KR100931928B1 - P25/cdk5 저해 화합물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

A pharmaceutical composition for preventing or treating a neurodegenerative disease comprises a compound inhibiting a P25/CDK5(cycline-dependent kinase 5) complex as an active ingredient. Also disclosed is a method for screening a compound capable of preventing or treating a neurodegenerative disease, which comprises the steps of a) reacting a candidate compound with a P25/CDK5 complex and beta-site APP(amyloid precursor protein)-cleaving enzyme 1 (BACE1) or treating a mammalian cell expressing P25 with the candidate compound, and measuring BACE1 phosphorylation; and b) comparing the measured BACE1 phosphorylation with that of a control group employing no candidate compound, and identifying a compound reducing BACE1 phosphorylation compared to the control group. The compound inhibiting the P25/CDK5 complex may be useful for preventing or treating a neurodegenerative disease including Alzheimer's disease because it inhibits BACE1 phosphorylation and reduces the secretion of β-amyloid and the hyperphosphorylation of Tau.

Description

P25/CDK5 저해 화합물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING A P25/CDK5 INHIBITOR FOR PREVENTING OR TREATING A NEURODEGENERATIVE DISEASE}

본 발명은 P25/CDK5 저해 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 상기 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD)은 대표적인 노인성 퇴행성 뇌 질환으로 기억력과 인지기능의 장애로 시작되어 행동능력의 장애로까지 이어진다. AD는 수년 이상의 기간을 두고 점진적으로 악화되는 만성적 질환으로서, 환자뿐만 아니라 주위 가족들에게도 심각한 정신적 고통과 막대한 의료비 지출 등 여러 문제를 야기하고 있다. 하지만 현재까지 개발된 치료제들은 단지 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로, 병을 근본적으로 치료하거나 진행을 억제하는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

현재까지 AD 치료제 개발의 주 표적은 AD에서 나타나는 신경전달물질 이상으로, 특히 콜린성 신경세포를 표적으로 한 콜린에스테라제 억제제들 (Aricept, Exelon, Reminyl 등)이 현재 시판 중이다. 최근 FDA 승인된 글루타메이트 수용체의 길항제인 memantine도 대표적 신경전달물질인 글루타메이트의 분비 이상을 표적으로 한다. 하지만 이들 약물도 병의 진행 자체를 근원적으로 막을 수는 없다. 최근에는 AD의 주요 특징인 노인반 (amyloid plaque)을 이루는 β-아밀로이드(Αβ)를 주요 표적으로 하여 Αβ 생성에 중요한 역할을 하는 β-또는 γ-시크리테이즈를 억제하거나 생성된 Aβ를 분해하는 약물을 개발하려는 연구가 활발히 진행 중이다. 그러나, 이 경우는 인체 내에 정상적으로 존재하는 단백질을 표적으로 하므로 정상적인 기능을 저해할 수 있어 부작용이 예측된다. 그러므로 병적인 상태에서만 생성되고 병의 진행과 밀접하게 관련되어 있어, 이를 저해함으로써 병의 진행을 근원적으로 막을 수 있는 단백질을 약물개발의 표적으로 하는 것이 바람직하다.

최근에, P25가 AD 환자의 뇌에서 축적되어 있다고 알려졌다 (Patrick, G.N. et al, Nature 402: 615-622 (1999)). P25는 CDK5의 활성화 인자인 P35의 잘려진 C-말단 조각으로 P35와 같이 CDK5 (cycline-dependent kinase 5)를 활성화시킬 수 있다. CDK5의 가장 잘 알려진 기능은 발달 과정 중 신경조직의 생성과 유지를 조절하는 것이며, 이외에도 액틴 다이나믹스(actin dynamics), 미세관 안정성(microtubule stability), 액손 유도(axon guidance), 막 수송, 도파민 시그날링 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. CDK5는 신경조직에 광범위하게 분포하고 S(또는 T)PX(X)K(또는 R 또는 H) 보존적 모티프를 가진 단백질을 인산화시키며, Munc18, APP, P35, PAK1, Tau, β-카테닌(catenin), Nudel, DARPP32, 앰피파이신 1(Amphyphysin1)과 시냅신1(synapsin1) 등 다양한 기질이 알려져 있다 (Dhavan, R. and Tsai, L.H. Nature Review Molecular Cell Biology 2:749-759 (2001)).

Lee 등은 P25가 P35와 달리 신경독성을 나타내며, P35가 캘파인(calpain)에 의해 p10과 P25의 두 단백질 조각으로 분해된다는 사실을 발견했다 (Lee M.S. et al, Nature 405: 360-364 (2000)). P25는 P35에 있던 막에 부착시키는 미리스토일화(myristoylation) 신호 부분이 없기 때문에 세포 내를 돌아다니며 P35보다 훨씬 오랫동안 세포 내에 존재하므로 CDK5를 병적으로 활성화한다. CDK5는 여러 단백질들, 특히 세포 골격(cytoskeleton) 단백질 중 하나인 타우(tau)를 과인산화시키는데, 타우가 인산화되면 세포 골격 단백질들에 결합할 능력이 줄어들게 되고, 서로 뭉쳐 AD 환자의 주요 특징인 신경섬유다발(neurofibrillary tangles)을 형성하게 된다. AD에서 노인반 (senile plaque)을 일으키는 Aβ는 P35 가 P25로 분해되도록 유도할 수 있으며(Lee M.S. et al, 상기 문헌 참조), 최근에는 P25가 Aβ 분비를 증가시킴이 보고되었다(Lie, F. et al, FEBS Letters 547:193-196 (2003)). 그러므로 P25는 노인반(amyloid plaque)과 신경섬유다발(neurofibrillary tangles) 병리 사이의 분자적 링크로 관여하리라 생각된다. 이외에도 P25/CDK5 복합체는 세포체질(cytoskeleton) 파괴와 신경세포사(neuronal death) 등 다른 신경변성(neurodegeneration)과 연관되어 있는 것이 확인되었다(Patrick, G. N. et al, 상기 문헌 참조).

한편, AD 환자의 Aβ 축적이 일어나는 뇌 부위에서 Aβ 생성에 관여하는 분해 효소인 BACE1 (beta-site APP(amyloid precursor protein)-cleaving enzyme 1) 단백질의 양 및 활성의 증가가 보고되었으나 (Yang, L-B. et al, Nature Medicine 9:3-4 (2003); 및 Fulumoto, H. et al,, Arch neurol. 59:1381-1389 (2002)), 그 정확한 기전은 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 P25가 증가하면 CDK5가 활성화되어 BACE1을 인산화시키고, 또한 β-시크리테이즈 활성을 증가시킴으로써 Aβ 분비를 증가시킴을 발견하였고, P25/CDK5 저해 화합물들을 선별하여 이들이 BACE1의 인산화 및 Aβ 분비를 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 P25/CDK5 저해 화합물을 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 P25/CDK5 저해 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 포유동물에서 퇴행성 뇌질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ 또는 Ⅱ로 표시되는 P25/CDK5 저해 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다:

＜화학식 Ⅰ＞

상기 식에서,

R¹은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알콕시기, 또는 C₃-C₈ 사이클로알킬로 치환된 C₁∼C₄ 알킬포름아마이드이고,

R²는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₆ 알킬기이고,

R³는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₆ 알킬기, 또는 1∼3개의 헤테로 원자를 포함하는 포화 또는 불포화된 5원 또는 6원 헤테로고리 화합물이거나,

R² 및 R³는 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 1∼3개의 헤테로 원자를 포함하는 포화 또는 불포화된 5원 또는 6원 헤테로고리 화합물을 형성한다.

