KR100930133B1 - 베타-아밀로이드 결합인자 및 이의 저해자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 VEGF 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 β-아밀로이드를 격리시키는 화합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 VEGF를 격리시키는 화합물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 VEGF의 β-아밀로이드와의 결합을 저해하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이고 또한 알츠하이머 질환의 진단 및 치료에 관한 것이다.

베타-아밀로이드

Description

베타-아밀로이드 결합인자 및 이의 저해자{BETA-AMYLOID BINDING FACTORS AND INHIBITORS THEREOF}

본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 VEGF 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 β-아밀로이드를 격리시키는(sequester) 화합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 VEGF를 격리시키는 화합물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 VEGF의 β-아밀로이드 결합 저해성 화합물을 검색하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 알츠하이머병 및 과도한 혈관신생을 치료하고 진단하는 방법에 관한 것이다.

노인 치매의 주된 원인인 알츠하이머병(AD)은 중추신경계의 복잡한 장애로, 진행성 인지력 감소의 임상학적 특징을 갖는다. 알츠하이머병의 병리학적 특징은 세포외 노쇠반점(senile plaques), 세포내 신경섬유농축(intracellular neurofibrillary tangles), 신경세포 손실, 대뇌 아밀로이드 혈관병증(cerebral amyloid angiopathy) 및 뇌 특정 부위의 뇌혈관 변성이다(Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(26):15809-15814; Yamada M., Neuropathology 2000; 20(1): 8-22; Yankner BA, Neuron 1996;16(5):921-932). β-아밀로이드(Aβ)는 노쇠반점을 이루는 주된 성분으로, 아밀로이드 전구체 단백질이 단백질 분해되어 생성된다(Vassar et al., Neuron 2000; 27(3): 419-422). 축적된 증거들은 β-아 밀로이드가 알츠하이머병의 중요한 원인물질임을 나타내고 있지만(Calhoun et al., Nature 1998;395(6704):755-756; Hardy et al., Science 1992;256(5054):184-185; Hsiao et al., Science 1996;274(5284):99-102; Lewis et al., Science 2001;293(5534):1487-1491; Schenk et al., Nature 1999;400(6740):173-177; Sommer B., Curr Opin Pharmacol 2002;2(1):87-92; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171), 알츠하이머병에서 신경세포 변이에 대한 정확한 기작은 명확하지 않다. 그러나 다수 인자들이 상기 질환 발생에 관여하는 것으로 추정된다.

대부분의 알츠하이머병 환자들은 대뇌 아밀로이드 혈관변증, 내피세포 변이 및 관류저하와 같은 뇌혈관성 병리를 수반한다(de la Torre JC. Stroke 2002;33(4):1152-1162; Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171). 뇌혈관 질환 및 중풍과 연관된 혈관 위험 인자들로는 고혈압, 죽상경화증, 당뇨병 및 심장질환이 있으며, 이들은 알츠하이머병 발병 위험도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 혈관 병리의 대다수는 알츠하이머 환자에서 공통적으로 나타나는 뇌 허혈을 야기한다. 이에 뇌혈관 기능장애는 알츠하이머에서 신경세포변이의 연속과정에 중요한 역할을 하는 것으로 추론된다.

혈관 내피세포 성장인자(VEGF)는 과투과성, 내피세포 성장 및 증강된 글루코스 전달과 같은 혈관 기능에 대한 주된 조절자이다. VEGF는 또한 종양 성장 및 허혈성 질환과 같은 생리적 혈관 형성 및 병리적 신생혈관증식에 중요하다 (Ferrara N. Am J Physiol Cell Physiol 2001;280(6):C1358-C1366; Harrigan et al., Neurosurgery 2002;50(3):589-598; Plate et al., Nature 1992;359(6398):845-848; Shweiki et al., Nature 1992;359(6398):843-845; Zhang et al., J Clin Invest 2000;106(7):829-838). 뇌를 비롯한 다양한 기관에서, VEGF 및 이에 대한 수용체 발현은, 알츠하이머병에서 나타나는 저산소성 스트레스 또는 저혈당성 스트레스에 대한 반응에서 상향 조절된다(Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(26):15809-15814; Marti et al., Am J Pathol 2000;156(3):965-976; Stein et al., Mol Cell Biol 1995;15(10):5363-5368).

알츠하이머 환자는 건강한 노인에 비하여 뇌척수액내 VEGF 농도가 증가되어 있으며, 혈관주위의 별아교세포(astrocyte) 및 뇌혈관 벽 근처에서 VEGF 면역반응성이 강화된다는 보고들이 있다(Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging 2002;23(2):237-243). 더욱이, 알츠하이머병과 관련된 뇌혈관 병리가 뇌 허혈을 야기하여, VEGF는 신경세포 및 아교세포에서 높게 발현된다(Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging 2002;23(2):237-243). 그러나, 이러한 보고들에서 VEFG와 β-아밀로이드의 직접적인 상호작용 및 동일 부 위치성(co-localization)은 확정되어 있지 않다.

최근, VEGF는 허혈 및 글루타메이트-유도성 외독소 위험에 대한 신경보호 기능뿐 아니라 향신경(neurotrophic) 기능을 갖는 것으로 보고되었다(Jin et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(18):10242-10247; Matsuzaki et al., FASEB J 2001;15(7):1218-122P; Ogunshola et al., J Biol Chem 2002;277(13):11410-11415; Oosthuyse et al., Nature Genet 2001;28(2):131-138; Schratzberger et al., Nature Med 2000;6(4):405-413; Sondell et al., J Neurosci 1999;19(14):5731-5740). 이러한 연구들로 VEGF가 알츠하이머병 혈관 병리학 및 신경세포 병리학에 관련성이 있을 수 있다는 가능성이 제기되었다. 본 출원은 알츠하이머병 환자의 뇌에서 β-아밀로이드 병반과 VEGF의 과다 축적 및 동일부 위치성을 언급한다. 시험관 내 실험에서 VEGF는 β-아밀로이드와 강한 친화성 결합을 갖는다는 것이 확인되었다. 결합이 이루어진 후, VEGF는 복합체로부터 서서히 분리된다. β-아밀로이드 형성 및 응집 여부를 검출하여 신경 질환 특히, 알츠하이머 질환을 초기에 진단하고 치료할 수 있는 정확하고 민감한 분자적 기술이 요구된다. 또한 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 저해하므로써 유리(free) VEGF가 뇌에서 신경보호 및 향신경 활성을 수행가능하도록 하는 화합물이 요구된다. 본 발명의 목적은 하기 발명의 설명, 첨부된 도면 및 청구범위에서 더욱 충분히 설명된다.

본 발명은 상기한 문제점들을 해결하고자 한다. 본원발명은 VEGF 폴리펩타이드가 β-아밀로이드에 특이적으로 결합한다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. VEGF의 특정 절편들과, 이들에 결합하는 β-아밀로이드를 밝혔다. 또한 VEGF는 β-아밀로이드 반점과 함께 침착되므로, 본 발명은 표지된 VEGF 폴리펩타이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 응집된 β-아밀로이드 또는 반점의 존재를 분석하는 것에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 알츠하이머병 또는 아밀로이드 반점의 존재로 특정화된 그외 다른 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 VEGF 폴리펩타이드에 근거하여 제작한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 이는 유리 부유상태의 β-아밀로이드에 결합 및 흡착하여 β-아밀로이드를 응집에 이용될 수 없도록 한다. 이와는 반대로, 다른 실시예에서, 본 발명은 β-아밀로이드 서열에 근거하여 제작한 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 과다 혈관신생으로 인한 질환 특히 암, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 신장질환 또는 비만 등을 치료 및 예방하기 위한 목적으로, 환경으로부터 VEGF를 제거하는 것이 이로운 조건에서 VEFG를 격리시키고 비활성화시키기 위한 용도로 이용된다.

특히, 본 발명은 헤파린 및 β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 β-아밀로이드 결합성 폴리펩타이드(β-ABP)에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 5를 포함하지 않는다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3과 적어도 85% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있으며, 서열번호 3과 적어도 90%, 95% 또는 97% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되며, N- 말단 또는 C-말단에 약 5개의 아미노산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다. 더욱이, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4의 24번째 Gly 에서 35번째 Met까지인 β-아밀로이드 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 해리 상수 약 10 nM, 1 nM 또는 100 pM의 β-아밀로이드에 대하여 결합 친화성을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 기재한 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 상기 폴리펩타이드에 특이적인 단클론 항체일 수 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 β-아밀로이드 및 내인적 VEGF 간의 결합을 방지하는 방법에 관한 것으로, (a) 작동되도록 프로모터에 연결된 VEGF 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제조하고, 및 (b) 상기 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 필요한 환자에 투여하여 상기 DNA 서열이 뇌내에서 발현되어 β-아밀로이드 및 VEGF 폴리펩타이드간의 결합이 형성되는 것을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 과다 혈관신생 부위에서 내인성 VEGF를 비활성화시키는 방법에 관한 것으로, (a) 작동되도록 프로모터에 연결된 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 제조하고, 및 (b) 상기 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 필요한 환자에 투여하여 상기 DNA 서열이 과다 혈관신생 부위에서 발현되어 β-아밀로이드 펩타이드와 내인성 VEGF간에 결합이 형성되는 것을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 검출하는 방법에 관한 것으로, (a) VEGF를 β-아밀로이드가 함유된 것으로 추정되는 시료에 가하고 및 (b) 시료에 β-아밀로이드가 존재하는 경우 VEGF에 β-아밀로이드 결합을 확 인하는 것을 포함한다.

본 방법에서 상기 폴리펩타이드는 전-응집(pre-aggregate)된 β-아밀로이드에 결합할 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드는 세포외 반점(plaque)에 결합할 수 있다. 또한 본 방법에서 상기 폴리펩타이드는 VEGF의 헤파린 결합성 도메인이다. 또한 상기 폴리펩타이드는 실제로 헤파린 결합성 도메인의 절반부중 C-말단부이다.

본 발명의 다른 실시예는 아밀로이드 반점의 존재로 표시되는 질환을 진단하는 방법에 관한 것으로, (a) 아밀로이드 반점을 포함하는 것으로 추정되는 시료 조직을 제공하고, (b) 상기 시료 조직을 β-아밀로이드에 특이적으로 결합가능한 VEGF 폴리펩타이드와 접촉시키고, 및 (c) 상기 폴리펩타이드와 상기 아밀로이드 반점간의 결합을 검정하는 것을 포함하며, 상기 결합은 병에 걸린 상태임을 나타낸다.

상기 방법에서, VEGF 폴리펩타이드는 β-아밀로이드 결합성 폴리펩타이드(β-ABP)일 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드는 표지된 것일 수 있다. 또한 상기 기술한 방법에서 단계 (c)의 상기 검정은 상기 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 특이적으로 결합하는 리간드를 검출하므로써 실시되며, 상기 리간드는 표지된 것이다.

본 발명은 또한 (a) β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 VEGF 폴리펩타이드를 포함하는 용기, (b) 상기 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 특이적으로 결합하는 제1 리간드, (c) 상기 제1 리간드에 특이적으로 결합하는 표지된 제2 리간드 및 (d) 사용설명서를 포함하는 진단키 트에 관한 것이다.

본 발명은 VEGF 및 β-아밀로이드 간의 결합을 저해하는 방법에 관한 것으로, VEGF 및 β-아밀로이드 간의 상호작용을 억제하는 화합물을 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법에서 상기 화합물은 아밀로이드 반점 형성으로 표시되는 질환에 걸린 포유류에 제공된다. 상기 화합물은 당 벡본(backbone)에 페놀 또는 설페이트 치환기를 포함하는 단량체 또는 중합체일 수 있다. 또한 상기 화합물은 카테킨 또는 카테킨 페놀 화합물일 수 있다.

또 다른 실시예로, 본 발명은 VEGF/β-아밀로이드 결합을 억제하는 화합물 검색방법에 관한 것으로, (a) VEGF 및 β-아밀로이드를 함유한 시료에 화합물을 접촉시키고, (b) VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 VEGF 및 β-아밀로이드가 서로 정상적으로 특이 결합하는 조건에서 결정하고, (c) 상기 화합물 존재조건에서 VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 결정하여 상기 (a) 및 (b) 에서 기재한 VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 비교하여 상기 결합율이 (c)가 (b)에 비하여 낮은 경우 상기 화합물은 VEGF/β-아밀로이드 결합 저해자인 것을 포함한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병 치료방법에 관한 것으로, 필요한 사람에 VEGF 및 β-아밀로이드간의 결합을 저해하는 화합물을 치료상 유효용량으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 포함하는 분리된 분자에 관한 것으로, 이는 VEGF에 결합하여 무기능성 복합체를 형성하며, 상기 분자는 (a) β-아밀로이드 폴리펩타이드를 포함하여 VEGF에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 구성요소 및 (b) 다중결합성(multimerizing) 구성요소를 포함한다.

본 발명은 VEGF를 포함하는 것으로 추정되는 시료를 상기 기재한 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 VEGF의 무기능성 복합체를 형성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 β-아밀로이드에 결합하여 무기능성 복합체를 형성할 수 있는 VEGF 폴리펩타이드를 포함하는 분리된 분자에 관한 것으로, 상기 분자는 (a) VEGF 폴리펩타이드를 포함하여 β-아밀로이드 폴리펩타이드에 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리렙타이드 구성요소 및 다중결합성 구성요소를 포함한다.

또한 본 발명은 β-아밀로이드를 함유한 것으로 추정되는 시료를 상기 기재한 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 β-아밀로이드의 무기능성 복합체를 형성하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 "하나(a)"및 "하나(an)"는 단수 및 복수를 모두 의미한다.

본 발명에서, "약" 또는 "실질적으로"는 통상 정확한 수치 한정에 여지를 제공한다. 예를들면, 폴리펩타이드 서열 길이를 언급하는 문맥에 사용되어, "약" 또는 "실질적으로"는 상기 폴리펩타이드가 기재된 아미노산 수에 한정되지 않음을 나타낸다. 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한, N- 말단 또는 C-말단에 몇 개의 아미노산의 추가 또는 공제(subtracted)를 포함한다.

본 발명에서, 1종 이상의 치료제를 추가로 "와 조합하여" 투여는 동시적(일치하는) 및 순서에 상관없는 연속적인 투여를 포함한다.

본 발명에서, "아미노산" 및 "아미노산들"은 모두 자연적으로 형성되는 L-α-아미노산을 언급하는 것이다. 상기 정의는 노르루신(norleucine), 오르니틴(ornithine) 및 호모시스테인(homocysteine)을 포함하는 것이다.

본 발명에서, 일반적으로, "아미노산 서열 변형체""는 기준(예, 천연 서열) 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열상 일부 차이가 있는 분자를 언급하는 것이다. 아미노산 변이는 천연 아미노산 서열에서 치환, 삽입, 삭제 또는 상기 변화들의 의도된 조합일 수 있다.

치환성 변형체들은 동일 위치에서 천연 서열에서 1종이상의 아미노산 잔기가 제거되고 다른 아미노산 서열이 삽입된 것이다. 치환체는 분자내에서 단지 하나의 아미노산만이 치환된 단일 개일 수 있으며 또는 동일 분자에서 2종이상의 아미노산들이 치환된 다수개일 수 있다.

서열내 아미노산 서열에 대한 치환체는 상기 아미노산이 속하는 군의 다른 일원들로부터 선택될 수 있다. 예를들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진 및 글루타민을 포함한다. 양전하성(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하성(산성) 아미노산은 아스파레이트 및 글루타메이트를 포함한다. 또한 본 발명의 범위는 단백질 또는 절편 또는 이와 유사 또는 동일한 생물학적 활성을 갖는 유도체 및 번역 과정중 또는 이후, 일예로 당쇄화, 단백질 절단, 항체 분자 또는 그외 세포 리간드에 결합 등에 의하여 차별되게 변형된 유도체를 포함한 다.

삽입성 변형체들은 천연 아미노산 서열에서 특정 위치에서 아미노산에 옆에 인접하여 1종이상의 아미노산이 삽입된 것들이다. 아미노산 옆에 인접하여는 상기 아미노산의 α-카르복시 또는 α-아미노 기능기에 연결된 것을 의미한다.

