KR101713421B1 - 뇌신경질환의 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼페인에 의해 절단된 DARPP-32 단백질 내의 절단 펩타이드를 포함한 뇌신경질환 진단용 바이오마커 조성물과 시료 내에서 DARPP-32의 mRNA 레벨 측정 또는 발현된 DARPP-32 단백질의 크기를 측정하는 단계와 이를 정상 시료의 그것과 비교하는 단계를 포함하는 뇌신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 Thr¹⁵³ 을 포함한 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 이를 이용하여 알츠하이머를 포함한 뇌신경질환을 진단할 수 있으며, 칼페인에 의한 DARPP-32 단백질의 개열을 경쟁적으로 억제하여 신경세포 보호효과를 유효하게 발휘할 수 있다.

Description

뇌신경질환의 진단 또는 치료용 조성물{Composition for diagnosing or treating brain neuronal disease}

본 발명은 알츠하이머, 치매, 퇴행성 뇌질환, β-아밀로이드-관련 염증성 질환 또는 장애, 및 인지 능력 상실을 포함하는 뇌신경질환의 진단용 조성물, 진단 방법 및 약학 조성물에 관한 것이다.

알츠하이머 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 등으로 대표되는 뇌신경질환은 신경세포 손상과 소실로 인하여 발생하는 것으로 알려져 있다.

그 중 치매는 후천적으로 발생한 뇌의 병변으로 인한 기억장애, 언어의 장애, 인격이나 감성의 변화를 포함한 고차원적인 대뇌의 기능장애가 지속되는 상태를 의미하는 임상증후군이다.

치매는 기질적인 원인이 밝혀져 있지 않고 호전을 기대할 수 없는 알츠하이머성 치매 등을 포함한 원발성 치매와, 뇌혈관이나 심혈관 장애로 인한 중풍으로 일어나는 혈관성 치매로 분류할 수 있으며, 현재 알츠하이머성 치매의 치료제로는 아리셉트, 레미닐, 엑셀론과 같은 콜린에스테라제 억제제를 사용하는 반면, 혈관성 치매는 혈관확장제나 혈전억제제를 사용하고 있으며, 치매의 종류에 따라 다양한 치료제들이 사용되고 있다.

그러나 아직까지 알츠하이머에 대한 치료제는 현재 거의 없으며, 출시된 약들도 미미한 증상경감 효과만 있을 뿐, 원인을 치료하는 약물은 현재 전무한 상태이다.

한편, 알츠하이머에 대한 진단은 MRI 등을 이용한 뇌 위축 정도나 지적, 행동학적 장애에 의한 정도로 확인이 가능하지만 알츠하이머가 많이 진행되어야만 확인이 가능하며 특히 정상노화인지 알츠하이머인지 여부를 감별할 수 있는 진단으로는 적합하지 않다.

알츠하이머의 주요한 병인적 특징 중 하나는 아밀로이드 플라크로서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP, Amyloid precursor protein)이 β-세크리타아제(β-secretase)와 γ-세크리타아제(γ-secretase)에 의해 잘려 베타 아밀로이드(beta-amyloid)가 만들어지며, 다양한 원인과 과정에 의해 베타 아밀로이드는 중합체를 형성하여 플라크가 된다. 이렇게 아밀로이드 플라크 형성과정에서 베타 아밀로이드 펩타이드는 뉴런에 독성을 나타내어 뉴런이 퇴화되고 결국은 알츠하이머병으로 진행한다고 알려져 있다.

이에 따라, 방사선 동위원소로 표지한 염료를 인체에 주입하여 베타 아밀로이드 축적의 정도를 확인하여 알츠하이머의 진단과 진행의 정도를 측정하는 방법이 개발되어 있지만 정상노인에서도 아밀로이드 플라크가 많이 발견되는 등의 여러 가지 문제로 진단마커로 아직 사용되고 있지 못한 상황이다.

따라서, 보다 효과적인 진단 마커 및 진단 방법의 개발이 요구되고 있다.

1. 대한민국 공개특허 10-20110132080호.

