KR100939825B1 - 신규 화합물 에페드라닌 ｋ 및 그 화합물의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 화합물 ephedrannin K 및 그 화합물의 용도에 관한 발명으로 본 발명의 화합물은 항염증 치료제, 피부미백제 등의 용도로 사용될 수 있다.

ephedrannin K, 미백, 항염증

Description

신규 화합물 에페드라닌 Ｋ 및 그 화합물의 용도{A novel compound, ephedrannin K, and the use thereof}

본 발명은 신규 화합물 ephedrannin K 및 그 화합물의 용도에 관한 발명이다.

일반적으로 염증은 기계적, 화학물질 또는 자기 파괴적인 과정에 의한 해로운 자극에 대한 소포성 조직의 복잡한 생물 반응이다. 영향을 받은 부근에서의 일련의 변화를 겪는 이들 반응은 재생과 치료를 이끄는 해로운 물질의 파괴 또는 제거 및 식세포 활성의 위치화에 대한 세포 및 조직학적 조직 반응으로 구성된다. 이들 과정에 관여하는 대식세포는 LPS 및 IFN-감마와 같은 염증 자극에 의하여 활성화된다. 그 활성화된 대식세포들은 염증 반응들의 업-조절에 관련된 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IFN-알파와 같은 pro-염증 사이토카인을 생성하고 면역반응을 증폭하거나 외래 물질을 파괴하는 작용을 가지는 자유기(NO), 프로스타그란딘(PGE₂), 엑시토톡신(glutamate)을 포함하는 여러 염증 매개자들을 분비한다(Pierce G. F., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1990, 2, 233-234).

특히 각각 NO와 PGE₂를 합성하는 것과 관련된 유도되는 나이트릭 옥사이드 합성효소(iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)는 염증 과정들을 매개하는 중요한 효소들이다. iNOS 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 부적당한 업-조절은 염증 이상 뿐 아니라 일부 타입의 질환과도 관련된다(K. T. Wilson, 등, Cancer Res., 1998, 58, 2929-2934;S. Ambs, 등, Cancer Res. 1998, 58, 334-341).

iNOS 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 조절과 관련하여 최근 연구에 따르면 NF-카파B가 염증 과정들을 매개하는 중요한 효소들인 이들 iNOS 및 cyclooxygenase-2 (COX-2) 발현을 조절한다고 한다(Xie Q. W., 등, J. Biol. Chem., 1994, 269, 4705-4708; Heiss E., 등, J. Biol. Chem., 2001, 276, 32008-32015).

이들 염증성 사이토카인들과 매개체들의 생성을 직접 억제하고 전사인자들의 부적당한 활성화를 막아주는 항-염증 약제 발견은 염증성 질환과 일부 암들과 같은 질환을 감소시키는데 중요하다.

멜라닌은 멜라노사이트 세포에 의하여 생성되는 색소로 표피를 통하여 축적되어 피부 색을 결정하는 인자이다. 그것은 타이로시네이즈(EC 1.14.18.1)에 의하여 촉발된다. 멜라닌 생합성 경로는 경로에서 율속단계 반응인 L-tyrosine을 L-3, 4-dihydroxyphenylalaninine (DOPA)로 하이드록실레이션하는 단계를 촉매하는 타이로시네이즈에 의하여 효소 수준에서 조절된다. 그 후 DOPA는 또한 타이로시네이즈에 의하여 DOPAquinone으로 산화될 수 있고, 양 단계는 산소분자에 의존적이 다(Hearing VJ Jr, Methods in enzymology 142, 154-165, 1987;Spritz RA와 Hearing VJ, Adv. Hum. Genet. 22, 1994, 1-45); DOPAquinone은 더 산화되어서 피부의 여러 색에 관여하는 대부분 갈색에서 흑색 폴리머 멜라닌을 낸다(Prota, G. Melanins and melanogenesis; Academic: New York, 1992; Prota G. Cosmet. Toiletries 1996, 111, 43). 기미, 주근깨, 노인반을 포함하는 피부침착은 멜라닌 색소의 비정상적인 과축적에 의하여 야기된다.

이러한 피부 색소침착의 문제는 점점 더 관심이 증가하고 있다. 특히 과도한 색소침착은 심각한 미적인 문제를 야기할 수 있으므로 비정상적인 멜라닌 색소의 축적으로 야기되는 과도한 색소 침착의 치료제 개발에 많은 노력들이 집중되고 있다. 알부틴, 하이드로퀴논, 코지산, epigallocatechin-3-o-gallate (EGCG) -같은 탄닌류 화합물들, 비타민 C 및 그 유도체들, 그리고 태반 추출물들와 같은 치료제들이 국소 피부 미백제로 알려져 있다(No, J. K., 등, 1999, Life Sci., 65, 241-246; Jimbow K., 등, J. Invest. Dermatol.,62, 436-49 (1974); Maeda K., 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 276, 765-69(1996); Imokawa G., 등, Cancer Res., 42, 1994-002 (1982); Masuda M., 등, Cosmetic. Toilet., 111, 65-7(1996); Curto, E. V., 등, 1999, Biochem. Pharma., 57, 663-673). 이들 치료제 대부분은 타이로시네이즈 활성을 저해하고 나아가서는 멜라닌 생성을 저해한다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 항 염증 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피부미백제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I에 기재된 신규 화합물 및 그 유도체를 제공한다.

[화학식 I]

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 항염증 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 하는 염증 관련 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 염증관련 질환은 천식, 골 다공증, 패혈 쇼크, 출혈성 쇼크, 다발성 경화증, 루마티스성 관절염, 궤양성 대장염, 동맥경화, 알쯔하이머, 천식 및 헌팅턴 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 것을 특징으로 하고, 상기 화합물은 멜라닌 생성 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 본 발명자들은 Epherda sinica STAPF로부터 다른 극성을 가진 여러 용매들을 사용한 연속 용매-추출들과 실리카겔을 사용한 컬럼-크로마토그래피들에 의하여 80% 에탄올 마황(Ephedra sinica) 분획으로부터 새로운 ephedrannin K 화합물을 분리하여 그 구조를 FT-IR, UV/Vis, LC/MS, ¹H-NMR, 및 ¹³C-NMR로 결정하였다. in vitro 염증 모델로 LPS-자극된 RAW 264.7 세포를 사용한 항-염증 활성을 조사한 결과 상기 ephedrannin K 화합물은 그들의 해당 유전자들의 발현을 다운-조절하여 NO(nitric oxide), TNF-α, 및 인터루킨(IL)-1β의 생성을 농도 의존적으로 억제하여 강력한 항-염증 활성을 가진다는 것을 증명하였다. ephedrannin K 구조(도 1A 및 2, 분자식: C₃₀H₂₀O₁₀, 분자량: 540 amu)은 여러 가지 분광계들(FT-IR, UV/Vis, LC/MS, LR-FABMS, HR-FABMS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT-NMR, 및 COSY, HMQC, 및 HMBC와 같은 2D-NMR 실험)을 이용하여 분광학적 방법을 통하여 결정하였다.