＜화학식 Ⅱ＞

상기 식에서,

R¹, R², R³, R⁶, R⁷ 및 R⁸은 각각 독립적으로 수소, 할로겐 원자, 비치환되거나 할로겐 원자로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₆ 알킬기, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₆ 알콕시기, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₆ 알킬에스테르이고,

R⁴ 및 R⁵는 각각 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알킬기이다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 후보 화합물을 P25/CDK5 복합체 및 BACE1과 반응시키거나 후보 화합물을 P25를 발현하는 포유동물 세포주에 처리한 후 BACE1의 인산화 정도를 측정하는 단계, 및 측정된 BACE1의 인산화 정도를 후보 화합물을 사용하지 않은 대조군에서의 BACE1의 인산화 정도와 비교하여 BACE1의 인산화 정도를 대조군보다 감소시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, P25/CDK5 저해 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 BACE1의 인산화를 저해함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이며, 각 도면은 다음을 나타낸다:

도 1A: P25/CDK5 복합체에 의해 BACE1이 인산화됨을 보여주는 SDS-PAGE의 방사선 자동 사진(autoradiography) 결과;

도 1B: 인산화 특이적 BACE1 항체가 Thr²⁵²에 인산화된 BACE1에 특이적으로 반응한다는 것을 보여주는 이뮤노블랏팅 결과;

도 1C: BACE1의 Thr²⁵² 부위의 인산화가 CDK5에 의해 일어남을 보여주는 이뮤노블랏팅 결과;

도 2A: 시험관내에서 P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1 인산화에 의해 β-시크리테이즈 활성이 증가됨을 보여주는 그래프;

도 2B: SK-N-BE2C 세포주에서 BACE1과 인산화 변이체인 BACE1T252A의 일시적 발현이 β-시크리테이즈 활성에 미치는 영향을 보여주는 그래프;

도 3A: SK-N-BE2C 세포주에서 P25의 일시적 발현으로 β-시크리테이즈 활성이 증가함을 보여주는 그래프;

도 3B: P25를 안정적으로 발현하는 PC12_tet-off 세포주 P25-3 및 P25-5의 단백질 발현을 분석하는 웨스턴 블랏팅 결과;

도 3C: PC12_tet-off 세포주 P25-3 및 P25-5의 Aβ 분비량을 측정한 그래프;

도 4A: 야생형 생쥐 및 P25 발현 형질전환 생쥐의 해마, 피질 및 소뇌에서 BACE1의 인산화 정도를 보여주는 면역조직화학 염색 결과;

도 4B: 야생형 생쥐 및 P25 발현 형질전환 생쥐의 해마, 피질 및 소뇌에서 P25, 인산화된 BACE1과 액틴의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과;

도 4C: 도4B와 동일한 실험을 반복하여 웨스턴 블랏팅한 결과를 덴시토미터(densitometer)로 측정하여 정량화한 그래프;

도 4D: 야생형 생쥐 및 P25 발현 형질전환 생쥐의 해마, 피질 및 소뇌에서 β-시크리테이즈 활성을 보여주는 그래프;

도 4E: 야생형 생쥐 및 P25 발현 형질전환 생쥐의 해마, 피질 및 소뇌에서 Aβ의 양을 보여주는 그래프;

도 5: P25/CDK5에 의해 BACE1이 인산화되어 BACE 활성이 증가되고 그로 인해 Aβ 분비가 증가되는 새로운 경로를 보여주는 모델;

도 6A: P25/CDK5 복합체에 의한 히스톤 H1의 인산화를 P-Thr-Pro 항체를 이용하여 확인한 면역블랏팅 결과;

도 6B: DSS30과 DSS36 및 유사체 화합물의 P25/CDK5 저해 활성을 히스톤 H1과 P-Thr-Pro 항체를 사용한 ELISA에 의해 확인한 결과;

도 7A: DSS30과 DSS36 및 유사체 화합물의 P25/CDK5 저해 활성을 BACE1과 phospho-BACE1 항체를 사용한 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과;

도 7B: DSS30과 DSS36 및 유사체 화합물의 P25/CDK5 저해 활성을 Tau 와 phospho-Tau 항체를 사용한 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과;

도 8A: P25-3 세포주에서 DSS30 및 DSS36 화합물이 BACE1의 인산화를 억제하는지를 확인한 웨스턴 블랏팅 결과 및 덴시토미터(densitometer)로 정량화한 그래프; 및

도 8B: 세포주 P25-3에서 DSS30과 DSS36 및 유사체 화합물들의 Aβ 분비 억제 효과를 보여주는 그래프.

본 명세서에서 "퇴행성 뇌질환"이란 신경섬유 다발 (neurofibrillary tangles), P25 또는 β-아밀로이드의 뇌 내 축적과 관련된 질환으로서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 니만-픽병, 뇌 허혈, 뇌출혈로 인한 치매 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물의 활성성분으로서 화학식 1로 표시되는 화합물들 중 바람직한 것은 화학식 1에서, R¹이 수소, 메톡시 또는 사이클로프로필메틸포름아마이드이고, R²가 수소이고, R³가 피페리딘이거나, R² 및 R³가 그들이 부착된 탄소원자와 함께 피롤, 또는 1,4-디옥산 고리를 형성하는 화합물들이다. 이 중 가장 바람직한 화합물들은 표 1에 기재된 화합물 DSS30, DSS301, DSS302, DSS303 및 DSS304이다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물의 활성성분으로서 화학식 2로 표시되는 화합물들 중 바람직한 것은, 화학식 2에서 R¹, R² 및 R³가 각각 독립적으로 수소, 할로겐 원자, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알콕시기, 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알킬에스테르이고, R⁴ 및 R⁵가 각각 독립적으로 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알킬기이고, R⁶, R⁷ 및 R⁸가 각각 독립적으로 수소, 비치환되거나 할로겐 원자로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C₁∼C₄ 알킬에스테르인 화합물들이다. 이 중 가장 바람직한 화합물들은 표 1에 기재된 화합물 DSS36, DSS361, DSS362 및 DSS363이다.

P25/CDK5 저해 화합물을 스크리닝하기 위한 본 발명의 방법은 후보 화합물을 P25/CDK5 복합체 및 BACE1과 반응시키거나 후보 화합물을 P25를 발현하는 포유동물 세포주에 처리한 후 BACE1의 인산화 정도를 측정하는 단계, 및 측정된 BACE1의 인산화 정도를 후보 화합물을 사용하지 않은 대조군에서의 BACE1의 인산화 정도와 비교하여 BACE1의 인산화 정도를 대조군보다 감소시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

상기 스크리닝 방법에서, P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1의 인산화 정도를 인산화된 BACE1에 특이적으로 결합하는 phospho-BACE1 항체 또는 방사성 동위원소로 표지된 ATP를 이용하여 검출하는 것이 바람직하다.

인산화된 BACE1에 특이적으로 결합하는 항체는 BACE1의 아미노산 서열(서열번호: 6)에서 252번 트레오닌(Thr²⁵²)을 중심으로 N-말단 방향 및 C-말단 방향으로 각각 10개 이하의 아미노산이 포함되도록 선택된 영역의 올리고펩타이드를 항원으로 사용하여 동물을 면역시킴으로써 제조할 수 있다. 특히, 펩타이드 SLWYThr²⁵²(PO₄)PIRR(서열번호: 2)을 사용하여 제조된 항체가 바람직하다.

시험관 내(in vitro) P25/CDK5 저해제 스크리닝에서, 표 1에 나타낸 본 발명의 P25/CDK5 저해 화합물들(DSS30, DSS36 또는 구조적 유사체 화합물)은 P25/CDK5 복합체에 의한 히스톤 H1, AD 관련 기질인 BACE1 및 Tau의 인산화에 대해 50％ 이상의 저해 활성을 나타낸다(도 6B, 도 7A 및 도 7B 참조).

이와 같은 방법으로 확인된 본 발명의 P25/CDK5 저해 화합물들은 현재까지 개발된 저해제들처럼 CDK5의 ATP 결합 부위에 결합하기 보다는 ATP와 비-경쟁적인 저해제로 작용하는 것으로 보인다.

한편, P25를 과발현하는 세포주를 사용한 세포-기반 어세이에서 본 발명의 P25/CDK5 저해 화합물인 DSS303 및 DSS36 화합물은 Aβ 분비를 50 ％ 이상 억제하며 BACE1의 인산화도 저해한다(도 8A 및 도 8B 참조).

본 발명에서는 상기와 같은 시험관 내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo) 실험에서 P25/CDK5 복합체에 의한 기질의 인산화 정도를 저해 화합물을 사용하지 않은 대조군의 인산화 정도에 비해 10 ％ 이상, 바람직하게는 20 ％ 이상 저해하는 화합물을 P25/CDK5 저해 화합물로 결정한다.

이와 같은 본 발명의 결과로부터, AD 환자의 뇌에서 증가된 P25에 의해 CDK5가 활성화되고, P25/CDK5 복합체가 Aβ 생성에 가장 중요한 효소인 BACE1을 인산화하여 활성을 증가시킴으로써 β-시크리테이즈 활성 및 Aβ 분비를 증가시키는 AD의 새로운 발병 경로를 확인할 수 있다(도 5 참조).

