KR100932835B1

KR100932835B1 - 카뎁신 케이의 활성을 저해하는 번데기동충하초 추출물

Info

Publication number: KR100932835B1
Application number: KR1020030017703A
Authority: KR
Inventors: 이정희; 신정걸; 백영진
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2003-03-21
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2009-12-21
Also published as: KR20040083149A

Abstract

본 발명은 골다공증에 관여하는 효소인 카뎁신 K(Cathepsin K)의 활성을 억제하는 작용을 하는 번데기동충하초 추출물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 번데기동충하초에 증류수를 첨가하여 90 내지 100℃에서 가열 (끊는 물에 중탕)하고, 중탕된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조한 추출물로서 카뎁신 K효소의 활성을 억제하여 골다공증을 예방하고 치료할 수 있는 물질과 이의 제조방법에 관한 것이다.

이러한 본 발명은, 번데기동충하초 추출물은 카뎁신 K 효소 활성을 효과적으로 억제하는 효과가 있으며, 상기 눈꽃 동충하초 추출물의 유효성분을 포함하여 약 또는 기능성식품을 만들면 골다공증 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 특히, 칼슘제제에 상기 번데기동충하초 추출물의 유효성분을 추가하는 경우 골다공증 예방 및 치료를 위한 의약품을 만들 수 있다.

번데기동충하초, 카뎁신K, 골다공증

Description

카뎁신 케이의 활성을 저해하는 번데기동충하초 추출물{MATERIAL FOR INHIBITING ACTIVITY OF CATHEPSIN K BY EXTRACTING OF CORYCEPS MILITARIS}

도1는 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 번데기동충하초 추출물의 농도별 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프,

도2은 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 번데기동충하초 부위에 따른 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프,

도3은 본 발명에 따른 일실시예에 있어서, 번데기동충하초의 음이온교환수지 분획물의 카뎁신 K 활성을 나타낸 그래프.

본 발명은 골다공증에 관여하는 효소인 카뎁신 K(Cathepsin K)의 활성을 억제하는 작용을 하는 번데기동충하초 추출물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 번데기동충하초에 증류수를 첨가하여 90 내지 100℃에서 가열(끊는 물에 중탕)하고, 중탕된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상 등액을 동결건조한 추출물로서 카뎁신 K효소의 활성을 억제하여 골다공증을 예방하고 치료할 수 있는 물질과 이의 제조방법에 관한 것이다.

골다공증을 비롯한 골대사 관련 질환은 생활수준의 향상, 노인인구의 증가로 인해 매년 증가될 것으로 예상된다. 영국의 경우 매년 15만명 정도가 골다공증에 의한 골절이 일어나며, 이로인해 매년 7억5천만 파운드가 지출된다고 한다. 미국의 경우 인구의 10%에 해당하는 2천5백만명의 골다공증 환자 중 매년 130만명 이상이 골절로 고생한다고 하며, 이와 관련된 치료비 규모가 200억 달러에 달한다고 한다. 우리나라의 경우 아직 정확한 통계자료가 없으나 골다공증 환자는 약 200만명으로 추정된다.

초기에는 아무런 증세도 없이 진행되는 골다공증은 45세 여성의 50%에서 진행되며, 75세이상 여성의 90%는 심한 골다공증이 있다고 한다.

카뎁신 K는 최근에 발견된 papain계열의 cystein protease로서, 골조직의 재흡수에 관여하는 중요한 단백질이다(Bromme et al., 1995, Bossard et al., 1996). Bone Remodeling에서 재흡수 단계는 뼈의 표면에 부착되어 있는 파골세포에 의해 이루어진다. 파골세포는 낮은 pH를 유지하고 있는 resorption pit에 카뎁신 K와 같은 단백분해효소를 분비한다(D'Alessio et al., 1999). 카뎁신 K는 효과적인 collagenase로서 typeI과 typeII 콜라겐을 절단한다(Bromme et al., 1999). 골다공증은 파골세포에서 뼈의 재흡수 속도가 조골세포에서의 뼈의 생성 속도보다 빠르게 나타나므로 카뎁신 K의 이런 작용은 골다공증을 치료하기 위한 효과적인 drug target으로 생각되고 있다. 그래서 현재 골다공증을 예방, 치료하기 위해서 카뎁 신 K에 대한 억제물질을 찾기 위한 연구가 진행되고 있다.

현재까지 알려진 카뎁신 K의 억제물질은 alkoxymethylketone(Marquis, Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 581-588), NO donors(Percival, Biochemistry, 1999, 38, 13574-13583), 카뎁신 K의 propeptide(Billington, Biochem. Biophy. Res. Comm., 2000, 276, 924-929)등이 알려져 있다.