일반적으로 염증은 인체의 주된 방어 시스템이기 때문에 여러 염증 자극에 대한 선천적인 면역 반응에서 NO, PGE₂, TNF-α, 및 IL-1β 생성은 주된 역할을 한다. 그러나 이들 염증 매개체들이 비조절되고 과생성된 채로 남으면, 그들은 패혈 쇼크, 출혈성 쇼크, 다발성 경화증, 루마티스성 관절염, 궤양성 대장염, 및 동맥경화 또는 사망과 같은 급성 및 만성 질환을 야기한다(Tilg H., 등, Gastroenterology, 1992, 103, 264-274;Bertolini A., 등 Pharmacol. Res., 2001, 44, 437-45031). 특히 장기간 염증은 알쯔하이머 및 헌팅턴 질환과 같은 신경 질환의 진행과 관련이 있다(Turrin N. P., 등 Mol. Neurobiol., 2006, 34, 221-24233). 따라서 이들 염증성 매개체의 저해는 원하지 않는 염증성 반응을 예방하여서 이들 질환들의 진행을 막는 유효한 치료 전략이다. 이 억제와 관련하여 강력한 항-염증 활성들을 가지는 식용 및 약용 식물로부터 존재하는 천연 화합물을 발견하는 것은 매우 유용하다. 항산화 및 항염증 활성을 가지는 천연 화합물의 대부분은 Curcumin, epigallocatechin gallate (EGCG), resveratrol, quercetin, 및 theaflavin과 같은 페놀성 화합물들이다. 또 이들 항산화 및 항염증 활성을 가지는 천연 화합물들은 주로 항암성을 나타낸다. 예를 들어, curcumin, EGCG, 및 resveratrol은 암 성장을 강하게 저해하고 또한 NF-κB 활성화를 저해하여서 COX-2 및 iNOS의 다운-조절을 나타낸다는 것이 보고되었다(Y. J. Surh, 등 Mutation Research 2001, 480-481, 243-268 34). 본 발명에서, 본 발명자들은 ephedrannin K가 iNOS, TNF-α, 및 IL-1β mRNAs와 이들 단백질의 축적을 저해한다는 것을 보였다. Ephedrannin K (7.5 μM)는 대조군과 비교하여 NO, TNF-α, 및 IL-1β의 생성을 각각 약 85%, 84%, 및 81% 감소시켰다. ephedrannin K 의 7.5 μM에 의한 NO 생성 저해 정도가 EGCG 경우 200 μM (F. Yang, 등 J. Nutr., 1998, 128, 2334-2340)에 의하여, curcumin 8-9 μM(I. Brouet 등 Biochem. Biophys. Res. Comm., 1995, 206, 533-540), resveratrol 15 μM(S. H. Tsai, 등, British J. Pharm., 1999, 126, 673-680), roflumilast 30 μM(H. J. Kwak, 등 J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2005, 315, 1188-1195), 또는 astaxanthin 경우 50 μM(S. J. Lee, 등 Mol. Cells, 2003, 16, 97-10540)에 의하여 저해되는 정도가 같다는 것은 비교될만한 결과이다. 이같은 낮은농도는 Ephedrannin K가 다른 보고된 천연 화합물과 비교하여 더욱 우수한 효과를 나타낸다는 것을 보였다.

또 ephedrannin K의 항염증 효과는 NF-카파B의 LPS-유도된 DNA 결합 활성뿐 아니라 IκB 인산화의 저해에 기인한다. 이러한 발견은 ephedrannin K가 NF-κB-의존적인 염증 관련 질환의 진행을 늦추는 물질로 사용될 수 있다는 것을 알 수 있 다.

본 발명은 마황뿌리로부터 새로운 효과적인 항-염증 성분을 분리하여 그 구조를 분석하고 염증 과정에서 활성 메카니즘을 조사하였다. 이 화합물은 LPS-자극된 대식세포에서 NO생성뿐 아니라 iNOS, TNF-α, 및 IL-1β의 발현을 억제하여 NF-카파B 의존적인 염증에서 저해효과에 의하여 우수한 항-염증 효과를 보인다.

또한 본 발명에서 B16F10 멜라노마 세포에서 ephedrannin K에 의한 멜라닌생성 저해를 조사하기 전에, 본 발명자들은 NIH 3T3 정상 섬유아세포로 세포독성 실험을 수행하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, ephedrannin K를 포함하는 80% 에탄올 추출물은 NIH3T3 세포 증식에 영향이 없었다. 이 결과는 미백제로서의 안전한 사용의 가능성이 있다는 것을 알 수 있다.

또한 80% 에탄올 추출물과 ephedrannin K는 큰 타이로시네이즈 저해 활성을 나타냈다(표 1). B16 세포에서 멜라닌합성의 유도는 타이로시네이즈 단백질 발현으로부터 야기된 타이로시네이즈 활성의 촉진에 의하여 일어난다(Winder A. J., 등, Cell Mol. Biol. Res., 40, 613626(1994). 따라서 본 발명은 B16 세포에서 멜라닌 합성 단백질들의 활성에 대한 ephedrannin K의 효과를 조사하고 ephedrannin K는 타이로시네이즈 활성을 저해하는데 효과가 있다는 것을 알았다(표 1). Englaro 등은 타이로시네이즈 활성의 증가가 멜라닌 합성을 촉진한다는 것을 밝혔다(Englaro W., 등, J. Biol. Chem., 273, 99669970 (1998)). ephedrannin K가 멜라닌합성의 저해를 이끄는지를 더 직접적으로 조사하기 위하여 본 발명은 B16 세포에서 멜라닌 합성에 대한 ephedrannin K의 효과를 조사하였다. 타이로시네이즈 활성과 유사하게, ephedrannin K는 48시간 내에 멜라닌 형성을 저해하는데 효과적이었다(도 10). 이 결과는 ephedrannin K가 멜라닌 합성의 억제를 촉진한다는 것을 나타낸다. 타이로시네이즈 단백질의 발현을 동정하기 위한 웨스턴 블럿 분석에서, 본 발명의 ephedrannin K는 비처리 대조군의 레벨에 비하여 타이로시네이즈 단백질의 양이 현저하게 감소하였다 (도 11). 상기 결과에 기초하여, 본 발명자들은 ephedrannin K는 멜라닌형성 활성과 관련된 단백질을 저해할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

μg/ml	ESS4	ESS4H	ESS4E	ESS4B	ESS4W
100	64.4±0.51	18.5±0.04	75.6±0.32	60.0±0.11	21.5±0.09

표 1은 타이로시네이즈 활성의 저해에 대한 여러 용매 추출물들의 효과를 보여준다.

상기 표에서 ESS4: 80% 에탄올 추출물, ESS4H: 80% 에탄올 추출물의 헥산 추출물, ESS4E: 80% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 추출물 ESS4B: 80% 에탄올 추출물의 부탄올 추출물, ESS4W: 기존 용매로 추출한 후에 남은 최종 수 추출물. 값들은 대조군과 비교하여 각 용매 추출물에 의한 저해 %를 나타낸다.

본 발명에서 ephedrannin K는 신규 화합물이고, LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 활성화 억제를 통하여 여러 항-염증성 매개체를 저해하였다. Ephedrannin K는 전구성 매개체에 대한 ephedrannin K의 저해 효과가 기존에 알려진 화합물(curcumin, EGCG, resveratrol, astaxanthin, 및 roflumilast 등)에 비하 여 더욱 우수하기 때문에 여러 인간 질환을 치료하는 우수한 후보물질이 될 수 있다.

또한 본 발명에서 본 발명자들은 마황근으로부터 분리한 ephedrannin K가 타이로시네이즈 활성뿐 아니라 멜라닌 생성도 농도의존적으로 저해한다는 것을 밝혔으며, 본 발명의 화합물인 ephedrannin K는 타이로시네이즈 단백질 레벨을 농도의존적으로 저해하였다. 따라서 본 발명은 ephedrannin K가 피부 미백제로서 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 사용된 Epherda sinica STAPF 뿌리는 한약업자로부터 구입하였고, Dulbecco modified Eagle 배지(DMEM), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Life Technology Inc. (Rockville, MD)로부터, LPS (Escherichia coli O111:B4)는 Sigma(USA)로부터 구입하였다. NF-κB-특이적인 올리고뉴크레오타이드는 Promega (Madison, WI)로부터, 그리고 단일클론 iNOS 항체는 Transduction Laboratories (Lexington, KY)로부터 구입하였다. 타이로시네이즈, TNF-α 및 IL-1β에 대한 폴리클론 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA)로부터 구입하였다.