삭제성 변형체들은 천연 아미노산 서열에서 1종이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 대개, 삭제성 변형체들은 분자내 특정부위에 하나 또는 두개의 아미노산이 제거된다.

일 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드 변형체들은 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 폴리펩타이드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 범위로, 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 비결합성 부위 또는 VEGF 비결합성 부위에 다수의 아미노산들 또는 아미노산 변이를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드의 모든 부위에서의 치환 및/또는 삽입 및/또는 삭제를 포함하며, 상기 변형체는 VEGF 폴리펩타이드와 β-아밀로이드간의, β-아밀로이드 폴리펩타이드와 VEGF간의 특이 결합을 방해하지 않는다.

이하, "β-아밀로이드 결합 폴리펩타이드" 또는 "β-ABP"는 β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드로, 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는다. 특히, β-ABP는 β-아밀로이드의 약 25번째 잔기에서 약 35번째 잔기에 이르는 부위에 결합한다. 또한 β-ABP는 서열번호 3의 핵심 폴리펩타이드로부터 양 말단, N-말단 또는 C-말단에 약 0 내지 10개의 아미노산, 약 0 내지 5개 또는 0 내 지 4개 또는 0 내지 3개 또는 0 내지 2개 또는 0 내지 1개의 아미노산이 추가 또는 삭제될 수 있다.

이하, "β-아밀로이드 폴리펩타이드"는 β-아밀로이드로부터 유래한 폴리펩타이드이나, β-아밀로이드의 특이 서열에 한정되는 것은 아니다. 폴리펩타이드가 VEGF에 결합 가능한 한, 다양한 돌연변이들 및 보존아미노산의 변화, 또한 특정 비-보존아미노산의 변화가 허용되는 것으로 이해된다. 상기 폴리펩타이드의 VEGF 결합력이 유지되는 한, 절편화들 및 특정 당쇄화들 역시 허용되며, β-아밀로이드 폴리펩타이드의 어떤 변화도 모두 가능하다.

출원인들은 최초로 VEGF에 결합하는 β-아밀로이드를 발견하였으며, 상기 서열에서 특정 변형체들, β-아밀로이드에 결합력을 유지하는 변형체들을 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 영역에 속한다. 특히 트랩 구조체에 사용하여 무기능성 VEGF 복합체를 형성하는 경우, 다양한 β-아밀로이드 서열들을 이용할 수 있으며, 서열번호 4로 표시되는 폴리펩타이드와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는 분자를 포함한다. 또한 상기 폴리펩타이드는 전체 1-40 또는 1-42 아미노산 길이의 β-아밀로이드일 수 있으며 또는 25 내지 35 부위의 절편일 수 있다.

이하, 용어 "높은 엄격한(highly stringent) 조건하에서 혼성 가능한"은 매우 엄격한 조건하에서 목적 DNA에 상보적인 DNA 가닥이 붙음(annealing)을 의미한다. 그리고, "낮은 엄격한 조건하에서 혼성 가능한"은 낮은 엄격한 조건에서 목적 DNA에 상보적인 DNA 가닥이 붙음을 지칭한다. 붙임 과정에서 "높은 엄격한 조건 들"은 일예로 높은 온도 및/또는 낮은 염도로, 부적절한 염기쌍들간의 수소-결합 접촉에 불리하다. "낮은 엄격한 조건들"은 높은 엄격한 조건에 비하여 낮은 온도 및/또는 고염도일 것이다. 이러한 조건들은 실질적으로 두 가닥간에 상보성이 거의 완벽하지 않더라도, 두개의 DNA 가닥이 붙도록 하며, 이는 유전자 암호의 겹침(degeneracy)으로 인하여, 동일 단백질을 암호하나 서열상 차이가 있는 경우이다. 적절한 엄격 조건들, DNA 혼성화를 조성하는 조건, 예를 들면 45 ℃에서 6x SSC 이후 50 ℃에서 2X SSC로 세척하는 것은, 본 발명의 기술분야의 당업자에게 공지된 것이며, 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31-6.3.6)에서 확인할 수 있다. 일예로, 세척단계에서 염농도는 약 2x SSC, 50℃의 낮은 엄격 조건에서 0.2 x SSC, 50 ℃의 높은 엄격조건으로부터 선택될 수 있다. 또한 세척단계에서 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격조건에서 약 75℃의 높은 엄격조건까지 증가시킬 수 있다. 그외 엄격 조건의 변수들은 문헌(Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), at pp. 387-389; see also Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y. at pp. 8.46-8.47 (1989))에 기재되어 있다.

이하, "전달체"는 약제학적으로 허용가능한 전달체들, 첨가제들 또는 안정화제들을 포함하며, 이는 투여량 및 농도로 적용한 경우 이에 노출된 세포 또는 포유류에 비독성을 나타낸다. 종종 약제학적으로 허용가능한 전달체는 수용액의 pH 완 충화된 용액이다. 약리학적으로 허용가능한 전달체들의 예들은 인산염, 구연산염 및 그외 유기산과 같은 완충액들; 아스코르빅산과 같은 항산화제들; 저분자량의 폴리펩타이드(약 10개 이하의 잔기); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질들; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체들; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산들; 단당류들, 다당류들 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린과 같은 그외 탄수화물들; 또는 나트륨과 같은 반대이온(counterion) 형성용 염; 및/또는 트윈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS^R)와 같은 비이온성 계면활성제들에 한정되지 않는다.

이하, "공유결합 유도체들"은 천연 폴리펩타이드 또는 이의 절편이, 유기 단백질성(proteinaceous) 또는 비-단백질성 유도체화제(derivatizing agent) 및 후-번역 수식(modification)으로 수식(modification)됨을 포함한다. 공유 수식은 선별된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응가능한 유기 유도체화제로 표적 아미노산 잔기를 반응시키거나, 선별된 재조합 숙주세포에의 후-번역 수식 기작을 이용하므로써 도입되어진다. 모든 후-번역 수식은 재조합 숙주세포에서 발현된 폴리펩타이드에 작용한 결과이다. 글루타민일(Glutaminyl) 및 아스파라긴일(asparaginyl) 잔기는 종종 후-번역으로 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미노화 된다. 선택적으로, 이러한 잔기들은 온화한(mildly) 산성 조건하에서 탈아미노화 된다. 이러한 잔기의 두가지 형태는 본 발명의 β-아밀로이드 또는 VEGF에 존재할 수 있다. 그외 후-번역 수식은 프롤린 및 리신의 수산화, 세릴(seryl), 티로신 또는 트레오닐의 수산기 들의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기들의 메틸화를 포함한다 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)).

이하, "유효함량"은 이로운 또는 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과를 나타내기에 충분한 양이다. 유효함량은 1회 이상 투여할 수 있다. 본 발명의 목적으로, 저해제 화합물의 유효함량은 완화, 개선, 안정화, 전환, 병의 진행을 느리게 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 본 발명의 바람직한 일실시예로, "유효함량"은 β-아밀로이드 또는 아밀로이드 반점에 VEGF 결합을 방지할 수 있는 화합물의 양으로 정의된다. 다른 실시예로, "유효함량"은 VEGF의 향신경 또는 신경보호에 유효한 양으로 정의된다. 다른 실시예로, "유효함량"은 결합 및 유리 부유(free-floating)하는 응집되지 않은 β-아밀로이드를 격리하므로써, 반응에 이용되지 못하게 하는 VEGF 폴리펩타이드 함량일 수 있다. 또다른 실시예로, "유효함량"은 VEGF에 결합하여 격리시키고, 혈관신생을 방지하고 감소시키는 경우에 이후 반응에서 비활성 상태가 되도록 하기에 충분한 β-아밀로이드 폴리펩타이드 함량을 의미한다.

이하, "단편"은 폴리펩타이드의 일부분을 언급하는 것으로, 이용성 및 기능적 특징을 유지하고 있다. 일예로, 본 발명의 명세서에 기재된 바와 같이, 폴리펩타이드 절편은 β-아밀로이드, 전-응집된(pre-aggregated) β-아밀로이드 또는 β-아밀로이드 플라크에 결합하는 기능을 갖는다. 더욱이 β-아밀로이드 절편은 VEGF에 결합할 수 있다.

이하 "GFP"는 푸른 형광 단백질이다.

이하, "GST"는 글루타티온 S 전이효소이다.

이하, "숙주세포"는 본 발명의 벡터 수여체(recipient)이거나 이를 포함한 각각의 세포 또는 세포 배양물이다. 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우연한, 또는 계획적인 돌연변이 또는 변화로 인해 최초의 모체 세포와 필수적으로 완전히 상동(형태학상 또는 총 DNA 상보체)하지 않을 수 있다. 숙주세포는 혈관신생 인자를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터로 세포내 감염 또는 형질전환된 세포를 포함한다.

이하, "면역조직화학"은 다양한 조직에서 특이 단백질의 수준을 측정하는 방법이다.

이하, "면역침전"은 단백질의 발현정도를 정량적으로 측정하고 폴리펩타이드간의 상호작용을 정성적으로 분석하는 생물학적 방법이다.

이하, "저해제"는 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 저해하는 분자를 언급한다.

이하, "리간드"는 폴리펩타이드와 같은 분자에 공유결합으로 또는 일시적으로 특이 결합하는 분자 또는 제제 또는 화합물을 언급한다. 특정 문맥에서 사용되는 경우 리간드는 항체를 포함할 수 있다. 다른 문맥에서, "리간드"는 리간드 트랩과 같이, 높은 친화력을 갖는 다른 분자와 결합되는 것으로 확인된 분자를 의미한다.

이하, 치료 목적의 "포유류"는 포유류로 분류되는 동물로, 사람, 가축, 농용동물(farm animal) 및 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등의 동물원 동물, 스포츠 동 물 또는 애완동물을 포함한다. 바람직하기로는 포유류는 사람이다.

이하, "미드카인(midkine)"은 헤파린-결합성, 향신경 성장인자를 의미하며, 이의 발현은 주로 태아에서 일어난다.

이하, "정제된" 또는 "분리된" 분자는 이들의 자연적 환경으로부터 떨어지고, 자연적으로 조합되는 다른 요소들로부터 유리된 생물학적 분자이다.

이하, "시료" 또는 "생물시료"는 가장 넓은 의미로, 수행할 분석 종류에 따라 개체, 체액, 세포주, 조직 배양물 또는 그외 출처로부터 수득한 생물 시료를 포함하며, β-아밀로이드 또는 VEGF를 포함할 수 있다. 기재한 바와 같이, 생물 시료는 정액, 림프, 혈청, 혈장, 소변, 윤활액, 척수액 등과 같은 체액을 포함한다. 포유류로부터 생체시료(sample biopsies) 및 체액을 수득하는 방법은 본 발명의 기술분야에 공지된 것이다. 뇌 생체 조직이 바람직한 출처이다.

생물 시료로, 폴리펩타이드는 영상(imaging)으로 생체내에서 검출될 수 있다. 단백질의 생체 영상에 사용되는 표지물(Label) 또는 표시물(marker)은 X-방사선촬영술, NMR 또는 ESR에 의하여 검출되는 것을 포함한다. X-방사선촬영술은, 적절한 표지물로 방사성 동위원소, 즉 바륨 또는 세슘을 포함하며, 이들은 검출가능한 방사능을 방사하나 검체에 유해하진 않다. NMR 및 ESR에 적절한 마커는 중수소와 같이 검출가능한 특징적인 독특한 스핀을 갖는 것으로, 공지의 기술로 표지하여 폴리펩타이드에 합체시킬 수 있다.

또한, 환자로부터 수득한 "생물시료"는 "생물시료" 또는 "환자의 시료" 중 어느 하나로 언급되어질 수 있다. "환자의 시료" 분석은 환자로부터 세포 또는 조 직의 절제가 필수적으로 요구되지 않음은 주지의 사실일 것이다. 예를 들면, 적절히 표지된 폴리펩타이드(예, β-아밀로이드에 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드, 즉 VEGF 또는 β-아밀로이드)는 대상(subject)에 주입되어 표준 영상 기술(예, CAT, NMR, EPR, PET 및 유사기술)로 가시화(표적에 결합된 경우)될 수 있다.

이하, "서열 상동성"은 서열을 정렬하여 차이를 표시한 후, 천연 폴리펩타이드 서열의 아미노산과 상동성을 갖는 후보 서열의 아미노산 잔기 퍼센트로 정의되며, 필요한 경우 최대 서열 상동성(%)을 확보하기 위하여, 보존적 치환체는 서열 상동성 부위로 고려하지 않을 수 있다. 서열 상동성(%)은 Altschul et al., (1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)에 의해 정의된 NCBI BLAST2.0 소프트웨어로 연산된다. 매개 변수들은 내정값(default value)로 설정하고, 불일치에 대한 벌점은 제외하였으며, -1로 설정한다.

이하, "특이적 결합한다"는 두 분자간의 비-무작위적 결합 반응을 의미하며, 일예로 항원과 이에 면역반응성이 있는 항체분자 사이 또는 β-아밀로이드와 같이 하나의 폴리펩타이드와 이에 반응하는 비-항체 리간드 사이가 있다. 더욱이, 특이 결합은 화합물 또는 작은 펩타이드와, VEGF사이에 발생될 수 있다.

이하, "대상"은 척추동물이며, 바람직하기로는 포유류, 더욱 바람직하기로는 사람이다.

이하, "치료"는 이로운 또는 바람직한 임상적 결과를 얻기위한 접근이다. 본 발명의 목적으로, 이로운 또는 바람직한 임상결과는 이에 한정되는 것은 아니 나, 인지가능하거나 인지할 수 없는 경우든지, 증상을 완화시키고, 질병 범위를 축소시키고, 질병상태를 안정화시키고(예, 악화되지 않음), 질병 진행을 지연 또는 느리게 하고, 질병상태를 개선 또는 일시적 완화(Palliating)시키고, 진정시키는 것(부분적으로 또는 전체적으로)을 포함한다. "치료"는 또한 치료받지 않은 경우의 예상되는 생존과 비교하여 생존이 연장되는 것을 의미한다. "치료"는 치료적(therapeutic) 치료 및 예방적(prophylactic) 또는 방지적(preventative) 치료 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 사람은 질환에 대해 방지된 사람 뿐만 아니라 이미 질환에 걸린 사람을 포함한다. "완화"는 치료하지 않은 상태와 비교하여 질병 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 적어지고 및/또는 진행의 시간추이가 느려지거나 연장되는 것을 의미한다.

하기, "벡터", "폴리뉴클레오티드 벡터", "구조체" 및 "폴리뉴클레오티드 구조체"는 상호 호환가능하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터는 여러가지 형태중 하나일 수 있으며, 이에 한정되진 않으나, RNA, DNA, 레트로바이러스 막내에 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 막내에 캡슐화된 DNA, 또다른 바이러스 또는 바이러스 유사 형태(단순 포진 및 아데노-조합 바이러스(adeno-associated virus : AAV)에 충전된(package) DNA, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA, 면역학적으로 분자를 "가림(mask)" 및/또는 반감기를 증가시키기 위한 목적으로, 폴리리신, 다양이온성(polycationic) 합성 분자, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 화합물과 복합체를 이룬 DNA 또는 비-바이러스 단백질과 접합된 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 이하, "DNA"는 염기 A, T, C, G 를 포함할 뿐 만 아니라 이들의 유사물질 또는 이들 염기가 수정된 형태를 포함할 수 있으며, 그 예로는 메틸화된 뉴클레오티드, 전하를 띄지 않은 연결체(linkage) 및 티올레이트와 같은 뉴클레오타이드 사이의 수정, 당 유사물질의 이용 및 폴리아미드와 같은 벡본(backbone) 구조의 수정 및/또는 대체가 있다.