본 발명의 저해 화합물은 P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1의 인산화 및 활성을 억제함으로써 Aβ 분비를 억제하여 AD의 진행을 근본적으로 막을 수 있을 뿐만 아니라 AD의 다른 병적인 상태의 기질인 타우의 과인산화(Cruz, J.C. et al., Neuron 40:471-83 (2003)) 역시 효과적으로 저해한다. 그러므로, 본 발명의 저해 화합물은 AD 환자의 주요 특징인 노인반 (amyloid plaque)과 신경섬유 다발 형성을 모두 억제할 수 있어 AD를 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 저해 화합물은 AD 뿐만 아니라 타우의 과인산화와 관련된 다른 퇴행성 뇌질환의 치료에도 효과적일 것이다.

본 발명에서 얻어진 저해 화합물들은 인체에 정상적으로 존재하는 CDK5를 표적으로 하지 않고 병적인 상태에서 생성되는 P25의 기질 결합 부위를 표적으로 억제하므로 퇴행성 뇌질환 환자에게 보다 안전할 것으로 예상된다.

이에, 본 발명에서는 상기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 BACE1의 인산화를 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 포유동물에서 BACE1의 인산화를 저해함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 사용될 수 있다. 제제는 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 유효 성분인 P25/CDK5 저해 화합물은 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.05 내지 200 ㎎/㎏ 체중의 양으로 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 P25/CDK5 저해 화합물의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 따라 적당히 조절될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1 인산화의 기전 규명

AD 환자의 뇌에서 BACE1과 P25 단백질의 양이 증가되어 있고 그로 인해 β-시크리테이즈 활성과 P25/CDK5 복합체의 활성이 증가되어 있다고 보고되었다(Yang, L.B. et al., Nature Medicine 9:3-4 (2003), Patrick, G.N. et al, Nature 402: 615-622 (1999)). 본 실시예에서는 AD 환자에서 비이상적으로 증가된 P25/CDK5 복합체의 활성에 의해 BACE1이 인산화되어 β-시크리테이즈 활성이 증가되고 Aβ 분비가 증가되는지를 다음과 같이 조사하였다. 하기 실험에서 사용한 정제된 BACE1은 인비트로젠사(Invitrogen, 미국)로부터, P25/CDK5 복합체는 Upstate사(미국)로부터 각각 구입하였다.

(1) P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1의 인산화

(1-1) 방사선을 이용한 인산화 실험 (isotope-based kinase assay)

1.5 ㎍의 정제된 BACE1 및 40 ng의 정제된 P25/CDK5 복합체에 카이네이즈 완충액(20 mM MOPS (pH7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 20 μM 소듐 오르토바나데이트), 100 μM ATP와 5 μCi [γ-³²P]ATP를 첨가하고 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절한 후, 30℃에서 1 시간 반응시키고, 5X 시료 완충액(60 mM Tris-HCl(pH6.8), 25％ 글리세롤, 2 ％ SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1 ％ 브로모페놀 블루) 7.5 μl를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응물을 5분간 끓인 후, 12 ％ SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 젤을 10 ％ 글리세롤에 30 분간 넣어 둔 후, 80℃에서 2시간 동안 건조시키고 필름에 노출시킨 후 FLA3000(Fuji Photo Film, Japan)으로 확인하였다. BACE1을 첨가하지 않고 동일한 실험을 반복하여 대조군으로 하였다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, P25/CDK5 복합체에 의해 BACE1이 인산화됨을 확인하였으며, CDK5에 의한 P25의 자가인산화(Autophosphorylation, 도 1A에 *로 표시)도 역시 관찰되었다.

(1-2) 인산화 특이적 항체를 이용한 인산화 실험(phosphospecific antibody-based kinase assay)

BACE1의 아미노산 배열을 보면 사람, 쥐 및 생쥐에서 동일한 CDK5 인산화 보존 모티프(consensus motif)가 Thr²⁵² 부위에 있다(Thr-Pro-Ile-Arg; 서열번호: 1). BACE1의 Thr²⁵² 위치가 인산화되는지를 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다.

(단계 1) BACE1 인산화 특이적(phosphospecific) 항체의 제조

인산화 펩타이드 SLWYThr²⁵²(PO₄)PIRR(서열번호: 2)에 대한 항체를 다음과 같이 한국의 Peptron 사에 주문 제작하였다. 상기의 인산화 펩타이드 2 ㎎을 KLH(key-hole limpet hemocyanin)에 결합시켰다. 생후 10-12주의 뉴질랜드 흰토끼(NewZealand white rabbit)에 매 회당 400 ㎍씩의 결합 펩타이드를 3주 간격으로 3회 주사하였다. 3차 주사한지 1주일 후, 토끼의 혈액시료를 채취한 후 혈청을 다음과 같이 분리하였다. 인산화 특이적 항체를 분리하기 위해 인산화 펩타이드와 정상 펩타이드(SLWYTPIRR; 서열번호: 3)를 설포링크 젤(SulfoLink gel, Pierce, 미국)에 각각 2 ㎎/ml 농도로 연결시키고, L-시스테인으로 여분의 반응기들을 블로킹한 친화성 수지(affinity resin)를 만들었다. 혈청과 1 mM PMSF를 먼저 정상 펩타이드 친화성 수지에 넣고 실온에서 20분간 결합시킨 후, 결합하지 않은 혈청을 얻었다. 이를 다시 인산화 펩타이드가 결합된 친화성 수지에 넣고, 1 mM PMSF를 첨가하고 다시 실온에서 20분간 결합시킨 후 10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 500 mM NaCl 완충액으로 세척한 다음 100 mM 글라이신(pH 2.5)으로 용출시켰다. 용출액에 존재하는 IgG가 인산화 펩타이드에만 결합하고 정상 펩타이드에는 결합하지 않는 것을 ELISA로 확인하고 이를 센트리콘(centricon)을 이용하여 농축하여 인산화 특이적-BACE1 항체를 얻었다.

(단계 2) HEK293 세포의 일시적 형질감염 및 면역블랏팅

HEK293 세포(ATCC, CRL-1573)를 10％ FBS(Gibco-BRL)를 포함하는 DMEM(Gibco-BRL) 배지가 들어 있는 6-웰 플레이트에 8X10⁵ 세포/웰로 로딩하고 5 ％ CO₂, 37℃로 밤새 배양한 후, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 사용자 매뉴얼에 따라 다음과 같이 형질감염시켰다. BACE1 cDNA는 인간 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터 PCR 방법으로 증폭하여 서열을 확인한 후 pcDNAmychis 벡터(Invitrogen, 미국)에 클로닝하였다. BACE1 cDNA를 주형으로 하고 부위-특이적 돌연변이유발 방법을 이용하여 BACE1의 인산화 결핍 변이체인 BACE1T252A를 제조하였다. BACE1 cDNA 또는 BACE1T252A cDNA를 대조군 DNA(pcDNAmychis, Invitrogen, 미국), P25 cDNA 또는 CDK5 cDNA와 함께 총 DNA 양이 6 ㎍이 되게 각 웰에 넣고, 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 24 hr 배양한 후, 1X PBS(80 mM Na₂HPO₄, 20 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 7.4)로 한번 세척하였다. 각 웰에 200 μl 용해 완충액(1 mM PMSF와 프로테이즈 억제제 칵테일 (Calbiochem)을 첨가한 RIPA 완충액(1 ％ NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 ％ SDS, 0.5 ％ deoxycholic acid))을 첨가하여 세포 용해액을 얻었다. BCA 단백질 측정법(Pierce)으로 세포용해액의 단백질을 정량하여 10 ％ SDS-PAGE 젤에 각 레인당 50 ㎍씩 로딩하고 전기영동한 후, 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달하고 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST(80 mM Na₂HPO₄, 20 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, pH 7.4, 0.1 ％ 트윈 20)로 밤새 블로킹하였다. 각 막을 PBST로 15분씩 3회 세척한 후 상기에서 제조된 인산화 특이적-BACE1 항체를 10 ％ BSA/PBST에 1:1000으로 희석한 용액을 막에 가하고 상온에서 1 시간 반응시켰다. 1X PBST로 10 분씩 3회 세척하고 2차 항 토끼-HRP 항체(Amersham)를 10 ％ BSA/PBST에 1:10,000으로 희석한 용액을 가하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 다시 1X PBST로 10분간 3회 세척한 후, ECL 시스템(Amersham)을 이용하여 BACE1의 인산화 정도를 검출하였다.

그 결과, 상기 항체는 BACE1이 CDK5 및 P25와 함께 발현된, 즉 인산화된 BACE1에 주로 반응하였다. BACE1의 Thr²⁵²가 Ala로 치환된 인산화결핍 변이체(BACE1T252A)는 CDK5 및 P25와 함께 발현해도 인산화 항체와 반응하지 않으므로, 상기에서 제작한 인산화 항체가 Thr²⁵²에 인산화된 BACE1에 특이적으로 반응한다는 것을 알 수 있다(도 1B).