따라서 본 발명은 뇌신경질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 뇌신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

또한 본 발명은 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 칼페인에 의해 절단된 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료 내에서 DARPP-32의 mRNA 레벨 측정 또는 발현된 DARPP-32 단백질의 길이를 측정하는 단계; 상기 측정된 DARPP-32의 mRNA 레벨 또는 DARPP-32 단백질의 길이를 정상 시료의 그것과 비교하는 단계;를 포함하는 뇌신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Thr¹⁵³을 포함한 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산을 포함하는 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진다.

상기 펩타이드는 저분자 약물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA를 포함하는 핵산 또는 변형 핵산계열, PNA, 백신 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 뇌신경질환 치료제를 추가로 도입할 수 있다.

상기 뇌신경질환은 알츠하이머, 치매, 퇴행성 뇌질환, β-아밀로이드-관련 염증성 질환 또는 장애, 및 인지 능력 상실로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환이며, 바람직하게는 알츠하이머이다.

본 발명에 따른 칼페인에 의해 절단된 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 포함한 뇌신경질환 진단용 바이오마커 조성물과 시료 내에서 DARPP-32의 mRNA 레벨 측정 또는 발현된 DARPP-32 단백질의 길이를 측정하는 단계와 이를 정상 시료의 그것과 비교하는 단계를 포함하는 뇌신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 알츠하이머를 포함한 뇌신경질환 진단에 유용하게 사용할 수 있으며, Thr¹⁵³ 을 포함한 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 칼페인에 의한 DARPP-32 단백질의 개열을 경쟁적으로 억제하여 신경세포 보호효과를 유효하게 발휘할 수 있다.

도 1은 AD 환자 뇌에서 DARPP-32 단백질의 형태를 확인한 결과이고
도 2는 오카다산(okadaic acid, OA) 및 아밀로이드-β(amyloid-β, Aβ)를 처리한 신경세포에서 DARPP-32의 레벨을 확인한 결과이고,
도 3은 OA가 처리된 신경세포에서 칼페인 억제제에 의한 DARPP-32의 감소 차단 효과를 확인한 결과이고,
도 4는 칼페인에 의한 재조합 DARPP-32의 절단을 확인한 결과이고,
도 5는 Aβ독성으로부터 DARPP-32 또는 DARPP-32 T153A의 발현이 초기 신경세포와 SH-SY5Y 세포 보호하는 효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 알츠하이머, 치매, 퇴행성 뇌질환, β-아밀로이드-관련 염증성 질환 또는 장애, 및 인지 능력 상실을 포함하는 뇌신경질환 진단용 조성물에 대해 연구하던 중, 알츠하이머 뇌 시료에서 칼페인(Calpain)에 의한 사이클릭 아데노신일인산(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP)-조절된 뉴런의 인단백질(cAMP-regulated neuronal phosphoprotein, DARPP-32)의 특이적인 절단 펩타이드를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상기 DARPP-32 단백질은 단백질 인산가수분해효소 1 조절 서브유닛 1B(Protein phosphatase 1 regulatory subunit 1B, PPP1R1B)으로도 알려져 있으며, PPP1R1B 유전자에 코딩되어 있는 단백질이고, 신경전달의 조절 및 통합에서 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있다.

본 발명에 따른 DARPP-32 단백질은 NCBI 넘버: NP_115568.2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. DARPP-32 단백질은 상기 칼페인에 의해 절단될 수 있으며 칼페인은 DARPP-32 단백질 C 말단의 Thr¹⁵³을 절단한다.

따라서 본 발명은 칼페인에 의해 절단된 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 알츠하이머 환자의 뇌에는 DARPP-32 단백질이 각각 ~28kDa 또는 ~4kDa의 크기를 가지는 두 가지의 펩타이드 단편으로 존재한다는 것을 발견하였다.

상기 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드는 하기 표 1의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 단편 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 단편으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

서열번호 1	MDPKDRKKIQFSVPAPPSQLDPRQVEMIRRRRPTPAMLFRLSEHSSPEEEASPHQRASGEGHHLKSKRPNPCAYTPPSLKAVQRIAESHLQSISNLNENQASEEEDELGELRELGYPREEDEEEEEDDEEEEEEEDSQAEVLKVIRQSAGQKT
서열번호 2	TCGQGLEGPWERPPPLDESERDGGSEDQVEDPALSEPGEEPQRPSPSEPGT

본 명세서에서 청구하는 뇌신경질환은 알츠하이머, 치매, 퇴행성 뇌질환, β-아밀로이드-관련 염증성 질환 또는 장애, 및 인지 능력 상실로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환이며, 바람직하게는 알츠하이머이지만 이에 제한되는 것은 아니다.

