KR100909206B1 - 세코이소라리시레시놀(ｓｅｃｏ)의 제조방법 및 이를유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아마씨(Flaxseed) 추출물을 산, 알칼리 또는 효소반응시켜 세코이소라리시레시놀(secoisolariciresinol; SECO)을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 피부흡수율이 높고 ROS 생성 억제능이 뛰어난 세코이소라리시레시놀을 제조하는 방법, 그 중에서도, 특히 효소를 이용하는 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

아마씨, 항산화, Flaxseed, SDG, secoisolariciresinol diglucoside, SECO, secoisolariciresinol, 노화방지

Description

세코이소라리시레시놀(ＳＥＣＯ)의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{A method for preparing secoisolariciresinol(SECO) and cosmetic composition containing the secoisolariciresinol}

본 발명은 아마씨로부터 산, 알칼리, 효소반응을 통해 세코이소라리시레시놀을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 생성되는 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써 세포노화 또는 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 활성산소에 의한 지질과산화의 결과 생성되는 지질과산화물을 비롯한 여러가지 체내 과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴를 일으켜 각종 기능장애를 야기함으로써 여러 가지 질병의 원인이 되기도 한다.

따라서, 이와같은 자유 라디칼을 소거할 수 있는 화합물(free radical scavengers) 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들이 이들 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서 기대된다.

물론 인체에도 항산화물질(라디칼 소거제)인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase:SOD), 카탈라아제, 비타민 E, 비타민 C, 유비퀴놀(ubiquinol) 등이 있다. 그러나, 시간이 지남에 따라 인체의 항산화 체계는 나이, 공해, 자외선, 스트레스 등에 의해 점차적으로 깨지기 시작한다. 그 결과, 인체의 항산화체계가 무력화되고, 라디칼이 점차로 증가하게 된다. 이와 같이 증가된 라디칼은 진피의 결합조직인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히아루론산(hyaluronic acid) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하 현상을(주름) 일으키며 또한 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상을 일으켜 피부염, 여드름, 피부암 등의 질병을 유발하게 되는 것이다.

종래에는, 아스코르브산, α-토코페롤, SOD 등을 자유 라디칼 소거 효과를 가지는 물질로서 화장료나 의약품에 배합함으로써 주름 및 기타 피부 질환을 방지하는 방법으로 이용되어 왔는데, 이들 성분은 가격이 고가일 뿐만 아니라 배합시 성분 자체의 안정성이 좋지 못하여, 간단하면서도 저렴한 방법으로는 실질적인 효과를 얻기가 어려운 문제점이 있었다. 한편, 지금까지 알려진 천연 항산화제는 약한 활성, 독성 및 사용상의 한계를 내포하고 있어, 보다 안전하고 강한 활성을 지닌 신규 천연 항산화제의 개발이 요구되어 왔다.

천연 항산화제의 개발을 위하여 많은 천연물 유래의 원료들이 연구되어 왔는데, 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용이 되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않고 경험과 구전에 의해 화장료등에 사용되고 있는 것이 현실이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 보다 우수한 항산화제 원료를 찾고자 하는 연구의 일환으로 여러 천연물을 검색한 결과 아마인(flaxseed)의 리그난(lignan) 물질인 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드(secoisolariciresinol diglucoside, SDG)가 항산화제로 효과가 우수하다는 것을 발견하였고, 나아가, 상기 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드로부터 당이 제거된 세코이소라리시레시놀이 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 보다도 더 우수한 항산화력을 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

아마(亞麻; flax, Linum usitatissimum)는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 아마과의 한해살이풀로서, 원산지는 중앙아시아이며, 분포지역은 유럽, 아르헨티나 등이다. 높이 30∼100cm이다. 위에서 가지가 많이 갈라진다. 잎은 어긋나고 넓은 줄 모양이며 길이 2∼3.5cm이다. 끝이 뾰족하며 밑부분이 줄기에 붙는다. 가장자리가 밋밋하고 연한 녹색이다. 꽃은 6∼8월에 파란빛을 띤 자주색 또는 흰색으로 피며, 취산꽃차례로 달린다. 꽃받침조각은 긴 타원형이며 5장이고 가장자리가 밋밋하다. 꽃잎·수술·헛수술·암술대는 각각 5개씩이다. 열매는 삭과(殼果)로서 둥글고 5실이며 종자는 납작하고 긴 타원 모양이며 노란빛을 띤 갈색이다.