(단계 3) BACE1의 시험관내 인산화 및 면역블랏팅

320 ng의 정제된 BACE1 및 50 ng의 정제된 P25/CDK5 복합체에 카이네이즈 완충액(20 mM MOPS (pH7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 20 μM 소듐 오르토바나데이트)과 200 μM ATP를 첨가하고 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절한 후, 30℃에서 0, 10, 20, 60, 120, 180 분 동안 각각 반응시키고, 5X 시료 완충액(60 mM Tris-HCl(pH6.8), 25 ％ 글리세롤, 2 ％ SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1 ％ 브로모페놀 블루) 7.5 μl를 넣어 반응을 종료시켰다. CDK5 저해제인 로스코비틴(roscovitine, Calbiochem)을 처리하는 경우, 상기와 동일한 조건에서 반응 혼합물에 50 μM를 가한 후 120분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 5분간 끓인 후, 12 ％ SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달한 후, 막을 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST에서 밤새 블로킹하고, PBST로 15분씩 3회 세척하였다. 상기에서 제조된 BACE1 인산화 특이적 항체는 1:1000으로, BACE1 항체(BACE1의 296-310 aa에 해당하는 RLPKKVFEAAVKSIK(서열번호: 4)를 항원으로 사용하여 Peptron에서 주문제작)는 1:2500으로 5％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지(Gibco-BRL)에 각각 희석하여 막에 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 막을 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. 염소 항-토끼 HRP 결합된 항체(Amersham phamacia)를 1:10,000으로 5 ％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 처리하고, 다시 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. ECL 시스템(Amersham)을 이용하여 BACE1의 인산화 정도와 BACE1의 양을 각각 확인하였다.

그 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이 인산화 항체에 의해 탐지된 BACE1의 인산화는 시간에 따라 점차 증가하고 2 시간 후에는 다소 감소하였다. BACE1의 인산화는 CDK5의 저해제인 로스코비틴을 처리하면 억제되었으므로, BACE1의 Thr²⁵² 부위의 인산화가 CDK5에 의해 일어남을 확인할 수 있었다.

(2) P25/CDK5에 의한 BACE1의 인산화로 인한 β-시크리테이즈 활성 증가

보고된 BACE1의 결정 구조(Hong et al. Science:290:150-3(2000))에 따르면 Thr²⁵²이 효소의 활성 부위 근처에 있어서 효소 활성에 영향을 미칠 수 있을 것으로 예측되므로, BACE1의 CDK5에 의한 Thr²⁵² 부위의 인산화가 β-시크리테이즈 활성에 영향을 미치는지를 다음과 같이 확인하였다.

(2-1) BACE1의 시험관 내(in vitro) 인산화가 β-시크리테이즈 활성에 미치는 영향

BACE1을 인산화하기 위해 2.2 ㎍의 BACE1에 50 ng의 정제된 P25/CDK5 복합체, 카이네이즈 완충액과 50 μM ATP를 첨가하고 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절한 후 30℃에서 2시간 반응시켰다. β-시크리테이즈 활성 측정을 위해, 얻어진 반응물 10 μl, BACE1 FRET 어세이 완충액(50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5) 88 μl, 및 BACE1 기질(2 mM, R＆D) 2 μl를 96-웰 블랙 마이크로웰 플레이트 (Corning)의 각 웰에 총 100 μl가 되도록 넣고 공시험 웰(blank 웰)에는 FRET 어세이 완충액을 넣었다. 플루오로미터(Molecular Devices, SPECTRA MAX GerminiXS)에 플레이트를 넣고, 320 nm 여기, 405 nm 방출 조건에서 β-시크리테이즈 활성을 측정하고 소프트맥스(Soft max) PRO 4.3 LS 소프트웨어로 분석하였다. P25/CDK5 복합체를 첨가하지 않고 동일한 실험을 반복하여 대조군으로 하였다. 또한, 인산화 반응시 CDK5의 저해제인 로스코비틴을 50 μM로 가하고 동일한 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 2A에서 볼 수 있는 바와 같이, 인산화된 BACE1은 인산화되지 않은 BACE1(대조군)에 비해 21％ 유의성 있게 증가된 (N=3, p＜0.01) β-시크리테이즈 활성을 나타내었다. 동일한 실험을 5회 반복한 결과 인산화된 BACE1은 인산화되지 않은 BACE1(대조군)에 비해 β-시크리테이즈 활성이 20 ± 7％ 유의성 있게 증가되었다(p＜0.05). 또한, 도 2A에서 CDK5 저해제인 로스코비틴은 BACE1의 인산화에 의해 증가된 β-시크리테이즈 활성을 52％ 유의성 있게 억제하였다(N=3, p＜0.05). 동일한 실험을 5회 반복한 결과 로스코비틴은 BACE1의 인산화에 의해 증가된 β-시크리테이즈 활성을 62 ± 11％ 유의성 있게 억제하였다 (P＜0.01). 이 결과는 시험관 내에서 P25/CDK5에 의한 BACE1의 인산화에 의해 β-시크리테이즈 활성이 유의성 있게 증가함을 보여준다.

(2-2) SK-N-BE2C 세포에서 BACE1 인산화 결핍 변이체의 일시적 발현에 의한 β-시크리테이즈 활성

SK-N-BE2C 세포(ATCC, CRL-2268)는 10％ FBS를 첨가한 DMEM/F-12 배지에서 5 ％ CO₂, 37℃로 배양하였다. SK-N-BE2C 세포주에 상기 (1)의 (1-2) (단계 2)와 동일한 방법으로 대조군 DNA (pcDNAmychis), BACE1 cDNA 또는 BACE1T252A cDNA를 일시적으로 형질감염시킨 후 세포 용해액을 얻었다. BCA 단백질 측정법(Pierce)으로 세포용해액의 단백질을 정량하여, 각 실험 당 50 ㎍의 세포용해액에 BACE1 FRET 어세이 완충액(50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5) 을 첨가하여 198 μl까지 채워주고, BACE1 기질(2 mM, R＆D) 2 μl를 첨가하여 혼합한 후에, 상기 (2-1)과 동일한 방법으로 플루오로미터에서 β-시크리테이즈 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, BACE1 cDNA로 일시적으로 형질감염한 경우 β-시크리테이즈 활성이 53％ 증가하였고 (N=3, p＜0.01), BACE1T252A cDNA로 일시적으로 형질감염한 경우 대조군과 유사한 β-시크리테이즈 활성을 나타내었다. 이 결과는 BACE1의 CDK5에 의한 Thr²⁵² 부위의 인산화가 β-시크리테이즈 활성에 중요하다는 것을 보여준다.

(3) P25 단백질에 의한 BACE1의 인산화, β-시크리테이즈 활성 및 Aβ 분비 증가

산발성 AD 환자의 경우 P25가 증가되어 있고(Tseng, H.C. et al., FEBS Lett. 523:58-62(2002)), APP695sw를 계속 발현하는 신경세포주인 SH-SY5Y에서 P25를 일시적으로 발현시키면 Aβ 수준이 증가한다는 보고가 있다 (Lie, F. et al,, FEBS Lett. 547:193-196 (2003)). 본 실시예에서는 P25에 의한 Aβ 수준의 증가가 BACE1의 인산화 및 활성 증가에 기인하는지를 다음과 같이 조사하였다.

(3-1) SK-N-BE2C 세포에서 P25의 일시적 발현이 β-시크리테이즈 활성에 미치는 영향

SK-N-BE2C 세포(ATCC, CRL-2268)는 10％ FBS를 첨가한 DMEM/F-12 배지에서 5 ％ CO₂, 37℃로 배양하였다. P25 cDNA는 인간 뇌 cDNA 라이브러리(Clontech)로부터 PCR 방법으로 증폭하여 서열을 확인한 후 pcDNAmychis 벡터(Invitrogen, 미국)에 클로닝하였다. SK-N-BE2C 세포주에 상기 (1)의 (1-2) (단계 2)와 동일한 방법으로 대조군 DNA (pcDNAmychis) 또는 P25 cDNA를 일시적으로 형질감염시킨 후 세포 용해액을 얻었다. BCA 단백질 측정법(Pierce)으로 세포용해액의 단백질을 정량하여, 각 실험 당 50 ㎍의 세포용해액에 BACE1 FRET 어세이 완충액(50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5)을 첨가하여 198 μl까지 채워주고, BACE1 기질(2 mM, R＆D) 2 μl를 첨가하여 혼합한 후에, 상기 (2-1)과 동일한 방법으로 플루오로미터에서 β-시크리테이즈 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, P25 cDNA로 일시적으로 형질감염한 경우 β-시크리테이즈 활성이 86％ 증가하였다(N=3, p＜0.01). 이 결과는 P25 증가만으로 β-시크리테이즈 활성이 증가될 수 있음을 보여주는 것으로 기존에 보고된 P25에 의한 Aβ 수준의 증가가 β-시크리테이즈 활성 증가에 의한 것임을 제시한다.