본 발명은 골다공증에 효과를 나타내는 번데기동충하초 추출물 및 그 제조방법을 제공하며, 상기 번데기동충하초 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 의한 번데기동충하초 추출물은, 번데기동충하초로부터 추출되며 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 골다공증 예방 및 치료용 조성물과 기능성 식품은 상기 번데기동충하초 추출물을 유효성분으로 포함한다.

한편, 본 발명에 의한 번데기동충하초 추출물의 제조방법은, 번데기동충하초에 증류수를 첨가하여 90 내지 100℃에서 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 번데기동충하초 추출물은, 번데기동충하초에 에탄올을 첨가하여 60℃에서 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 카텝신 K 억제 효과가 있는 조성물을 제조하는데 이용되는 동충하초란 넓은 의미에서 곤충을 포함한 절지동물, 균류 또는 고등식물의 종자에 기생하는 균류에 속하는 모든 균류를 말한다. 지금까지 곤충에 침입하는 동충하초균은 세계적으로 약 800여종으로 알려졌다. 이들 중에서 버섯을 형성하는 것으로 알려진 것은 대부분 자낭균류의 동충하초속(Cordyceps)에 속하는 균들로서 모두 300여종이 보고되었다. 지금까지 한국에서 동충하초로 채집, 분류된 것은 78종이며, 대표적인 것으로 번데기동충하초(Cordyceps militaris), 유충흙색다발동충하초, 큰매미동충하초, 노린재동충하초, 눈꽃동충하초(Peacilomyce sjaponica), 백강균, 녹강균 등이 있다(성재모 등, 버섯학,1998, 교학사).

번데기동충하초는 여름과 가을에 산림 내 낙엽, 땅속에 묻힌 인시류의 번데기, 유충 등에 기생하여 단생 또는 속생하며, 전세계에 분포한다. 자실체의 높이는 3-6cm로 곤봉형이며, 1개의 번데기의 머리 부분 또는 가슴부분에서 1-4개의 자실체가 발생한다(박완희, 한국의 버섯, 2002, 교학사).

동충하초는 여러 가지 질병에 대한 약리적 효능을 갖기 때문에 많은 관심과 연구의 대상이 되고 있다. 동충하초는 동의치료에서 폐와 신장을 돕고 피를 멈추며 가래를 삭인다고 하기 때문에 강장, 진정, 기침멎이로 사용되며, 또한, 몸이 허약해진 경우로 기침, 각혈, 폐결핵, 땀흘리기, 빈혈, 양위, 유정, 허리아픔에도 사용된다(약초의 성분과 이용, 1999, 일월서각).

본 발명자는 식용 식물 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 억제하는 추출물에 대해 연구하는 과정에서 번데기동충하초의 열수 추출물이 카뎁신 K를 강하게 억제하는 것을 발견하였다.

본 발명의 번데기동충하초 추출물 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 즉, 번데기동충하초만을 채취하여 그대로 또는 건조하여 잘게 자른 후 물, 에탄올, 메탄올 등의 극성 용매 및 에테르, 헥산 등의 비극성 용매를 가하여 추출할 수 있지만, 극성 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 추출물은 일반 식품과 건강보조식품에 첨가하여 사용될 수 있으며, 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조하여 약제학적 제제로 제형화하여 이용할 수도 있다. 또한, 필요에 따라 번데기동충하초 추출물 이외에 골다공증을 예방 또는 치료하는데 사용하는 공지물질 또는 새로운 물질을 추가로 포함하여 상승작용을 발휘하도록 할 수도 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 번데기동충하초로부터 열수 추출물 제조

우리나라에서 채집한 번데기동충하초를 자실체와 번데기에 형성된 내생균핵 등의 부위별로 25g씩 파쇄하여 취하고 증류수 250ml를 첨가하고, 100℃에서 4시간 추출(뚜껑을 덮고 중탕하였으므로 4시간 가열후에 남은 용액도 처음과 거의 동일) 한 후, 원심분리하여 상등액을 얻었다.

[실시예2] 번데기동충하초의 열수 추출물의 농도에 따른 카뎁신 K 저해 활성

실시예1에서 얻는 동충하초의 열수 추출물을 동결건조한 후, 증류수에 농도별로 다시 녹인 용액을 시료 용액으로 사용하였다. 카뎁신 K의 활성은 형광성 기질인 Z-Leu-Arg-AMC(Carbobenzoxy-L-Leucyl-L-Arginine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide)를 pH5.5인 50mM MES(2-[N-Morpholino]ethane -sulfonic acid), 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 10%디메틸설포옥사이드(dimethyl sulfoide, DMSO)가 함유된 완충용액에 10μM이 되도록 녹인 후, 96 well plate에 200㎕ 첨가하고, 시료 용액 20㎕와 카뎁신 K 효소액 20㎕를 첨가한 후, 25℃에서 10분간 반응시켰다. Synergy HT(Bio-Tek산, Fluorescence, Absorbance, Luminescence 측정 가능한 기기)를 사용하여 여기(excitation)파장과 방사(emission)파장이 각각 360/40nm, 460/40nm인 조건에서 생성되는 형광을 측정한 결과, 표1 및 도1와 같이 나타났다. 표1 및 도2을 참고하면, 번데기동충하초 1mg/ml의 농도에서 카뎁신 K는 80%정도 억제되는 것으로 나타났으며, 0.2mg/ml의 농도에서 약 40%정도로 억제되는 것으로 나타났다.

