 증가되는 문제가 발생한다.

상기 (c) 단계에서, 상기 (b)에서 얻은 고체분산체를 양친성 블록 공중합체 또는 고상 계면활성제 중에서 선택된 회합방지제를 포함하는 수용액에 용해시켜 캄토테신 유도체의 나노입자가 현탁된 수용액을 얻는다. 이때, 폴리에틸렌글리콜은 수용액에 용해되나, 폴리에틸린글리콜에 분산된 캄토테신 유도체는 물에 용해되지 않기 때문에, 폴리에틸린글리콜은 용해되고, 나노입자 크기로 분산된 캄토테신 유도체는 수용액에 현탁된다. 이때 수용액의 pH가 7.5 이상의 알칼리가 되면, 난용성 캄토테신 유도체의 카르복시 음이온 형태가 생성되기 때문에 이를 방지하기 위하여 나노입자 수용액의 pH를 4 ~ 7 범위의 약산성을 유지하는 것이 바람직하다. pH 조절제로는 구연산, 아세트산, 주석산, 탄산, 젖산, 황산, 인산 또는 그 나트륨 염과 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 암모늄염이 바람직하고, 가장 바람직하기는 젖산을 사용한다.

상기에서 제조된 캄토테신 유도체 나노입자 현탁액 중 캄토테신 유도체의 농도는 0.1 ~ 4 mg/ml 범위가 가능하나, 바람직하기로는 0.2 ~ 2 mg/ml 범위이다.

한편, 상기 캄토테신 유도체가 고상 폴리에틸렌글리콜에 분산된 고체분산체를 상기 회합방지제 함유 수용액에 용해시켜 캄토테신 유도체의 나노입자가 현탁된 수용액을 제조할 경우, 상기 회합방지제 함유 수용액은 회합방지제가 1 ~ 200 mg/ml의 농도로 가용화되고, pH는 4.0 ~ 7.0의 범위인 것이 바람직하다. 이때 고상 폴리에틸렌글리콜이 물에 용해되는 속도를 증가시키기 위하여 0 내지 60℃ 범위의 온도로 증가시키는 것이 가능하다. 바람직하기로는 30 ℃ 이하의 온도에서 용해시키며, 이 경우 폴리에틸렌글리콜의 물에 대한 용해속도를 증가시키고, 난용성 캄토 테신 유도체 나노입자의 균일한 분산을 유도하기 위하여 초음파를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 바람직하게는 (c) 단계에서 얻어진 수용액을 동결건조시키는 (d) 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (d) 단계에서, (c) 단계에서 제조된 캄토테신 유도체 나노입자가 현탁된 수용액을 동결건조시키며, 이 때, 바람직하게는 상기 수용액 조성물에 동결건조 보조제로 락토스, 만니톨, 솔비톨 중의 하나를 가하여 용해시킨 후 동결 건조시킨다.

상기 방법에 의해 제조된 본 발명에 따른 나노입자는 동결 건조된 형태로서 사용시 주사용수 또는 생리 식염수에 희석 또는 재건하여 사용할 수 있다. 본 발명의 나노입자를 주사용수, 생리식염수, 5 % 덱스트로스 등의 용액으로 캄토테신 유도체의 농도가 0.1 ~ 1.0 mg/ml가 되도록 재건하였을 때, 캄토테신 유도체의 활성형인 락톤형태가 실질적으로 100 % 존재하는 용액으로서 경구 또는 비경구 경로로 투여하는 것이 가능하다.

하기 실시예들은 당업자가 본 발명을 실시하는 방법을 보다 명확히 이해할 수 있도록 할 것이다. 본 발명을 바람직한 구체적 태양으로 설명하지만 하기하는 것은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명의 다른 측면들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.