이하, "VEGF 폴리펩타이드"는 VEGF로부터 유래한 폴리펩타이드를 의미하나, VEGF의 특이 서열에 한정되는 것은 아니다. 다양한 돌연변이 및 아미노산의 보존적 변화뿐만 아니라 아미노산의 특정 비-보존적 변화도, 상기 폴리펩타이드가 β-아밀로이드에 결합가능하는 한, 허용된다. 절편 및 특정 당화 역시 용납되며, 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합력을 유지하는 한 VEGF 폴리펩타이드의 모든 변화가 실제 허용된다. 다른 실시예로, 상기 폴리펩타이드는 또한 헤파린에 결합한다. 출원인이 최초로 β-아밀로이드에 결합하는 VEGF와 특히 헤파린 결합 도메인을 발견하였으며, 따라서 β-아밀로이드에 대한 결합능력을 유지하는 서열에 대한 변형체들을 제조하는 것은 본 기술분야의 당업자의 기술에 포함된다. VEGF 폴리펩타이드는 β-ABP를 포함하나 이에 한정되진 않는다. VEGF 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열상동성을 갖는 폴리펩타이드를 더욱 포함한다.

VEGF의 β-아밀로이드 결합성 도메인

VEGF 전구체 RNA는 다양한 RNA 교대 스플라이싱 현상을 거쳐 4개의 성숙형 동종이합체(homodimer) 단백질을 제조하며, 각 단량체(VEGF121, VEGF 165, VEGF189 and VEGF206, 각각)는 121, 165, 189 및 206 아미노산을 포함한다 (Leung et al., Science 1989;246:1306-1309; Tischer et al., J. Biol. Chem. 1991;266:11947-11954; Houck et al., Mol. Endocrinol. 1991;5, 1806-1814). 이들중, VEGF165는 가장 많이 발현되는 VEGF 이성체이다. 다양한 이성체들중, VEGF165, VEGF189 및 VEGF206은 C-말단에 헤파린 결합성 도메인이 있으며, 세포 표면 및 세포외 기질에서 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합한다. VEGF121은 헤파린 결합성 도메인이 없으며, 헤파린 설페이트에 결합하지 않는다. VEGF의 헤파린 결합성 도메인의 역할은 표적 세포, 예컨대 내피세포 표면상에서 VEGF의 분리(sequestration)하고 이의 세포 표면 수용체에 VEGF 결합 친화성을 증가시키는 것으로 보인다(Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem. 1992;267, 6093-6098). 사실, VEGF165는 이의 세포 표면 수용체에 VEGF121에 비하여 높은 결합 친화력을 가진다. 또한 VEGF165는 VEGF121에 비하여 약 100배의 생물학적 활성을 가진다(Keyt et al., J. Biol. Chem. 1996;271:7788-7795).

VEGF의 수용체 결합성 도메인은 구조적으로 혈소판-유래 성장인자(PDGF) 및 성장인자 계열과 연관성이 있으며, 예컨대 신경세포 성장인자(NGF) 및 형질전환 성장인자(TGFβ)가 있다(Ferrara et al., Endocrinol Rev. 1992;13, 18-32; Murray-Rust et al., Structure 1993;1, 153-159). 그러나, 실험한 몇가지 성장인자들, 예컨대 신경세포 성장인자, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 혈소판-유래 성장인자 및 미드카인(midkine) 중(Yu et al., Neurosci Lett 1998;254, 125-128, for description of midkine), VEGF와 미드카인만 배타-아밀로이드에 결합한다. 미드카인이 헤파린-결합성 도메인을 통하여 β-아밀로이드에 결합하는 것으로 보이나, VEGF 및 미드카인의 헤파린-결합성 도메인은 상호 서열 상동성이 4 %에 불과하여 서열상으로 관련성이 없는 것으로 확인되었다. 미드카인의 헤파린 결합성 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다: ADCKYKFENW GACDGGTGTK VRQGTLKKAR YNAQCQETIR VTKPCTPKTK AKAKAKKGKG KD (서열번호: 5).

VEGF 서브유닛들은 두개의 동종 서브유닛간에 비대칭적으로 조합하여 이량체로 결합하고, VEGF165의 두개의 헤파린-결합성 도메인은 노출되고, 플라스민에 의해 선택적으로 절단된 후 C- 말단의 55개 아미노산, 헤파린-결합성 도메인과 VEGF의 주요 부분인 110개 아미노산은 분리된다(Fairbrother et al., Structure 1998;6,637-648).

55개 아미노산으로 이루어진 헤파린-결합성 도메인의 3차구조는 밝혀졌으며, Arg13, Arg14, Lys15, Lys30, Arg35, Arg39 및 Arg46 잔기들의 양전하를 갖는 측쇄가 헤파린 결합에 관여하며, 여기에 Lys52, Arg54 및 Arg55가 잠재적으로 기여하는 것으로 추정되었다. 헤파린 중합체의 6탄당(hexasaccharide) 단위는 양전하를 띄는 헤파린-결합성 도메인에 결합하는 것으로 제안되었다. 55개의 아미노산의 헤파린-결합성 도메인을 N-말단(약 1 내지 29번째 아미노산)과 C-말단(약 29 내지 55번째 아미노산)으로 나누어볼 때, β-아밀로이드는 대개 절반부의 C-말단에 결합한다(도 5).

VEGF165의 아미노산 서열은 다음과 같다: APMAEGGGQN HHEVVKFMDV YQRSYCHPIE TLVDIFQEYP DEIEYIFKPS CVPLMRCGGC CNDEGLECVP TEESNITMQI MRIKPHQGQH IGEMSFLQHN KCECRPKKDR ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR (서열 번호: 1). VEGF165의 헤파린-결합성 도메인의 서열은 다음과 같다: ARQENPCGPC SERRKHLFVQ DPQTCKCSCK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR (서열번호: 2). 예시된 헤파린-결합성 도메인의 절반중 C-말단은 서열번호2의 29에서 55번째 잔기이다: CK NTDSRCKARQ LELNERTCRC DKPRR (서열번호: 3).

1-55(VEGF165의 111 에서 165 부위) 헤파린-결합성 도메인의 3차 구조로, 헤파린-결합성 도메인의 N-말단부위 1-29는 역평행(antiparallel) β-판(sheet) 구조(18-21, 26-29)이며, C-말단부위 29-55는 짧은 α-나선(33-38)과 역평행 β-판(42-44, 49-51) 구조인 것으로 확인되었다.

본 발명의 일 실시예로, VEGF 폴리펩타이드는 β-아밀로이드에 결합하며, 서열번호 1과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는다. 본 발명의 다른 실시예로, VEGF 폴리펩타이드는 β-아밀로이드에 결합하며, 서열번호 2의 폴리펩타이드와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시예로, VEGF 폴리펩타이드는 β-아밀로이드에 결합하며, 서열번호 3과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시예로, VEGF 폴리펩타이드는 헤파린과 β-아밀로이드 모두에 필히 동시적이진 않으나 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 폴리펩타이드의 길이는 약 17 내지 100개의 아미노산 길이, 약 17 내지 70개의 아미노산 길이, 약 17 내지 47개 아미노산 길이, 약 20 내지 45개의 아미노산 길이, 약 25 내지 약 40개의 아미노산 길이, 약 22 내지 32개의 아미노산 길이, 약 25내지 30개의 아미노산 길이 또는 약 27 내지 47개의 아미노산 길이 일 수 있다.

VEGF/β-아밀로이드 공동 침착(Co-Accumulation)

VEGF는 알츠하이머 환자 대뇌 피질에서 아밀로이드 반점과 공동 침착하고, 동일위치에 있다. VEGF는 높은 친화성과 특이성으로 β-아밀로이드 펩타이드에 직접 결합한다. 이와 대조적으로, VEGF는 나이가 파악된 환자들의 피질부에선 거의 검출되지 않는다. 생체외 실험으로 VEGF가 높은 친화성과 특이적으로 β-아밀로이드에 결합하나 역위(reverse) 펩타이드 Aβ_40-1는 그렇지 않음을 확인하였다. 또한 β-아밀로이드의 VEGF 결합은 VEGF의 내피세포의 수용체 및 뉴트로필린(neuropilin)-1을 발현하는 암세포와의 결합과, VEGF에 유도된 내피세포의 증식에 영향을 미치지 않는다. 반대로, Aβ_1-40와 공동 응집된 VEGF는 β-아밀로이드 응집속도에 외양적인 영향이 없으며 전-응집된 β-아밀로이드에 강하게 결합한다. VEGF는 공동 응집된 β-아밀로이드/VEGF 복합체로부터 서서리 해리되며, β-아밀로이드/VEGF 놀랍게도, 혈관신생 인자로 가장 가능성 있는 인자들 중 하나인 VEGF는 높은 친화성으로 β-아밀로이드에 직접 결합하고, 대량으로 응집되어 알츠하이머 환자의 뇌의 β-아밀로이드 반점에 동시 위치한다. 상기 결과는 VEGF가 β-아밀로이드에 결한하는 것으로 공지된 그외 분자들에 비하여 Aβ_1-42 와 Aβ_1-40 에 매우 강하게 결합함을 나타낸다(Bohrmann et al., J Biol Chem 1999;274(23):15990-15955; Hamazaki H., J Biol Chem 1995;270(18):10392-10394; Hughes et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(6):3275-3280; Strittmatter et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(17):8098-8102). VEGF는 실험한 분자들중 가장 강한 β-아밀로이드 결합 파트너(K_D >> 50 pM) 이고, VEGF와 β-아밀로이드간의 친화도는 VEGF의 수용체 예컨대 KDR/Flk-1 및 Flt-1 간의 친화도와 유사하다(de Vries et al., Science 1992;255(5047):989-991; Terman et al., Biochem Biophys Res Commun 1992;187(3):1579-1586).

본 실험에서, β-아밀로이드는 VEGF에 높은 친화력으로 결합되더라도 VEGF의 세포 결합성 및 세포분열 촉진 활성에 영향을 미치지 않는다. 알츠하이머 환자의 뇌에서의 VEGF와 β-아밀로이드 간의 강한 응집 및 동시 위치성은 정상적인 노인과 비교되는 것으로, 이는 VEGF의 높은 발현, VEGF와 β-아밀로이드간의 강한 상호작용과 공동 응집, 및 상기 복합체로부터 VEGF의 느린 해리의 조합에 의한 것이다. VEGF의 연속적인 응집 및 동일 위치성은 알츠하이머 환자의 뇌의 불용해성 β-아밀로이드 침전체의 원인이 될 수 있다. 학설에 연관없이, 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 VEGF 침착과 β-아밀로이드 반점의 의미는, 뇌에서의 혈관성 기능장애와 관계된다는 것을 생각해볼 수 있다. 알츠하이머 질환의 대다수 경우 뇌혈관성 병리, 예컨대 뇌의 아밀로이드 혈관병증 및 내피세포 변성이 동반되며, 이는 혈관성 기능장애가 알츠하이머 질환에서 신경 퇴행의 연속단계에 원인일 수 있음을 제시한다(de la Torre JC. Stroke 2002;33(4):1152-1162; Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168- 171). 이의 뇌혈관성 병리로 인하여, 알츠하이머 질환의 뇌 세포에는 글루코스 및 산소의 관류저하가 심하게 발생된다. 증거는 뇌의 관류저하가 산발성 및 가족성 알츠하이머 질환 모두의 초기 단계의 주된 임상적 특징 중 하나이며, 허혈발작의 병력 및 공존이 알츠하이머 질환에 대한 위험도를 증가시킴을 시사한다(Kalaria RN. Neurobiol Aging 2000;21(2):321-330; Kokmen et al., Neurology 1996;46(1):154-159; Snowdon et al., JAMA 1997;277(10):813-817).

VEGF는 혈관 기능의 주된 조절자이다. VEGF는 저산소증- 및저혈당-유도성 혈관신생 펩타이드이다. 또한 VEGF 및 이의 수용체는 저산소증에 의해 유도되며, 혈관신생 및 뇌혈관 관류를 증강시키고, 뇌 허혈에서 신경학상의 회복을 유의적으로 향상시킨다(Harrigan et al., Neurosurgery 2002;50(3):589-598; Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(26):15809-15814; Zhang et al., J Clin Invest 2000;106(7):829-838). 최근 연구들에서, VEGF는 그외 활성, 예컨대 저산조증 및 글루코스 제한 조건에서의 향-신경성 작용 및 글루타메이트 독성 및 허혈성 말초신경병증에 대한 신경보호 작용을 하여 알츠하이머 질환의 신경병리와 관련된 것으로 제시되다(Jin et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000;97(18):10242-10247; Matsuzaki et al., FASEB J 2001;15(7):1218-1220; Oosthuyse et al., Nature Genet 2001;28(2):131-138; Schratzberger et al., Nature Med 2000;6(4):405-413; Sondell et al., J Neurosci 1999;19(14):5731-5740).

VEGF 농도는 연령별 대조군에 비하여 알츠하이머 환자의 뇌에서 증가되므로(Kalaria et al., Brain Res Mol Brain Res 1998;62(1):101-105; Tarkowski et al., Neurobiol Aging 2002;23(2):237-243), 알츠하이머 병증의 뇌에서 유도된 VEGF는, 증강된 신생혈관증식을 이끌어 관류저하 발병을 보정하고, 신경세포에 대한 직접적인 신경보호 작용과 이의 혈관신생 활성을 통하여 허혈에 의한 신경세포 사멸을 저해할 수 있을 것이다.

그러나 본 발명의 결과들은, 알츠하이머 환자에서, 알츠하이머 기간동안 발현된 VEGF 대부분은 전환없이 β-아밀로이드 침전물에 결합할 수 있을 것으로 보여주었다. 이러한 상황은 관류저하에 대하여 뇌 혈관 및 신경세포를 보호하기 위해 요구되는 수용성 VEGF의 부족으로 나타날 수 있으며, 이는 알츠하이머의 병리와 연관이 된다. 또한 허혈은 뇌에서 아밀로이드 전구체 단백질의 β-아밀로이드로의 축적 및 절단과, β-아밀로이드의 침전을 유발시킨다는 것은 주목할만한 일이다(Bennett et al., Neurobiol Aging 2000;21(2):207-214; Jendroska et al., Acta Neuropathol (Berl) 1995;90(5):461-466). 그리고 또한 알츠하이머 발병기전에서 제안된 역할도 주목할만한 일이다(Calhoun et al., Nature 1998;395(6704):755-756; Hardy et al., Science 1992;256(5054):184-185; Hsiao et al., Science 1996;274(5284):99-102; Lewis et al., Science 2001;293(5534):1487-1491; Schenk et al., Nature 1999;400(6740):173-177; Sommer B., Curr Opin Pharmacol 2002;2(1):87-92; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171). β-아밀로이드는 알츠하이머 병증의 뇌에서 발현되는 VEGF에 대한 분자적 하수구(sink)로써 역할을 할지 모르며, 따라서 VEGF의 혈관신생 및 신경세포 보호 활성을 차단하므로써 알츠하이머 질환의 진행을 더욱 악화시 킨다.

β-아밀로이드의 VEGF 결합부

β-아밀로이드_1-42 서열: DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNRGA IIGLMVGGVV IA (서열번호:4). 1-28 도메인은 전하를 띈 잔기를 높은 비율(46%)로 포함하고 있는 친수성 도메인이고; 교차 β-판 구조를 가지면 원섬유(fibril)를 형성한다. 부위29-42는 β-분지의 아미노산을 고비율로 포함하며 소수성이 풍부하다. 부위25-35는 신경 독성 작용의 생물학적 활성 도메인이다 출원인은 VEGF가 β-아밀로이드의 25-35 부위에 결합함을 발견하였다(도6).

본 발명의 일측면으로, β-아밀로이드 폴리펩타이드는 VEGF에 결합하며,서열번호 4와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 포함한다. 본 발명의 다른 측면으로, 상기 폴리펩타이드는 VEGF에 대한 특이 결합성을 포함한다. β-아밀로이드 폴리펩타이드의 길이는 약 10 내지 약 42로 다양하며, 이에 부착된 다른 서열을 포합할 수 있으며, VEGF 결합 활성을 유지하고 있을 수 있다. 특히, β-아밀로이드 폴리펩타이드는 약 10 내지 40개의 아미노산 길이, 약 10 내지 35, 약 10 내지 30, 약 10 내지 25, 약 10 내지 20, 약 10 내지 15, 약 10개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 10개의 아미노산 단편은 서열번호 4의 25 내지 35번째 잔기들일 수 있다.