더불어 본 발명은 시료 내에서 DARPP-32의 mRNA 레벨 측정 또는 발현된 DARPP-32 단백질의 길이(length)를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 DARPP-32의 mRNA 레벨 또는 DARPP-32 단백질의 길이(length)를 정상 시료의 그것과 비교하는 단계;를 포함하는 뇌신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 Thr¹⁵³을 포함한 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 펩타이드는 서열번호 3(QKT) 또는 서열번호 4(KTT)의 아미노산을 포함하는 3 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, K와 T 사이가 절단된다.

일례로 QKTTCG(서열번호 5), QKTT(서열번호 6), QKTTC(서열번호 7) 또는 VLKVIRQSAGQKTTCGQGLEGPW(서열번호 8)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 칼페인과 결합하여 DARPP-32 단백질의 절단을 저해하는 모방 억제제(mimic inhibitor)일 수 있다.

더불어 상기 펩타이드는 뇌신경질환 치료제를 추가로 도입하여, 신경세포 보호 효과를 나타낼 수 있다.

상기 뇌신경질환 치료제는 저분자 약물, 단백질, 펩타이드, RNA, DNA를 포함하는 핵산 또는 변형 핵산계열, PNA(Peptide Nucleic Acid), 백신 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

당업자는 약물의 종류를 고려하여 적당한 공지의 방법을 통해 뇌신경질환 치료제와 같은 약물을 도입시킬 수 있다. 일례로서 시판된 커플링 시약(N-결합형, COOH-결합형, 아미노산 잔기 변형형, S-S 결합형 등)을 이용하는 방법, 크로라민(chloramine) T를 이용하는 방법, 이소치아네이트기(isothiocyanate group) 등을 통해 상기 펩타이드에 약물을 도입시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 칼페인에 의해 분해되어 유리된 뇌신경질환 치료제가 뇌신경질환 치료에 유용한 혈중 농도가 되도록 충분한 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 비강흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

< 실시예 1> 실험 방법

1. 인간의 뇌 조직과 APP/PS1- Tg 마우스 뇌 조직 준비

8명의 AD 환자로부터 얻은 안쪽 측두부의 뇌회(Medial temporal gyri)와 7개의 나이와 성별이 맞는 대조군을 네덜란드 브레인 뱅크(Netherlands Brain Bank)로부터 얻었다(표 2).

AD의 병리학적 병기(Pathological staging)는 Braak staging system(Braak & Braak 1991)를 기반으로 하였다.

같은 연령(12달) 대조군 마우스와 APP/PS1 마우스로부터 얻은 전체 뇌 조직은 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다.

진단	성별	연령	Braak	아밀로이드	PMD	pH	무게
알츠하이머(AD)	남	85	5	C	07:10	6.13	1020
AD	남	65	6	C	08:50	6.88	1057
AD	남	65	5	C	05:50	6.36	1355
AD	남	65	5	C	07:20	6.47	1173
AD	남	87	5	C	06:10	6.14	1047
AD	남	67	5	C	04:10	6.40	1252
AD	남	70	6	C	04:50	6.95	1040
AD	남	82	5	C	05:15	6.34	1182
대조군	남	73	0	O	24:45	?	1267
대조군	남	71	1	O	07:40	6.20	1150
대조군	남	87	1	A	10:20	6.32	1256
대조군	남	80	0	O	07:15	5.80	1331
대조군	남	84	1	A	05:35	6.98	1337
대조군	남	82	1	O	05:10	6.75	1087
대조군	남	78	1	O	<17:40	6.52	1125

* PMD: 후 검시 지연(post mortem delay)

2. 신경세포의 배양 및 형질주입

마우스 대뇌 피질의 신경세포(mouse cortical neuron)의 초기 배양은 16일 째의 발달되지 않은 새끼의 뇌로부터 준비하였다.