제조예 1

모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락타이드 (mPEG- PLA ) 블록 공중합체 (AB타입) 중합

500 g의 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (중량 평균 분자량 (Mw): 2,000)을 100ml 2구 둥근바닥 플라스크에 가하고, 2 내지 3시간 동안 감압 하에 100℃로 가열하여 탈수하였다. 반응 플라스크에 건조 질소를 채우고, 주사기를 이용하여 반응 촉매인 스테이너스 옥토에이트 (Sn(Oct)2)를 D,L-락타이드의 0.1 중량 % (1g, 2.5mol)로 가하고, 30분 동안 교반한 후 130℃에서 1시간 동안 감압 (1mmHg)하여 촉매를 용해시킨 용매(톨루엔)을 제거하였다. 정제한 락타이드 1375g을 가한 후, 130℃에서 18시간 가열하였다. 생성된 고분자를 메틸렌 클로라이드에 용해시킨 후 디에틸 에테르에 가하여 고분자를 석출시켰다. 얻어진 고분자를 진공 오븐에서 48시간동안 건조하였다. 얻어진 mPEG-PLA는 1,765-2,000 달톤의 중량평균 분자량을 가졌고, 1H-NMR에 의해 AB타입인 것으로 확인되었다(도 1).

제조예 2

mPEG- PLA -토코페롤 숙시네이트 합성

제조예 1에서 합성한 mPEG-PLA(10g)와 토코페롤 숙시네이트 (Sigma사, 1.55g; 고분자의 1.2배 몰수)를 아세토 니트릴 용매 (50ml)하에서 디사이클로헥실카보디이미드(DCC;0.76g)와 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP;0.045g)을 촉매로 사용하 여 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후, 부산물인 디사이클로헥실카보우레아(DCU)를 글래스 필터로 여과하여 제거하였다. 잔류하는 촉매는 염산 수용액으로 추출하여 제거하였다. 이렇게 정제된 생성물 용액에 마그네슘 설페이트를 가하여 잔류하는 수분을 제거한 후, n-헥산/디에틸에테르(v/v=7/3) 공용매에 침전시켜 재결정화한 후, mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트를 얻었다. 침전된 고분자 생성물은 여과한 후, 진공 건조하여 흰색 입자형태 (10g; 수율 88.6%)로 얻었다. 1H-NMR에 의해 합성여부를 확인하였다 (도 2).

제조예 3

mPEG- PLA - 팔미테이트 합성

제조예 1에서 합성된 mPEG-PLA(10g)와 팔미토익 클로라이드를 아세토 니트릴 용매 (50ml)에서 녹인 후 6 시간 동안 환류시켰다. 반응 종결 후, 반응 생성물을 n-헥산/디에틸에테르(v/v=7/3) 공용매에 가하여 mPEG-PLA-팔미테이트을 침전시켰다. 침전된 고분자 침전물을 여과한 후, 진공 건조하여 흰색의 고체를 (12g; 수율 95%) 얻었다.

[실시예]

실시예 1

SN -38/ PEG 4000/ mPEG- PLA -토코페롤 숙시네이트 블록 공중합체 나노입자 제조

SN-38(5 mg) 과 폴리에틸렌글리콜 (분자량 4000 달톤, 1000 mg)을 250 ml 둥근 바닥플라스크에 넣고, 이를 160℃ 기름중탕에 장치하였다. 자석 젓개로 저어 주면서 이 온도에서 2시간 방치하여 SN-38을 폴리에틸렌글리콜에 용융시켰다. 이어서 상기 반응용기를 실온으로 냉각시킨 후 즉시 액체질소에 가하여 급속 냉각시켜 SN-38이 분산된 고상 폴리에틸렌글리콜을 얻었다. 여기에 제조예 2에서 합성한 양친성 이중 블록 공중합체인 mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트가 50 mg/ml 농도로 용해된 수용액 10 ml를 가하고, 초음파를 가하면서 고상 폴리에틸렌글리콜을 용해시키고 SN-38 나노 입자가 현탁된 수용액을 제조하였다. 여기에 락토스모노하이드레이트 500mg을 가하여 용해시키고 수용액의 pH를 4.0 ~ 7.0으로 맞춘 다음, 생성된 SN-38 나노입자 현탁 수용액을 구멍크기 800 nm인 필터로 여과시키고 동결 건조시켜 동결건조 조성물을 제조하였다. 제조된 동결건조 조성물을 주사용수로 재건하여 SN-38 수득률, 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도, SN-38 락톤 함량 및 나노 입자크기를 분석하였다.