(3-2) PC12 세포에서 P25의 안정적 발현이 BACE1 인산화 및 Aβ 분비에 미치는 영향

P25의 안정적 발현이 BACE1의 인산화 및 Aβ 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해, PC12 세포(ATCC CRL-1721)로부터 P25를 안정적으로 발현하는 세포주를 제조하였다. PC12 세포는 신경내분비 세포주로서 신경세포의 기본적인 기능인 신경전달물질 분비기능과 신경세포의 기본적인 단백질 네트워크를 보유하고 있어서 뇌에서 일어나는 여러 생물학적 현상들을 이해하는데 널리 사용되는 세포주 중의 하나이다. P25는 세포에 독성이 있다고 보고되었고 (Patrick, G.N. et al, Nature 402:615-622 (1999)), 실제 실험결과 P25 발현 PC12 세포주의 경우 계대배양하는 동안 세포사가 관찰되었다. 본 실시예에서는 P25 단백질의 독성에 의한 세포사를 방지하기 위해 독시사이클린에 의해 발현이 조절되는 Tet-off 시스템을 가지고 P25를 안정적으로 발현하는 PC12_tet-off 세포주 (Clontech)를 이용하여 P25에 의한 BACE1의 인산화 및 Aβ 수준에 대한 영향을 다음과 같이 조사하였다.

(단계 1) P25를 안정적으로 발현하는 PC12_tet-off 세포주의 제조

PC12_tet-off 세포(Clontech, Palo Alto, CA)를 10 ％ FBS, 5 ％ HS(Gibco-BRL), 100 ㎍/ml의 G418을 첨가한 RPMI1640 배지(Gibco-BRL)에서 5 ％ CO₂, 37℃로 배양하였다. P25를 tet-off 시스템에서 발현하는 세포주를 제조하기 위하여, 상기(3-1)에서 제작된 P25 cDNA를 pTRE2pur 벡터(Clontech)에 서브클로닝(subcloning)하여 pTRE2puro-P25 cDNA를 얻었다. 6 웰 플레이트에 PC12_tet-off 세포를 1×10⁶/웰로 하루 배양한 후, pTRE2puro-P25 cDNA 4 ㎍ 과 12 μl의 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 섞어 각 웰에 넣고, 4시간 후에 10 ％ FBS, 5 ％ HS, 100 ㎍/ml의 G418을 첨가한 RPMI1640 배지로 교체해 주었다. 형질 감염한지 48 시간 후에 배지를 100 ㎍/ml G418(Clontech), 1 ㎍/ml 독시사이클린(Clontech)과 3 ㎍/ml 퓨로마이신(Puromycin, Clontech)이 첨가된 RPMI1640 배지로 교체한 후, 4일에 한번씩 갈아 주었다. 5-7일이 지나면, 살아있는 세포와 죽은 세포가 분리된다. RPMI 1640 배지로 여러 번 세척한 후, 살아 있는 세포만을 150 mm 접시에서 배양하여, 분리된 단일 세포 콜로니를 얻었으며, 이를 96-웰, 24-웰, 12-웰, 6-웰 플레이트로 순차적으로 옮기면서 배양하였다. 단백질을 발현시키기 위해서, 독시사이클린이 들어있지 않은 RPMI 1640 배지에서 3일 동안 배양하고 P25의 발현을 아래와 같은 웨스턴 블랏팅(단계 2)으로 확인한 후, 최종적으로 안정한 세포주를 선택하였다.

그 결과 독시사이클린이 없는 배지에서 키웠을 때 P25가 확연히 과발현되는 2 종류의 PC12_tet-off 세포주(P25-3 및 P25-5, 도 3B)를 얻었다.

(단계 2) P25 안정적 세포에서의 BACE1 인산화 분석(웨스턴 블랏팅)

P25 안정적 세포주인 PC12_tet-off 세포주 P25-3 및 P25-5를 독시사이클린을 함유하지 않는 RPMI 1640 배지에서 3일간 배양한 후, 상기 (1)의 (1-2) (단계 2)와 동일한 방법으로 세포를 용해시키고, 얼음에서 30분간 반응시킨 후, 4℃, 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻고, BCA 단백질 어세이(Pierce)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 각 세포주의 단백질 100 ㎍에 5X 시료 완충액 8 μl를 넣고, ddH₂O를 이용하여 최종 40 μl로 총 용량을 조절하고, 5분간 끓인 후, 12％ SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달한 후, 막을 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST에서 밤새 블로킹하고, PBST로 15분간 3번씩 세척하였다. P25 항체(c-19, Santa Cruz)는 1:700으로, CDK5 항체(J-3, Santa Cruz)는 1:1000으로, phospho-APP 항체(Cell signaling)는 1:1000으로, APP 항체(Cell signaling)는 1:1000으로, phospho-BACE1 항체는 1:1000으로, BACE1 항체(M-83, Santa Cruz)는 1:700으로 각각 5 ％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지에 희석하여 막에 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 막을 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. CDK5 항체가 사용된 경우는 염소 항-마우스 HRP 결합된 항체를, 그 밖의 항체가 사용된 경우는 염소 항-토끼 HRP 결합된 항체(Amersham phamacia)를 1:10,000으로 5％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 처리하고, 다시 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. ECL plus 시스템(Amersham)을 이용하여 각 단백질을 검출하였다.

그 결과, 도 3B에서 볼 수 있듯이, P25의 발현은 APP(amyloid precursor protein)와 BACE1의 인산화를 증가시켰다. 그러므로 P25를 안정적으로 발현하는 세포에서는 CDK5가 활성화되어 기존 알려진 APP(Lie, F. et al., FEBS Letters 547:193-196 (2003))외에 BACE1을 인산화함을 알 수 있다.

(단계 3) P25 안정적 세포에서 Aβ 수준 측정

P25 안정적 세포주인 PC12_tet-off 세포주 P25-3, P25-5 세포를 독시사이클린을 함유하지 않는 RPMI 1640 배지에서 3일간 키운 뒤, 0.05 ％ 폴리에틸렌이민-피복된 6 웰 플레이트에 1×10⁶ 세포/웰로 가하고 24시간 후에 조절된 배지(5 ％ HS, 1 ％ FBS, 0.5 ％ P/S가 첨가된 RPMI1640 배지) 1 ml로 교환하여 24시간동안 배양하였다. 배양액을 취하여 Aβ 어세이 키트(IBL)를 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 ELISA로 Aβ 양을 측정하였다. 시험 시료, 표준물질, 시험시료 공시험군(blank)과 시약 공시험군을 각각 100 μl씩 항체(항-인간 Aβ(35-40) 생쥐 IgG, 입수처: IBL)로 미리 피복된 96 웰 플레이트에 넣고 뚜껑을 닫은 채 4℃에서 24시간동안 배양하였다. 다음날 세척 완충액(0.05 ％ 트윈20 함유 인산염 완충액)으로 7번 세척하고 각 웰에 항-인간 Aβ(11-28) 생쥐 IgG-HRP 결합된 항체 (IBL)를 100 μl씩 넣고 뚜껑을 닫은 채 4℃에서 24시간동안 배양한 후 다시 세척 완충액으로 9번 세척하였다. TMB (Tetra methyl Benzidine, Sigma)를 각 웰 당 100 μl씩 넣고 빛을 가린 채 상온에서 15분간 배양한 후 정지 용액(1N H₂SO₄) 100 μl를 넣고 30분 이내에 450 ㎚에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 펩타이드의 정량은 표준물질에 의해 나온 그래프에 대입하여 계산하였다. 용해 완충액(1 mM PMSF와 프로티에이즈 저해제 칵테일(Calbiochem)을 첨가한 RIPA 완충액)을 각 웰당 120 μl씩 넣어 남은 세포를 용해시키고 얼음에서 30분간 배양한 후, 4℃, 14000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액의 단백질을 BCA 단백질 어세이(Pierce) 방법을 사용하여 정량하였다. 측정된 값은 Aβ(pg)/총 단백질 (mg)로 표준화하였다.