본 발명의 일 측면으로, β-아밀로이드 폴리펩타이드는 VEGF의 비적절한 활성이 있는 영역, 예컨대 과도한 혈관신생, 즉 류마티스 관절염, 암, 죽상경화증, 자궁내막증, 신장 질환과 비만증 등에서 VEGF를 고정하기 위한 트랩으로 사용될 수 있다. β-아밀로이드 폴리펩타이드는 전장 길이 또는 더 긴 길이 또는 짧은 또는 다양한 또는 유래된 것일 수 있으나, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4와 적어도 70%의 서열 상동성을 가지며, VEGF에 대한 특이 결합성을 유지하고 있다.

VEGF/β-아밀로이드 결합 저해제

일 실시예로, 본 발명은 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 저해하는 화학 적화합물 또는 폴리펩타이드와 같은 화합물을 탐색하는 것에 관한 것이다. 상기 저해제 화합물은 β-아밀로이드와 VEGF의 침전이 일 원인인 질환을 겪는 사람을 치료할 것으로 예상된다. 저해제를 사용하는 경우, VEGF는 β-아밀로이드 침전물과는 침착되지 않으며, 따라서 자유상태에서 정상적으로 기능하여 병증 부위에 신경보호 및 향신경 효과를 유도할 것이며 따라서 질환이 치료된다.

이점에 있어서, 일측면으로, 본 발명은 VEGF와 상호작용하여 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 봉쇄할 수 있는 어떤 저해제 분자에 관한 것이다. 특히, 상기 분자는 VEGF의 헤파린 결합성 도메인과 상호작용할 수 있어야 하며, 추가로 특히 상기 분자는 헤파린 결합성 도메인의 C- 말단 부와 상호작용할지도 모른다. 다른 한편으로, 상기 분자는 β-아밀로이드에 결합할 수도 있으며, 따라서, VEGF/β-아밀로이드 결합을 붕괴시킨다.

이런 저해제는 VEGF 폴리펩타이드일 수 있으며, β-아밀로이드 결합 기능을 유지하여 VEGF 기능과 연관된 다른 특성들, 예컨대 수용체 결합 활성 또는 신호 전이 전달과정 활성화가 일부 또는 모두가 결핍 또는 감소될 수 있다. 이러한 저해제 VEGF 폴리펩타이드는 헤파린 결합성 도메인을 포함할 수 도 있다. 다른 실시예로, 상기 저해제 VEGF 폴리펩타이드는 β-ABP일 수 있다.

저해제 화합물은, 상기 화합물이 VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 억제한다면, 다수의 생화학적 또는 효소적 저해 동역학, 예컨대 경쟁적,무경쟁적(non-competitive), 비경쟁적(uncompetitive) 저해로, VEGF 폴리펩타이드와 β-아밀로이드 간의 상호작용을 해칠 수 있음은 당연한 것이다.

따라서, 구체적으로, 본 발명은 VEGF와 β-아밀로이드 간의 결합을 저해할 수 있는 중합체 또는 단량체 화합물을 이용하는 것에 관한 것이다. 구체적인 실시예로, 상기 중합체 또는 단량체는 당 벡본(backbone)을 갖는다. 상기 당 벡본 단위는 글루코스 또는 슈크로스 또는 하나의 탄소와 나머지 탄소를 갖는 6원링(six-membered ring) 그룹일 수 있다. 상기 벡본은 치환기를 가질 수 있으며, 다수의 화학종 중 어느 것일 수 있다. 바람직하기로는 상기 치환기는 페놀 또는 폴리페놀일수 있으며, 실시예에 따라 갈릭산과 반응시켜 형성시킬 수 있다. 이런 점에 있어서, 탄닌산 및 펜타칼로일 글루코스(pentagalloyl glucose: PGG)는 글루코스 및 폴리페놀 기를 모두 포함하는 것으로, VEGF/β-아밀로이드 결합의 저해자인 것으본원발명에서 예시되었다. 또한 저해제는 카테킨 또는 카테킨 페놀 화합물로, 에피카테킨(EC), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨(EGC) 또는 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 화합물의 설명 및 활성은 Jung et al., Int J Exp Path 2001; 82:309-316 (incorporated by reference in its entirety) 에 있다.

여러가지 다른 변형체들은 당 벡본으로 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 특별한 실시예로, 헤파린 또는 PGG와 유사한 분자는 모사체 또는 유사체가 VEGF와 β-아밀로이드간이 결합을 저해한다면 본원발명의 범위에 속한다. 이런 관점에서, 헤파린, PGG, EGCG 및 탄닌산에 대한 모사체 및 유사체가 본원발명에 포함됨은 자명한 것이다. 추가로, 이러한 저해제는 다양한 타입의 글리코사미노글리칸 사슬(glycosaminoglycan chain), 예컨대 히알루로닌산, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 데르마탄 설페이트 등을 포함할 수 있으며, 헤파린과 관계있는 분자일 수 있다.

헤파린 관계된 분자 일부는 히알루로닌산, D-글루쿠로닌산 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위가 약 50,000 단위 이상 반복될 수 있으며, 상기 D-글루쿠로닌 산 및 N-아세틸-D-갈락토사민 단위는 약 250,000 단위이상 반복될 수 있으며; 데르마탄 설페이트, L-이두로닌 산 및 N-아세틸-D-갈락토사민 단위가 약 250,000 단위 이상 반복된 것일 수 있으며 적어도 1개 이상의 하이드록시기가 설페이트기로 치환된 것일 수 있으며; 헤파린 또는 헤파란 설페이트, 상기 D-글루쿠로닌 산 또는 L-이두로닌산 및 N-아세틸- 또는 N-설포-D-갈락토사민 단위가 약 15-30 단위로 반복된 것일 수 있으며, 특정 경우 하이드록시기 대시에 설페이트기가 1나 이상 포함되는 것이 바람직하며; 케라탄 설페이트, 상기 D-갈락토스 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위는 약 20-40회 반복된 것일 수 있으며, 하이드록시기 1종이상이 설페이트기로 치환된 것으로, 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예로. 자연식품 또는 기능성 식품의 추출액은 VEGF/β- 아밀로이드 복합체에 대한 저해제를 포함하는 것으로 간주된다. 차 카테킨은 그러나 저해제의 특정 카테고리의 일예는 아니다. 또한 카테킨과 함께, 그외 폴리페놀은 기능성 식품의 주된 성분이며, 플라보노이드, 레스베라트롤 및 퀘르세틴을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

헤파닐의 화학구조는 다음에 나타낸다.

PGG 의 화학구조는 다음에 나타낸다

EGCG 의 화학구조는 다음에 나타낸다

탄닌의 화학구조는 다음에 나타낸다.

β아밀로이드 또는 VEGF에 결합하는 폴리펩타이드를 암호화는 핵산

"분리된" 폴리펩타이드 서열은, 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 포함하고자 하는 의도이며, 이는 본래의 조건으로부터 이동된 것이다. 이는 본 발명의 VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 단편을 포함하고, 추가로 이종의 서열, 예컨대 벡터 서열 또는 그외 외래 DNA를 포함할 수 있다. 일예로, 벡터내 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적에 따라 분리된 것으로 간주되어 지며, 일부 또는 실질적으로 정제될 수 있다.

또한 분리된 핵산분자는 DNA 분자를 포함하며, 상기 기재한 것과는 실질적으로 다른 서열을 포함할 수 있으나, 그러나 유전자 암호의 겹침(degeneracy) 또는 변이성으로 인하여, VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 폴리펩타이드 및 이들의 펩타이드를 여전히 암호한다. 다라서, 본 발명의 기술분야의 당업자라면 상기 기재된 변형체들을 제조할 수 있음은 자명하며, 일예로, 특정 숙주에서의 코돈 발현 또는 일반적인 기능을 최적화할 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건에서 상기 기재한 본 발명의 핵산 분자의 폴리뉴클레오티드 일부분에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 혼성하는 폴리뉴클레오티드는 진단 탐침자나 프라이머로 유용하다. 서열번호 1-3으로 예시된 서열을 암호하는 VEGF 폴리펩타이드과 혼성되는 폴리펩타이드의 일부분은, 프라이머 또는 프로브로 이용될 수 있으며, 5' 및 3'의 염기 위치나 또는 뉴클레오티드 염기 크기로 명확히 특정화하거나 동일한 방법으로 명확히 배제할 수 있다. 바람직한 본 발명의 혼성되는 폴리뉴클레오티드는 표지하여 공지의 혼성화 분석법(예, 서든 또는 노던 블롯 분석)으로 실시한 경우, 다른 이종 서열의 존재와 상관없이 동일 몰 농도에서 매우 강한 신호 강도를 나타낸다.

변형체 및 돌연변이 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 단백질, VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 폴리펩타이드의 유사체 또는 유도체를 암호하는 핵산 분자의 변형체들에 관한 것이다. 변형 체는 자연적으로 발생될 수 있으며, 예컨대 자연적 대립 변형체가 있다. "대립성 변형체"는 생물체의 염색체상의 정해진 위치에 있는 유전자의 여러가지 변이 형태들 중 하나를 의도한다. 비-자연적으로 발생되는 변형체는 공지의 돌연변이화 기술로 제조될 수 있다.

이러한 핵산 변형체는 뉴클레오티드 치환, 삭제 또는 첨가에 의하여 제조된 것을 포함한다. 상기 치환, 삭제 또는 첨가는 1종이상의 뉴클레오티드가 관여할 수 있다. 아미노산 서열상의 변이는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 삭제 또는 첨가를 형성할 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 무증상(silent) 치환, 첨가 및 삭제로, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 일부분의 특성과 활성은 변이되지 않는다.

본 출원은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드와 적어도70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암포하는 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드 각각은 β-아밀로이드 또는 VEGF에 대한 특이 결합 기능이 유지된 것이다.

본 발명은 발현벡터 뿐만 아니라 숙주세포 및 세포주, 즉 원핵 또는 진핵세포 전달(transfection)에서의 서열 용도를 고려한다. 본 발명은 또한 박현 벡터로부터 발현된 폴리펩타이드의 정제를 고려한다. 상기 발현벡터는 초기 정제를 위해 다양한 분자적 꼬리표를 포함할 수 있다. 따라서, 수득된 발현 구조체는 선택된 어떤 숙주세포에도 형질전환될 수 있다. 숙주세포의 세포 용혈물은 기술분야의 공지 방법에 따른 분리한다. GFP- 또는 GST- 포함하는 발현 벡터는 VEGF 또는 β-아 밀로이드 폴리펩타이드를 숙주세포에 위치시키기 위하여 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터는 유도성 또는 구성성(constitutive) 프로모터를 포함할 수 있다.

변형체 및 돌연변이 폴리펩타이드

본 발명의VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 펩타이드의 특징들을 개선 또는 변이시키기 위하여, 아미노산 공학이 사용될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 공지된 것으로, 단일 또는 다중 아미노산 치환, 삭제, 첨가 또는 융합 단백질을 포함한 신규한 폴리펩타이드 돌연변이를 생성하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 이러한 수정된 폴리펩타이드는 예로, 증가된/감소된 활성 또는 증가된/감소된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한 최소한 특정 정제 및 저장 조건에서, 고수율로 정제될 수 있으며, 대응되는 자연적인 폴리펩타이에 비하여 향상된 용해성을 나타낼 수 있다.

특이한 것은 전하를 띤 아미노산을 그외 전하를 띤 또는 중성의 아미노산으로 치환하는 것으로, 적절한 개선된 특징, 예컨대 생산된 폴리펩타이드의 응집 감소와 같은 특징을 갖는 단백질을 생산할 수 있다. 응집은 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 약제의 제형 조제시, 응집체들이 항원성으로 작용할 수 있어, 문제가 될 수 있다.

항체

실시예로, 본 발명은 다양한 검정방법을 이용한 β-아밀로이드 형성물 검출에 관한 것이다. VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 검출하는 방법은, VEGF 폴리펩타이드를 직접적으로 표지하고, 본 발명의 기술분야의 당업자에게 통상 적인 표지 및 분리 기술을 이용하여 이의 결합을 분석하는 것이다. 다른 방법은 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체 중 하나에 특이적으로 결합하는 표지된 리간드를 이용하는 것을 포함한다. 이러한 리간드는 항체일 수 있다.

정제된 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체는 단클론성 또는 다클론성 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. VEGF 폴리펩타이드 단편들은 또한 단클론성 또는 다클론성 항체를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 수득한 단클론성 또는 다클론성 항체는 VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합과, VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체 형성을 다양한 시료들, 예컨대 세포, 조직 및 이에 한정되진 않으나 혈청, 혈장 및 소변과 같은 체액에서 측정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체는 다양한 분자생물학적 방법으로 분석될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나, 세포내 혼성화(in situ hybridization), 면역침전, 면역형관 염색, 웨스턴 블롯 분석 등을 포함한다. ELISA는 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 대한 단클론성 항체를 이용하여, 뇌 조직 또는 그외 신체 일부, 즉 β-아밀로이드가 응집 및 축적되고 아밀로이드 반점을 형성하는 표식된 장애가 있는 것으로 여겨지는 환자의 체액에서 β-아밀로이드 양을 측정할 수 있다.

본 발명의 항체는 이에 한정되는 것은 아니나, 단클론성, 다클론성, 다수특 이성(multispecific), 사람, 인체에 적응시킨(humanized), 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리로부터 제조된 단편, 항-이디오타입(idiotypic, 항-Id) 항체(예, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체) 및 상기의 어느것의 에피토프-결합성 절편을 포함한다. 용어 "항체"는, 기재된 바와 같이, 면역글로블린 분자과 면역글로블린 분자의 면역학적으로 활성을 갖는 부분을 언급하며, 그 예로 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합부를 포함하는 분자가 있다. 본 발명의 면역글로블린 분자는 면연글로블린 분자의 모든 종류의 타입(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY), 클레스(e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) 또는 서브클레스일 수 있다.

본 발명의 항체는 일특이적(monospecific), 이중특이적(bispecific), 삼중특이적(trispecific) 또는 그 이상의 다수특이적 일 수 있다. 다수 특이적 항체는 폴리펩타이드의 별개의 에피토프들에 특이적일 수 있으며, 본 발명의 펩타이드와 이종(heterologous) 에피토프, 예컨대 이종 폴리펩타이드 또는 고형의 지지체, 모두에 특이적일 수 있다.

본 발명의 항체는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 에피토프(들) 또는 일부분(들)이란 용어로 기재 또는 특정화될 수 있으며, 이들은 인식하거나 특이적으로 결합한다. 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드 일부분(들)은 기재한 바와 같이, 즉, N-말단 위치, C-말단위치, 연속된 아미노산 잔기의 크기로 상술된다.

본 발명의 항체는 일예로, 이에 한정되지 않으나 정제하고, 본 발명의 폴리페타이드를 정제하고, 검출하고, 목표화하기 위한 용도로 사용될 수 있으며, 이는 생체외 및 생체내 진단 및 치료 방법 모두를 포함한다. 그예로, 항체는 생물학적 시료에서 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합의 농도를 정성 및 정량적으로 측정하는 면역분석에 이용된다.

하기에 보다 구체적으로 설명하면, 본원발명의 항체는 다른 조성물과 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다. 항체는 추가적으로, N-말단 또는 C-말단에 재조합적으로 이종 폴리펩타이드에 융합되거나 폴리펩타이드 또는 그외 조성물에 화학적으로 접합(공유적 및 비공유적 접합을 포함함)될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 검출 분석의 표지물로 유용한 분자 및 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사선핵종 또는 독소와 같은 작동체(effector) 분자에 재조합적으로 융합 또는 접합될 수 있다.

본 발명의 항체는 기술분야의 적합한 공지 방법으로 제조될 수 있다. 관심항원에 대한 다클론성 항체는 기술분야의 공지된 다양한 공정에 따라 제조할 수 있다. 그 예로, 본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 숙주 동물, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니나 토끼, 마우스, 쥐 등을 포함한 동물에 투여하여 상기 항원에 특이적인 다클론성 항체를 함유한 혈청 형성을 유도할 수 있다. 다양한 보강제(adjuvant)를 숙주 종에 따라 사용하여 면역 반응을 증가시킬 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나 Freund's (완전체 및 불완전체), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 리소렉시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리아니온(polyanions), 펩타이드, 오일 유제, 키홀 임펫트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀(dinitrophenol)과 같은 표면 활성의 물질 및 BCG (bacille Calmette-Guerin)와 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)과 같은 잠재력있는 유용한 사람 보강제를 포함한다. 이러한 보강제는 본 발명의 기술분야에 공지된 것이다.