시료의 수득률은 적당량의 수성용매 속에서 투석이나 원심분리(30,000xg, 1시간)를 통해 초기 함유된 SN-38의 함량 대비 최종 SN-38수용액에 함유된 SN-38의 함량으로부터 얻었으며, 시료를 메탄올에 녹인 후 HPLC를 사용하여 시료 수용액 중에 SN-38의 농도를 측정하였다. SN-38의 락톤 함량은 C18 Vydac 칼럼을 이용하여 HPLC로 분석 시에 4분대 카복시 음이온 피크와 12분대 락톤 피크의 확인으로부터 얻을 수 있으며, pH 10의 염기성 수용액에서의 카복시 이온의 총 함량 또는 pH 2의 산성 수용액에서의 락톤의 총 함량 대비 SN-38 수용액에서의 락톤의 함량을 계산하여 얻었다.

시료의 입자경은 DLS(dynamic light scattering)방법으로 측정하였다.

- PEG 4000/mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트 블록 공중합체 중량비 : 2/1

- SN-38 수득률: 98 %

- 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도: 0.5 mg/ml

- SN-38 락톤 함량: 100 %

- 나노 입자 크기: 400 nm

실시예 2

SN-38(10 mg) 과 폴리에틸렌글리콜 (분자량 4000 달톤, 3000 mg)을 500 ml 둥근 바닥플라스크에 넣고, 메탄올 100ml 및 디클로로메탄 250ml을 가하여 SN-38 과 폴리에틸렌 글리콜을 완전히 용해시킨 다음 감압하에서 유기 용매를 제거하고, 계속하여 이를 160℃의 온도로 가열하고 자석 젓개로 저어 주면서 2시간 방치하여 SN-38을 폴리에틸렌글리콜에 용융시켰다. 상기 반응용기를 실온으로 냉각시킨 후 즉시 액체질소에 가하여 급속 냉각시켜 SN-38이 분산된 고상 폴리에틸렌글리콜을 얻었다. 여기에 제조예 2에서 합성한 양친성 이중 블록 공중합체인 mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트가 50 mg/ml 농도로 용해된 수용액 10ml를 가하고, 초음파를 가하 면서 고상 폴리에틸렌글리콜을 용해시키고, SN-38 나노 입자가 현탁된 수용액을 제조하였다. 여기에 락토스모노하이드레이트 600mg을 가하여 용해시키고 수용액의 pH를 4.0 ~ 7.0으로 맞춘 다음, 생성된 SN-38 나노입자 현탁 수용액을 구멍크기 800 nm인 필터로 여과시키고 동결 건조하여 동결건조 조성물을 제조하였다. 제조된 동결건조 조성물을 주사용수로 재건하여 SN-38 수득률, 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도, SN-38 락톤 함량 및 나노 입자크기를 분석하였다.

- PEG 4000/mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트 블록 공중합체 중량비: 6/1

- SN-38 수득률 : 99 %

- 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도: 0.5 mg/ml

- SN-38 락톤 함량: 100 %

- 나노 입자 크기: 500 nm

실시예 3

SN -38/ PEG 4,000/ mPEG- PLA 블록 공중합체 나노입자 조성물 제조

상기 제조예 1에서 합성한 mPEG-PLA 블록 공중합체 (Mw; 1,800-2,000) 1g, PEG4000 8g, SN-38 40mg을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정에 따라 SN-38 나노입자 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물을 주사용수로 재건하여 SN-38 수득률, 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도, 및 SN-38 락톤 함량을 분석하였다.

- PEG4,000/ mPEG-PLA 블록 공중합체 (mPEG-PLA) 중량비: 8/1

- SN-38 수득률: 90 %

- 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도: 0.4 mg/ml

- SN-38 락톤 함량: 100 %

실시예 4

SN -38/ PEG 4000/ mPEG- PLA - 팔미테이트 나노입자 조성물 제조

상기 제조예 3에서 합성한 mPEG-PLA-팔미테이트 100 mg, PEG4000 400 mg, 및 SN-38 1.0mg을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 SN-38 나노입자 수용액을 제조하였다. 제조된 조성물을 주사용수로 재건하여 SN-38 수득률, 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도, 및 SN-38 락톤을 분석하였다.