그 결과, 도 3C에서 보는 바와 같이, P25를 발현하는 PC12_tet-off 세포 P25-3 및 P25-5의 경우 Aβ가 증가함을 알 수 있다.

(3-3) P25 발현 생쥐에서 BACE1의 인산화, β-시크리테이즈 활성 및 Aβ 조사

세포주에서 관찰한 BACE1의 인산화 및 활성 증가가 동물에서도 일어나는지 확인하기 위해 P25가 발현된 형질전환 생쥐(TgN(Eno2CDK5R1)1Jdm, Jackson lab, 미국)를 사용하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

(단계 1) 면역 조직 화학법에 의한 P25 발현 형질전환 생쥐의 BACE1 인산화 확인

20 주령의 P25 TG(transgenic) 생쥐와 같은 나이의 야생형 생쥐를 각각 이소플루란(isoflurane(Rhodia))을 이용하여 20초간 마취한 후, PBS 5 ml로 관류하여 혈액을 씻어내고, 4 ％ 파라포름알데하이드 (Sigma)가 들어 있는 PBS 10 ml로 관류한 후 뇌를 적출하여 4 ％ 파라포름알데하이드가 들어 있는 PBS 100 ml에 4℃에서 하룻밤동안 담가 고정하였다. 다음날 10 ％, 15 ％, 20 ％ 슈크로즈로 1시간씩 각각 3번 교환해주고, 마지막 20 ％ 슈크로즈는 4℃에서 밤새 처리하였다. 다음날 OCT 화합물(Tissue-Tek)에 포매한 뇌를 액체질소로 온도를 떨어뜨린 이소팬테인(Yakuri pure chemicals)에 담가 얼려 -20℃에 보관하였다. Cryostat(Microm, HM 505 N)으로 -20℃에서 16 ㎛ 두께로 절편을 만들어 Superfrost^*/Plus 슬라이드(Fisher Scientific)에 올린 후, 슬라이드를 상온에서 30분 공기 건조시킨 후, -20℃에 보관하였다. -20℃에 보관된 슬라이드를 상온에서 30분 동안 건조시킨 후, PBS로 5분씩 3회 세척하고, 3％ 정상 염소 혈청(Jackson Immuno Research Lab.) 100 μl와 상온에서 1시간 반응시켜 블로킹하였다. 인산화-BACE1 항체를 1％ 정상 염소 혈청 100 μl에 1:500 비율로 희석하여 슬라이드에 가한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 슬라이드를 PBS로 15분씩 3회 세척한 후, Cy3-결합된 염소 항-토끼 IgG (Jackson Immuno Research Lab.)을 1 ％ 정상 염소 혈청 100 μl에 1:500 비율로 희석하여 슬라이드에 가한 후 상온에서 1시간 반응시키고, PBS로 15분씩 3회 세척한 후, 수성 고정 용액(ResGen)으로 고정하여 형광현미경(Carl Zeiss, Axiophoto 2)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, BACE1의 인산화가 야생형 생쥐에 비해 P25 TG 생쥐의 해마에 현저하게 증가되어 있고, 피질 및 소뇌에서는 약간 증가되어 있음을 알 수 있었다. P25 TG 생쥐와 같은 나이의 야생형 생쥐 각각 3마리씩을 더 이용하여 실험하였을 때 동일한 결과를 얻었다. 이로써 P25 TG 생쥐에서도 P25 안정적 세포주와 동일하게 P25 발현으로 BACE1의 인산화가 증가함을 확인할 수 있었다.

(단계 2) P25 발현 형질전환 생쥐에서의 BACE1 인산화, β-시크리테이즈 활성 및 Aβ 측정 분석

26 주령의 P25 TG 생쥐를 각각 경추 탈골하여 뇌를 적출하여 해마, 피질, 소뇌로 각각 분리하였다. 분리된 조직은 에펜도르프 튜브에 넣고 액체질소에서 30초간 급속냉동한 후, 1 mM PMSF(Sigma)와 프로티에이즈 저해제 칵테일 (Calbiochem)을 첨가한 RIPA 완충액(1％ NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 ％ SDS, 0.5 ％ 데옥시콜산)을 뇌 100 mg당 200 μl로 넣고 균질화기(Homogenizer)를 이용하여, 조직을 완전히 용해시켰다. 얼음에서 30분간 반응시킨 후, 4℃, 14,000 rpm에서 60분간 원심분리하여 상층액을 얻고, BCA 단백질 어세이(Pierce) 방법을 사용하여 단백질을 정량하였다. BACE1 인산화 분석을 위해서 각 조직의 단백질 200 ㎍씩을 사용하여 상기 (3-2)의 (단계 2)과 동일한 방법으로 P25 항체(1:700, Santa Cruz), phospho-BACE1 항체(1:1000), 액틴(1:10,000, Sigma)을 사용하여 웨스턴 블랏팅하였다.

덴시토미터를 사용하여 웨스턴 블랏팅의 phospho-BACE1과 액틴 밴드를 측정하고 phospho-BACE1 측정값/액틴 측정값으로 표준화하였다. β-시크리테이즈 활성을 측정하기 위해 각 조직의 단백질 100 ㎍씩을 사용하여 상기 (2-1)(2-2)과 동일한 방법으로 BACE FRET 어세이를 실시하였다. Aβ의 양을 측정하기 위해 원심분리 후 남은 펠렛(pellet) 부피의 4배에 해당되는 2％ SDS가 첨가된 PBS에서 균질화기(Homogenizer)를 이용하여, 조직을 용해시켰다. 20℃, 14,000 rpm에서 60분간 원심분리하여 상층액을 얻고, BCA 단백질 어세이(Pierce) 방법을 사용하여 단백질을 정량하였다. 각 조직의 단백질 50 또는 100 ㎍씩을 사용하여 (3-2)의 (단계 3)과 동일한 방법으로 Aβ 어세이를 실시하여 Aβ의 양을 측정하였다. 같은 나이의 야생형 생쥐로 동일한 실험을 반복하여 대조군으로 하고 P25 TG 생쥐의 측정값은 대조군 생쥐 측정값 1에 대한 상대적인 비율로 그래프에 표시했다.

그 결과, 도 4B에서 나타낸 바와 같이, 26 주령 P25 TG 생쥐의 해마와 피질에서 P25가 많이 발현되어 있고, 소뇌에서도 약간 발현되었다. 이는 보고된 바와 동일한 결과이다 (Ahlijanian M.K. et al, PNAS 97:2910-2915 (2000)). BACE1의 인산화는 야생형 생쥐에 비해 P25 TG 생쥐의 해마와 피질에 특히 증가되어 있고, 소뇌에서는 차이가 없음을 알 수 있다. 15 내지 26 주령 P25 TG 생쥐로 동일한 실험을 반복하여 얻은 측정값을 대조군 생쥐 측정값과 비교한 결과, 면역 조직 화학법에 의한 결과와 일치하게 P25 TG 생쥐의 해마에서 BACE1의 인산화가 같은 나이의 야생형 생쥐에 비해 54 ± 10 ％ 유의성 있게 증가되어 있었다 (N=4, p＜0.05).

이 결과와 일치하게, 도 4C에서 볼 수 있는 바와 같이, P25 TG 생쥐에서의 β-시크리테이즈 활성이 대조군에 비해 해마에서 56 ± 13 ％ 유의성 있게 증가되어 있고 (N=5, p＜0.05) 피질과 소뇌는 큰 차이가 없었다. 그러므로, BACE1의 인산화와 β-시크리테이즈 활성이 실제 P25 TG 생쥐의 뇌에서 직접적으로 밀접하게 연관되어 있음을 알 수 있다.

또한, 도 4E에서 볼 수 있는 바와 같이, P25 TG 생쥐에서의 Aβ의 양은 대조군에 비해 해마에 약 36 ± 9.5 ％ 유의성 있게 증가되어 있고 (N=4, p＜0.05) 피질과 소뇌에서는 증가 양상은 보이지만 유의성이 없다. 이는 BACE1의 인산화와 β-시크리테이즈 활성 분석 결과와 일치한다. 이로써 P25 TG 생쥐에서도 P25 안정적 세포주와 동일하게 P25 발현으로 BACE1의 인산화, β-시크리테이즈 활성과 Aβ의 양이 증가함을 확인할 수 있었다.