단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지(phage) 표시(display) 기술 또는 이들의 조합을 포함한, 본 발명의 기술분야에서 알려진 다양한 기술들을 이용하여 준비할 수 있다. 그 예로, 단클론성 항체는 본 발명의 기술분야에서 알려진기술을 포함한 하이브리도마 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 용어 "단클론 항체"는 기재한 바와 같이, 이에 한정되는 것은 아니나 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체를 의미한다. 용어 "단클론 항체"는 모든 종류의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래한 항체를 언급하며, 생산된 방법을 의미하는 것은 아니다.

하이브리도마 기술을 이용한 특이 항체 생산 및 탐색방법은 통상적이며, 본 발명의 기술분야에 널리 알려져 있다. 비한정의 예로, 마우스는 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체 또는 이러한 전체를 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 면역 반응이 검출되면, 예로, 항원에 특이적 항체는 마우스 혈청에서 검출되며, 마우스 지라(spleen)을 수집하여 지라세포(splenocyte)를 분리한다. 지라세포는 이후 공지의 방법으로 적합한 모든 종류의 골수종 세포, 예를들면 ATCC로부터 이용가능한 세포주 SP20에 융합시킨다. 하이브리도마를 선별하고, 제한 희석으로 클론닝(cloning)한다. 하이브리도마 클론은 이후 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 결합 파트너에 결합한 복합체에 결합 가능한 항체를 분비하는 세포로, 공지의 방법에 따라 분석된다. 복수액, 일반적으로 고농도의 항체를 함유하는 것으로, 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시켜 제조할 수 있다.

항체는 고형 지지체에 접착된 것일 수 있으며, 특히 목적 항원의 면역분석 및 정제에 유용하다. 이러한 고형 지지체는 이에 한정되는 것은 아니라, 유리, 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함한다.

항체 결합 분석

본 발명의 항체는 본 발명의 기술분야의 공지된 방법으로 면역특이 결합을분석할 수 있다. 상기 사용가능한 면역분석은 경쟁적 및 무경쟁적 분석 시스템, 예컨대 웨스턴 블롯, 방사능면역분석, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응(gel diffusion precipitin reactions), 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역방사계측 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석을 포함하는 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 분석은 통상적이며, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 것이다(see, e.g., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, which is incorporated by reference herein in its entirety). 예시된 면역분석은 하기에 간략하게 기술하나 이는 한정하기 위함은 아니다.

면역침전 프로토콜(protocol)은 통상적으로 세포 용해(lysis) 완충액, 예컨 대 단백질 포스파타제(phosphatase) 및/또는 단백질 분해효소 저해제(예, EDTA, PMSF, aprotinin, sodium vanadate)를 함유시킨 RIPA 완충액(1% NP-40 or Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M sodium phosphate at pH 7.2, 1% Trasylol)에 세포 개체들을 용해하고, 세포 용해물에 관심(interest) 항체를 첨가하고, 4℃에서 일정시간(예, 1-4시간) 배양하고, 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 비드(bead)를 상기 세포 용해물에 첨가하고, 4℃에서 약 1시간 이상 배양하고, 상기 비드를 세포용해용 완출액으로 세척하고, SDS/시료 완충액상에 상기 비드를 재현탁하는 것을 포함한다. 관심 항체의 특정 항원 면역침전능은 예컨대 웨스턴 블롯 분석에 의하여 조사할 수 있다. 본 발명의 기술분야의 당업자가 항체의 항원 결합을 증가시키고, 배경(background)를 감소시키기(예, 세포 용해물을 세파로즈 비드로 전-정화) 위하여 한정 요소(parameter)를 수정할 수 있음은 자명한 사실이다. 면역침전 프로토콜에 관한 추가적인 논문으로 Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1가 있다.

웨스턴 블롯 분석은 통상 단백질 시료 준비하고, 상기 단백질 시포를 폴리아크릴아미드 젤(예 항원의 분자량에 따라8% 내지 20%의 SDS-PAGE)상에 전기영동하고, 상기 단백질 시료를 상기 폴리아크릴아미드 젤에서 나이트로셀롤로스, PVDF 또는 나일론과 같은 막으로 전이하고, 차단용 용액(blocking solution, 예, PBS with 3% BSA or non-fat milk)으로 막을 차단하고, 세척용 완충액(예, PBS-Tween 20)으로 상기 막 세척하고, 상기 막은 차단용 완충액상에 희석시킨 일차 항체(the antibody of interest)로 차단하고, 세척용 완충액으로 상기 막 세척, 효소적 기질(e.g., horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) 또는 방사능 물질(e.g., ³²P or ¹²⁵I)에 접합된 이차항체(일차항체를 인식하고, 예, 항-사람 항체)를 차단용 완충액으로 희석하고 이를 이용하여 상기 막을 차단하고, 상기 막을 세척용 완충액으로 세척하고 및 상기 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 기술분야의 당업자가 신호 검출을 증가시키고, 배경 잡음(background noise)를 감소시키기 위하여 한정 요소(parameter)를 수정할 수 있음은 자명한 사실이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가적인 논문으로 Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1가 있다.

ELISA는 항원을 준비하고, 이는 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드를 포함하는 시료를 포함할 수 있으며, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 상기 항체로 코팅하고, 상기 웰에 효소적 기질(예, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase)과 같은 검출가능한 화합물이 접합된 관심 항체를 첨가하여 일정시간 배양하고, 및 상기 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서 관심 항체는 검출가능한 화합물에 접합될 필요는 없으며; 대시, 검출가능한 화합물이 접합된 이차항체(상기 관심 항체를 인식함)를 상기 웰에 첨가할 수 있다. 또한 상기 웰에 상기 항원을 코팅하는 대신, 상기 항체로 상기 웰을 코팅할 수 있다. 본 발명의 기술분야의 당업자가 신호 검출을 증가시키 거나 본 발명의 기술분야의 공지된 다양한 ELISA 변형법에 따라 한정 요소(parameter)를 수정할 수 있음은 자명한 사실이다. ELISA 프로토콜에 관한 추가적인 논문으로 Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1가 있다.

진단분석

본 발명은 생물시료에서 β-아밀로이드의 존재를 검출하는 진단방법을 또한 제공한다. 이는 직접적 (예, VEGF 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 반응을 유도하는 항체를 이용한 폴리펩타이드 농도 분석) 또는 간접적(예, VEGF 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이성을 갖는 항체 분석)으로 분석될 수 있다.

질환상태 진단이 이미 실시된 경우, 본 발명은 환자에서 존재하는 β-아밀로드이/VEGF 복합체 농도를 측정하여 질환상태의 발전 또는 퇴화를 측정하는데 유용하고 또는 그로 인하여 증강된 β-아밀로이드 생산을 보이는 환자가 낮은 농도의 β-아밀로이드를 생산하는 환자에 비하여 보다 나쁜 임상결과를 경험할 것임을 관찰하는데 유용하다.

표지된 분자의 존재는 생체내 탐색시 공지된 방법으로 환자에서 검출할 수 있다. 이러한 방법은 사용하는 표지물의 종류에 따라 다르다. 당업자는 특정 표지물을 검정하데 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단방법에 사용될 수 있는 방법 및 기구는 이에 한정되는 것은 아니나, 컴퓨터 X선 단층 촬영(computed tomography, CT), PET(position emission tomography)와 같은 전신 스캔, 자기공명영상(MRI) 및 초음파촬영술(sonography)과 또한 전자상자성 공명(electron paramagnetic resonance, EPR) 및 핵자기공명(NMR)을 포함한다.

구체적인 실시예로, β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드등의 분자는, 방사성 동위원소로 표지되고, 방사능 반응성 외과 기구(Thurston et al., U.S. Pat. No. 5,441,050)를 이용하여 환자에서 검출한다. 다른 실시예로, 상기 분자는 형광화합물로 표지되고, 형광 반응성 탐색기를 이용하여 환자에서 검출한다. 다른 실시예로, 상기 분자는 양전자 방사 금속으로 표지하고, 양전자 방사 X선 단층 촬영으로 환자에서 검출한다. 또 다른 실시예로, 상기 분자는 상자성의 표지물로 표지하고, 자기공명양성을 이용하여 환자에서 검출한다.

일측면으로, 생체내 진단은 상기 기술한 방법 또는 그외 작용으로 검출가능한 표지물을 이용하여 실시될 수 있으며, 환자에 무독하며, 상기 표지된 폴리펩타이드는 환자에 주입하여 상기 폴리펩타이드가 이동하여 이의 결합 표적물, 예컨대 β-아밀로이드가 응집된 부위에 결합하므로써, 따라서 표적물, 예컨대 β-아밀러이드 또는 β-아밀로이드 응집물의 존재가 검출된다.

표지물

적합한 효소 표지물은 일예로 산화효소 군으로부터 유래한 것을 포함하며, 기질과 반응하여 과산화수소 생성을 촉진시킨다. 글루코스 산화효소는 안정성이 우수하고, 이의 기질을 쉽게 이용할 수 있으므로, 특히 바람직하다. 산화효소의 활성도는 효소-표지된 항체/기질 반응으로 형성된 과산화수소의 농도를 측정하여 분석할 수 있다. 효소를 제외하고, 다른 적합한 표지물은 방사성동위원소, 예컨대 요오드 (¹²⁵I, ¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 3중수소( ³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크네튬 (^99mTc)과, 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine)과 같은 형광 표지물 및 바이오틴 (biotin)이 있다.

또한 본 발명의 VEGF 폴리펩타이드-, β-아밀로이드- 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체-특이 항체에 적합한 표지물을 하기에 제공한다. 적합한 효소의 예로는 말레이트 탈수소효소, δ-5-스테로이드 이성화효소(isomerase), 효모-알코올 탈수소효소, α-글리세롤 인산염 탈수소효소, 트리오스 인산염 이성화효소, 과산화효소, 알칼린 인산분해효소(alkaline phosphatase), 아스파라긴분해효소(asparaginase), 글루코스 산화효소, β-갈락토시데이즈, 리보뉴클레이즈, 유레아제, 카탈라제, 글루코스-6-인산염 탈수소효소, 글루코아밀레이즈 및 아테틸콜린 에스터라제를 포함한다.

적합한 방사성 동위원소 표지물의 예로는 ³H, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹ I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵² Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd, 등을 포함한다. ¹¹¹In는 생체내 이미지를 사용할 수 있는 바람직한 동위원소이며, 간에 의한 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I-표지된 폴리펩타이드의 탈할로겐화를 방지할 수 있다. 또한 방사능뉴클레오티드(radionucleotide)는 영상에 보다 유리한 감마 방사 에너지를 포함하고 있다. 예컨대, 1-(P-이소티오시아나토벤질)-DPTA와 같이 단클론성 항체에 연 결된 ¹¹¹In는 비-종양조직에서, 특히 간에서 거의 흡수되지 않으며, 종양 위치특이성이 증강된다.

적합한 비-방사능 동위원소표지물의 예로는 ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, 52 ^Tr, 및 ⁵⁶Fe가 포함된다.

적합한 형광 표지물의 예로는, ¹⁵²Eu 표지물, 플루오레센인 표지물, 이소티오시아네이트 표지물, 로다민 표지물, 피코에리트린 표지물, 피코시아닌 표지물, 알로피코시아닌 표지물, o-프트알데하이드(phthaldehyde) 표지물 및 플루오레스카민 표지물을 포함한다.

적합한 독소의 예로는, 슈도모나스 독소, 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소를 포함한다.

적합한 화학발광(chemiluminescent) 표지물의 예로는 루미날 표지물, 방향성 아크리디니움 에스테르 표지물, 이미다졸 표지물, 아트리디니움 염 표지물, 옥살레이트 에스테르표지물, 루시페린 표지물 및 에어쿠로린 표지물을 포함한다.

핵자기공명 조영제의 예로는 Gd, Mn, 및 철과 같은 중금속 핵을 포함한다. 중소수도 또한 사용될 수 있다. 그외 조영제 역시 EPR, PET 또는 그외 영상 기술에 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술분야의 당업자에겐 공지된 것이다.

폴리펩타이드에 상기 기재한 표지물을 결합하는 전형적인 기술들은 Kennedy et al. (1976) Clin. Chim. Acta 70:1-31, and Schurs et al. (1977) Clin. Chim. Acta 81:1-40로부터 제시된다. 연결(Coupling) 기술은 글루타르알데하이드 방법, 페리오데이트(periodate) 방법, 디말레이미드(dimaleimide) 방법 및 m-말레이미도벤질-N-하이드록시-숙신이미드 에스테르 방법을 포함하며 이러한 방법들 모두 참고문헌에 의해 통합된다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 이의 단편들을 포함하며, 생체칩 및 생체센서 기술을 이용하여VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체를 검출하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 생체칩 및 생체센서는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하여 항체를 검출할 수 있으며, VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체를 특이적으로 인지한다. 본 발명의 생체칩 및 생체센서는 또한 폴리펩타이드를 특이적으로 인지하는 항체를 포함하며 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체를 검출한다.

키트

본 발명은 또한 생물시료에서 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체의 존재확인을 위한 시료분석키트를 포함한다. 일반적인 실시예로, 상기 키트는 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 특이적으로 결합하는 리간드를 1종이상의 용기에 포함하며, VEGF 폴리펩타이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 대한 정제된 항체일 수 있다. 구체적인 실시예로, 본 발명의 키트는, 키트에 포함된 항체에 면역특이적 면역반응성이 있는 에피토프를 포함하는, 실질적으로 분리된 폴리펩타이드를 함유한다. 바람직하기로는 본 발명의 키트는 관심을 갖는 폴리펩타이드와 반응하지 않는 대조 항체를 추가로 포함한다. 상기 키트는 또한 설명서와 표지물을 더욱 포함한다.

다른 구체적인 실시예로, 본 발명의 키트는 항체와 주목한 폴리펩타이드간의 결합을 검출하는 수단(예, 상기 항체는 검출가능한 기질, 예컨대 형광 화합물, 효소적 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물에 접합될 수 있으며, 또는 일차 항체를 인지하는 이차항체가 검출가능한 기질과 접합될 수 있다.)과, 설명서 및 표지물을 포함한다.

상기 키트는 또한 β-아밀로이드 검출자로 이용하기 위한 표지된 VEGF 폴리펩타이드를 설명서와 함께 포함할 수 있다.

β-아밀로이드 및 VEGF에 대한 고친화성 트랩(Trap)

리간드 트랩, 리간드 활성을 차단하는 것으로, 이는 상기 리간드를 격리하므로써, 동일종의 리간드에 대한 선별적인 고친화성 대항제로 작용하고, 따라서 이의 본래의 대응물, 예컨대 수용체 또는 공동-응집 집합과 상호작용할 수 없도록 한다. 이러한 리간드 트랩을 제조하는 상세한 설명은 미국 출원 제 6,472,179에 기술되어 있으며, 본 발명에 통합된다.

상기 리간드 트랩은 그외 분자에 조합하는 VEGF 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 이에 한정되진 않으나, 이형(heteromeric) 면역글로블린 중쇄/경쇄 수용체와 같은 폴리펩타이드를 포함하며, 트랩을 형성하여, β-아밀로이드, 바람직하기로는 자유-부유하는 β-아밀로이드에 결합하거나 격리시킨다. 이와는 반대로, 상기 리간드 트랩은 그외 다른 분자에 조합하는 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나, 이형의 글로블린 중쇄/경쇄 수용체와 같은 폴리펩타이드를 포함하며, 트랩을 형성하고, VEGF에 결합하거나 격리시킨다. 상기 이형의 리간드 트랩은, 화학적으로 결합된 트랩이 적합한 경우, 상호이황화(interdisulfide)로 연결된 단백질로 이루어질 수 있다. 또는 이러한 리간드 트랩은 재조합 융합 단백질을 이용하여 형성할 수 있다.