- PEG4000/mPEG-PLA-팔미테이트 중량비: 4/1

- SN-38 수득률: 95 %

- 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도: 0.5mg/ml

- SN-38 락톤 함량: 100 %

실시예 5

SN -38/ PEG 4000/ 토코페롤 폴리에틸렌글리콜 숙신산 에스테르( TPGS )

나노입자 조성물 제조

토코페롤 폴리에틸렌글리콜 숙신산 에스테르 (TPGS, vitamin-E polyoxyethyleneglycol-1000-succinate, Eastman Chemical Co., Kingsport Tenn., Mn ; 1,000) 70mg, PEG4000 21g, 및 SN-38 70mg을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 SN-38 나노입자 수용액을 제조하였다. 제조된 조성물을 주사용수로 재건하여 SN-38 수득률, 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도, 및 SN-38 락톤 함량을 분석하였다.

- PEG4000/토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(TPGS, Mn; 1,000) 중량비: 300/1

- SN-38 수득률: 93 %

- 재건 후 나노입자 수용액의 SN-38 농도: 0.7mg/ml

- SN-38 락톤 함량: 100 %

실시예 6

SN -38 함유 고상 폴리에틸렌글리콜 나노입자 조성물 제조

아래 표와 같은 중량 조성비로 약물과 분산매로 고상 폴레에틸렌 글리콜만을 가지고 고상 폴리에틸렌 글리콜의 분자량에 따른 조성물을 제조하였다. 제조시 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 후 마지막 단계에서 회합 방지제를 첨가하지 않은 pH 5-6사이의 수용액(1 ml)을 가하여 최종 조성물을 얻었다. 제조된 조성물은 제조 직후(0시간) 및 실온에서 4시간, 24시간 방치 후 나노입자의 입자경을 측정하였다. 또한 이 조성물들을 구멍크기 800nm의 필터로 여과된 후의 약물농도를 측정하여 함량을 결정하고 이를 표 1에 나타내었다.

[표 1] 조성 1~9의 조성비, 입자경 및 약물 함량

고상 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 회합방지제가 없이 제조한 SN-38 나노입자 현탁 수용액은 시간에 따른 입자경 안정성이 떨어지고, 실온에서 방치 후 24시간이 지난 뒤의 입자경은 1000나노미터 이상이 되었다. 따라서 상기 조성물의 안정성을 확보하기 위해 계면 활성제와 같은 회합방지제가 요구된다.

실시예 7

SN38 함유 나노입자 조성물

본 발명은 실시예 6에 보여준 결과들을 보완하고자 계면활성제 역할을 하는 회합 방지제를 사용하여 SN38을 함유하고 있는 나노입자 조성물을 제조하였다. 아래의 표 2에 나타낸 바와 같은 중량 조성비로 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 SN-38 나노입자 조성물을 얻었다. 또한 이 조성물에 동결 건조 시에 케이크 물질로 사용하는 만니톨 (D,L-Mannitol)을 전체 대비 15% 중량비로 가하고, 혼합물을 실온에서 15분간 교반하였다. 이로부터 얻어진 나노입자 수용액을 구멍 크기가 800nm인 필터로 여과하고, 약물의 동일 용량씩 포함하도록 일정량을 유리 바이알에 분주한 뒤 동결 건조하였다.

동결 건조된 조성물들은 생리식염수로 0.5 mg/ml의 농도가 되게 재건한 후, 상온에서 0(제조 직후), 4, 24시간 경과에 따른 SN-38의 입자경 및 pH를 측정하여 표 2 에 나타내었다.

[표 2] 조성 10~20의 조성비, 입자경 및 약물 함량

상기 표 2의 조성물들은 수용액 상에서 24시간까지 100% 락톤 형태를 유지 하였고, 약물의 입자경은 회합방지제를 추가한 결과 시간에 따른 입자경 안정성을 보였다.

[실험예]

실험예 1

SN -38 함유 나노입자 조성물의 안정성

실시예 2, 3, 5로부터 제조된 주사용 동결건조 조성물을 각각 25℃에서 6개월간 보존한 후의 외관, 잔존율(함량), 락톤의 %, 재용해 시간, pH의 변화 및 평균 나노 입자경을 측정하여 조성물의 안정성을 검토하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3] 주사용 동결건조 조성물의 외관, 잔존율(함량), 락톤의 %, 재용해 시간, pH의 변화 및 평균 나노 입자경 (25℃, 6개월간 보존 후)

본 발명에 따라 제조된 동결건조 제제는 장기보존에도 안정하였고, 임상 적용이 가능한 것으로 판단되었다.

