KR100897908B1 - 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하여피부 건조증상을 개선하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하여 피부의 건조증상을 개선함을 특징으로 하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부세포의 분화를 촉진하여 새로운 각질의 재생산을 돕고, 피부에 보습기능을 담당하고 있는 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF)를 생산하고, 피부 내부로부터 수분유지에 필요한 지질의 합성을 증가시킴으로써, 피부의 수분함유능력 증강, 피부 건조의 방지, 그리고 아토피(atopy) 및 접촉성 피부염 증상의 예방, 개선 또는 치료에 효과가 있는 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) * 보습 * 각질형성세포 분화 * 필라그린 * 지질생합성 * 세라마이드 * 천연보습인자 * 피부건조 * 아토피 * 접촉성 피부염

Description

프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하여 피부 건조증상을 개선하는 피부 외용제 조성물{Composition for external applications to the skin containing D-fructose 1,6-diphosphate or derivatives thereof to improve skin xerosis}

도 1은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부세포주의 각질형성 효과를 보여준다.

도 2는 프럭토스 1,6-디포스페이트 유도체에 의한 피부세포주의 각질형성 효과를 보여준다.

도 3은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부세포주의 트랜스글루타미네이즈의 발현 효과를 보여준다.

도 4는 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 사람피부세포주에서의 필라그린 증가효과를 보여준다.

도 5는 아세톤 장기처치 후의 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 수분증발 억제효과를 보여준다.

도 6은 아세톤 장기처치 후의 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 수분량 증가효과를 보여준다.

도 7은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부에서 필라그린 발현효과를 보 여준다.

도 8은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 필라그린 발현 효과를 보여준다.

도 9는 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 표피 지질생합성 증가 효과를 보여준다.

도 10은 프럭토스 1,6-디포스페이트(F1,6DP)에 의한 표피 세라마이드 증가 효과를 보여준다.

본 발명은 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부의 건조증상을 개선함을 특징으로 한 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부세포의 분화를 촉진하여 새로운 각질의 재생산을 돕고, 피부에 보습기능을 담당하고 있는 천연보습인자(natural moisturizing factor, NMF)를 생산하고, 피부 내부로부터 수분유지에 필요한 지질의 합성을 증가시킴으로써, 피부의 수분함유능력 증강, 피부 건조의 방지, 그리고 아토피(atopy) 및 접촉성 피부염 증상의 예방, 개선 또는 치료에 효과가 있는 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부(skin) 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리,화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 피부세포로부터 분화되어 형성되며, 이 때문에 피부세포를 각질세포 또는 각질형성세포라 부른다. 각질층은 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(J. Invest. Dermatol. 1983; 80: 44-49). 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 「표피 세포의 분화」 혹은 「각화(keratinization)」라고 부른다. 각화과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다. 천연보습인자는 각질층에서 수분을 함유할 수 있는 기능을 담당하게 되는 데, 피부세포에서 필라그린(filaggrin)이라는 단백질이 만들어지고, 이후에 각질층에서는 필라그린이 천연보습인자로 전환된다. 이러한 필라그린의 합성 증가는 곧 천연보습인자의 증가를 의미하며 보습기능의 향상을 뜻하게 된다.

세포간 지방질은 피부에서 보습기능을 담당하는 또 다른 중요한 인자가 되는 데, 이 세포간 지방질 성분의 대부분은 세라마이드로 이루어져 있다. 이 세포간 지질이 부족하면 피부가 건조하고, 각질의 견고함과 유연함이 떨어져 쉽게 탈락하게 된다. 건조피부는 이러한 세포간 지방질이 부족하여 형성되며, 개선을 위해서는 세포간 지방질을 외부로부터 보충하거나 내부로부터 합성을 증가시켜야 한다.

그러나, 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목욕 등의 생활습관적 요소나, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인, 그리고 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 여러 위해 요인들이 늘어난 최근에 들어서는 건조피부증상 및 이로 인한 피부 장애를 호소하는 사람이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.