대뇌 피질을 배아 뇌로부터 절개하였고, 이를 37℃에서 10분 동안 트립신을 이용하여 해리하였다.

그런 후, 세포 현탁액을 B27(Gibco-BRL)이 보충된 뉴로베셀 배지(Neurobasal medium)에 재현탁하였고, 폴리-D-라이신-(poly-D-lysine-, Sigma) 및 라미닌(Gibco-BRL)이 코팅된 플레이트 또는 커버슬립(coverslips)상에 도포하였다.

신경세포는 화학물질을 처리하기 전 5% CO₂, 37℃의 조건으로 12일간 배양하였다.

형질주입을 위해, 일차 대뇌 피질 신경세포를 24웰 플레이트에 4.8×10⁶ cells/plate의 밀도로 접종하고 5일간 배양하였다.

DIV5에서, 신경세포는 리포펙트아민 2000(Lipofectamin 2000, Invitrogen, #11668-019)을 이용하여, 제조사의 방침을 따라 DARPP32-야생형(dopamine-and cAMP-regulated neuronal phosphoprotein-wild type, DARPP32-WT) 및 T-153A 돌연변이 구조로 형질주입하였다.

1.5시간 후, 형질주입된 신경세포의 배양 배지를 항생제가 첨가된 신선한 조정 배지로 교체하고, 1μM 올리고머 Aβ를(oligomeric Aβ)를 48시간 처리하였다.

3. 약(Drug)

오카다산(okadaic acid, OA, 10 nM, Boehringer Mannheim), 칼페인 억제제-I(calpain inhibitor-I, 100 μM, Calbiochem), 칼페인 억제제-III(calpain inhibitor-III, 100 μM, Calbiochem) 및 칼펩틴(calpeptin, 100μM, Calbiochem)은 지정된 최종 농도로 신경세포 배양에 첨가하였다.

4. 세포 배양 및 Aβ 처리

인간 신경아세포종 세포주(human neuroblastoma cell line)인 SH-SY5Y 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovin serum, Hyclone)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)배지에서 성장시켰다.

동결건조된 Aβ 펩티드는 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 용해하였고, DMEM을 이용하여 최종농도 1μM으로 희석한 후, 16시간 동안 4℃에서 배양하였다.

준비된 Aβ 올리고머는 지정된 시간에 SH-SY5Y 세포주에 첨가하였다.

5. 부위 특이적 변이(Site-directed mutagenesis )

인간 DARPP-32의 잔기 153에 트레오닌-to-알라닌 포인트 돌연변이(threonine-to-alanine point mutation)를 Pfu 울트라 HF(Pfu Ultra HF, Agilent)를 이용하여 삽입하고(T153A) 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다.

사용한 프라이머의 염기서열은 서열번호 9 및 10과 같다.

6. 재조합 DARPP -32 단백질의 발현 및 정제

인간 DARPP-32 WT 및 DARPP-32 T153A 포인트 돌연변이가 코딩된 cDNA는 박테리아 발현 벡터 pGEX-4T-1(GE Healthcare)안에서 복제하고 대장균 균주 BL21(DE3, Novagen)로 형질전환하였다.

DARPP-32 WT 및 DARPP-32 T153A의 발현을 위해, 형질 전환된 세포들을 OD600에서 0.5 값을 가질 때까지 37℃에서 LB 배지에서 성장시켰다.

단백질 발현은 28℃에서 5시간 동안 0.5mM 이소프로필-β-d-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside, Sigma-Aldrich)를 첨가함으로 유도하였다.

발현된 재조합 단백질은 GST-결합 아가로스 레진(GST-Bind Agarose Resin, Elpis Biotech)을 이용하여 정제하였다.

7. 칼페인 절단 분석

칼페인에 의한 재조합 DARPP-32 WT 및 T153A 단백질의 생체 외 절단을 시행하였다.

재조합 DARPP-32 WT 또는 T153A(5μg)은 칼페인-1(calpain-1)과 함께 반응 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM DTT, 1 mM EDTA)에서 다양한 시간 동안(1, 5, 10 및 30분) 칼페인 억제제(100 μM zVAD, 100 μM calpeptin) 존재 또는 비 존재하에 배양하였다.