실험예 2

SN -38 함유 나노입자 조성물의 약동력학적 특성

실시예 2, 3, 5로부터 제조된 동결건조 조성물 각각에 대한 약동력학적 특성을 확인하기 위해, 이들 조성물들을 체중 200-250g의 웅성 스프래그-도울리 랫트의 경정맥과 경동맥에 삽관하였다. 각 조성물을 2mg/kg의 용량으로 10초에 걸쳐 미 정맥으로 주사하였다. 주사 5, 15, 30분 및 1, 2, 4, 8 시간 후, 0.4ml의 전 혈을 경동맥으로부터 채혈한 후, 원심 분리하여 맑은 상등 혈장을 얻었다.

또한 약물의 혈장 농도를 분석하기 위하여 혈장에 10% ZnSO₄ 및 200mM의 락테이트 버퍼 (pH3.5)로 맞춘 pH 5.5 메탄올을 가하였다. 상기의 혼합물을 30초간 격렬히 혼합한 후, 원심 분리하였다. 상등액을 취하여 깨끗한 시험관으로 옮긴 후, HPLC로 농도를 측정하였다. HPLC 조건은 아래와 같았다:

주입부피 : 0.085ml

유속 : 1ml/min

검출기 : FLD

파장 : Ex 355nm, Em 515nm

이동상 : 아세토니트릴 80 대 3% 트리에틸아민 수용액 20 부피 비율로 혼합하여 아세트산으로 pH 5.5로 맞춘 혼합용액

칼럼 : 4.6 X 250mm (C18, Vydac, USA)

투여된 나노 입자에서 방출된 SN-38 락톤 형태의 혈장 농도 분석 결과를 아래 표 4에 나타내었다.

비교제제로는 SN-38의 수용성 프로드럭화한 캠푸토 주^®(20mg/ml, CJ제약사업본부/화이자, USA)를 생리식염수로 희석하여 사용하였다.

[표 4] 투여된 나노 입자에서 방출된 SN-38 락톤 형태의 혈장농도 분석 결과

실험예 3

SN -38 함유 나노입자 조성물의 생체 항암 활성

실시예 2에서 제조한 나노입자 조성물을 가지고 항암 활성에 대한 영향을 평가하고자 하였다. 비교제제로 캠푸토 주^®(20mg/ml, CJ제약사업본부/화이자, USA)를 생리 식염수로 희석하여 사용하였으며, CPT-11의 함량이 1.5mg/ml가 되도록 하였다.

액체 질소에 저장된 세포를 채취하고 시험관내 세포배양으로 확립하였다. 세포를 수획한 후, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 생존 세포수를 측정하였다. 세포를 약 7 × 10⁷ 세포/ml 의 농도로 멸균 PBS에 재현탁하였다. 건강한 누드 (nu/nu) 비흉선 마우스 (20-25g, 8주령)의 오른쪽 옆구리에 7 × 10⁶ 의 인간 암세포 (HT-29, MIA-Paca-2)를 함유하는 0.1ml의 세포 현탁액을 피하 주사하였다. 암이 일정한 크기에 도달한 후, 3회 이종이식하여 3-4mm의 이종 이식편을 형성하였 다. 이종이식 단편을 건강한 누드 (nu/nu) 비흉선 마우스 (20-25g, 8주령)의 오른쪽 옆구리에 12게이지 트로카 니들로 피하주사하였다. 암 부피가 100-300mm³ 에 도달한 후, 약물을 투여하고 이 시점을 0일로 기록하였다. 0일에, 마우스를 5그룹으로 나누고 0, 1, 2, 3, 4, 5일에 실험예 2에서 제조한 SN38 함유 나노입자 및 비교 제제를 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 암 부피를 상이한 시간 간격으로 측정하였다. 종양 부피는 하기 식에 의해 계산하였다.

종양부피 (TV) = 0.5 × L × W² (L: 장축, W: 단축)

상대적 종양부피 (RTV) = (V_t/V₀) × 100% (V_t : t일의 TV, V₀ : 0일의 TV)

치료 효능은 평균 종양 증식 곡선, 최적 성장 억제 (T/C%) 및 비 성장 지연 (SGD)을 종합적으로 고려하여 평가하였다.