껍질은 섬유자원으로서 방직·여송연 종이 등을 만드는 데 쓴다. 종자에서 짠 기름은 아마인유라고 하는데, 건성유이므로 인쇄잉크·수채화·페인트·약재 등으로 이용한다. 중앙아시아 원산으로서 옛부터 이집트와 터키에서 섬유식물로 재배하였다. 유럽과 아르헨티나에 주로 분포하며 한국에서도 한때 재배하였다.

한편, 리그난(lignan)은 n-페닐프로판이 n-프로필 곁사슬의 β자리에서 2분자가 결합한 천연물을 총칭하여 이르는 말이다. n-페닐프로판과 그 중합체인 리그닌의 중간체에 해당하는 것으로, 천연으로는 삼중합체 또는 사중합체 등은 아직 발견되지 않았다. 리그난은 자연계에 널리 분포하며, 겉씨식물·속씨식물에서 발견되나, 현화식물에서는 아직 발견되지 않았다. 배당체(글리코시드)나 유리상태로 식물의 뿌리·심재(心材)·잎·과실·수지(樹脂) 등 거의 모든 부분에 존재한다. 대부분의 리그난은 무색의 고체이며 광학적으로 활성이다. 최근에 리그난의 성분에는 비록 동물실험이기는 하나 육종(肉腫)을 파괴하고 치료하는 작용이 있다는 것이 판명되어, 암치료에 중요한 시사를 주고 있다.

본 발명은 기존의 천연물로부터 단순추출한 추출액을 사용한 것이 아니라, 분리정제와 산, 알칼리 및 효소반응을 통하여 항산화에 탁월한 효과를 보이는 SDG와 세코이소라리시레시놀을 발견하고 추출물의 효능을 증대시키고자 하였으며, 추출물을 2차 가공함으로써 추출물에 포함된 미지의 성분으로부터 발생될 수 있는 안정성의 문제도 해결하고자 하였다. 또한, 배당체 형태인 SDG의 당을 제거하여 세코이소라리시레시놀을 제조함으로써 피부에서의 흡수를 증대시킬수 있다는 것을 발견하고 흡수증가에 의한 효능 극대화를 이루고자 하였다.

따라서, 본 발명은 아마씨로부터 산, 알칼리, 효소가수분해 반응을 통해 세코이소라리시레시놀을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아마씨(flaxseed) 추출물 또는 이로부터 분리한 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)를 산 가수분해반응, 알칼리 가수분해반응 또는 효소 가수분해반응을 시켜 세코이소라리시레시놀(secoisolariciresinol; SECO)을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 효소 가수분해반응에 사용되는 효소는 당결합을 분해하는 엑소 당결합 분해효소 및 이들을 함유하고 있는 복합효소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기의 엑소 당결합 분해효소에는 β-글루코시다제(β-glucosidase), α,β-아라비노시다제(α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제(α,β-rhamosidase, β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 등이 있으며, 이들 중 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 복합효소제로는 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase), 셀룰라제(cellulase) 등이 있으며, 이들 중 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 아울러, 상기 엑소 당결합 분해효소와 상기 복합효소제를 동시에 사용할 수 있음은 물론이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

아마씨(flaxseed)는 오메가-3 지방산과 식이섬유가 풍부한 물질로서 기능성식품으로 관심의 대상이 되어 왔다. 특히 상기 아마씨에는 식물성 에스트로젠 (phytoestrogen) 물질의 하나인 리그난이 많이 함유되어 있으며, 리그난 중에서 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)가 다량 함유되어 있다. 이러한 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드는 식물성 호르몬의 일종으로서, 에스트로젠 (estrogen)과 구조적으로 유사하며 체내에서 에스트로젠 합성에 관여하는 효소의 작용을 방해하여 에스트로젠의 함량을 낮춰주는 기능을 가지고 있다. 따라서 최근에는 여성의 유방암과 남성의 전립선암에 대한 예방 및 치료에 대한 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드의 역할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

또한, 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드는 mammalian 리그난의 전구체로서, 인체내로 섭취시 당이 떨어진 세코이소라리시레시놀 혹은 엔테로다이올 (enterodiol, ED), 엔테로락톤(enterolactone, EL)의 형태로 전환되어 실질적인 효능을 발현한다고 알려지고 있다.