이상의 실시예 1에서는 P25/CDK5가 BACE1을 인산화시키고 이로 인해 β-시크리테이즈 활성을 증가시킴으로써 Aβ 분비를 증가시키는 새로운 경로를 시험관 내 및 생체내 실험으로 확인하였다(도 5).

실시예 2: P25/CDK5 저해 화합물의 시험관 인산화 실험 및 세포-기반 어세이를 통한 저해 활성 조사

하기 표 1에 기재된 DSS30과 유사체 및 DSS36과 유사체 화합물에 대해 시험관 인산화 실험 및 세포-기반 어세이를 통하여 다음과 같이 P25/CDK5 저해활성을 조사하였다.

DSS30과 그 유사체(DSS301, DSS302, DSS303, DSS304) 화합물은 메이브릿지사(Maybridge) 에서, DSS36, DSS362는 바이오넷사(Bionet)에서, DSS361, DSS363은 켐브리지사(Cambridge)에서 각각 구입하여 10 mM 농도로 DMSO(Sigma)에서 보관하였으며, 실험 전에 화합물의 최종 농도가 50 μM, DMSO의 최종 농도는 0.5 ％가 되도록 희석하여 사용하였다.

표 1

P25/CDK5 저해 활성 조사를 위한 시험관 내 어세이로 (1) P25/CDK5의 일반적 기질인 히스톤(histone) H1과 인산화 항체를 이용한 ELISA 방법, (2) P25/CDK5의 AD관련 기질인 BACE1과 BACE1 특이적인 인산화 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법, 및 (3) P25/CDK5의 AD관련 기질인 Tau와 Tau 특이적인 인산화 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅 방법을 다음과 같이 실시하였다.

(1) 히스톤 H1과 인산화 항체를 이용한 P25/CDK5 저해 활성 조사

(1-1) 히스톤 H1과 인산화 항체를 이용한 인산화 실험

P25/CDK5 복합체는 기질의 Thr(또는 Ser)-Pro-(X)_n-Lys(또는 Arg 또는 His)(서열번호: 5; 상기 서열에서, X는 임의의 아미노산이며, n은 1 또는 2임) 부위를 인산화하므로, 인산화된 기질을 특이적으로 인식하는 포스포-트레오닌-프롤린 항체(P-Thr-Pro 항체, Cell signaling)를 사용하면 P25/CDK5 저해제의 활성을 측정할 수 있을 것이다. 이에, P-Thr-Pro 항체가 인산화된 히스톤 H1만을 특이적으로 인지하는지를 다음과 같이 확인하였다.

1 ㎍의 히스톤 H1, 카이네이즈 완충액 및 200 μM ATP에 P25/CDK5 복합체 20 ng을 첨가한 후 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 2시간 반응시키고, 5X 시료 완충액 7.5 μl를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응 혼합물을 5분간 끓인 후, 12 ％ SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달한 후, 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST에서 밤새 블로킹하고, PBST로 15분씩 3회 세척하였다. P-Thr-Pro 항체를 5 ％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지에 1:2500으로 희석하여 막에 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 막을 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. 염소 항-마우스 HRP 결합된 항체(Amersham phamacia)를 5 ％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 1:10,000으로 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 처리하고, 다시 PBST로 15분씩 3회 세척 하였다. ECL plus 시스템(Amersham)을 이용하여 P25/CDK5 복합체에 의한 히스톤 H1의 인산화 정도를 검출하였다. P25/CDK5 복합체를 첨가하지 않고 동일한 실험을 실시하여 정제된 히스톤 H1이 인산화되어 있는지 확인했다. 또한 인산화 반응시에 CDK5의 저해제인 로스코비틴 (Calbiochem)을 50 μM의 농도로 가하여 동일한 실험을 실시하고 히스톤 H1의 인산화가 저해되는지 확인했다.

그 결과, 도 6A에서 보이는 것과 같이, P-Thr-Pro 항체는 히스톤 H1의 인산화된 형태만을 검출하고 로스코비틴을 사용한 경우 히스톤 H1의 인산화가 저해됨을 확인하였다. 따라서, P-Thr-Pro 항체는 P25/CDK5 복합체에 의한 히스톤 H1 인산화를 측정하는데 적절한 항체임을 알 수 있다.

(1-2) 히스톤 H1과 인산화 항체를 이용한 DSS30과 DSS36 화합물 및 유사체에 대한 P25/CDK5 저해 어세이

1 ㎍ 히스톤 H1(1 mg/ml), 10 μl NHS 용액(Sigma), 및 50 μl EDC 용액(Sigma)에 PBS(pH 7.4)를 100 μl가 되도록 가하여 잘 혼합하고, 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. 4℃에서 밤새 반응시켜 히스톤 H1을 웰에 코팅하고, 1 ％ BSA가 들어있는 100 μl PBS로 4℃에서 4시간 블로킹한 후, 웰당 200 μl의 PBS(pH 7.4)로 2번 세척하였다. 각 웰에 5％ DMSO에 녹인 500 μM 농도의 저해 화합물 10 μl (화합물의 최종 농도: 50 μM)를 가하고, 20 ng의 정제된 P25/CDK5, 카이네이즈 완충액, 200 μM ATP를 첨가한 후, ddH₂O로 총 용량을 100 μl로 조절하였다. 30℃에서 2시간 반응시킨 후, PBST로 각 웰당 200 μl씩 첨가하여 5번 세척하고 PBS(pH 7.4)로 다시 한 번 세척하였다. P-Thr-Pro 항체(Cell signaling)를 5 ％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지에 1:1000으로 희석한 희석액을 각 웰당 100 μl씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 각 웰을 200 μl의 PBST로 4번 세척하였다. 염소 항-마우스 HRP 결합된 2차 항체(Zymed)를 5 ％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 1:4000으로 희석한 희석액을 각 웰당 200 μl씩 첨가하고, 37℃에서 3시간 반응시켰다. 각 웰을 200 μl의 PBST로 4번 세척한 후, 각 웰당 200 μl의 ABTS 기질 용액(Roche)을 첨가하고 37℃에서 약 15분간 반응시킨 다음, 플레이트 리더에서 405 ㎚로 흡광도를 측정하였다. 화합물을 첨가하지 않고 동일한 실험을 반복하여 대조군(도 6B 및 6C, No inhibitor)으로 하였으며, ATP를 첨가하지 않고 동일한 실험을 반복하여 얻은 값을 배경값(background)으로 하였다. 다음의 식으로 저해 화합물 처리시의 상대적인 인산화 활성을 계산하여 화합물의 저해 활성을 확인하였다:

인산화 활성(％) = {(저해 화합물 처리시 흡광도-배경값)/(대조군의 흡광도-배경값)} × 100

그 결과, 도 6B에서와 같이, DSS30, DSS36 화합물은 50 μM 농도에서 P25/CDK5 복합체의 활성을 50 ％ 까지 저해하였다. 또한 DSS30의 유사체 4종은 저해 활성이 DSS30과 유사하거나 우수하였으며 DSS36의 유사체 3종 중 DSS363은 저해 활성이 DSS36 보다 우수하였다. 그러므로, DSS30 및 DSS36의 골격이 P25/CDK5 저해 활성에 중요함을 알 수 있다.

(2) BACE1과 인산화 특이적 BACE1 항체를 이용한 P25/CDK5 저해제 활성조사

본 발명에서 확인한 AD 발병에 관여하는 BACE1을 기질로 사용하여, DSS30과 DSS36 화합물 및 유사체 화합물이 P25/CDK5에 의한 BACE1의 인산화를 저해하는지 다음과 같이 조사하였다.

320ng의 정제된 BACE1 (Panvera) 및 50 ng의 정제된 P25/CDK5 복합체에 카이네이즈 완충액(20 mM MOPS (pH7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 20 μM 소듐 오르토바나데이트)과 200 μM ATP를 첨가하고 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절한 후, 30℃에서 90분 동안 반응시키고, 5X 시료 완충액(60 mM Tris-HCl(pH6.8), 25 ％ 글리세롤, 2 ％ SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1 ％ 브로모페놀 블루) 7.5 μl를 넣어 반응을 종료시켰다. 이때 CDK5 저해제인 로스코비틴(roscovitine, Calbiochem)과 화합물을 반응 혼합물에 50 μM 농도로 가한 후, 상기와 동일한 조건에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 5분간 끓인 후, 12 ％ SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달한 후, 막을 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST에서 밤새 블로킹하고, PBST로 15분씩 3회 세척하였다. BACE1 인산화 특이적 항체는 1:1000으로, BACE1 항체(BACE1의 296-310aa에 해당하는 RLPKKVFEAAVKSIK(서열번호: 4)를 항원으로 사용하여 Peptron에서 주문제작)는 1:2500으로 5％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지(Gibco-BRL)에 각각 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 막을 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. 염소 항-토끼 HRP 결합된 항체(Amersham phamacia)를 1:10,000으로 5 ％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 처리하고, 다시 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. ECL 시스템(Amersham)을 이용하여 BACE1의 인산화 정도와 BACE1의 양을 각각 확인하였다.