예로, 일실시예에서, 리간드에 대한 고친화성 트랩, 예컨대 VEGF 또는 β-아밀로이드는 본 발명의 기술분야의 당업자가 제조할 수 있는 것으로, 리간드 결합성 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 제일 폴리펩타이드 구성요소를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 다중결합성(multimerizing) 구성요소(예, IgG의 Fc 도메인) 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 구성요소를 암호하는 1종이상의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 융합 핵산을 제조하여, 상기 리간드에 대한 고친화성 트랩을 만들 수 있다. 할 수 있다. 상기 융합 구조체는 1종이상의 리간드 결합성 도메인 폴리펩타이드와 다중결합제를 암호하는 1종이상의 폴리펩타이드를 암호하는 DNA로 이루어질 수 있다. 도한 다중결합제 및 리간드 결합성 도메인은 별개의 DNA 구조체에서 암호되고 발현될 수 있다. 그러나, 다중결합성 구성요소는 폴리펩타이드에 한정되지 않으며, 리간드에 결합하고 다른 한편으로는 다른 다중결합성 구성요소와 결합하여 리간드 트랩을 형성시킬 수 있는, 모든 종류의 분자를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

리간드 결합성 트랩은 용해가능하거나 또는 고형 표면에 결합될 수 있다. 또한 상기 리간드 결합성 트랩은 다양한 분석법으로 VEGF 또는 β-아밀로이드와의 결합성을 실험할 수 있다. 그 예로, 상기 리간드 트랩에 결합된 VEGF 또는 β-아밀로이드의 해리속도는 항-VEGF 또는 항-β-아밀로이드 단클론성 중화 항체로부터의 VEGF 또는 β-아밀로이드의 해리속도와 병행하여 측정할 수 있다. 기 결정한 농도의 표지된 리간드를 단클론 항체 또는 리간드 트랩과 약 20시간 전배양한다. 비-표지된 리간드를 과도하게 추가할 수 있다. 주기적으로, 반응물의 분획물을 이동시키고, 리간드 트랩은 단백질 G-세파로즈에서 침전될 수 있으며, 잔류한 표지물의 수를 측정할 수 있다.

유전자 치료

구체적인 실시예로, VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 암호하는 서열을 포함하는 핵산을, 본 발명의 폴피펩타이드의 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료, 억제 또는 방지하기 위한 목적으로 유전자치료방식으로 투여할 수 있다. 유전자 치료는 발현되거나 발현가능한 핵산을 환자에 투여하는 요법을 의미한다. 본 발명의 실시예로, 상기 핵산은 이를 암호하는 단백질, 치료효과를 중재하는 단백질을 생산한다.

본 기술분야에서 이용가능한 모든 종류의 유전자 치료를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 예시되는 방법은 하기와 같다.

유전자 치료 방법의 통상적인 내용은, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)를 참조한다. 재조합 DNA 기술분야에서 통상적인 공지 방법을 사용할 수 있으며, 이는 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기술되어 있다.

바람직한 측면으로, 핵산 서열은 VEGF 폴리펩타이드 또는 β-아밀로이드 폴리펩타이드를 암호할 수 있으며, 핵산 서열은 적합한 숙주에서 상기 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 특히, 이러한 핵산 서열은 폴리펩타이드 암호 부위에 작동되도록 연결된 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 유도성 또는 구성성 및 선택적으로는 조직-특이적일 수 있다. 다른 구체적인 실시예로, 핵산 분자는 폴리펩타이드 코딩 서열과 그외 적합한 서열이 게놈에서 적합한 부위에 상동 재조합을 촉진하는 지역 측면에 사용되어, 핵산을 암호하는 항체의 염색체간 발현을 제공한다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

핵산의 환자로의 전달은 직접, 이 경우 환자는 핵산 또는 핵산 운반 벡터에직접적으로 노출되며, 또는 간적접으로 이루어지며. 이 경우 세포는 생체외에서 핵산으로 일차 형질전환되고, 이후 환자에 이식된다. 이러한 두가지 접근은 생체내 또는 ex 생체내 유전자 치료로 공지된 것이다.

구체적인 실시예로, 상기 핵산 서열은 생체내에서 직접적으로 투여되고, 암호된 산물이 발현되어 생산된다. 이는 본 발명의 기술분야에서 공지된 다수의 모든 방법에 의해 실시될 수 있으며, 예컨대 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로 구성시키고, 이를 투여하여 세포내 위치되게 실시하거나, 예컨대 결손 또는 감쇠된 레트로바이러스 또는 그외 바이러스 벡터를 이용한 감염, 또는 노출된(naked) DNA, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 전이제로 코팅, 또는 리포좀, 마이크로파티클 또는 마이크로캡슐을 이용한 피막형성(encapsulation)시킨 DNA의 직접 주사, 또는 이들을 핵내 이입되는 것으로 공지된 펩타이드와 연결시켜 투여 또는 리간드에 연결하여 수용체-매개 세포내이입(endocytosis) 되도록 투여 등의 방법(see, e.g., Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (which can be used to target cell types specifically expressing the receptors) 이 있다. 다른 실시예로, 핵산-리간드 복합체는, 리간드가 용해성(fusogenic) 바이러스 펩타이드를 포함하여 엔도좀(endosome)을 파괴하는 형태로 제조할 수 있어, 상기 핵산은 리소좀(lysosom) 변성을 피할 수 있도록 한다. 또 다른 실시예로, 상기 핵산은 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내 특이 수용체를 표적으로 하여 표적화될 수 있다. 또다르게는 상기 ortks은 세포내로 도입되어, 상동 재조합으로 숙주세포 DNA내에 통합될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

구체적인 실시예로, 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용한다. 상기 핵산 서열은 유전자 치료에 사용되는 폴리펩타이드를 암호하는 것으로, 1종이상의 벡터에 클로닝하여, 상기 유전자의 환자에게로의 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-부속 바이러스는 사용가능한 바이러스 벡터의 예이다. 레트로 바이러스는 바이러스 게놈의 정확한 팩킹(packaging)과 숙주세포 DNA로의 삽입에 필수적인 구성요소를 포함 한다.

아데노바이러스는 호흡기관 상피에 유전자를 전달하기에 매우 매력적인 운송수단으로, 이는 이들이 가벼운 질환을 야기하는 호흡기관의 상피에 자연적으로 감염되기 때문이다. 아데노바이러스에 기초한 전달시스템의 다른 목표는 간, 중추신경시스템, 내피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하지 않는 세포에 침입할 수 있는 장점이 있다. 또한 아데노-부속 바이러스(AAV)는 유전자 치료 용도로 제안되었다.

유전자 치료의 다른 접근은, 조직 배양물에서 유전자를 일렉트로포레이션(electroporation ), 리포펙션, 칼슘 인산염 매개 형질도입 또는 바이러스 감염과 같은 방법으로 세포에 전이하는 것이다. 통상, 전이 방법은 세포에 선별성 마커 전이를 포함한다. 세포는 선별조건에 두어 응하는 세포를 분리하고 전이된 유전자를 발현한다. 이러한 세포는 횐자에 전달한다.

실시예로, 상기 핵산은 재조합 세포 결과물을 생체내로 투여하기 이전에 세포에 도입한다. 이러한 도입은 공지의 방법에 의하여 실시될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나, 형질도입, 일렉트로포레이션, 미세주입, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테이러파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개한 유전자 전이, 마이크로셀-매개한 유전자 전이, 스페로플라스트(spheroplast) 융합등을 포함한다. 외래 유전자의 세포 도입에 관한 다수의 기술들이 공지되어 있으며, 본 발명에 따라 사용할 수 있으며, 수용세포의 필수적인 발생적 또는 생리적 기능이 파괴되지 않도록 한다. 이 기술은 상기 핵산을 세포에 안전하게 전이하며, 상기 핵산 은 세포에 의해 바람직하기로는 세포 자손에 의해 유전되고 발현된다.

유전자 치료목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포는 모든 적합한, 이용가능한 세포타입을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니나 상피세포, 내피세포, 각질형성세포, 섬유모세포, 근육세포, 간세포; T-림프구, B-림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 거대핵세포, 과립백혈구와 같은 혈액세포; 다양한 줄기세포 또는 전구세포(progenitor cell), 예컨대 골수, 제대혈액(umbilical cord blood), 말초혈액, 태아 간 등으로부터 수득되는, 것을 포함한다.

바람직한 실시예로, 유전자 치료용 세포는 환자의 자가(autologous)세포이다.

재조합세포를 유전자 치료에 사용하는 실시예에서, 폴리펩타이드를 암호화는 핵산 서열은 세포로 도입되고, 세포나 이들의 자손에 의해 발현된 다음 재조합 세포는 치료작용을 위해 생체내 투입된다. 구체적인 실시예로, 줄기세포 또는 전구세포가 사용된다. 분리하고 생체외에서 유지시킬 수 있는 모든 줄기세포 및/또는 전구세포를 본 발명의 실시예에 따라 사용할 수 있다.

구체적인 실시예로, 유전자 치료목적으로 도입된 핵산은 상기 암호부위(coding region)에 작동가능하도록 연결된 유발성(inducible) 프로모터를 포함하여, 핵산의 발현은 적절한 전사 유발인자의 존재 여부를 조절하여 통제가능하다.

치료 조성물

실시예로, 본 발명은 β-아밀로이드 응집 또는 아밀로이드 반점으로 특징화되는 다양한 질환의 치료에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 치료 조성물은 VEGF의 β-아밀로이드 결합을 억제하는 화합물을 제공하므로써 질병에 걸리거나 걸리기 쉬운 사람에 투여될 수 있다. 특히, 상기 질환은 치매, 만성적인 뇌 신경변성 장애(chronic neurodegenerative disorder of the brain), 신경세포 소실 특히 해마와 대뇌피질에서, 신경전달물질 감소, 뇌혈관 변성 및/또는 인지력 소실과 연관이 있다 또한 특히 본 발명은 알츠하이머 질환을 치료에 관한 것이다.

다른 실시예로, 본 발명은 과도한 혈관신생으로 특징화되는 다양한 질환의 치료에 관한 것으로, 이에 한정되진 않으나, 암, 죽상경화증, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 신장질환 또는 비만을 포함한다. β-아밀로이드 리간드 트랩을 포함한 다양한 형태의 β-아밀로이드 펩타이드는 상기한 질환에 걸린 환자에 투여하여 혈관신생에서 주된 원인제인, VEGF 가 결합되거나 비활성화된다.

치료 화합물의 제형(formulation)은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 공지되어 있으며, 참고문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA를 이용할 수 있다. 예를 들면, 약 0.05g 내지 약 20 mg/kg(body weigth)/day를 투여할 수 있다. 투여량 체제는 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 그 예로, 수회 나누어진 복용량은 매일 투여되거나, 긴박한 치료상태로 표시됨에 따라 복용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다. 활성 화합물은 일반적인 방법, 예컨대 구강으로, 정맥내(수용성의), 근육내, 피하, 비내, 진피내, 또는 좌약식 또는 이식(예, 복막내 경로에 의한 서방형 분자 를 이용하거나, 또는 세포 예컨대 생체외에서 민감화되고, 수여체에 채택적으로 전이된 단핵구 또는 덴드리트(dendrite) 세포를 이용)으로 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드는 효소, 산 및 상기 성분을 비활성화시킬 수 있는 그외 자연조건으로부터 보호하기 위하여 물질내 코팅되도록 요구될 수 있다.

예를 들면, 낮은 지질친화성(lipophilicity)의 펩타이드는 위장관에서 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의하여 훼손되거나, 위에서 산 가수분해에 의하여 훼손될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방법으로 펩타이드를 투여하기 위하여, 이의 비활성화를 방지하는 물질로 코팅되거나 공동 투여될 것이다. 예로, 펩타이드는 보강제로 투여되어자, 효소 저해제와 공동투여 또는 리포솜 내 함유시켜 투여할 수 있다. 본 발명의 보강제는 레소르시놀(resorcinol), 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르를 포합한다. 효소 저해제는 췌장의 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트(diisopropylfluorophosphate: DEP) 및 트라실롤(trasylol)을 포함한다. 리포솜은 water-in-oil-in-water CGF 유제와 통상적인 리포솜을 포함한다.

활성 화합물은 또한 비경구 또는 복막내로 투여될 수 있다. 분산제(dispersions)는 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일상으로 조제될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건하에서, 이러한 조제는 미생물의 성장을 방지할 수 있는 방부제를 포함한다.

주사하기에 적합한 조제의 형태는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산제 및 멸균 주사액 또는 분산제의 즉각적으로 조제용 멸균 가루를 포함한다. 모든 겨우, 형태는 살균된 것이어야 하며, 쉽게 주사할 수 있는 정도로 유동성이 있어야 한다. 조제 및 보관 조건에서 안정하여야 하며, 박테리아 또는 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 운반체는 용매 또는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 수용액 및 유사무질)을 포함하는 분산 배지, 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일일 수 있다. 적절한 유동성이 유지될 수 있으며, 그예로 렉틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산시 일정 파티클 크기 유지에 의해 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제를 이용하여 실시할 수 있으며, 그예로, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티오메르살(theomersal) 및 유사물이 있다. 대부분, 등장제(isotonic agent), 에컨대 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기간의 흡수는 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테레이트 및 젤라틴과 같은 제제의 사용에 의하여 수행될 수 있다.

멸균의 주사가능용액은 일정량의 활성 화합물을 상기에 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매에 혼합하여 제조하며, 필요에 따라 여과 멸균(filtered sterilization)을 실시한다. 통상, 분산제는 다양한 활성성분을 멸균 매개체(vehicle)에 혼합하여 제조되며, 상기 매개체는 염기성 분산 배지 및 일정량의 다른 성분을 포함한다. 주사가능한 멸균액의 조제용 멸균분에서, 바람직한 조제방법은 진공 건조 및 냉동건조 기술이며, 미리 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 그외 첨가된 적합한 성분의 분말(powder)이 수득된다.

펩타이드가 상기 기술한 바와 같이 적절히 보호되는 경우, 활성 화합물은 예컨대 불활성 희석제 또는 흡수할 수 있는 식용 운반체와 같이 경구 투여될 수 있거나, 딱딱한 또는 부드러운 껍질의 젤라틴 캡슐내로 봉입되거나, 또한 정제로 압착되거나, 규정식(food of the diet)에 직접 혼합할 수 있다. 경구투여시, 활성 화합물은 부형제와 혼합될 수 있으며, 섭취가능한 정제, 구강(buccal) 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭실제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제(wafers) 등의 형제로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 조제품은 활성 화합물을 적어도 1 중량% 이상 포함한다. 조성물 및 조제품의 비율은 다양할 수 있으며, 약 5 내지 80 중량%일 수 있다. 이런 치료학적으로 유용한 조성물의 활성 화합물의 함량은, 적합한 투여량이 획득될 수 있는 수준이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 조제품을 준비하여, 경구 투여단위는 약 0.1 ug 내지 2000 mg의 활성 화합물을 포함한다.

정제, 환제 및 캡슐제 등은 다음을 또한 포함할 수 있다: 결합제 예컨대 검 트라가캔스(tragacanth), 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴; 부형제 에컨대 디칼슘 포스페이트; 분해제(disintegrating agent) 예컨대, 옥수수 녹말, 감자 녹말, 일기닌산 등; 윤활제 에컨대 마그네슘 스테레이트; 및 감미제 예컨대 자당, 유당 또는 사카린이 첨가될 수 있거나, 향료 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리양을 포함할 수 있다. 제형이 캡슐인 경우 상기 물질들과 함께 액체의 전달체를 포함할 수 있다. 다양한 그외 물질들은 코팅제일 수 있으며, 제형 단위의 물질적 형태를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셀락(shellac), 당 또는 이들 모두로 코팅될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭실제는 활성 화합물, 감미제로 자당, 방부제로 메틸 및 프로필파라빈, 염료 및 향료로 체리 또는 오렌지 향을 포함할 수 있다. 또한 투여단위 제형제조에 사용되는 모든 물질은 약제적으로 순수(pure)하고 사용시 실질적으로 독성이 없어야 한다. 또한 활성 화합물은 지속된-방출 조제 및 형태로 만들어질 수 있다.