본 발명에 사용된 다른 시약들은 특별한 언급이 없으면 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였다.

실시예 1:마황뿌리의 용매 추출

80 % 에탄올 추출물은 Soxhlet 장치를 사용하여 80℃에서 히팅 맨틀에서 3시간 동안 1Kg의 건조된 Ephedra 뿌리를 포함하는 3리터의 80% 에탄올을 환류하여 얻었다. 추출은 부가적인 3리터의 80 % 에탄올로 반복한 후 그 전 80% 에탄올 추출물과 혼합하였다. 그 추출물은 50℃ 물 중탕에서 회전식 감압농축기를 사용하여 농축한 후 동결건조하였다. 그 분말 추출물을 1 리터의 증류수로 녹인 후 연속 용매 추출을 위하여 분리 깔대기에 쏟았다. 1리터의 헥산을 첨가하고 그 용액을 심하게 진탕한 후 혼합된 용액이 자발적으로 분리될 때까지 정치하였다.

아래 수층을 또 다른 분리 깔대기로 옮기고 또 1리터의 헥산으로 한 번 더 추출하였다. 아래 수층을 두 번째 에틸아세테이트 용매 추출을 위하여 새로운 분리 깔대기로 옮기고 잔류 위층 헥산 층을 그 전 헥산층과 합하였다. 그 헥산 추출물을 회전 감압농축기를 사용하여 증류 후에 얻었다. 에틸아세테이트로 추출 후 잔류 수층을 그 후에 부탄올로 추출하였다. 모든 용매 추출을 2회 수행하였고 각 추출물은 진공하에서 회전 감압농축기를 사용한 증류에 의하여 얻었고 동결건조를 수반하였다. 다른 네 종의 용매(헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 및 수 추출물) 추출물들을 얻었다.

실시예 2: 항-염증 활성 및 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 에틸아세테이트 추출물로부터 활성성분의 분리 및 동정

상기 네 종류의 다른 용매 추출물 중에서 에틸아세테이트 추출물이 현저한 항염증 활성 및 타이로시네이즈 활성에 대한 저해를 보였다. 따라서 에틸아세테이트 추출물로부터 항-염증 활성와 타이로시네이즈 활성을 포함하는 활성 성분의 분 리는 다음과 같이 수행되었다: 에틸아세테이트에 녹아 있는 50 g의 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름(CHCl₃) : 메탄올(MeOH) = 20 : 1 (v/v)으로 평형화된 실리카겔 60 (70 - 230 mesh, Merck, Germany) 컬럼(10 cm x 40 cm)에 로딩하였다. 로딩 후 메탄올 양의 증가하는 순서로 20 / 1, 15 / 1, 12 / 1, 10 / 1, 8 / 1, 4 / 1, 및 1 / 1의 CHCl₃ / MeOH (v/v) 비율의 일곱 개의 혼합된 용매로 단계 그레디언트 이루션을 수행하였다..

각 혼합된 용매의 각 분획의 부피는 500 ml이고 분획들은 프리코팅된 Merck Kieselgel 60 F_254S 플레이트(0.25 mm)를 가지는 TLC로 용출된 분획에서 더 이상의 성분이 검출되지 않을 때까지 수집하였다. 각 혼합된 용매에서 각 용출된 성분을 포함하는 모든 분획들을 모아서 그 용매를 회전감압농축기을 사용하여 증발시키고 증류된 용출물들을 다음 단계를 위하여 적당한 용매에 녹였다. 용출물에서 효과적인 성분을 분리하기 위하여, 동일한 실리카겔을 가지는 두 부가적인 단계의 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 용출에 사용된 용매 비는 두 번째 컬럼 크로마토그래피(5 cm x 50 cm)에서는 메탄올 양의 증가하는 순서로 10 / 1, 9 / 1, 8 / 1, 7 / 1, 5 / 1, 3 / 1 및 1 / 1의 CHCl₃ / MeOH (v/v) 이었고 세 번째 컬럼 크로마토그래피에서(2 cm x 25 cm)는 메탄올 양의 증가하는 순서로 15 / 1, 12 / 1, 10 / 1, 7 / 1, 및 5 / 1의 CHCl₃ / MeOH (v/v)이었다.

각 혼합된 용매에서 각 분획의 부피는 두 번째 크로마토그래피에서는 250 ml 이었고 세 번째에서는 100 ml이었다. 분획들은 TLC로 용출된 분획에서 더 이상의 성분이 검출되지 않을 때까지 수집하였다. 용출된 성분들을 포함하는 모든 분획을 합하고, 용출된 성분들을 포함하는 모든 분획들은 감압농축기로 증류하였다. 항-염증 활성을 포함하는 용출물과 각 분획의 모든 성분들은 TLC로 분석하였다. 그 항-염증 활성들은 NO 생성의 저해로 우선 판단하였다. 항-염증 활성을 포함하는 각 분획의 성분들을 HPLC/MS로 더 분석하였다. TLC에 대한 전개 용매는 그 용출 용매 또는 CHCl₃ : MeOH = 85 : 15 (v/v)이고, TLC 판 상의 스팟은 에탄올 용액 내의 5 % 황산으로 태워서 UV 하에서 시각화하였다.

실시예 3: 항-염증 활성 및 타이로시네이즈 저해 활성을 포함하는 유효 성분의 구조 분석

상기 실리카겔 컬럼을 통하여 분리된 항-염증 활성을 포함하는 유효 성분의 구조는 Fourier Transform-Infra Red (FT-IR) 분광기, Ultraviolet/Visible (UV/Vis) 분광기, Liquid Chromatography/Mass (LC/MS) 분광기, Low Resolution Fast Atom Bombardment Mass (LR-FABMS) 분광기, High Resolution (HR)-FABMS spectrometer, Proton Nuclear Magnetic Resonance (¹H-NMR) 분광기 및 ¹³C-NMR 분광기를 사용하여 결정하였다. ¹H- 및 ¹³C-NMR 스펙트럼들은 JEOL JUM-ECP 400 (¹H에 대해서 400 MHz, ¹³C에 대해서는 100 MHz) 분광기에서 DMSO-d₆ 용액 하에서 기록되었다. 그 HMQC, HMBC, DEPT, 및 COSY 스펙트럼들은 펄즈 필드 그래디언트들을 사용하 여 기록되었다. 케미털 쉬프트가 각 잔류 용매 피크에 레퍼런스되었고 그 값들이 표현되고, δ에 기록되었다. 적외선 스펙트럼(IR)이 JASCO FT-IR 460 플러스 분광기에서 수행되었다. 모든 샘플들은 1 % (w/w) 화합물을 KBr로 혼합하고 미세분말로 갈아서 제조되었다.스펙트럼들은 베이스라인 보정없이 400 -4,000 cm^-1 범위 하에서 기록되었다. UV/visible 스펙트럼들은 용매로 메탄올을 사용한 Shimadzu UV 미니 1,240 분광기에서 기록되었다. 최대 흡수 파장은 nm로 기록되었다. HR-FAB-MS 스펙트럼들은 PEG 400 매트릭스를 사용하여 70 eV에서 작동하는 JEOL JMS-700 분광기에서 기록되었다. 낮은 해상도 질량 (MS)은 70 eV에서 작동하는 Micromass ZQ 4,000에서 기록되었다.