그러나, 생활환경 중에 사람에 대한 위해요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 피부, 즉 피부장벽기능이 와해된 피부를 갖고 있는 사람들도 증가추세에 있다.

이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피, 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 모든 질환들은 자체로 수분보유기능만을 갖는 통상적인 보습제 만으로는 단지, 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이었다.

이에 본 발명자들은 보습인자의 생성증가와 지질의 합성을 증가하는 물질을 개발하여 피부에 적용함으로써, 피부 각질층에 존재하는 천연보습인자들의 생성 및 유지를 강화시키고 세포간 지질 합성을 자연적으로 증가시켜 피부건조증과 이에 수반하는 아토피 등의 건조피부질환을 예방 또는 치료하고자 시도하였다.

표피 내에 존재하는 각질형성세포에서 보습인자 생산을 증가시키고, 지질합성을 촉진함으로써 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다. 첫째, 각질층 및 피부장벽을 구성하는 골격성분인 각질세포를 정상적으로 유도하여 외부로부터의 물리적인 자극으로부터 피부를 보호할 수 있게 하고 둘째, 각질세포를 둘러싸서 피부장벽을 완성시키는 구성성분인 지질의 생합성을 촉진하여 피부장벽의 강화를 유도할 수 있게 한다. 또한 각질세포가 보유하고 있는 천연보습인자들의 생성에 중요한 원천이 되는 단백질인 필라그린(filaggrin)의 발현을 촉진한다. 이러한 작용은 궁극적으로 피부의 수분보유능력을 증진시킴으로써, 피부의 유연성과 견고성을 높여 피부가 본래의 보호기능을 원활히 수행하게 하며, 부수적으로는 피부건조로 인한 잔주름의 발생도 감소시키는 효과를 가져올 수 있다.

본 발명자들은 표피분화와 관련된 연구를 수행하는 과정에서 프럭토스 1,6-디포스페이트가 피부세포의 분화를 촉진시켜 새로운 각질을 재생산하며, 필라그린 의 발현 및 지질생합성과 세포간 지질인 세라마이드의 합성도 촉진하는 것을 처음으로 확인하였으며, 외용제 제형으로 동물 및 사람의 피부에 적용했을 때 피부장벽을 강화하는 확실한 결과를 얻음으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 프럭토스 1,6-디포스페이트를 유효성분으로 함유하여 피부의 수분보유능과 피부장벽을 강화하는 효과를 부여하여 건조피부나 아토피 등과 같은 피부건조성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 프럭토스 1,6-디포스페이트가 피부에서 수분 증발량을 억제시키고, 피부내의 수분량을 증가시키며, 천연보습인자의 전구체인 필라그린 생성을 증가시키고, 지질합성을 촉진하는 작용이 있다는 것을 확인하고, 아울러 이러한 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유함으로써, 각질층과 피부장벽을 정상적으로 형성시키고, 피부보습을 유지시키는 기능을 가진 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들의 연구에 의하면 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체는 피부표피세포의 분화를 촉진시켜 새로운 각질의 재생산, 천연보습인자의 생산, 필라그린 합성증가, 피부내부로부터 지질의 합성을 증가 또는 세라마이드 생성을 촉진하는 기능을 가져 피부외용제 조성물의 보습용 유효성분으로 사용이 가능하다.

프럭토스 1,6-디포스페이트는 생체내에서 해당과정 중에 발생하는 중간물질 로써 심장이나 뇌에서 저산소증(hypoxia)이나 허혈(ischemia) 이후 오는 재관류(reperfusion)시 유발되는 손상으로부터 세포를 보호해 주는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 쥐의 대식세포(macrophage)에서 내독소(endotoxin)에 의해 발생되는 산화질소(nitric oxide)의 생성을 저해하는 것으로 보고되어 있다. 세포 내에서 프럭토스 1,6-디포스페이트의 이러한 작용들은 그 메커니즘이 정확히 알려져 있지는 않으나 지금까지의 결과를 근거하여 볼 때 프럭토스 1,6-디포스페이트는 세포내에서 일어나는 여러 가지 반응을 제어, 또는 조절하며 대사과정에 관여하는 물질로 추측할 수 있다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명에서 사용된 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-Fructose 1,6 diphosphate)는 미국 시그마社(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 시약을 사용하였다.