정해진 시간 동안 배양한 후, 반응 혼합물을 동일한 볼륨의 2x 도데실 황산나트륨(sodium dodecylsulfate, SDS) 샘플 버퍼와 혼합하고 10분 동안 가열했다.

샘플은 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)으로 분류한 후, 쿠마씨 염색(Coomassie staining)하거나 항-DARPP-32(anti-DARPP-32, Cell Signaling)항체 또는 항-GST(anti-GST, Santa cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다.

8. 웨스턴 블로팅

세포 또는 인간 뇌 조직 용해물은 단백질 추출 용액(protein extraction solution, Pro-Prep, Intron)을 이용하여 준비하였다.

단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 분류하였고 폴리피닐덴디플루오리드 멤브레인(PVDF membrane, Bio-Rad)으로 옮긴 후, 5% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 TTBS(tween 20-Tris-Buffered Saline) 완충액으로 차단하였다.

차단한 멤브레인은 DARPP-32(1:1000, Cell Signaling), 인산화(phospho)-DARPP-34(1:1000, Cell Signaling), cAMP 응답 인자-결합 단백질(cAMP response element-binding protein, CREB, 1:1000, Millipore), 인산화(phospho)-CREB (1:1000, Millipore), c-fos (1:100, Santa Cruz), 항-HA(anti-HA,1:5000, Roche), 항-PP1(anti-PP1, 1:200, Santa Cruz) 및 β-액틴(β-actin, 1:1000, Sigma)의 항체와 함께 4℃에서 16시간 배양하였다.

블롯은 TTBS 완충액으로 세척하고, 23℃에서 1시간 동안 이차 항체와 함께 배양하고 강화된 화학발광 시약(enhanced chemiluminescence reagents, Thermo)으로 가시화하였다.

9. 신경돌기 성장( neurite outgrowth)의 정량 분석

일차 신경세포는 독립적으로 GFP를 발현하는 DARPP-32 WT 또는 T153A cDAN를 형질주입하였다.

GFP159 양성 신경세포(n=100)의 낮은 해상도의 이미지(10×배율)은 샘플 당 20 내지 65 지점의 각각 다른 부위에서 취득하였다. 각 이미지에서 GFP-양성 신경세포의 신경돌기 길이 및 수는 메타모프(MetaMorph) 소프트웨어(Universal Imaging Corporation)을 이용하여 측정하였다.

10. 정량 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR )

네덜란드 브레인 은행에서 제공받은 8개의 AD 환자의 안쪽 측두부의 뇌회(Medial temporal gyri), 7개의 연령 및 성별이 매칭된 대조군의 인간 총 RNA는 뉴클레오스핀 RNA 키트(NucleoSpin RNA kit, Macherey-Nagel)을 이용하여 정제하였다.

단일가닥 cDNA는 슈퍼스크립III 역전사 효소(SuperScript III Reverse Transcriptase, Invitrogen)을 이용하여 합성하였다.

정량적 RT-PCR은 iCycler(Bio-Rad)를 이용하여 수행하였다.

RT-PCR을 위해 사용한 프라이머는 하기와 같다:

정방향(Forward)_엑손1a(exon1a)와 결합: 서열번호 11, 역방향(Reverse)_엑손2(exon2)와 결합:서열번호 12.

11. 단백질 인산가수분해효소 1(Protein phosphatase 1) 활성 분석

DARPP-32 WT 또는 T153A 돌연변이를 발현하는 SH-SY5Y 세포는 1% 트립톤 X-100(triton X-100)을 포함한 인산 완충 식염수(Phosphate buffer saline, PBS)로 용해하였다.

세포 용해물은 항-PP1(anti-PP1)항체와 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, 단백질 G-세파로스(G-sepharose, GE healthcare)과 함께 배양하였다.

비드는 용해 버퍼로 3회 세척하고, 100μM 형광 PP1 특이 기질(fluorogenic PP1 specific substrate)인 DiFMUP(Invitrogen)을 포함한 반응 용액(0.1M 아세트산 나트륨, pH5.0)과 함께 실온에서 30분간 배양하였다.