여기, "약제학적으로 허용가능한 전달체 및/또는 희석제"는 모든 종류의 용매, 분산 배지, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수지연제를 포함한다. 이러한 매체와 약제학적으로 활성이 있는 물질의 사용은 공지된 것이다. 기존의 매체 또는 약제가 활성성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하곤, 치료조성물에서의 이들의 사용을 예상할 수 있다. 부수적인 활성 성분 역시 조성물에 혼합될 수 있다.

비경구 조성물은 투여 용이성 및 조제 균일성을 고려하여 투여단위형태로 제조하는 것이 좋다. 여기 언급하는 투여단위 형태는 치료 대상인 포유류에 대한 단일의 투여에 적합한 물질적으로 분리된 단위와, 약제학적 전달체와 연계하여 적합한 치료효과가 발생되기 위한 기결정된 활성 물질의 양을 포함하는 각각이 단위를 의미한다. 본 발명의 투여단위형태에 대한 설명은 에 의하여 규정되고 직접적으로 좌우된다. (a) 활성 물질의 독특한 특징과 성취되는 특정 치료 효과 및 (b) 신체적 건강이 손상된 질환상태의 생존자에 질환치료용 활성 물질을 조제하는 기술분야 한정에 직접적으로 좌우되며 이에 의하여 규정된다

주된 활성 성분은 편리하고 효과적인 투여를 위해, 유효함량을 사용하여 약 제학적으로 허용가능한 적합한 전달체와 함께 투여 단위 형태로 조제된다. 1 단위의 투여형태는 예를들면 주된 활성 화합물을 0.5 ug 내지 2000mg으로 포함할 수 있다.

표시되는 비율상으로는, 활성 화합물은 통상 약 0.5 ug/ml(전달체)로 존재한다. 추가적인 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우, 투여는 참고문헌에 따라 일반적인 양과 상기 성분의 투여방법으로 결정된다.

전달 시스템

다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 화합물을 투여하기 위하여 사용될 수 있으며, 예컨대, 리포솜내 캡슐화. 마이크로파티글, 마이크로캡슐, 상기 화합물을 발현성 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입(endocytosis), 레트로바이러스 또는 그외 벡터 일부로서 핵산 구조체 등이 있다. 도입방법은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비내, 경막외 및 구강 경로를 포함하나 이에 한정되진 않는다. 화합물 또는 조성물은 용이한 경로로, 예를들면 주입액 또는 6

약 덩어리 주사(bolus injection), 상피 또는 점막피부 내층(예, 구강점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의하여 투여될 수 있으며, 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물을 적절한 경로를 통하여 중추신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며, 상기 적절한 경로는 뇌실내 주사 및 경막내 주사를 포함하며, 뇌실내 주사는 그 예로 저장소에 접촉된 뇌실내 도관(catheter), 예컨대 Ommaya 저장소을 이용하여 용이하게 할 수 있다. 폐 투여는, 예컨대 흡입기 또는 분무기를 사용하여 실시될 수 있으며, 분무화제(aerosolizing agent)를 이용한 제형을 이용할 수 있다.

구체적인 실시예에서, 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물은 치료가 요구되는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이는 예를 들면, 외과적 국소 주입, 국소 처치, 예컨대 수술후 상처 치료제와 함께, 도관을 이용한 수단으로, 좌약을 이용한 수단으로, 또는 이식물, 다공성의 이식물, 비다공성의 이식물 또는 젤란틴성 물질 즉, 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막, 또는 섬유를 이용한 수단에 의하여 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하기로는, 단백질, 즉, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 투여하는 경우, 처리(care)는 상기 단백질이 흡수되지 않는 물질을 이용하여 실시되어야 한다. 다른 실시예로, 화합물 또는 조성물은 운반체, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다. 또 다른 실시예로, 화합물 또는 조성물은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 실시예로, 펌프를 사용할 수 있다. 다른 실시예로 중합성 물질을 사용할 수 있다. 또 다른 실시예로 조절되는 방출 시스템을 치료 목표물, 예켠대 뇌, 근처에 위치시킬 수 있으며, 따라서, 시스템적 투여 분획만이 요구된다.

조성물의 투여가 수여 동물에서 허용될수 있거나 또는 동물 투여가 적합한 경우, 조성물은 "약제학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한"라 한다. 투여 함량이 생리학적인 유의성이 있는 경우, 상기 약제는 "치료학상으로 유효함량"으로 투여된다고 한다. 약제의 존재가 수여 환자의 생리적으로 확인가능한 변화를 야기하는 경우 약제는 생리학적 유의성이 있다.

본 발명은 하기 주어진 상세한 설명으로 충분히 이해될 수 있으며, 첨부된 도면들은 일예로 제시된 것으로, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

도 1A -1G는 알츠하이머병 환자의 뇌피에서 β-아밀로이드 및 VEGF의 동일부 위치성성을 나타낸다. 알츠하이머 환자(70 세, 남성, Braak stage VI, A, B) 및 정상 노인(85세, 남성 C, D)의 뇌 단편들은 VEGF 항체(A, C) 및 콩고 레드(Congo Red)(B, D) 로 염색되었다. 화살표시는 콩고 레드 친화성 플라크들을 나타낸다. 다른 알츠하이머(80세, 남성 Braak stage VI) 환자의 단편은 β-아밀로이드(E) 및 VEGF 항체(F)로 중복 면역염색하여, 이미지가 병합되었다(G). 화살표시한 부위들은 콩고 레드로 또한 염색되었다(데이터 미첨부). VEGF의 강한 염색과 둘 사이의 대응되는 패턴이 확인된다. 확대: 400x. 정상 노인(n=4)과 알츠하이머 환자(n=7)의 표본 자료를 나타낸다.

도 2A-2C는 VEGF의 β-아밀로이드 특이 결합을 나타낸다. A 및 B는, 공지 β-아밀로이드 결합성 단백질 및 VEGF의 CM5 센서칩에 고정화된 β-아밀로이드 펩타이드와의 상호작용에 대한 자기공명분석. RU, 공명단위 A, 공지된 β-아밀로이드 단백질 및 VEGF에서 β-아밀로이드 펩타이드 결합. a2M, α2-마이크로글로블린; a1ACT, α1-액티키모트립신; SAP, 혈청 아밀로이드 P 요소; ApoE4, 아포리포프로테인 E4. B, 다양한 농도의 VEGF를 고정된 Aβ_1-40에 가한 센서그램(Sensorgram). Aβ_1-42로 수득한 동일 결합 센서그램(similar binding sensorgram) (데이터 미첨부). C, 비표지된 VEGF를 이용한 고정된 Aβ_1-40 에 대한 ¹²⁵I-VEGF 결합 저해. 고정된 Aβ _1-42를 이용한 동일 저해 패턴(데이터 미첨부). 모든 수치는 평균 ±표준편차로 나타냄.

도 3A-3C는 VEGF의 β-아밀로이드와의 응집을 나타낸다. A, VEGF는 Aβ_1-40와 함께 응집되나 Aβ_40-1와는 응집되지 않는다. 투입 Aβ_1-40 및 표지된 VEGF의 동일 비는 원심분리한 펠렛에서 나타났다. *, P = 0.0076. B, VEGF는 β-아밀로이드 응집율에 영향을 미치지 않는다. Ab_1-40 단독 (■, 선) 또는 Ab_1-40 (▲, 점선) 와 VEGF를 공동 배양시 다양한 배양시간 후 β-아밀로이드 침전물이 관찰되었다. C, VEGF는 새롭게 용해된 Aβ_1-40에 비하여 전-응집된 Aβ_1-40 와 공동-침전되는데 유효하다. 결과는 VEGF와 전-응집된 β-아밀로이드의 결합을 나타낸다. **, P < 0.0001. 모든 수치는 평균± 표준편차로 나타낸다.

도 4A-4B은 β-아밀로이드/VEGF 공동-응집체에서의 VEGF의 느린 방출을 나타낸다. A, VEGF는 서서히 β-아밀로이드/VEGF 공동-응집물로부터 해리된다. Inset, 3일후 공동-응집물로부터 분리된 VEGF는 1.5% 이하이다. 모든 수치는 평균± 표준편차로 나타낸다. B, β-아밀로이드/VEGF 복합체는 SDS 처리에 민감하다. 방사능 사진은 A에서 수득한 것으로, 비변성 조건에서의 펠렛의 SDS-PAGE를 나타낸다. 레인1: ¹²⁵I-VEGF 단독. 레인2: Aβ/¹²⁵I-VEGF 복합체. 좌측 숫자는 사이즈 마커 위치이다. VEGF 단독에 비하여 β-아밀로이드/VEGF 복합체에서는 추가적인 밴드가 관찰되지 않는다.

도 5는 β-아밀로이드가 VEGF의 헤파린 결합 도메인의 C-말단(29-55 아미노산) 부위에 주로 결합함을 나타낸다. β-아밀로이드는 헤파린 결합 도메인의 C-말단 하위(sub) 도메인에 결합하나, 헤파린 결합 도메인의 N-말단 절반부에는 결합하지 않는다. 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 나타낸다. GST-HBD: GST에 융합된 총 헤파린 결합 도메인, GST-NHBD: GST에 융합된 N-말단 절반부(아미노산1-29), GST-CHBD: GST에 융합된 헤파린 결합 도메인의 C-말단 절반부(아미노산29-55).

도 6은 VEGF와 Aβ_25-35 의 결합을 나타낸 것이다. β-아밀로이드의 다양한 부분 절편들에 대한 실험에서 Aβ_25-35 절편이 β-아밀로이드에 경쟁적으로 작용하여 고정된 VEGF165에 결합한다. 상기 결과는 Aβ_25-35 가 VEGF 결합 부위임을 나타낸다.

도 7은 헤파린에 의한 β-아밀로이드와 VEGF의 결합 억제를 나타낸 것이다. GST-헤파린-결합 도메인은 마이크로타이터 웰에 고정되어있으며, 바이오틴 표지된 Aβ_1-42의 결합을 헤파린의 존재 유무에 따라 확인하였다. 헤파린 농도가 증가될수록 바이오틴 표지된 β-아밀로이드의 헤파린-결합 도메인과의 결합은 억제된다. IC50= ~25 ng/ml.

도 8은 펜타갈로일 글루코스(pentagalloyl glucose: PGG), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate: EGCG) 및 탄닌산(tannic acid)에 의한 β-아밀로이드와 VEGF 간의 결합 억제를 나타낸 것이다. VEGF165 (50 ng/well)를 플라스 틱 웰에 코팅하고, 바이오틴 표지된 β-아밀로이드(100 ng/ml)를 PGG, EGCG 또는 탄닌산의 증가된 농도조건에서 첨가한다. 바이오틴 표지된 β-아밀로이드의 VEGF165 결합은 양고추냉이 과산화효소 접합된 스트렙타비딘으로 검정하였다.

본 발명은 이하 기재한 구체적인 실시예에 의하여 범위가 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 기재한 내용과, 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명과 도면으로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에겐 용이한 것이다. 이러한 변형은 특허청구범위에 해당된다. 하기 실시예들은 본 발명의 설명하기위해 제공할 뿐이며, 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 -조직학 및 면역세포화학

포르말린-고정된 대뇌 피질 부검 조직은 보스톤 대학의 알츠하이머 질환 센터으로부 제공받았다. 냉동된 뇌는 30 um 두께로 절편하였다. 절편들은 젤라틴 코팅된 유리판 위에 높고, 30분간 3.5%의 파라포름알데하이드로 후-고정한 다음, 15분간 0.3% H₂O₂ 로 전배양하였다. 면역조직화학을 위해, 상기 절편은 0.25% 트리톤 X-100으로 처리하고 10%의 말 혈청을 첨가하여 1시간도안 배양한 후 β-아밀로이드에 대한 마우스 단클론성 항체(ZYMED, South San Francisco, USA)나 또는 사람 VEGF에 대한 염소 다클론성 항체(R&D Systems Inc., Minneapolis, USA 와 12-16시간동안 반응시켰다. 상기 절편은 텍사스 레드-접합된 항 마우스 IgG(Vector Laboratories, Burlingame, USA) 또는 바이오틴 접합된 토끼 항-염소 IgG (Vector Laboratories)와 반응시켰다. 후자는 형광-접합된 스트렙타비딘(Vector Laboratories)과 반응시켰다. 콩고 레드 염색으로, 면역표지한 절편은 포화된 알코올성 소듐 클로라이드 용액(4% (w/v) NaCl in 80% EtOH), 상기 용액은 사용하기 전에 2.5mM NaOH를 처리하여 염기화시키키고 20 분간 배양한 다음 0.2% 콩코 레드(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 를 첨가하였다. 20분 후, 절편은 무수에탄올로 세척하고, VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories)로 표본하였다.

실시예 2 -결합분석

공지된 β-아밀로이드 결합 단백질 및 VEGF의 β-아밀로이드 펩타이드 결합을 표면 플라즈몬 공명 분광기(surface plasmon resonance spectroscopy)로 확인하였다. Aβ_1-40, Aβ_1-42, 및 Aβ_40-1 (BACHEM, Bubendorf, Switzerland)는 아민 연결 키트로 CM5 센서 칩상에 고정시켰다. α2-마크로블로불린, α1-안티키모트립신, 혈청 아밀로이드 P 요소, 아포리포프로테인 E4 및 VEGF₁₆₅ (100 nM)는 유속 10 ul/min으로 고정화된 아밀로이드에 결합시켜 센서그램을 실시간으로 측정하였다. 결합 친화성을 결정하기 위항, 마이크로리터 웰들을 0.5 uM β-아밀로이드 펩타이드(100uL)으로 코팅하고, 과잉 부분은 결합 완충액(0.1% BSA in M199/25 mM HEPES/NaOH, pH 7.4)으로 봉쇄하고, 결합은 50 pM의 ¹²⁵I-VEGF (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 단독 또는 비표지된 VEGF가 다양한 농도로 존재하는 조건에서 첨가하여 분석하였다.

실시예 3 -공동 응집 분석

β-아밀로이드_1-40 응집은 공지방법(Chang et al., Brain Res Brain Res Protoc 2000;6(1-2):6-12)을 일부 변형한 방법으로 확인하였다. β-아밀로이드_1-40 를 FITC-접합된 β-아밀로이드_1-40(1uM)과 함께 50 mM MES에서 2일간 배양한 후, 혼합물을 원심분리하고 펠렛에서의 형광을 측정하였다. VEGF의 β-아밀로이드와의 응집으로, β-아밀로이드_1-40 또는 β-아밀로이드 100 uM을 ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ (1 nM)와 혼합하고 2일간 37℃에서 배양하였다. 혼합물을 원심분리하고 펠렛에서의 방사능을 감마-계수기로 결정하였다. β-아밀로이드의 응집속도에 대한 VEGF의 영향을 조사하기 위하여, β-아밀로이드_1-40(50 mM of Ab_1-40 and 1 mM of FITC- Ab_1-40 ) 또는 β-아밀로이드 및 1 uM VEGF 혼합물은 37℃에서 배양하고, 응집정도를 원심분리 후 펠렛에서의 형광을 측정하여 결정하였다. VEGF의 전-응집된 β-아밀로이드_1-40 결합으로, 새로운 β-아밀로이드 또는 2일간 전배양한 β-아밀로이드 50 uM를 ¹²⁵I-VEGF (1 nM)와 혼합하고 즉시 원심분리하였다. 펠렛에서의 방사능을 결정하였다.

실시예 4- 해리 분석

β-아밀로이드/VEGF 공동 응집으로부터의 VEGF의 해리를 위해, 공동 응집 분석에서 수득한 펠렛을 50 mm MES, pH 5.8에 재현탁하고, 다양한 시간별로 배양한 후 원심분리하였다. 상등액에서의 방사능을 결정하였다. β-아밀로이드/VEGF 복합 체의 SDS에 대한 민감성을 조사하기 위하여, 비-변성 SDS-PAGE 시료 염색제를 ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ 또는 공동 응집 분석에서 수득한 펠렛에 첨가하고 10분간 끓였다. 혼합물은 SDS-PAGE(10%)예 전해하고 방사능사진을 촬영하였다.