실시예 4: 대식세포 배양과 세포 추출물 및 핵 추출물의 제조

RAW 264.7 세포(American Type Culture Collection, Bethesda, USA), 쥐 대식세포주를 2 mM L-글루타민, 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 10% 태반 소 혈청(HyClone Labs, USA)을 포함하는 DMEM하에서 배양하였다. 세포들을 6-웰 플레이트(4 x10⁶ 세포/웰)에서 37 ℃, 5 % CO₂ / 95 % 공기 하에서 배양하였다. 염증에 대한 Ephedra 뿌리 추출물의 효과를 조사하기 위하여, 이들 세포들을 신선한 배지로 2회 세척하고 염증 과정을 촉발하기 위하여 1 μg/ml LPS를 그 추출물의 여러 다른 농도(1, 2, 및 4 μg/ml)의 존재 또는 부존재에서 배양하였다. 배양 후 세포들을 짧은 원심분리에 의하여 배양 배지로부터 분리하고 각 분획을 다음 실험에 사용하였다. 그 침전된 세포들을 얼음 냉각된 인산-버퍼 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 세척 후 세포들을 0.1 mM PMSF를 포함하는 PBS로 재부유하고 30 초간 짧게 쏘니케이션하였다. 염증 과정과 관련된 매개체들을 포함하는 세포 추출물은 20분간 4 ℃에서 12,000 x g 원심분리한 후 상등액으로부터 얻어서 -80 ℃에서 보관하였다. 핵 추출물들을 Dignam등의 변형된 방법(Tilg H., 등 Gastroenterology, 1992, 103, 264-274). 세포들을 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10 μg/ml의 루펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴을 가지는 10 mM HEPES(pH 7.9)에 재부유하고 얼음에서 15분간 배양한 후 0.6 % Nonidet P-40의 존재하에서 10초간 볼텍스하였다. 핵은 12,000 x g에서 60초간 원심분리하여서 세포질로부터 분리하였다. 그 상등액을 제거하고 그 펠렛을 25% glycerol, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10 μg/ml의 루펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴을 가지는 50 -100 μl의 20 mM HEPES (pH 7.9)에서 부유하였다. 그 샘플들을 4 ℃에서 15분간 로킹하여 배양한 후 12,000 x g로 5분간 원심분리하였다. Ephedra 뿌리 추출물로 보충된 그 세포에 대한 세포 생존 실험은 그 전에 기재된 CV 염색방법(Kim, Y. M., 등, J. Biol . Chem ., 1997, 272, 31138-1148)을 사용하여 모든 실험 전에 수행하였다. 브레드포드(M. M. Bradford, Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254) 방법에 의하여 단백질 농도를 결정하였고 소 혈청 알부민을 스탠다드로 사용하였다.

실시예 5: 일산화질소 및 사이토카인들의 결정

NO의 안정한 산화된 산물은 Griess 시약들(Kim, Y. M., 등 J. Biol. Chem., 1997, 272, 1402-1411 24)을 사용하여 배양 배지에서 측정되었다. 100 μl의 배양 배지는 96웰 플레이트 내에 100 μl Griess 시약[동일 부피의 1% sulfanilamide in 5% H₃PO₄ 및 0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride in H₂O 혼합물]을 혼합한 후 550 nm에서 분광기적으로 측정하였다. 일산화질소 농도는 스탠다드로 NaNO₂를 사용하여 결정하였다. 배양 배지 내의 사이토카인, TNF-α 및 IL-1β는 제조업자의 지시에 따라서 상업적으로 구입한 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 결정하였다.

실시예 6: 웨스턴 블럿 분석

세포 추출물 내의 단백질들(50 μg의 단백질)을 10 % SDS- PAGE로 분리하고 나이트로셀루로스 막으로 옮겼다. 트랜스퍼 막들을 0.1 % Tween 20을 가지는 PBS(PBST)의 5% 탈지분유로 불록킹한 후 , 1% 탈지분유를 포함하는 PBST에서 iNOS, IL-1β, TNF-α, 인산화된 IκB, 인산화된 p38, 인산화된 JNK, 또는 인산화된 ERK 항체들로 프로브하였다. PBST로 3회 세척 후, 막들을 양고추냉이 퍼옥시데이즈-커플된 2차 항체로 1시간 동안 하이브리다이즈하고 PBST로 5회 세척하였다. 세척 후, 그 막들을 ECL 시약으로 2분간 배양하고, X-레이 필름에 노출시켰다. 동일한 막들을 스트립핑 버퍼[2 % SDS와 100 mM 2-mercaptoethanol을 함유하는 63 mM Tris-HCl (pH 6.8)]에서 스트리핑하고, 전체 JNK, ERK, 또는 p38에 대한 특정 항체들로 재프로브한 후, 대조군 실험을 위하여 상기 언급된 동일 시약들로 처리하였다.

실시예 7: 역전사 효소 체인 반응( RT - PCR )

세포 추출물로부터 iNOS, IL-1β, 및 TNF-α 발현 수준은 인터널 대조군으로 β-actin을 사용하고 mRNA를 사용한 RT-PCR에 의하여 측정하였다. 총 mRNA는 Trizol Reagent 키트(Life Technology)를 사용하여 추출하였다. 역전사는 5 μg의 mRNA, 200 유니트의 역전사효소 및 500 ng의 oligo-dT 프라이머를 사용하여 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 및 1 mM dNTPs에서 42 ℃에서 1시간 수행되었다. 그 반응은 70 ℃에서 15 분간 가열하여 정지하고 3 ㎕의 cDNA 혼합물은 효소 증폭에 대하여 사용하였다.

PCR은 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 2.5 유니트의 Taq DNA 중합효소, 및 iNOS, TNF-α, 및 IL-1β에 대한 0.1 μM의 각 프라이머에서 수행되었다. 증폭조건은 다음과 같다: 첫 번째 사이클에 대해서는 94 ℃에서 5 분간 변성하고 두 번째 사이클부터는 45초 스타트, 47 ℃에서 45 초간 iNOS 어닐링, 51 ℃에서 45 초 TNF-α, 및 IL-1β 어닐링, 및 35주기 동안 72 ℃에서 30 초간 익스텐젼. 최종 익스텐젼은 72 ℃에서 10 분간 수행되었다.

첫 가닥 cDNA는 iNOS 특이적인 프라이머 5'-TTTGGAGCAGAAGTGCAAAGTCTC-3' (포워드)(서열번호 1) 및 5'-GATCAGGAGGGATTTCAAAGACCT-3' (리버스)(서열번호 2), TNF-α 특이적인 프라이머 5'- ATGAGCACAGAAAGCATG-3' (포워드)(서열번호 3) 및 5'-TCACAGAGCAATGACTCC-3' (리버스)(서열번호 4), IL-1β 특이적인 프라이머 5'-ATGGCAACTGTTCCTGAAC-3' (포워드)(서열번호 5) 및 5'-TAGGAAGACACGGATTC-3' (리버스)(서열번호 6), 또는 β-액틴 특이적인 프라이머 5'-TCCTTCGTTGCCGGTCCACA-3' (포워드)(서열번호 7) 및 5'-CGTCTCCGGAGTCCATCACA-3' (리버스)(서열번호 8)을 사용하여 증폭하였다. 그 PCR 산물들을 EtBr을 포함하는 1.2 % 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다.