그런 후, 상등액을 수집하고 멀티 플레이트 리더기(multiplate reader, Infinite M200PRO, TECAN)을 이용하여 형광강도를 측정하였다.

< 실시예 2> AD 환자 뇌의 DARPP -32 단백질 형태 확인

DARPP-32가 알츠하이머의 발병 기전에 관여하는지를 확인하기 위하여, 대조군과 AD 환자의 DARPP-32 단백질의 레벨을 비교하였다.

흥미롭게도, AD 환자의 DARPP-32 단백질의 총 레벨은 대조군에 비하여 낮았다(도 1A 및 1B).

더불어 AD 환자의 뇌에서 DARPP-32의 두 가지 작은 형태(~28kDa, ~4kDa)가 증가하는 것을 발견하였다(도 1A, 1C 내지 1D).

이러한 대체가능한 DARPP-32 단백질은 APP/PS1 마우스 뇌에서도 발견되었다(도 1I).

DARPP-32의 대안적인 스플라이스 형태는 t-DARPP-32라고 보고된 바 있다.

상기 큰 DARPP-32 형태(~28kDa)는 t-DARPP-32와 크기가 비슷하기 때문에, DARPP-32(~28kDa)내부의 Thr34의 인산화 상태를 t-DARPP-32와 비교하였다. 그 결과 t-DARPP-32는 Thr43 인산화된 부위를 갖고 있지 않다고 알려져 있으나, 상기 큰 DARPP-32 형태(~28kDa)는 Thr 잔기에서 인산화되었고 AD 환자에서 이 인산화는 변화가 없었다(도 1A, E).

이 결과에 따라, AD 뇌에서 t-DARPP-32의 mRNA 레벨을 대조군 그룹과 비교하였다(도 1H).

흥미롭게도, 불활성화 형태로 알려진 DARPP-32 WT 및 단편에서 인산화는 AD 환자에서 증가된 것을 확인하였다(도 1F).

이러한 결과를 통해 인간 AD 뇌에서 DARPP-32의 구별되는 절단 생성물을 확인하였다.

< 실시예 3> OA 및 Aβ를 처리한 신경세포에서 DARPP -32의 감소 확인

AD 에서 DARPP-32 레벨 감소의 메커니즘을 이해하기 위하여, OA 또는 Aβ펩티드를 처리한 초기 신경세포와 SH-SY5Y 세포에서 DARPP-32 단백질 레벨을 측정하였다. 상기 Aβ펩티드는 세포 배양 모델에서 AD 병리를 모방하는데 사용되어 왔다.

상기 도 1의 결과와 마찬가지로, DARPP-32 단백질은 28kDa 단편으로 절단되었고, 모든 AD 세포 모델에서 덜 풍부하였고, CREB 인산화의 감소를 발견할 수 있었다(도 2).

이러한 결과를 통해 감소된 DARPP-32 레벨이 AD에서 PKA-CREB 신호의 손상과 연관이 있음을 확인하였다.

< 실시예 4> OA가 처리된 신경세포에서 칼페인 억제제에 의한 DARPP -32의 감소 차단 확인

상기 도 1G에서 비정상적인 DARPP-32 단백질 발현이 대안적인 스플라이싱(splicing)에 의한 것이 아닌 것을 확인하였기 때문에, 단백질 가수분해적 절단 활성이 DARPP-32 단백질 단편의 생성과 연관이 있을 것으로 추측하였다.

OA를 처리한 신경세포에서 활성화된 칼페인에 의해 일부 중요한 분자가 가수분해적으로 절단되며, AD에서 Aβ에 의해 증가된 세포질 칼슘 농도에 의해 강화된 칼페인 활성이 주요 단백질의 절단을 이끈다고 보고된 바 있다(Yoon et al. 2006; Yoon et al. 2007; Yoon et al. 2008 참고).

따라서 상기 실시예에서 AD 뇌 조직과 APP/PS1 Tg 마우스 뇌에서 칼페인에 의한 α-스펙트린(α-spectrin) 절단 생성물이 증가된 것을 발견한 것을 기반으로(도 1A, D 및 도1I) 칼페인이 DARPP-32 분해에 기여하는지 확인하였다. 이를 위해 OA를 처리한 초기 신경세포에 다양한 칼페인 억제제를 처리 또는 비처리한 후, DARPP-32 단백질 레벨을 조사하였다.