특히 항산화력에 있어서는 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 보다도 세코이소라리시레시놀, 엔테로다이올 그리고 엔테로락톤이 훨씬 월등한 것으로 연구 결과가 나오고 있다.

본 발명에서는 아마씨 추출물 중에서 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드와 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드의 인체 내 전환물질 중의 하나인 세코이소라리시레시놀이 항산화능이 있다는 것을 발견하고, 이들을 천연 항산화제로서 화장료에 적용한 것이다. 본 발명에서는 상기 천연의 항산화제를 화장료에 적용함으로써, 화장료에 적용되던 항산화제의 부작용을 최소화하고자 하였으며, 항산화제의 선택의 폭을 넓혔다. 본 발명에서는 단순히 아마씨 추출물을 사용하는 것이 아니라, 아마씨 추출물 또는 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드로부터 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드의 인체 내 전환물질 중의 하나인 세코이소라리시레시놀을 제조하여 화장료에 적용하였다.

본 발명에 의한 세코이소라리시레시놀의 제조 방법에는 세 가지가 있으며 하기에 나타낸다.

우선, 아마씨(flaxseed)를 그라인더(grinder)로 잘게 부수고 헥산 또는 이와 유사한 유기용매를 이용하여 아마씨 내의 오일 성분을 제거하고, 오일이 제거된 잔류물을 물, 물을 포함한 유기용매(예; 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 크로로포름 등) 또는 유기용매(예; 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 크로로포름 등)로 추출하고, 이 추출물을 여과, 농축하여 아마씨 추출물을 제조한다.

상기 제조된 아마씨 추출물을 상온 또는 40∼60℃에서 알칼리용액(NaOH, KOH등)을 추출물 대비 1∼20배(wt/v) 넣고 하루동안 교반하며 반응시키고 반응이 종료된 후 산용액을 이용하여 pH가 7이 되도록 중화시킨다. 상기 중화시킨 반응액을 흡착칼럼(XAD 또는 HP-20) 에 통과시켜 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 칼럼에 흡착시키고 저급알콜(에탄올, 메탄올등)을 흡착칼럼에 흘려준다. 흡착칼럼을 통과한 액을 여과, 농축하여 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 얻는다.

이렇게 제조된 아마씨 추출물과 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드로부터 다음의 세가지 방법에 의해 세코이소라리시레시놀을 제조한다.

첫째, 산 가수분해 방법에 의한 세코이소라리시레시놀의 제조방법이다. 먼저, 아마씨추출물혹은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드에 산과 알코올의 혼합물을 가하고 수욕조에서 가열 환류시켜 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드에 결합된 당결합을 가수분해시킨다. 이어, 용매를 제거하고, 잔사를 현탁한 후 유기용 매를 이용하여 추출한다. 추출물이 포함된 유기용매 층을 탈수, 농축하여 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

예를 들어, 아마씨추출물 혹은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드에 20배(v/w)의 7％ 황산/50％ 에탄올 용액(v/w)을 가하여, 100℃ 수욕조에서 6∼24시간 동안 가열 환류시켜, 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드에 결합된 당결합을 가수분해시킨다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출한다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

둘째, 염기 가수분해 방법에 의한 세코이소라리시레시놀의 제조 방법이다. 먼저, 아마씨추출물 혹은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 건조 피리딘에 녹이고, 여기에 강 알칼리(금속나트륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, sodium methoxide 등)를 가해 유욕상에서 환류반응시켜 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드의 당결합을 가수분해시킨다. 이어, 반응액의 용매를 제거하고, 잔사를 현탁시킨 후 유기용매를 이용하여 추출한다. 추출물이 포함된 유기용매 층을 탈수, 농축하여 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

예를 들어, 아마씨추출물 혹은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 건조 피리딘에 녹이고, 여기에 sodium methoxide(powder)를 가해 유욕상에서 6∼24시간동안 환류 반응시킴으로써, 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드의 당결합을 가수 분해시킨다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

셋째, 효소분해방법을 통한 세코이소라리시레시놀의 제조 방법이다. 먼저, 아마씨추출물 혹은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 산완충용액에 용해시키고, 여기에 효소 또는 효소 혼합물을 첨가하여 수욕상에서 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 유기용매를 이용하여 추출, 여과, 농축하여 생성물 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

예를 들어, 세코이소라리시레시놀을 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 단일 효소(pectinase, naringinase, cellulase, β-glucuronidase, β-galactosidase, amyloglucosidase등) 또는 이들의 혼합물을 첨가하고 30∼50℃ 수욕상에서 24∼72시간동안 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 에테르로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 세코이소라리시레시놀을 얻는다.