<표 1> 번데기동충하초 열수 추출물의 농도에 따른 카뎁신 K의 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위 : FU

시간(분)	1mg/ml	0.2mg/ml	0.04mg/ml	증류수
0	51	69	76	84
1	53	86	103	119
2	58	105	130	153
3	62	124	155	187
4	70	142	179	219
5	75	160	202	249
6	80	177	223	278
7	87	194	245	305
8	94	209	266	332
9	101	226	286	358
10	108	242	305	384

[실시예3] 번데기동충하초의 추출부위에 따른 카뎁신 K 저해 활성 측정

실시예1에서 얻은 상등액을 동결건조한 후, 1.0 mg/ml의 농도가 되도록 증류수로 다시 녹인 후 시료 용액으로 사용하였다. 카뎁신 K의 억제활성의 측정은 실시예3과 동일하게 실시하였다. 그 결과 카뎁신 K의 저해 활성은 표2 및 도2와 같이 나타났으며 자실체 부위는 거의 대부분 억제되었으나, 번데기에 형성된 내생균핵은 약 50% 정도 밖에 억제활성을 나타내지 않았다.

<표 2> 번데기동충하초의 부위에 따른 카뎁신 K 활성량

(460/40nm에서의 형광)

단위:FU

시간(분)	자실체	내생균핵	증류수
0	61	67	78
1	62	76	104
2	63	87	133
3	69	98	161
4	71	112	187
5	75	124	217
6	81	138	247
7	83	153	277
8	88	167	305
9	92	184	333
10	97	198	361

[실시예4] 번데기동충하초 열수 추출물의 정제 분획물의 카뎁신 K 저해 활성

실시예1에서 얻은 번데기동충하초 열수 추출물의 상등액을 음이온 교환 수지인 Q-200 컬럼(Bio-Rad사)을 사용하여 정제한 후, 각각의 분획물에 대하여 카뎁신 K 저해 활성을 측정하였다(도3참조). 이때 이동상(移動相)으로는 50mM Tris·HCl완충용액(pH 7.5)과 1M NaCl이 첨가된 50mM Tris·HCl완충용액(pH 7.5)을 사용하였으며, 유속 3ml/min인 조건에서 정제를 실시하였다. 도3의 그래프 중 점선으로 그려진 그래프에서 볼 수 있듯이, 시료를 주입한 후로부터 이동상이 약 13ml 정도 흐른 뒤의 활성억제률이 약 80%로 최대가 되었으며, 이때의 OD_254nm 값도 837mAU로 최대를 나타내었다. 따라서, Q-200 컬럼(Bio-Rad사)을 이용하여 상기와 같은 조건으로 본 발명에 따른 번데기동충하초 추출물을 정제할 때는, 시료주입 후 이동상이 12-14ml 정도 흘렀을 때(3.5-4.5분) 정제된 추출물에 카뎁신 K의 활성을 억제하는 유효성분이 가장 많음을 알 수 있었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면, 번데기동충하초 추출물은 카뎁신 K 효소 활성을 효과적으로 억제하는 효과가 있으며, 상기 번데기동충하초 추출물의 유효성분을 포함하여 약 또는 기능성식품을 만들면 골다공증 예방 및 치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 특히, 칼슘제제에 상기 번데기동충하초 추출물의 유효성분을 추가하는 경우 골다공증 예방 및 치료를 위한 의약품을 만들 수 있다.

Claims

번데기동충하초로부터 추출되며 카뎁신 K효소의 활성을 저해하는 번데기동충하초 추출물.
제1항의 번데기동충하초 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 저해하는 유효성분을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물.
제1항의 번데기동충하초 추출물 중 카뎁신 K의 활성을 저해하는 유효성분을 포함하는 골다공증 예방용 기능성 식품.
제1항에 번데기동충하초에 의한 번데기동충하초 추출물의 제조방법으로서,증류수를 첨가하여 90 내지 100℃에서 가열하고, 가열된 용액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 상기 상등액을 동결건조하는 것을 특징으로 하는 번데기동충하초 추출물의 제조방법.