그 결과, OA에 의한 DARPP-32의 감소는 칼페인 억제제를 처리하였을 때 차단되었다(도 3).

더불어 같은 조건에서 CREB의 감소된 인산화가 회복된 것을 발견하였다.

따라서, 이러한 결과는 AD에서 DARPP-32의 감소는 활성화된 칼페인에 의한 단백질 가수분해적 절단에 의한 것이고, 칼페인의 활성은 DARPP-32 절단을 통한 CREP 신호와 연결되어 있음을 보여주었다.

< 실시예 5> 칼페인에 의한 재조합 DARPP -32의 절단 확인

DARPP-32가 칼페인에 의해 직접적으로 분해되는지 확인하기 위하여, 다양한 시간 동안 칼페인-1과 재조합 DARPP-32를 반응시키고, DARPP-32 단편을 웨스턴 블랏과 쿠마시 염색을 통해 조사하였다.

그 결과, 중요한 절단 생성 밴드(~40kDa)를 발견하였고, 이 크기는 AD 뇌와 AD 세포 모델에서 DARPP-32의 전체 길이(full-length) 형태와 큰 이형 사이의 크기 차이와 비슷하였다(도 1 및 도 4A).

전체 길이 GST-DARPP-32는 30분 후에 빠르게 소실되지만, 절단된 생성물(GST-DARPP-32 CF)는 이른 시기(1분)에 나타나 칼페인 절단에 대해 내성을 보였다(도 4A).

상기 GSF-DARPP-32로부터 생성된 절단 혼합물을 DARPP-32 및 GST 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 4A).

절단 반응 혼합물을 칼페인, 칼페인 억제제와 함께 배양하였을 때, 절단 생성물은 생성되지 않았다(도 4B).

DARPP-32의 칼페인 절단 부위를 식별하기 위하여, 다양한 잠재적인 절단 부위를 계산 프로그램(GPS-CCD)를 이용하여 확인하였다.

그 결과 재조합 DARPP-32 절단 생성물의 N-말단 GST-tag는 칼페인에 의한 절단 후에도 남아있었다(도 4A, 4B).

그러므로 DARPP-32 절단 부위가 C-말단 지역 근처에 있을 수 있다는 가능성을 기반으로 다양한 예측 사이트 중 Thr153에서 잠재적인 절단 사이트를 선택하였고 이 잔기를 알라닌(alanine)으로 변형하였다(DARPP-32 T153A).

그 결과 도 4C와 같이, DARPP-32 T153A는 칼페인 절단에 저항성을 가진 것을 확인하였다.

< 실시예 6> Aβ독성으로부터 DARPP -32 또는 DARPP - 32 T153A의 발현의 초기 신경세포와 SH-SY5Y 세포 보호 효과 확인

DARPP-32는 PP-1 억제를 통해 CREB의 인산화를 조절하기 때문에, DARPP-32 절단이 CREB 신호전달을 조절하지 못하고, 기능 이상을 이끌어 신경세포를 독성에서 보호할 수 있는 능력이 약화될 것이라 추측하였다.

이를 확인하기 위하여, DARPP-32 WT 또는 DARPP-32 T153A 돌연변이체를 발현하는 Aβ를 처리한 SH-SY5Y 세포에서 CREB 신호전달의 변화를 확인하였다.

그 결과 Aβ 처리는 CREB 인산화, c-fos 및 그 하류 타겟 유전자의 발현을 감소시켰고 DARPP-32 WT 또는 T153A 돌연변이는 CREB 인산화 및 c-fos 발현을 감소시켰다(도 5A 내지 5C).

일차 신경 세포에서 같은 조건의 실험을 한 결과, Aβ 처리는 전체 길이 DARPP-32 WT 발현 레벨의 감소를 유도하는 반면, DARPP-32 T153A에서는 아무런 변화도 보이지 않았다. 따라서 초기 신경세포에서 T153A 돌연변이를 확인하는 것은 DARPP-32의 절단을 방지할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 같은 조건에서 초기 신경세포에서 DARPP-32 절단에 의한 CREB 신호 조절 조절장애를 확인하였다(도 5D 내지 5F).