실시예 8: Electrophoretic mobility shift assay ( EMSA )

Ephedra로부터 추출물에 의한 핵 내의 NF-κB 양의 변화를 조사하기 위하여, 배양된 세포로부터 핵 추출물은 Kim(Kim, Y. M., 등 J. Biol. Chem., 1997, 272, 1402-1411 24)의 방법을 사용하여 제조되고 EMSA에 의하여 조사하였다. 이중 가닥 NF-κB-특이적인 올리고뉴크레오타이드 (5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)(서열번호 9)는 T4 폴리뉴크레오타이드 카이네이즈를 사용하여 [γ-³²P]ATP로 표지하고 G-50 Sephadex 컬럼으로 정제하였다. 상기 핵 추출물(10 μg의 단백질)을 상온에서 20분간 ~ 40,000 cpm (~ 0.5 ng)의 ³²P-표지된 올리고뉴크레오타이드로 배양하였다. NF-κB·p65 소단위체에 의한 수퍼 쉬프트 분석을 위하여, p65 항체를 포함하는 핵 추출물을 사용하였다. 샘플들은 10 V/cm로 5% PAGE로 분리하였다. 그 젤을 건조하고 코닥 Biomax MS 필름(Rochester, NY)에 -70 ℃에서 1-24시간 노출하였다.

실시예 9: 세포 배양

B16F10 쥐(murine) melanoma 세포들과 NIH3T3 섬유아세포(한국 세포주 은행)는 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 10% 태반 소 혈청(HyClone Labs, USA)을 포함하는 DMEM에서 37 ℃, 5 % CO₂ / 95 % 공기 하에서 배 양하였다. 세포들을 6-웰 플레이트(4 X10⁶ 세포/웰)에서 37 ℃, 5 % CO₂ / 95 % 공기 하에서 배양하였다. 멜라닌 정량과 웨스턴 블럿 실험을 위하여, B16F10 세포(5 X10⁶ 세포/웰)을 6웰 플레이트로 옮기고 배양하였고, NIH3T3 세포(1 X10⁴ 세포/웰)을 96웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 세포 증식 분석을 위하여 배양하였다.

실시예 10: 세포 증식의 측정

세포 증식에 대한 효과를 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium blomide (MTT)를 사용하는 비색분석을 수행하였다. NIH3T3 세포(1X10⁴ 세포/웰)을 가지는 200㎕ 배지를 브랭크 대조군을 위하여 8웰을 제외하곤 96웰 플레이트에 플레이트하고 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 배양하였다. 2㎕의 80% 에탄올 추출물[최종 농도: 10, 30, 50, 100, 150, 및 200 g/ml 스톡 용액: 100 mg / 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) + 4 ml DMEM(1% FBS 포함)]을 각 웰에 첨가한 후 그 플레이트를 150 rpm에서 5 분간 진탕하였다. 그 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 3일간 배양한 후 20㎕의 신선하게 제조된 MTT 용액[5 mg/ml in PBS, pH 7.5]을 각 웰에 첨가한 후 150 rpm에서 5 분간 진탕하였다. 그 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 3시간 배양한 후 플레이트를 세척하고 건조하였다. 각 웰에 있는 MTT 대사산물인 불용성 formazan을 200㎕ propan-2-ol에 녹였다. 각 웰의 흡광도를 570 nm 테스트 파장과 630 nm 레퍼런스 파장을 사용하여 마이크로플레이트 리더(VERSAmax, Molecular Devices, USA) 로 읽었다. 대조군 세포에 의하여 형성된 formazan 흡광도를 100%로 하였다.

실시예 11: 타이로시네이즈 효소 분석

본 발명의 타이로시네이즈 저해 활성을 측정하기 위하여 시판중인 타이로시네이즈를 사용하였다. 그 효소분석은 노 등의 방법 (1999, Life Sci., 65, 241-246)을 변형하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 그 효소반응은 다른 반응 혼합물에 기질인 L-타이로신을 첨가하여 시작하고, 200㎕의 전체 부피: 50㎕의 6 mM L-타이로신과 150㎕의 다른 반응 혼합물(40㎕의 200 units/ml 버섯 타이노시네이즈, 100㎕의 100 mM sodium phosphate 버퍼 (pH 6.7),와 ephedrannin K (최종 농도: 1에서 1,000 ㎍/ml)의 10㎕ 메탄올 용액)에서 37 ℃에서 40분간 배양한 후 그 반응을 475 nm 파장을 사용하여 마이크로플레이트 리더(VERSAmax, Molecular Devices, USA) 로 측정하였다. 매 측정시 비효소반응의 효과를 고려하여 효소를 첨가할 때 측정된 값으로부터 감하였다. 또 각 측정 물질의 10㎕ 메탄올 대신에 10㎕ 메탄올을 대조반응으로 사용하였다.

실시예 12: 멜라닌 양의 결정

B16F10 세포의 멜라닌 양에 대한 ephedrannin K 효과를 조사하기 위하여, 멜라닌 양은 Hosoi 등(Cancer Res., 45, 1474-1478 (1985))의 변형된 방법에 의하여 결정하였다. 6웰 플레이트에 웰당 5X 10⁴ B16F10 세포를 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 밤새 배양한 후 웰을 새로운 배지: 2 ml의 DMEM[5% 소태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 100 g/ml 스트렙토마이신, 및 ephdrannin K (최종농도: 1, 2, 3, 및 4 ㎍/ml; 스톡용액: 100 mg / 1 ml DMSO + 4 ml DMEM(1% FBS 포함)]로 교환하였다. 알파-MSH (melanocyte stimulating hormone)를 양성 대조군으로 사용하였다. ephedrannin K를 포함하는 새로운 배지를 가지는 세포를 37 ℃, 5 % CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 48시간 배양한 후, 세척하고, 각 웰에 있는 세척된 세포들을 웰로부터 덜어내서 200㎕의 0.25% trypsin-EDTA로 트립신 처리하여 수집하고 마이크로센트리푸즈 투브로 옮긴 후 2,800 rpm에서 3 분간 원심분리하였다. 그 침전된 세포를 PBS로 2회 세척 후 10% DMSO을 포함하는 200㎕의 1 M NaOH에 녹였다. 그 녹인 용액을 멜라닌 용해를 위하여 80 ℃에서 1시간 배양하였다. 각 마이크로센트리후즈 투브의 멜라닌 양을 475 nm에서 흡광도를 측정하여서 분광계적으로 결정하였다.

실시예 13: 웨스턴 블럿 분석

B16F10 세포에서 타이로시네이즈 단백질 레벨에 대한 ephedrannin K의 효과를 조사하기 위하여, 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 6-웰 플레이트에 옮겨진 웰당 5 X10⁴ B16F10 세포를 37 ℃에서 5% CO₂ 환경에서 밤새 배양한 후 각 웰로부터 배지를 제거하고 새 배지: 2 ml의 DMEM[(5% fetal bovine serum, 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 및 ephedrannin K (최종 농도: 1, 2, 3, 및 4 ㎍/ml; 스톡 용액: 100 mg / 1 ml DMSO + 4 ml DMEM(1% FBS 포함)을 포함)로 교환하였다. ephedrannin K를 포함하는 새 배지를 가지는 웰 플레이트 속의 세포를 37 ℃에서 5% CO₂ 환경에서 48시간 배양한 후, 각 웰에 있는 배지를 제거하고 세포를 PBS 버퍼로 2회 세척하였다. 각 웰에 있는 세척된 세포를 웰로부터 떼어내어서 200㎕의 0.25% trypsin-EDTA로 트립신처리하여 수집하여 마이크로센트리후즈 투브로 옮겨서 2,800 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 그 침전된 세포들을 PBS 버퍼로 2회 세척하고 세포 라이시스 버퍼(RIPA 버퍼): 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 2mM EDTA를 포함하는 50 mM Tris·HCl (pH 7.5)로 라이시스시켰다. 라이시스 후 세포 추출물을 12,000 g, 4 ℃에서 20 분간 원심분리시킨 후 상등액으로부터 얻었다. 세포 추출물 내의 단백질(50 ㎍의 단백질)을 10% SDS-PAGE로 분리하여 나이트로셀루로스 막으로 옮겼다. 트랜스퍼 막을 0.1 % Tween 20 (PBST)을 가지는 5 % 탈지분유 단백질로 블록한 후 1% 탈지분유를 포함하는 PBST내의 타이로시네이즈 항체로 프로브하였다. 3회 세척 후, 막을 양고추냉이과산화효소 부착된 2차 항체로 1시간 교잡하고, PBST로 5회 세척하였다. 세척 후 그 막을 ECL 시약으로 2분 배양 한 후 X-레이 필름에 노출시켰다.