본 발명의 프럭토스 1,6-디포스페이트는 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼20 중량%를 함유하는 것이 바람직하며, 프럭토스 1,6-디포스페이트의 유도체의 형태로 이용할 수 있다. 이러한 유도체의 구체적인 예로는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 바륨(barium)염, 디바륨(dibarium)염, 소디움(sodium)염, 디소디움(disodium)염, 테트라소디움(tetrasodium)염, 칼륨(potassium)염, 칼슘(calcium)염, 디칼슘(dicalcium)염, 디마그네슘(dimagnesium)염 및 트리싸이클로헥실아민(tricyclohexylamine)염에서 1종 이상 선택되는 것으로서, 프럭토스 1,6-디포스페이트의 유효 사용량과 동일한 함량으로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부에 적용할 수 있는 통상적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 예를 들면 화장수, 크림, 로션, 스킨로션, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품뿐만 아니라 액상비누, 고형비누, 세안 폼(foam)과 같은 인체세정제 등으로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

이하 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 화장수

	비교예 1 (중량%)	실시예 1 (중량%)	실시예 2 (중량%)	실시예 3 (중량%)	실시예 4 (중량%)
정제수	66.82	66.72	66.62	66.32	65.82
프럭토스 1,6-디포스페이트	-	0.1	0.2	0.5	1.0
식물성 경화유	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
폴리글리세롤-10 펜타스테아릭, 베헤닐 알콜 및 소디움 스테아 로일 락틸레이트	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알콜 및 아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알콜 및 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트, 글리세롤 올레이트 및 프로필렌 글리콜	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
카프릴릭/카르릭 트리글리세라이드	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
메도우폼 열매기름	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
세틸 옥타노에이트	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
사이클로 메티콘	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
메틸파라벤	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
프로필 파라벤	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
디소디움 EDTA	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
트리에탄올 아민	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13
글리세린	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00
카보머	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13
합계	100	100	100	100	100

2. 로션제형

	비교예 2 (중량%)	실시예 5 (중량%)	실시예 6 (중량%)	실시예 7 (중량%)	실시예 8 (중량%)
프럭토스 1,6-디포스페이트	-	0.1	0.2	0.5	1.0
밀납	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
폴리솔베이트	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
솔비탄세스퀴올레이트	0.70	0.70	0.70	0.70	0.70
유동파라핀	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
글리세린	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
부틸렌글리콜	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
프로필렌글리콜	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
카르복시비닐폴리머	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
트리에탄올아민	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
방부제	적량	적량	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100

[시험예 1] 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체에 의한 사람 피부세포주의 각질형성능 효과

피부세포가 기저층에서부터 각질층을 생산할 때, 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의해 피부세포가 정상적으로 분화가 이루어지는 것을 피부세포의 분화 시 생성되는 각질(Cornified Envelop)의 양을 측정하여 프럭토스 1,6-디포스페이트의 세포 분화 촉진 효과를 시험하였다. 사람피부세포주를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 시험물질들을 처리할 때, 35-S-메티오닌(methionine)을 같이 첨가하여 2일간 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거한 후, 이 세포를 2% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS), 20mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)를 첨가한 인산완충염액(phosphate buffered saline, PBS)에 녹여내었다. 전체 단백질양을 측정하기 위하여, 일부를 취해 액체섬광계수기(liquid scintillation counter, LSC)로 측정한 후, 나머지는 글래스 필터(glass filter)로 여과하여 불용성 단백질인 각질의 양을 액체섬광계수기로 측정하였다. 음성/양성 대조군을 설정하기 위하여 사람피부세포주의 분화되지 않는 상태는 저칼슘(0.03mM) 처리군으로 하고, 사람피부세포주가 분화되는 상태는 고칼슘(1.2mM) 처리군으로 하여 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘농도에 시험물질을 첨가하여 시험을 실시하였다. 도 1은 프럭토스 1,6-디포스페이트를 처리하였을 때 사람피부세포주의 각질형성정도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 1에서 보는 바와 같이 프럭토스 1,6-디포스페이트는 저칼슘(0.03mM) 상태에서 0.01, 0.1, 1.0mM의 농도에 따라 각각 24%, 28%, 40%의 각질형성의 증가량을 보이고 있다. 그러므로 프럭토스 1,6-디포스페이트는 피부세포주를 분화시켜 각질을 형성시키는 효과가 있다.