본 발명에서는 또한 상기 제조된 세코이소라리시레시놀이 피부흡수가 우수하다는 것을 발견하고 이를 화장료에 적용하였다. 즉, 어떤 유효성분이 화장료에 적 용되기 위하여는 안정성 및 안전성이 보장되어야 하고 피부 흡수가 우수하여야 하는데, 본 발명에 의한 세코이소라리시레시놀은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드로부터 예견되는 것보다 월등한 피부흡수효과를 나타낸다는 것을 발견 및 확인하고 이를 화장료에 적용한 것이다.

한편 본 발명의 화장료 조성물은 세코이소라리시레시놀을 조성물 총 중량에 대하여 각각 0.0001∼10중량％의 양으로 함유함을 특징으로 한다.

함량이 0.0001중량％ 미만일 경우, 상기 성분에 의한 항산화 효과 등을 얻을 수 없고, 함량이 10중량％ 초과일 경우, 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않기 때문이다.

바람직하게는, 상기 세코이소라리시레시놀은 아마씨(flaxseed)에서 추출된 것이 좋다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은, 바람직하게는, 항산화용, 노화방지용 또는 주름 방지용의 화장료 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 화장료는 종래 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 본원발명의 유효성분인 세코이소라리시레시놀을 화장료에 단순 첨가할 수도 있으며, 유화물 형태(emulsion) 또는 리포좀 형태로 만들거나 에멀전 혹은 리포좀 내부에 포집시켜 사용할 수도 있다.

본 발명의 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디 크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다.

[제조예 1] 아마씨(flaxseed)추출물 제조

아마씨(flaxseed) 1Kg을 그라인더(grinder)로 잘게 부수었다. 유기용매로서 헥산 2L를 이용하여 추출하고 유기용매 층을 분리하여 제거하였다. 상기 공정을 3회 이상 반복하여 오일을 완전히 제거한 아마씨 500g을 얻었다. 오일이 제거된 상기 아마씨를 70％ 메탄올수용액 2L를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 하루동안 방치하여 침적시켰다. 상기 공정을 2회 반복하여 얻은 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 건고물 80g을 얻었다.

[제조예 2] 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 제조

제조예 1에서 얻은 건고물 50g을 상온에서 1N NaOH 1L로 하루동안 교반하며 반응시켰다. 반응이 종료된 후 1N HCl을 이용하여 pH가 7이 되도록 중화시켰다. 상기 중화시킨 반응액을 흡착칼럼 XAD 에 통과시켜 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 칼럼에 흡착시키고 메탄올 4L를 흡착칼럼에 흘려주었다. 흡착칼럼을 통과한 액을 여과, 농축하여 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 13.5g을 얻었다.

[실시예 1]

제조예 1에서 얻은 아마씨 추출물 10g을 500㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 5g(pectinase 1.0g, naringinase 1.0g, cellulase 1.0g, β-glucuronidase 0.4g, β-galactosidase 1.0g, amyloglucosidase 0.6g ; Sigma社製)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 8시간 간격으로 확인하고, 기질이 완전히 소실된 48시간 후 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 동량의 에테르로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 1.2g을 얻었다.

[실시예 2]

제조예 2에서 얻은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 5g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5g(pectinase 0.5g, naringinase 0.5g, cellulase 0.5g, β-glucuronidase 0.2g, β-galactosidase 0.5g, amyloglucosidase 0.3g ; Sigma社製)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 8시간 간격으로 확인하고, 기질이 완전히 소실된 48시간 후 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액은 동량의 에테르로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 2.3g을 얻었다.