본 발명의 결과는 적어도 3회 반복한 평균 ±표준편차로 나타내었다. 스투던트 t-test는 언급된 편차의 통계 분석에 사용되었다. 0.05 이하의 P 값들을 통계적으로 유효하다고 간주하였다.

상기의 실시예의 결과는 다음과 같다.

Ephedra 뿌리로부터 항-염증 성분의 분리

기초 실험으로부터 상당한 항-염증 활성을 나타낸 마황 뿌리의 80 % 에탄올 추출물(12.85 % 수율)로부터 활성 성분을 분리하기 위하여, 80 % 에탄올 추출물을 물에 녹이고 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순서로 연속적인 용매 추출을 수행하였다. 수율은 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 각각 6.84 %, 35.91 %, 및 17.91% 이었다. 최종 수층에 26 %의 80 % 에탄올 추출물이 남아있었다. 이들 추출물 중에서, NO의 생성을 감소시키는 항-염증 활성은 에틸아세테이트 추출물에서 관찰되었고 이 추출물의 많은 성분들이 TLC에서 확인되었다. 항-염증 성분을 분리하기 위하여 연속적인 실리카겔 컬럼을 여러 단계 그래디언트 용출 시스템을 사용하여 3회 수행하였다. CHCl₃ : MeOH = 20 : 1에서 CHCl₃ : MeOH = 1 : 1 (v/v)로 단계 그래디언트 일루션을 사용한 첫 번 컬럼에서, 항-염증 활성을 나타내는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 용액에서 얻었고 수율은 에틸아세테이트 분획과 비교하여 50.51 %이었다. CHCl₃ : MeOH = 10 : 1에서 CHCl₃ : MeOH = 1 : 1 (v/v) 단계 그래디언트 일루션을 사용한 두 번째 컬럼에서, 항-염증 활성을 가지는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 9 : 1 용출 용액에서 얻었고 그 수율은 1.21 %이었다. CHCl₃: MeOH = 15 : 1에서 CHCl₃: MeOH = 5 : 1 (v/v)인 세 번째에서, 항-염증 활성을 보이는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 15 : 1 용출용액에서 얻었으며 그 분획은 TLC에 의하여 단지 한 성분만이 동정되었다. 재결정 후 무정형 황색 분말이 얻어졌고 최종 수율은 0.06 %이 었다.

마황근으로부터 몇 용매 추출물 사이의 타이로시네이즈 저해 효과 비교

본 발명에서는 버섯에서 유래한 타이로시네이즈를 사용하여 저해 활성을 조사하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 80 % 에탄올 추출물(12.85 % 수율)의 100㎍/ml는 66.4%의 타이로시네이즈 저해 활성을 농도 의존적으로 나타내었다. 성분을 분리하기 위하여, 80 % 에탄올 추출물을 물에 녹이고 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 순서로 연속적인 용매 추출을 수행하였다. 수율은 헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 각각 6.84 %, 35.91 %, 및 17.91% 이었다. 최종 수층에 26 %의 80 % 에탄올 추출물이 남아있었다. 가장 높은 저해 활성(75.6%)이 에틸아세테이트 추출물에서 관찰되었고 이 추출물의 많은 성분들이 TLC에서 확인되었다. 타이로시네이즈 저해 성분인 ephedrannin K를 에틸아세테이트 추출물로부터 분리하기 위하여 연속적인 실리카겔 컬럼을 여러 단계 그래디언트 용출 시스템을 사용하여 3회 수행하였다.

CHCl₃ : MeOH = 20 : 1에서 CHCl₃ : MeOH = 1 : 1 (v/v)로 단계 그래디언트 일루션을 사용한 첫 번 컬럼에서, 가장 효과적인 타이로시네이즈 저해 활성을 나타내는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 10 : 1 용액에서 얻었고 수율은 에틸아세테이트 분획과 비교하여 50.51 %이었다. CHCl₃ : MeOH = 10 : 1에서 CHCl₃ : MeOH = 1 : 1 (v/v) 단계 그래디언트 일루션을 사용한 두 번째 컬럼에서, 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 9 : 1 용출 용액에서 얻었고 그 수율은 1.21 %이었다. CHCl₃: MeOH = 15 : 1에서 CHCl₃: MeOH = 5 : 1 (v/v)인 세 번째에서, 가장 효과적인 타이로시네이즈 저해 활성을 보이는 분획은 CHCl₃ : MeOH = 15 : 1 용출용액에서 얻었으며 그 분획은 TLC에 의하여 단지 한 성분만이 동정되었다. 재결정 후 무정형 황색 분말이 얻어졌고 최종 수율은 0.06 %이었다. 무정형 황색 분말을 재결정화 후에 얻었고 최종 수율은 0.06 %이었다. 이 결과는 에틸아세테이트 추출물로부터 분리된 ephedrannin K가 80% 에탄올 추출물과 그것의 에틸아세테이트 추출물에서 저해 활성을 보이기 때문에 타이로시네이즈 저해 활성을 보인다는 것을 나타낸다.

정제된 성분의 구조분석

정제된 성분의 구조 및 분자량 분석은 TLC/MS, LR-FABMS, 및 HR-FABMS 분광기 뿐 아니라 FT-IR, UV/Vis, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT-NMR 분광기 및 COSY, HMQC, and HMBC와 같은 2D-NMR 실험을 사용하여 수행되었다. ¹H-NMR (DMSO-d6, 400MHz)에 의해 분석된 데이터는 δ: 12.59 (1H, s, 14'-OH), 10.14 (1H, s, 5'-OH), 9.65 (1H, s, 14-OH), 9.62 (1H, s, 7-OH), 9.54 (1H, s, 3'-OH), 9.20 (1H, s, 5-OH), 8.45 (2H, d), 7.44 (2H, d), 6.98 (2H, d), 6.81 (2H, d), 6.32 (1H, s), 5.95 (1H, d), 5.89 (1H, d), 5.6 (1H, d), 4.77 (1H, d) and 4.12 (1H, t). 또 ¹³C-NMR (DMSO-d6, 100MHz)에 의해 얻은 데이터는 δ: 176.1 (C'-4), 159.3 (C'-5), 158.4 (C'-14), 158.2 (C'-7), 157.8 (C-9), 157.1 (C-5), 155.4 (C-7), 152.8 (C'-9), 150.8 (C-14), 147.5 (C'-2), 135.9 (C'-3), 131.1 (C-11), 130.2 (C'-12), 130.2 (C'-16), 126.8 (C-12), 126.8 (C-16), 121.9 (C-11), 115.3 (C-13), 115.3 (C-15), 114.9 (C'-13), 114.9 (C'-15), 104.2 (C'-9), 103.6 (C-10), 103.6 (C'-8), 98.9 (C-2), 98.2 (C'-6), 96.0 (C-6), 94.3 (C-8), 32.9 (C-3), 및 19.9 (C-4)이었다. 이들 기초 데이터 및 2D 스펙트럼 데이터로부터 그 구조를 유추하여 도 1에 도시하였다. 이 구조의 계산된 분자량은 540 amu 이고 그 구조식은 C₃₀H₂₀O₁₀이었다. 이 구조는 LC/MS 네가티브 모드 m/z 538.87[C₃₀ H₂₀ O₁₀-H]^－에서 온 데이터와 잘 일치하였고(도 2) LR-FABMS 및 HR-FABMS 분광기에서 온 데이터로 더 확인하였다. 결론적으로 항-염증 활성을 보이는 정제된 화합물은 ephedrannin K (도 3)로 명명하였다. 또 본 발명에서 사용된 1, 2, 및 4 ㎍/ml의 ephedrannin K는 약 1.85, 3.70, 그리고 7.40 μM이었다.