DARPP-32는 직접적인 상호작용을 통해 PP1활성을 억제한다고 알려져 있다.

이를 기반으로 ARPP-32 절단에 의한 CREB 신호 조절 조절장애에 대한 자세한 메커니즘을 확인하기 위해, PP1과 DARPP-32 WT 또는 T153A 돌연변이와의 상호작용을 조사하였다.

그 결과 Aβ 처리는 PP1와 DARPP-32 WT와의 연결을 감소시키며, DARPP-32 T153 돌연변이는 PP1과의 상호작용을 향상시키는 것을 확인하였다(도 5G, H).

이 상호작용은 PP1에서 DARPP-32의 억제기능에 대해 중요하기 때문에, PP1 활성에서 DARPP-32 WT 또는 DARPP-32 T153 돌연변이와 PP1의 다른 상호작용이 차이를 이끌 것으로 추측되었다.

이와 일치하게 DARPP-32 T153A 돌연변이는 더 강한 PP1 억제를 나타내었다(도 5I).

마지막으로, Aβ를 처리한 초기 신경세포에서 DARPP-32 WT 또는 T153A 돌연변이의 발현에 의하여 매개된 CREB 신호의 복구를 조사하였다.

상기 실시예의 결과와 일치하게(도 5A 내지 I), 모의 형질주입된 초기 신경세포에서 Aβ처리는 DARPP-32 WT 또는 T153A 돌연변이의 발현에 의해 차단되어 수상돌기의 성장을 예방하였다(도 5J, K).

또한 DARPP-32 T153A 돌연변이 발현은 Aβ 부재하에 수상돌기의 성장을 증가시켰고(도 5J), 이를 통해 DARPP-32 절단의 차단은 신경세포의 성장을 위한 CREB 신호를 유지하여 Aβ독성으로부터 신경세포를 보호한다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Composition for diagnosing or treating brain neuronal disease <130> ADP-2015-0220 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Pro Lys Asp Arg Lys Lys Ile Gln Phe Ser Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Gln Leu Asp Pro Arg Gln Val Glu Met Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys 65 70 75 80 Ala Val Gln Arg Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Asn Glu Asn Gln Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val 130 135 140 Ile Arg Gln Ser Ala Gly Gln Lys Thr 145 150 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu Arg Pro Pro Pro Leu 1 5 10 15 Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp Gln Val Glu Asp Pro 20 25 30 Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg Pro Ser Pro Ser Glu 35 40 45 Pro Gly Thr 50 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Lys Thr 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Thr Thr 1 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Lys Thr Thr Cys Gly 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Lys Thr Thr 1 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Lys Thr Thr Cys 1 5 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser Ala Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp 20 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Site-directed mutagenesis <400> 9 agtctgctgg gcaaaaggca acctgtggcc agggt 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Site-directed mutagenesis <400> 10 accctggcca caggttgcct tttgcccagc agact 35 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_binds to exon1a <400> 11 ttttcatttc tcacaaggac tgggt 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_binds to exon2 <400> 12 ctggtgagga gtgctctgag agc 23

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 진단용 바이오마커 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드는 NCBI accession no. NP_115568.2인 DARPP-32 단백질의 153번째 아미노산인 Thr¹⁵³ 위치에서 칼페인에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 진단용 바이오마커 조성물.
3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 진단용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 제제는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 진단용 조성물.
5. 시료 내에서 NCBI accession no. NP_115568.2인 DARPP-32 단백질의 153번째 아미노산인 Thr¹⁵³ 위치에서의 절단 여부를 확인하는 단계; 및
   상기 DARPP-32 단백질이 절단된 것으로 확인된 경우 알츠하이머로 진단하는 단계;를 포함하는 알츠하이머 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 NCBI accession no. NP_115568.2인 DARPP-32 단백질의 153번째 아미노산인 Thr¹⁵³ 위치에서의 절단 여부를 확인하는 단계는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 DARPP-32 단백질의 절단 펩타이드를 검출하여 확인하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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