프럭토스 1,6-디포스페이트의 유도체들에 의한 피부세포주의 각질형성능이 도 1과 유사한 결과를 나타내는지 평가하기 위하여, 상기 같은 조건에서 프럭토스 1,6-디포스페이트의 염들(바륨, 디바륨, 소디움, 디소디움, 테트라소디움, 트리소디움, 칼륨, 칼슘, 디칼슘, 디마그네슘, 트리싸이클로헥실아민 및 전체 혼합물염)을 각각 1mM로 처리하여 각질형성능을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 것처럼 각 유도체별로 사람 피부세포주의 각질형성능을 증가시키는 것을 알 수 있다.

[시험예 2] 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부세포주의 트랜스 글루타미네이즈(transglutaminase)의 발현효과

사람피부세포주(keratinocyte)를 96well 형 세포배양 플레이트의 각 well에 5×10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 부착시킨 피부세포주에 시험물질을 처리한 후, 2일이 지난다음, 배지를 제거하였고, -20℃ 냉장고에 보관하였다. 얼림-녹임(Freeze-thawing)을 2회 반복하여 물질 처리한 세포를 파괴시킨 후, -20℃에 보관한 아세톤:에탄올(1:1, v/v)을 처리하여 4℃에서 30분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 실온에서 방치하여 유기용매가 증발되게 하고, 블로킹(blocking; 1% bovine serum albumin), 트랜스글루타미네이즈 항체(primary antibody), HRP 항-마우스 항체(secondary)를 수행하고, 발색은 OPD(o-phennyldiamine)를 첨가하여 수행하였다. 발현량은 490㎚에서 흡광도를 측정하였고, 보정은 630㎚에서 배경(background)을 측정하여 수행하였다. 측정 결과는 Majken의 방법에 의하여(J. Invest. Dermatol. 2001, 116: 702-712) 나타내었으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 저칼슘(0.03mM) 농도에서 0.01mM, 0.1mM, 1.0mM의 프럭토스 1,6-디포스페이트를 처리하였을 때, 트랜스글루타미네이즈의 발현을 각각 38%, 42%, 66% 증가시킴을 보여준다. 즉, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 피부세포주가 분화하여 각질을 형성할 때, 각질 형성에 관여하는 효소인 트랜스글루타미네이즈의 발현을 증가시킴으로써 분화를 증가시킴을 알 수 있었다.

[시험예 3] 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 사람피부세포주의 필라그린(filaggrin) 생성 촉진 효과

앞서 언급하였다시피 피부에서 보습에 중요한 영향을 미치는 천연보습인자의 생산을 알아보기 위하여 천연보습인자의 전구체인 필라그린(filaggrin)의 합성을 사람 피부세포에서 시험하였다. 시험예 1과 동일한 방법으로 사람피부세포를 배양한 다음, 시험 물질 처리를 2일간 행하였다. 물질 처리가 끝난 후, 배지를 제거한 다음 세포만을 취하여 초음파파쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄한 후, 단백질만을 얻어내었다. 이 단백질을 이용하여 합성된 필라그린의 양을 살펴보았는데, 방법은 웨스턴 블랏팅(western blotting)의 방법을 이용하였다. 도 4에서 보여지는 것은 필라그린의 항체를 붙여서 발현되는 필라그린의 양을 이미지분석기(Image analyzer)를 이용하여 수치화한 그래프이다. 저칼슘(0.03mM) 처리군에 비하여 프럭토스 1,6-디포스페이트 1.0mM을 처리한 군이 두 배 이상 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 천연보습인자의 전구체인 필라그린의 합성 증가를 보이므로 간접적으로 천연보습인자의 증가를 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 피부에서 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부장벽회복 및 보습력 시험