실시예 5 - 결과

실시예 5.1 - VEGF는 알츠하이머 환자 뇌에서 아밀로이드 반점과 동일부에 위치한다. VEGF의 발현양상이 알츠하이머 환자의 측두 피질에서 변화가 있는지 실험하였다. 노인 대조군에 비하여 알츠하이머 환자의 뇌에서 VEGF 면역반응성이 증강되는 것을 관찰하였다(도 1A 및 C). 예상과는 달리, VEGF의 강한 침착은 알츠하이머 환자의 피질부의 콩고필릭(congophilic)반점에서 관찰되었다(도 1A 및 B). VEGF 면역반응성 및 아밀로이드 반점은 연령별 환자의 피질부에서 거의 관찰되지 않았다(도 1C 및 D). amyloid plaques were rarely detected in cortical sections of age-matched subjects 2차 면역세포화학으로 VEGF가 알츠하이머 환자의 신경염 반점 및 광범위 반점에서 β-아밀로이드와 함께 존재함을 확인하였다(도 1E -1G). 유사한 결과는 실험한 모든 알츠하이머 뇌 시료에서 관찰되었다(환자 7명).

실시예 5.2 - VEGF는 높은 친화성 및 특이성으로 나타내며 β-아밀로이드 펩타이드에 결합한다. β-아밀로이드 및 VEGF가 높은 친화성 및 특이성의 상호 작용을 하는지 조사하였다. BIAcore CM5 센서 칩상에 Aβ_1-42, Aβ_1-40, 및 Aβ_40-1 를 고정시키고, VEGF 및 그외 분자의 β-아밀로이드 펩타이드 결합을 표면 플라스몬 공명 분광기로 조사하였다(도 2A 및 B). 그 결과 VEGf는 β-아밀로이드에 결합하는 것 으로 알려진 물질들, 예컨대 α2-마크로글로불린, α1-안티키모트립신, 혈청 아밀로이드 P요소 및 아포리포프로테인 E4에 비하여 더욱 강하게 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 에 결합하는 것으로 확인되었다(Bohrmann et al., J Biol Chem 1999;274(23):15990-15955; Hamazaki H., J Biol Chem 1995;270(18):10392-10394; Hughes et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(6):3275-3280; Strittmatter et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(17):8098-8102). 표면 플라스몬 공명 분광기로 확인한 결과는 바이오틴 표지된 Aβ_1-40 를 이용한 ELISA 분석에서도 유사하게 나타났다. VEGF는 Aβ_1-40의 아미노산 서열이 역순으로 배열된 Aβ_40-1 펩타이드에 결합하지 않았다. β-아밀로이드와 VEGF 간의 결합 친화성은, 비표지된 VEGF의 농도를 증가시킨 조건에서의 방사능표지된 VEGF와 고정화된 β-아밀로이드간의 결합을 분석하므로써 결정하였다(도 2C). 본 분석에서, Aβ_1-40의 해리상수(K_D = IC₅₀ [¹²⁵ I-VEGF])는 약 50 pM이었다(DeBlasi et al., Trends Pharmacol Sci 1989;10(6):227-229). Aβ_1-42 는 VEGF에 대하여 유사한 결합 친화력을 나타내었다(데이터 미 첨부함). 이러한 결과는 VEGF가 특이적 및 높은 친화력으로 β-아밀로이드 펩타이드 결합함을 제시한다.

실시예 5.3 - β-아밀로이드 펩타이드는 VEGF의 세포 결합 및 세포분열 활성에 거의 영향을 미치지 않는다. 이후 VEGF의 세포 결합 및 세포분열 활성에 대한 β-아밀로이드 펩타이드의 영향을 조사하였다. Aβ_1-40와 Aβ_1-42는 고 농도(1uM)에서도 VEGF의 내피세포의 수용체에 대한 결합이나, VEGF에 의한 내피세포의 증식에 영 향을 주지 않는다. 최근 연구들에서 VEGF가 신경세포, 내피세포 및 일부 종양에서 발현되는 뉴트로필린-1과 상호작용하는 곳으로 보고되고 있다(Soker et al., Cell 1998;92(6):735-745). Aβ_1-40 및 Aβ_1-42는 VEGF가 뉴트로필린-1을 발현하는 MDA-MB-231 종양세포에 결합하는데 영향을 미치지 않는다(데이터 미첨부함). 또한 β-아밀로이드 펩타이드는 높은 친화력으로 VEGF에 결합된 상태에서도 VEGF의 세포 결합성 및 세포분역 활성에 영향을 주지 않는다.

실시예 5.4 - VEGF는 β-아밀로이드와 공동 응집되고, 전-응집된 β-아밀로이드에 강력하게 결합하고, 공동-응집된 복합체로부터 매우 서서히 해리된다. VEGF는 알츠하이머 환자의 뇌의 β-아밀로이드 반점에서 침착되고, β-아밀로이드 펩타이드와 강력하게 결합하므로, VEGF와 β-아밀로이드간의 공동 응집되는 기작을 연구하였다. β-아밀로이드 만 2일간 배양하면, 원심분리한 펠렛에서 약 60%의 β-아밀로이드가 발견된다(데이터는 미첨부함). ¹²⁵I-VEGF 와 Aβ_1-40 VEGF를 용액상에서 함께 배양하면 동율의 VEGF가 펠렛에서 발견된다(도 3A). 그러나 역위 펩타이드, Aβ_40-1가 존재하는 경우 VEGF의 다량의 침전은 발생되지 않았다(P = 0.0076). 시간 경과 실험에서, VEGF(1 uM)는 50 uM 및 100 uM의 Aβ_1-40의 응집에 유의할만한 영향을 나타내지 않았다(도 3B 및 데이터 미첨부함). VEGF는 새로운 또는 전-응집된 β-아밀로이드와 혼합하고 즉시 원심분리하는 경우 VEGF는 전 응집된 β-아밀로이드에 결합하고 이러한 복합체는 원심분리시 펠렛화된다(도 3C). 이후 β-아밀로 이드/VEGF 복합체로부터의 VEGF의 해리속도를 조사하였다. 3일 후, 1.5 % 이하의 VEGF가 상기 복합체로부터 해리되었다(동 4A). 그러나 β-아밀로이드/VEGF 복합체는 SDS 처리에 민감하였다(도 4B). 이러한 결과는 VEGF가 β-아밀로이드 응집속도에 육안적인 영향을 전혀 치지 않으면서 β-아밀로이드와 공동 응집하고, 전-응집된 β-아밀로이드에 강력하게 결합할 뿐만 아니라 공동-침착된 β-아밀로이드/VEGF 복합체로부터 매우 서서히 방출됨을 명확히 보여준다.

실시예 6 -VEGF의 β-아밀로이드 결합 부위 결정

VEGF의 β-아밀로이드 결합부위를 결정하기 위하여, 전체 VEGF, 헤파린 결합성 도메인 및 헤파린 결합성 도메인의 일부분을 글루타티온-S-전이효소(GST) 로 기존 방법(Soker et al., J Biol Chem 1996;272(50):31582-31588)에 따라 융합시켰다. 정제한 단백질은 12 % SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석하였다. GST 및 GST-융합 단백질은 200 nM로 마이크로리터 웰에 고정시키고, 반면에 VEGF는 100 nM로 고정시켰으며, 이는 VEGF 이량체가 두개의 헤파린 결합성 도메인을 포함하고 있기 때문이다. 비특이적 결합은 3 % BSA/PBS로 봉쇄시킨 후, 200 nM의 β-아밀로이드를 각 웰ㅇ; 첨가하고 고정화된 단백질에 결합되도록 하였다. 결합되지 않은 β-아밀로이드는 제거하고, 결합된 β-아밀로이드는 토끼 항-β-아밀로이드 항체를 반응시킨 후 양고추냉이의 과산화효소가 접합된 항-토끼 항체로 결정하였다. 그 결과는 도 5에 있다.

실시예 7 -β-아밀로이드의 VEGF 결합 부위 결정

β-아밀로이드의 VEGF 결합부는 두가지 방법으로 결정하였다. VEGF는 100 nM 로 마이크로리터 웰에 고정시키고 3 % BSA/PBS로 비특이적 결합을 봉쇄하였다. Ab_1-42 (50 nM)를 단독 또는 β-아밀로이드 돌연변이가 30 uM로 존재하는 조건에서 각 웰에 첨가하여 고정된 VEGF에 결합되도록 하였다. 결합되지 않은 β-아밀로이드를 제거한 후, 결합된 β-아밀로이드는 토기 항-β-아밀로이드 항체의 결합 및 양고추냉이 과산화효소가 접합된 항-토끼 항체 결합으로 결정하였다. 다른 방법으로, 바이오틴 표지된 Ab_1-42 (50 nM)는 β-아밀로이드 대신에 단독 또는 β-아밀로이드 돌연변이가 50 uM로 존재하는 조건으로 고정된 VEGF에 첨가하였다. 결합된 바이오틴 표지된 β-아밀로이드는 양고추냉이 과산화효소로 접합된 스트렙타비딘으로 결정하였다. 그 결과는 도 6이다.

실시예 8 -VEGF/β-아밀로이드 상호작용에 대한 저해자인 헤파린

VEGF 및 β-아밀로이드간의 상호작용에 대한 헤파린의 영향을 조사하기 위하여, GST-헤파린-결합성 도메인을 100 nM농도로 마이크로리터 웰에 고정시키고, 비특이적 결합은 3 % BSA/PBS로 봉쇄하였다. 바이오틴 표지된 Aβ_1-42 (50 nM) 는 단독 또는 헤파린의 농도가 증가된 조건에서 상기 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 바이오틴 표지된 β-아밀로이드를 제거한 후, 결합된 펩타이드는 양고추냉이 과산화효소로 접합된 스트렙타비딘으로 결정하였다. 그 결과는 도 7이다.

실시예 9 - VEGF/β-아밀로이드 상호작용에 대한 저해자인 PGG, EGCG, 탄닌산

PGG, EGCG 및 탄닌산의 저해요과는 다음에 따라 확인하였다: VEGF165 (50 ng/well)를 플라스틱 웰에 코팅하고 상기 웰은 3% BSA/PBS로 2시간 처리한 후 PBS로 세척하였다. 바이오틴 표지된 β-아밀로이드(100 ng/ml)는 테스트 화합물의 높은 농도조건에서 각 웰에 첨가하였다. 2시간 후, 각 웰은 0.05%의 트윈/PBS로 7회 세척하였다. 결합된 바이오틴 표지된 β-아밀로이드는 양고추냉이 유래 과산화효소로 접합된 스트렙타비딘으로 결정하였다. 그 결과는 도 8이다.

하기 언급된 모든 참고자료는 본 발명에 통합된다.

* * * * *

기술분야의 당업자는 일반적인 실험만으로 본 발명에서 상세히 기재한 구체적인 실시예와 동등한 결과를 인지 또는 확인가능할 것이다. 상기 동등한 결과는 청구범위의 범위에 포함된다.

<110> POSCO POSTECH Foundation <120> BETA-AMYLOID BINDING FACTORS AND INHIBITORS THEREOF <130> dpp20041786kr <150> US 60/339,932 <151> 2001-12-13 <150> PCT/KR02/02353 <151> 2002-12-13 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe 115 120 125 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser 130 135 140 Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys 145 150 155 160 Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 2 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His 1 5 10 15 Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr 20 25 30 Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys 35 40 45 Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 50 55 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 20 25 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Arg Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 5 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Asp Cys Lys Tyr Lys Phe Glu Asn Trp Gly Ala Cys Asp Gly Gly 1 5 10 15 Thr Gly Thr Lys Val Arg Gln Gly Thr Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Asn 20 25 30 Ala Gln Cys Gln Glu Thr Ile Arg Val Thr Lys Pro Cys Thr Pro Lys 35 40 45 Thr Lys Ala Lys Ala Lys Ala Lys Lys Gly Lys Gly Lys Asp 50 55 60

Claims (38)

1. 헤파린 및 β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 β-아밀로이드 결합성 폴리펩타이드(β-ABP) 로서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 것인 폴리펩타이드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되며, N-말단 또는 C-말단에서 약 5개의 아미노산이 첨가 또는 제거된 것인 폴리펩타이드.
7. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4의 25번째 Gly 잔기에서 35번째 Met 잔기로 이루어진 β-아밀로이드의 일부위에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제 1항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
12. 제 11항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인 항체.
13. 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호하는 분리된 핵산.
14. 제 13항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
15. 제 14항에 따른 발현벡터를 포함하는 숙주세포.
16. 서열번호 3으로 표시되는 VEGF 폴리펩타이드, 또는 프로모터에 작동가능하도록 연결된 상기 VEGF 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는

    알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
17. 삭제
18. (a) β-아밀로이드를 포함하는 것으로 예상되는 시료에 VEGF를 적용하는 단계; 및

    (b) β-아밀로이드가 시료내 존재하는 경우 VEGF와 β-아밀로이드간의 결합 을 검출하는 단계

    를 포함하는 VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 측정하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 전응집된(pre-aggregated) β-아밀로이드에 결합하는 것인

    VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 측정하는 방법.
20. 제 18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포외 반점(plague)에 결합하는 것인

    VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 측정하는 방법.
21. 제 18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 것인

    VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 측정하는 방법.
22. 제 18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 3으로 표시되는 것인

    VEGF 폴리펩타이드의 β-아밀로이드 결합을 측정하는 방법.
23. 아밀로이드 반점을 가진 것으로 예상되는 시료 조직을 β-아밀로이드에 특이적으로 결합가능한 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 VEGF 폴리펩타이드에 접촉시키는 단계; 및

    상기 폴리펩타이드와 상기 아밀로이드 반점간의 결합을 검출하여 상기 결합은 질환에 걸린 상태임을 표시하는 단계

    를 포함하는 알츠하이머 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
24. 삭제
25. 제 23항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 표지된 것인 방법.
26. 제 23항에 있어서,

    상기 폴리펩타이드와 상기 아밀로이드 반점간의 결합의 검출은 상기 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체중 어느 하나와 특이적으로 결합하는 리간드를 검출하는 것을 포함하며,

    상기 리간드는 표지된 것인

    방법.
27. (a) β-아밀로이드에 특이적으로 결합하는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 VEGF 폴리펩타이드를 포함하는 용기;

    (b) 상기 VEGF 폴리펩타이드, β-아밀로이드 또는 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체에 특이적으로 결합하는 제1 리간드; 및

    (c) 상기 제1 리간드에 특이적으로 결합하는 표지된 제2 리간드 및 사용설명서;

    를 포함하는 VEGF 폴리펩타이드/β-아밀로이드 복합체의 존재 확인을 위한 분석 키트.
28. VEGF 와 β-아밀로이드 간의 상호작용을 억제하는 화합물을 포함하고,

    상기 화합물은 당 벡본(backbone)에 페놀 또는 설페이트 치환기를 포함하는 단량체 또는 중합체인,

    알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
29. 삭제
30. 삭제
31. 제 28항에 있어서, 상기 화합물은 헤파린, 탄닌산, 펜타갈로일글루코오스 (PGG), 카테킨 또는 카테킨 페놀 화합물인 조성물.
32. (a) VEGF 및 β-아밀로이드를 함유한 시료에 화합물을 접촉시키는 단계;

    (b) VEGF 및 β-아밀로이드가 서로 정상적으로 특이 결합하는 조건에서 VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 결정하는 단계;

    (c) 상기 화합물 존재조건에서 VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 결정하는 단계; 및

    (d) 상기 (a) 및 (b) 에서 기재한 VEGF 및 β-아밀로이드 결합율을 비교하는 단계

    를 포함하고,

    상기 (c)의 결합율이 (b)에 비하여 낮은 경우, 상기 화합물을 VEGF/β-아밀로이드 결합을 저해하는 화합물로 결정하는 것을 특징으로 하는;

    VEGF/β-아밀로이드 결합을 저해하는 화합물의 탐색 방법.
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 서열번호 2로 표시되는 VEGF 폴리펩타이드, 또는 프로모터에 작동가능하도록 연결된 상기 VEGF 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는

    알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

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