[실시예 3]

제조예 1에서 얻은 아마씨 추출물 10g을 7％ 황산/50％ 에탄올 용액(v/w)을 1L가하여, 100℃ 수욕조에서 6시간 동안 가열 환류시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(500㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물 0.7g을 얻었다.

[실시예 4]

제조예 2에서 얻은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 5g을 7％ 황산/50％ 에탄올 용액(v/w)을 500㎖ 가하여, 100℃ 수욕조에서 6시간 동안 가열 환류시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(500㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물 1.2g을 얻었다.

[실시예 5]

제조예 1에서 얻은 아마씨 추출물 10g을 건조피리딘(500㎖)에 녹이고, 여기에 sodium methoxide(powder, 10g)를 가해 유욕(oil bath)상에서 8시간동안 환류 반응시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(500㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물 0.5g을 얻었다.

[실시예 6]

제조예 2에서 얻은 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드 3g을 건조피리딘(300㎖)에 녹이고, 여기에 sodium methoxide(powder, 5g)를 가해 유욕(oil bath)상에서 8시간동안 환류 반응시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(500㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO₄)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물 0.5g을 얻었다.

[시험예 1] 항산화 효과 시험(DPPH test)

유기 라디칼인 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)의 환원에 의해(항산화제는 산화됨) 발생되는 흡광도의 변화를 통해 항산화능을 평가하는 방법을 사용하였다. 하기 예들에 의해 DPPH의 산화가 억제되어 흡광도가 대조군에 비해 감소되는 정도를 측정하여, 대조군의 흡광도에 비해서 50％ 이하의 흡광도를 나타내는 농도를 유효 항산화 농도로 평가하였다.

100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕와 제조예1, 제조예 2, 실시예 1과 대조시료를 각각 10㎕ 넣어 반응액을 만들고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교시료로는 항산화제로서 널리 사용되고 있는 합성 항산화제 Trolox를 사용하였다.

각 물질의 DPPH assay 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

DPPH assay 결과(％ of inhibition)

농도(uM)	Trolox	제조예 1	제조예 2	실시예 1
62.50	73.2	7.4	64.8	87.8
31.25	59.2	3.1	41.2	66.9
15.63	39.7	1.7	23.2	34.4
7.81	24.4	0.8	13.1	18.4
3.91	15.3	0.9	5.9	10.5
IC 50 (ppm)	8.63		29.46	5.78

(IC₅₀ : 첨가한 시료에 의해 흡광도가 50％ 감소했을 때의 시료 농도)

표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본원발명에 의한 세코이소라리시레시놀이 Trolox 보다도 오히려 항산화능이 더 우수함을 알 수 있다. 또한, 아마의 단순 추출물보다는 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드가, 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드보다는 세코이소라리시레시놀의 항산화능이 우수한 것으로 나타났다.

[시험예 2] 형광물질을 이용한 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 생성 억제능 시험

시험에 사용한 세포주는 Human keratinocytes HaCaT cell line으로 형광측정용 96 well black plate에 well당 2.0X10⁴개로 분주하고 penicillin/streptomycin 이 첨가된 Dulbeccos Modification of Eagles Medium(DMEM, FBS 10％) 배지를 사용하여 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후 시험시료를 처리하였다. 하기 표 2에 나타나 있는 시료 처리에 사용된 배지로 penicillin/streptomycin 첨가된 Dulbeccos Modification of Eagles Medium(DMEM, FBS free)을 사용하고 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 1일간 배양하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후, HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, Inc)를 100㎕ 가하고 37℃, 5％ CO₂ 조건에서 20분간 배양하고 HCSS로 세척하였다. 이 후 시료 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 ROS로 산화된 DCF (dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다. 이후 UVB(30mJ/cm²)를 조사하고 처리직후 및 처리 3시간후의 형광도를 형광플레이트 리더(Ex=485 nm, Em=530nm)로 형광 강도를 측정하였다.

비교시료로서 Trolox를 사용하였다.

각 시험물질의 ROS 생성억제능 실험결과는 하기 표 2에 나타내었다.

ROS 생성억제능 실험결과(％ of Control)

농도	제조예 1 (flaxseed추출물)	제조예 2	실시예 1	Trolox
2.5 ppm	78.1	60.6	46.6	58.5
1.25 ppm	89.6	75.4	56.6	73.3
0.625 ppm	84.7	80.1	62.0	74.6
0.3125 ppm	89.1	80.6	63.2	76.9

위의 표 2에서와 같이 세코이소라리시레시놀이 가장 우수한 활성 산소종 생성 억제능을 나타내었다.