NO 생성 및 iNOS 유전자 발현에 대한 ephedrannin K 효과

LPS-자극된 쥐 대식 세포주인 RAW264.7 세포는 대식세포 매개된 염증 반응 모델로 사용되기 때문에 NO 생성에 대한 ephedrannin K의 효과를 1.85, 3.70, 또는 7.40 μM의 농도에서 배양된 세포를 사용하여 조사하였다. ephedrannin K의 세포독 성 효과는 이들 실험 조건하에서는 관찰되지 않았다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명자들은 나이트라이트, iNOS 단백질 및 iNOS 전사체 레벨이 면역 자극제인 세균 LPS 상에서 RAW264.7 세포에서는 상당하게 업-조절되었다는 것을 관찰하였다. 그러나 그 LPS-유도된 NO 생성은 ephedrannin K 첨가에 의하여 용량 의존적으로 현저하게 감소되었다(도 4A). 대략 LPS에 의하여 유도된 NO 생성의 85%가 4 ㎍/ml (7.40 μM) ephedrannin K에 의하여 저해되었다. ephedrannin K은 iNOS 유전자 발현의 저해를 통하여 NO 생성을 저해하였는지를 이해하기 위하여, 본 발명자들은 ephedrannin K 존재하에서 LPS에 의하여 처리된 세포에서 iNOS의 mRNA 레벨 및 단백질을 조사하였다. 웨스턴 블럿 및 RT-PCR 분석은 LPS-자극된 세포에서 iNOS의 mRNA 레벨 및 단백질의 수준을 농도 의존적으로 현저하게 감소시켰다(도 4B 및 4C)는 것을 보였다. 또 이들 결과들은 ephedrannin K가 iNOS mRNA 전사를 다운-조절하여서 NO 생성을 저해한다는 것을 나타낸다.

전구 염증( pro - inflammatory ) 사이토카인 발현에 대한 ephedrannin K 효과

본 발명자들은 ephedrannin K로 처리된 LPS-자극된 RAW264.7 세포에서 TNF-α 및/또는 IL-1β의 mRNA 발현 및 단백질을 비교하여 TNF-α 및 IL-1β과 같은 전구염증 사이토카인 생성에 대한 ephedrannin K 효과를 조사하였다. 도 5 및 6에서 알 수 있는 바와 같이, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현 및 단백질 모두가 LPS에 의하여 크게 유도되었다. Ephedrannin K는 용량의존적으로 배양 배지로 분비되는 TNF-α 및 IL-1β의 양을 크게 감소시켰다(도 5A 및 6A). 7.4 M의 Ephedrannin K는 배양배지에서 LPS-유도된 TNF-α 및/또는 IL-1β 수준을 각각 84%와 81% 감소시켰다. 더 깊은 조사를 위하여 LPS-자극된 세포에서 프로-TNF-α 및/또는 프로-IL-1β 단백질 및 mRNA 수준을 ephedrannin K 존재 하에서 조사하였다. 프로-TNF-α 및 프로-IL-1β는 세포 내에서 합성되어 각각 TNF-α-전환효소 및 IL-1β-전환 효소에 의하여 각각 그 활성형태로 절단된다. 이 번역후 변형은 배양배지에 성숙한 TNF-α 및 IL-1β의 분비를 야기한다. 도 5B 또는 6B, 및 도 5C 또는 6C에서 알 수 있는 바와 같이, 프로-TNF-α 및/또는 프로-IL-1β 단백질 및 mRNA 수준은 ephedrannin K에 의하여 농도-의존적으로 감소하였다. 이들 결과는 ephedrannin K이 전사 수준에서 TNF-α와 IL-1β 발현을 저해한다는 것을 나타낸다.

NF -κB 활성화에 대한 ephedrannin K 효과

ephedrannin K가 전사 수준에서 TNF-α와 IL-1β와 같은 사이토카인들과 iNOS 발현을 저해하기 때문에, 본 발명자들은 EMSA를 사용하여 LPS-자극된 RAW 264.7 세포의 핵 추출물에서 DNA에 대한 NF-κB 결합능력을 저해하는지를 조사하였다. 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, LPS는 대조군과 비교하여 DNA에 결합된 NF-κB를 증가시켰다. Ephedrannin K는 농도 의존적으로 DNA에 결합된 NF-κB를 현저하게 감소시켰다. DNA에 결합된 NF-κB에서 증가는 NF-κB의 주된 구성요소인 p65에 대한 증가된 항체의 첨가가 젤에서 DNA에 결합된 NF-κB·p65 복합체의 수퍼 쉬프트를 만들었다는 사실에 의하여 더 확인하였다(도 7A). 도 7B는 LPS는 농도-의존적으로 ephedrannin K에 의하여 크게 감소한 인산화된 IκB의 양을 크게 증가시키 는 것을 나타낸다. ephedrannin K (7.4 μM)에 의한 인산화된 IκB의 생성에 대한 저해 효과는 공지된 IκB 저해제인 쿠르쿠민(20 μM)에 의한 것 보다 더 우수하였다 (도 7C). 이 결과는 ephedrannin K가 IκB의 인산화를 저해한다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 ephedrannin K가 LPS-자극된 RAW 264.7 세포들에서 IκB 인산화를 저해하여 핵 속으로 활성 NF-κB의 전이를 저해한다는 것을 나타낸다.

NIH3T3 세포 증식에 대한 마황근으로부터 추출된 80% 에탄올 추출물의 효과

세포 독성에 대한 본 발명의 추출물의 효과를 조사하기 위하여, 정상 섬유아세포 세포인 NIH3T3를 여러 농도의 80% 에탄올 추출물(10에서 200 ㎍/ml)에 72시간 노출하였다. 80% 에탄올 추출물은 비처리 대조군과 비교하여서 어떤 농도에서도 세포 증식에 대한 현저한 효과를 나타내지 않았다(도 9). 이 결과는 80% 에탄올 추출물 뿐아니라 그 80% 에탄올 추출물로부터 분리된 물질도 NIH3T3 세포들의 증식에 영향이 없다는 것을 나타내고 더더욱 이들 물질들은 정상 세포인 NIH3T3의 증식에 영향을 주지 않으므로 B16F10 멜라노마 세포의 증식에도 영향을 주지 않을 것이라는 것을 알 수 있다.