그 결과, 도 7A에서와 같이 BACE1 인산화가 로스코비틴에 의해 저해되었으며 DSS30의 유사체 4종 모두 BACE1의 인산화를 저해할 수 있었고 그 중 DSS301과 DSS303이 가장 강하게 저해하였다. 또한 DSS36은 BACE1의 인산화를 저해할 수 있었다. 그러므로, DSS30 및 DSS36의 골격이 AD 발병에 관여하는 BACE1를 기질로 사용한 P25/CDK5 어세이에서 저해 활성에 중요함을 알 수 있다.

(3) Tau와 인산화 특이적 Tau 항체를 이용한 P25/CDK5 저해제 활성조사

기존 알려진 AD 발병에 관여하는 Tau를 기질로 사용하여, DSS30과 DSS36 화합물 및 유사체 화합물이 P25/CDK5에 의한 Tau의 인산화를 저해하는지 다음과 같이 조사하였다.

2.75 ㎍의 정제된 Tau (Calbiochem) 및 50 ng의 정제된 P25/CDK5 복합체에 카이네이즈 완충액(20 mM MOPS (pH7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 20 μM 소듐 오르토바나데이트)과 200 μM ATP를 첨가하고 ddH₂O로 총 용량을 30 μl로 조절한 후, 30℃에서 90분 동안 반응시키고, 5X 시료 완충액(60 mM Tris-HCl(pH6.8), 25 ％ 글리세롤, 2 ％ SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1 ％ 브로모페놀 블루) 7.5 μl를 넣어 반응을 종료시켰다. 이때 CDK5 저해제인 로스코비틴(roscovitine, Calbiochem)과 화합물을 반응 혼합물에 50 μM 농도로 가한 후, 상기와 동일한 조건에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 5분간 끓인 후, 12 ％ SDS-PAGE 젤에서 전기영동하였다. 분리된 밴드를 PVDF 막에 전달한 후, 막을 10 ％ 탈지유가 포함된 PBST에서 밤새 블로킹하고, PBST로 15분씩 3회 세척하였다. Tau의 인산화 특이적 항체(AT8, Innogenetics)는 1:1500으로, Tau 항체(AHB0042, Biosource)는 1:2500으로 5％ FBS(Gibco-BRL)가 첨가된 RPMI1640 배지(Gibco-BRL)에 각각 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 막을 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. 염소 항-마우스 HRP 결합된 항체(Amersham phamacia)를 1:10,000으로 5 ％ FBS가 첨가된 RPMI1640 배지에 희석하여 막에 가하고 실온에서 1시간 동안 처리하고, 다시 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. ECL 시스템(Amersham)을 이용하여 Tau의 인산화 정도와 Tau의 양을 각각 확인하였다.

그 결과, 도 7B에서와 같이 Tau 인산화가 로스코비틴에 의해 저해되었으며 DSS30의 유사체 4종 모두 BACE1의 인산화를 강하게 저해할 수 있었고 그 중 DSS303이 가장 강하게 저해하였다. 또한 DSS36과 DSS363은 BACE1의 인산화를 강하게 저해할 수 있었다. 그러므로, DSS30 및 DSS36의 골격이 기존 알려진 AD 발병에 관여하는 Tau를 기질로 사용한 P25/CDK5 어세이에서 저해 활성에 중요함을 알 수 있다.

(4) P25를 과발현하는 세포주를 사용한 DSS30과 DSS36 화합물 및 유사체 화합물에 대한 세포-기반 어세이

시험관 내(In vitro) 어세이에서 확인된 저해 화합물이 실제 세포 내에서 P25/CDK5에 의한 BACE1의 인산화를 저해하고 Aβ 분비를 억제하는지를 다음과 같이 조사하였다.

P25를 안정적으로 발현하는 PC12_tet-off 세포주의 제조, P25 안정적 세포에서의 BACE1 인산화 분석을 위한 웨스턴 블랏팅 및 Aβ 양의 측정은 실시예 1, (3-2)의 단계 1 내지 3에 기술되어 있다. P25-3 세포를 독시사이클린을 함유하지 않는 RPMI 1640 배지에서 3일간 키운 뒤 0.05 ％ 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine, Sigma)-피복된 6 웰 플레이트에 1×10⁶ 세포/웰로 가하고 24시간 후에 조절된 배지(5 ％ HS, 1 ％ FBS, 0.5 ％ P/S)가 첨가된 RPMI1640 배지) 1 ml로 교환하였다. 이때 로스코비틴 및 저해 화합물을 최종농도가 50 μM이 되게 하여 8 시간 동안 배양한 후, 배양액을 취하여 실시예 1, (3-2)의 단계 3과 동일하게 Aβ 양을 측정하고, 남은 세포는 실시예 1, (3-2)의 단계 2와 동일하게 세포용해액을 만들어 웨스턴 블랏팅하여 BACE1의 인산화 저해 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 8A에 나타나 있는 것과 같이 DSS36은 BACE1의 인산화를 25 ％, DSS30 화합물은 12％ 저해하였다. 도 8B에서 볼 수 있듯이, DSS303 화합물은 Aβ의 분비를 72％, DSS36 화합물은 Aβ의 분비를 81 ％ 저해하였다. 양성 대조군으로 사용했던 로스코비틴은 50 μM 에서 24시간 동안 처리하면 세포가 죽기 시작하므로, 세포 독성을 최소화하기 위하여 본 실시예에서는 화합물을 8시간 동안만 처리하였고, 이때 로스코비틴은 50％ 정도의 저해를 보이는 24시간 처리와 달리 BACE1의 인산화는 저해하지만 Aβ의 분비를 억제하지 않았다.

이상의 실시예 2에서는 DSS30 및 DSS36 화합물의 골격이 시험관 인산화 실험 및 세포-기반 어세이에서 P25/CDK5 복합체의 저해 활성을 나타내는데 중요함을 알 수 있다.

Claims (13)

1. 하기 화학식 Ⅰ의 화합물을 활성 성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:

   ＜화학식 Ⅰ＞

   상기 식에서,

   R¹은 수소, 메톡시 또는 사이클로프로필메틸포름아마이드이고,

   R²는 수소이고,

   R³는 피페리딘이거나,

   R² 및 R³는 그들이 부착된 탄소 원자와 함께 피롤, 또는 1,4-디옥산 고리를 형성한다.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 화학식 1의 화합물이 하기 구조식을 갖는 화합물들로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 퇴행성 뇌질환이 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 니만-픽병, 뇌 허혈, 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화학식 Ⅰ의 화합물이 BACE1 (beta-site APP-cleaving enzyme 1)의 인산화를 저해하여 β-아밀로이드의 분비를 저해함으로써 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 특징으로 하는 조성물.
8. 하기 단계들을 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 화합물의 스크리닝 방법:

   후보 화합물을 P25/CDK5 복합체 및 BACE1과 반응시키거나 후보 화합물을 P25를 발현하는 포유동물 세포주에 처리한 후, BACE1의 인산화 정도를 인산화된 BACE1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 방사성 동위원소로 표지된 ATP를 이용하여 측정하는 단계(단, 상기 인산화된 BACE1에 특이적으로 결합하는 항체는 BACE1의 아미노산 서열에서 252번 트레오닌(Thr²⁵²)을 중심으로 N-말단 방향 및 C-말단 방향으로 각각 10개 이하의 아미노산이 포함되도록 선택된 영역의 올리고펩타이드를 항원으로 사용하여 제조된 것임); 및

   측정된 BACE1의 인산화 정도를 후보 화합물을 사용하지 않은 대조군에서의 BACE1의 인산화 정도와 비교하여 BACE1의 인산화 정도를 대조군보다 감소시키는 화합물을 선별하는 단계.
9. 제8항에 있어서, 선별된 화합물이 P25/CDK5 복합체에 의한 BACE1의 인산화를 대조군에 비해 10 ％ 이상 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제8항에 있어서, 선별된 화합물이 β-시크리테이즈의 활성 증가 또는 β-아밀로이드의 분비를 저해하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
13. 삭제