[시험예 3] 경피 흡수량 측정시험

피부 흡수는 기네아피그 피부를 대상으로 프란츠 투과셀을 이용하여 측정하였다. 시험 직전, 기네아피그의 복부 부분 피부를 채취하여, 평방 1㎠의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 0.9㎝인 투과셀에 장치하고, 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽면(donor 용기)은 아래의 제형예 1, 2의 영양크림 0.5g을 도포하고, 반대쪽면(receptor 용기)은 정제수와 에탄올이 4:1 중량비로 혼합된 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험시 온도는 실제 피부 온도인 32℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 후, HPLC를 이용하여 피부에 흡수된 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드와 세코이소라리시레시놀의 양을 측정하여, 도포 농도당 피부 흡수량(㎍/㎠/중량％)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

<HPLC 분석조건>

- Column : C18(ODS)

- Solvent Flow : 1㎖/min

- Detection UV : 280㎚

- Sample test concentration : 5㎎/㎖

- Sample injection amount : 10㎍

- Eluent : Gradient condition

- A : 1％ acetic Acid

- B : Methanol

<용매 구배 조건>

시간(분)	A(％)	B(％)
0	95	5
44	40	60
50	40	60
55	95	5

[제형예 1, 제형예 2] 영양크림

배합성분	중량％
	제형예 1	제형예 2
제조예 2	5.0	-
실시예 1	-	5.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올리에이트	0.5	0.5
PEG60 경화피마자유	2.0	2.0
유동파라핀	10.0	10.0
스쿠알란	5.0	5.0
카프릴릭/카프락트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	5.0	5.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제	적량	적량
색소	적량	적량
향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

경과시간에 따른 경피 흡수량 (㎍/㎠/중량％)

시간	제형예 1	제형예 2
0	0	0
4	1.67	6.54
8	2.85	17.53
12	4.38	37.32

표 3의 결과로부터, 일반적으로 화장의 지속 시간이 4∼8시간임을 감안하더라도, 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드를 함유한 화장료에 비해 세코이소라리시레시놀을 함유한 화장료는 경피 흡수량이 최소 5배 이상 높음을 알 수 있다. 이 결과로부터 배당체의 구조로 이루어진 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드에 비해 당이 제거된 세코이소라리시레시놀이 피부 흡수에 훨씬 유리한 구조임을 알 수 있다.

이하에서는, 크림제형 외의 화장료 제형에 대하여 설명한다. 본 발명에 의한 화장료의 제형은 하기의 제형으로 한정되는 것은 아니다.

[제형예 3] 유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량％
실시예 1	0.5
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
PEG 12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[제형예 4] 영양화장수(밀크로션)

배합성분	중량％
실시예 1	0.5
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[제형예 5] 마사지크림

배합성분	중량％
실시예 1	5.0
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
PEG 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[제형예 6] 팩

배합성분	중량％
실시예 1	5.0
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
PEG 12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

[제형예 7] 젤

배합성분	중량％
실시예 1	1.0
에틸렌디아민초산나트륨	0.05
글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.3
에탄올	5.0
PEG 60 경화피마자유	0.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 세코이소라리시레시놀을 화장료에 함유함으로써, 피부흡수가 용이하고 ROS 생성 억제능이 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Claims (9)

1. 아마씨(flaxseed) 추출물 또는 상기 아마씨 추출물을 알칼리 용액으로 반응시키고, 산용액으로 중화시켜서 분리한 세코이소라리시레시놀 디글루코사이드(SDG)를 효소 가수분해반응을 시키고,

   상기 효소 가수분해 반응에서 사용되는 효소는 엑소 당결합 분해 효소 및 이들을 함유하고 있는 복합효소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며,

   상기 엑소 당결합 분해 효소는 β-글루코시다제(β-glucosidase), α,β-아라비노시다제(α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제(α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,

   상기 복합효소제는 펙티나제(pectinase), 나린지나제 (naringinase) 및 셀룰라제(cellulase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 세코이소라리시레시놀을 제조하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제