최후 주사 후 4주내 특정 일에서의 최적 성장 억제를 처리군 대 대조군의 평균 RTV 값에 100% (T/C%)를 곱하여 계산하였다.

SGD를 아래와 같이 1 및 2배가시간에 걸쳐 계산하였다 :

비성장 지연 (SGD) = (T_D 처리군 - T_D대조군)/T_D 대조군

T_D : 종양 배가 시간

활성 수준을 아래와 같이 정의 하였다.

실험을 유의한 것으로 인정하기 위하여, 처리당 적어도 7마리의 마우스와, 그룹당 적어도 7개의 종양을 사용하였다. 처리 시작 시, 최초 종양 직경은 4mm이거나 30mm³ 부피였다. 최종 약물 투여 후 2주 내에 죽는 동물을 독성 사멸로 간주하고 평가에서 제외하였다. 3마리당 1마리 보다 많은 독성 사멸이나 평균 체중이 15% 초과로 감소하여 완전히 회복되지 않는 처리군은 항 종양 효능이 없는 것으로 간주되었다.

표 5 및 도 3, 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2로부터 제조된 SN-38을 포함하는 나노입자 조성물의 처리군은 대조군에 비해 상당한 암 성장 억제를 나타내었으며, 특히 비교제제에 비해 높은 항암활성을 나타내었다

[표 5] 항암 활성 평가

도 1은 본 발명의 제조예 1에서 합성된 모노메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리락타이드 블록 공중합체 (mPEG-PLA)의 1H-NMR 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명의 제조예 2에서 합성된 mPEG-PLA-토코페롤 숙시네이트의 1H-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 인간 대장암 세포주 HT-29를 이용한 마우스에서의 SN-38 함유 나노입자 조성물, 비교제제 및 대조군의 시간에 따른 평균 상대적 종양부피(RTV)를 도시한 그래프이다.

도 4는 인간 췌장암 세포주 MIA-PaCa-2를 이용한 마우스에서의 SN-38 함유 나노입자 조성물, 비교제제 및 대조군의 시간에 따른 평균 상대적 종양부피(RTV)를 도시한 그래프이다.

Claims

캄토테신 유도체, 고상 폴리에틸렌글리콜 및 회합방지제로서 폴리에틸렌글리콜 토코페롤 숙신산 에스테르를 포함하는, 캄토테신 유도체의 나노입자 조성물.
제1항에 있어서, 캄토테신 유도체가 물에 대한 용해도가 10 ㎍/ml 이하인 화합물인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 캄토테신 유도체가 캄토테신 또는 7-에틸-10-히드록시캄토테신인 조성물.
제1항에 있어서, 고상 폴리에틸렌글리콜은 중량평균 분자량이 1,500 내지 20,000 달톤인 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, 고상 폴리에틸렌글리콜의 양 말단기가 히드록시기, 알킬기 또는 아실기로 보호된 조성물.
제1항에 있어서, 고상 폴리에틸렌글리콜의 함량이 캄토테신 유도체의 중량에 대하여 50 내지 1000배인 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 토코페롤 숙신산 에스테르 내의 폴리에틸렌글리콜의 중량평균 분자량이 1,000 내지 5,000 달톤인 조성물.
제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜 토코페롤 숙신산 에스테르의 함량이 캄토테신 유도체의 중량에 대하여 1 내지 400 배인 조성물.
제1항에 있어서, 나노입자의 입자 크기가 100 내지 1000 nm인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 나노입자 조성물이 동결건조 제형인 조성물.
삭제
(a) 고상 폴리에틸렌글리콜에 캄토테신 유도체를 용융시키는 단계;

(b) 상기 (a)에서 얻은 용융액을 냉각시켜 고체분산체를 형성시키는 단계; 및

(c) 상기 (b)에서 얻은 고체분산체를 폴리에틸렌글리콜 토코페롤 숙신산 에스테르의 수용액에 용해시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 나노입자 조성물의 제조 방법.
제15항에 있어서, (c) 단계에서 얻어진 수용액을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, (a) 단계에서 용융온도가 60 내지 180 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, (a) 단계에서 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 아세톤 또는 아세토니트릴로부터 선택되는 유기용매를 사용하고, 감압 하에 유기용매를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.