멜라닌 양에 대한 ephedrannin K 효과

멜라닌을 생산하는 것을 지속하는 B16F10 세포를 사용하여 ephedrannin K의 존재 또는 부존재하에서 타이로시네이즈 활성의 저해와 멜라닌 양이 직접적으로 관련되어 있는지를 조사하였다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, B16F10 세포를 여러 용량의 ephedrannin K로 처리할 때, 멜라닌 양은 대조군과 비교하여 ephedrannin K의 첨가에 의하여 용량 의존적으로 현저하게 감소한다. 대략 60%의 멜라닌 생성이 4 ㎍/ml (7.40 μM) ephedrannin K에 의하여 저해된다. 이 결과는 ephedrannin K가 멜라닌 합성의 큰 저해를 나타낸다는 것을 보여준다.

타이로시네이즈 발현에 대한 ephedrannin K 효과

ephedrannin K가 멜라닌 합성의 조절에 중요한 역할을 한다는 직접적인 증거를 얻기 위하여, 본 발명자들은 ephedrannin K를 처리한 B16F10 세포와 처리하지 않은 B16F10 세포에서 타이로시네이즈의 단백질 레벨을 비교하여 타이로시네이즈 단백질 생산에 대한 ephedrannin K 효과를 조사하였다 . 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 웨스턴 블럿 분석은 ephedrannin K가 농도 의존적으로 세포에서 타이로시네이즈 단백질의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 알 수 있다. 이 결과는 ephedrannin K가 타이로시네이즈 단백질의 발현을 다운-조절하여서 멜라닌 생성을 저해한다는 것을 알 수 있다.

도 1은 NMR 데이터로부터 얻은 ephedrannin K 구조이다.

도 2는 음 이온 모드에서 Ephedrannin K의 질량 스펙트럼이다.

도 3은 ephedrannin K의 구조이다.

도 4는 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성 및 iNOS 유전자 발현에 대한 ephedrannin K 효과를 나타냄. (A)는 Griess 시약들을 사용하여 16시간 후 측정된 배양 배지에서 일산화질소 레벨. 데이터는 평균 ±S.D.로 표시(단일 실험에서 n = 4). **, P ＜ 0.01; ***, P ＜ 0.001 vs. 대조군. (B)는 웨스턴 블럿에 의해 16시간 후 측정된 세포 추출물에서 iNOS 단백질 수준. 그 블럿은 단백질의 동일 로딩을 증명하기 위하여 액틴 항체로 재교잡됨. (C)는 RT-PCR 분석에 의하여 8시간 후 측정된 세포 추출물에서 iNOS mRNA 레벨. 액틴은 내부 대조군으로 사용.

도 5는 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 TNF-α 생성 및 TNF-α 유전자 발현에 대한 ephedrannin K 효과를 나타냄. (A)는 ELISA를 사용하여 16시간 후 측정된 배양 배지에서 TNF-α 단백질 수준. 데이터는 평균 ±S.D.로 표시(단일 실험에서 n = 4). ***, P ＜ 0.001 vs. 대조군. (B)는 웨스턴 블럿에 의해 16시간 후 측정된 세포 추출물에서 pro-TNF-α 단백질 수준. 그 블럿은 단백질의 동일 로딩을 증명하기 위하여 액틴 항체로 재교잡됨. (C)는 RT-PCR 분석에 의하여 8시간 후 측정된 세포 추출물에서 pro-TNF-α mRNA 레벨. 액틴은 내부 대조군으로 사용.

도 6은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 IL-1β 생성 및 IL-1β 유전자 발현에 대한 ephedrannin K 효과를 나타냄. (A)는 ELISA를 사용하여 16시간 후 측정된 배양 배지에서 IL-1β 단백질 수준. 데이터는 평균 ±S.D.로 표시(단일 실험에서 n = 4). *, P ＜ 0.05; **, P ＜ 0.01; ***, P ＜ 0.001 vs. 대조군. (B)는 웨스턴 블럿에 의해 16시간 후 측정된 세포 추출물에서 pro-IL-1β 단백질 수준. 그 블럿은 단백질의 동일 로딩을 증명하기 위하여 액틴 항체로 재교잡됨. (C)는 RT-PCR 분석에 의하여 8시간 후 측정된 세포 추출물에서 pro-IL-1β mRNA 레벨. 액틴은 내부 대조군으로 사용.

도 7은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 phospho-IκB 생성 및 NF-κB 활성화에 대한 ephedrannin K 효과. (A)는 NF-κB-특이적이고 ³²P-표지된 이중 가닥 올리고뉴크레오타이드에 결합된 핵 추출물에서 활성 NF-κB 레벨. ³²P-표지된 이중 가닥 올리고뉴크레오타이드에 결합된 활성 NF-κB 레벨을 20분간 과량(1000 배)의 콜드 올리고뉴크레오타이드의 존재 또는 부존재에서 ³²P-표지된 이중 가닥 올리고뉴크레오타이드로 핵 추출물(10 ㎍ 단백질)로 배양 후 EMSA 방법을 사용하여 조사. LPS에 의하여 핵에서 NF-κB의 증가는 마지막 라인에서 p65 항체의 첨가에 의하여 올리고뉴크레오타이드-결합된 NF-κB의 수퍼 쉬프트를 통하여 조사. (B)는 웨스턴 블럿에 의해 2시간 후 측정된 세포 추출물에서 인산화된 IκB 수준. 그 블럿은 단백질의 동일 로딩을 증명하기 위하여 액틴 항체로 재교잡됨. (C)는 쿠르쿠민과 ephedrannin K 사이에 인산화된 IκB 생성에 대한 저해 효과를 비교한 것. 방법은 (B) 실험과 동일.

도 8은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 인산화된 p38 MAPK, 인산화된 JNK, 및 인산화된 ERK 생성에 대한 ephedrannin K 효과. 웨스턴 블럿에 의하여 세포 추출물에서 (A) 인산화된 p38 MAPK, (B) 인산화된 JNK, 및 (C) 인산화된 ERK 레벨을 측정. 동일 단백질 로딩을 확인하기 위하여 그 블럿들을 총 p38, JNK, 및 ERK에 대한 특정 항체로 재교잡. ephedrannin K에 의하여 인산화된 p38 MAPK, 인산화된 JNK, 또는 인산화된 ERK 생성에 대한 저해 효과를 그것의 특이적 저해제인, SB203580, SP600125, 또는 U0126에 의하여 각각 비교.

도 9는 세포 증식에 대한 80% 에탄올 추출물의 효과를 나타낸 그래프.

도 10은 멜라닌 양에 대한 ephedrannin K의 효과를 나타낸 그림.

도 11은 B16F10 세포에서 타이로시네이즈 단백질의 발현에 대한 ephedrannin K의 효과를 나타낸 그림.

<110> LEE, HEE-BONG KIM, IK-SOO <120> A novel compound, ephedrannin K, and the use thereof <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS specific primer <400> 1 tttggagcag aagtgcaaag tctc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS specific primer <400> 2 gatcaggagg gatttcaaag acct 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha specific primer <400> 3 atgagcacag aaagcatg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha specific primer <400> 4 tcacagagca atgactcc 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta specific primer <400> 5 atggcaactg ttcctgaac 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta specific primer <400> 6 taggaagaca cggattc 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin specific primer <400> 7 tccttcgttg ccggtccaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin specific primer <400> 8 cgtctccgga gtccatcaca 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kappaB-specific oligonucleotide <400> 9 agttgagggg actttcccag gc 22

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물.

   

   [화학식 I]
6. 제 5항에 있어서, 상기 화합물은 멜라닌 생성 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.

Images