프럭토스 1,6-디포스페이트가 장기간의 피부손상으로 인한 피부장벽의 회복에 미치는 효과를 평가하기 위한 시험을 실시하였다. 출생 후 8-10주가 경과한 젊은 무모생쥐의 등에 아세톤을 1일 2회씩 5일 동안 주기적으로 도포하여 실험동물 등 피부의 장벽기능을 손상시킨 다음, 증발계(Evaporimeter)로 수분증발량(TEWL, Trans-Epidermal Water Loss)을 측정하여 40g/㎡/hr 이상의 피부 수분증발량을 나타내는 피부를 가진 실험동물만을 대상으로 Vehicle(프로필렌-글리콜:에탄올=7:3)과 프럭토스 1,6-디포스페이트 1%를 함유한 시험물질을 피부면적 5㎠ 당 200 ㎕의 용량으로 1일 2회씩 3일동안 연속 도포하면서 일정시간마다 수분증발량을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 것과 같이 프럭토스 1,6-디포스페이트를 도포한 처리군이 vehicle군에 비해 더 빠르게 장벽손상이 회복되어 정상 피부로 되돌아 가는 결과를 보이고 있다. 피부장벽 손상 후에 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 피부에서의 수분손실량은 50%이상의 회복력을 보여 월등한 피부장벽회복을 보이고 있다.

또한, 수분증발량 측정시점에 독일 Courage Khazaka사의 코니오미터 (Corneometer)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸 도 6에서 보여지는 바와 같이 피부 수분량의 경우에도 프럭토스 1,6-디포스페이트를 처치한 군의 피부수분량이 vehicle 처치군보다 높았으며, 장벽손상회복과 더불어 피부 수분량도 증가함을 알 수 있었다.

[시험예 5] 피부에서 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 필라그린 발현 효과

무모생쥐를 이용하여 표피에서의 필라그린 단백질의 발현에 미치는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 효과를 알아보기 위해 면역조직화학염색을 실시하였다. 상기 시험예 4에서 3일 동안 시험물질과 vehicle을 처치한 실험동물의 피부 조직을 잘라내어 파라핀에 고정하고, 필라그린 항체를 이용하여 피부조직의 면역조직화학염색을 수행하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7을 보면, 프럭토스 1,6-디포스페이트를 도포한 군이 vehicle군보다 필라그린의 발현이 더 많은 것으로 나타났다.

면역조직화학염색을 통하여 필라그린의 발현양이 증가함을 관찰하여, 피부조직에서 단백질을 얻어내어 필라그린양의 증가를 다시 관찰하였다. 피부조직에서 표피부분을 얻어내어 균질 분쇄기(homogenizer)를 이용하여 분쇄한 후, 초음파파쇄기(sonicator)를 이용하여 조직을 파쇄하였다. 여기에서 수용성 단백질 부분을 얻어내어 웨스턴 블랏팅(western blotting)의 방법을 수행하였다. 그 결과를 도 8에서 나타내었다. 프럭토스 1,6-디포스페이트를 처리하였을 때, 필라그린의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.

[시험예 6] 피부에서 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의한 지질생합성 증가 효과

피부에서 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의하여 표피내 지질생합성의 증가를 알아보기 위하여 세포간지질의 구성 성분들 중 하나인 세라마이드의 생성능을 측정하였다. 상기 시험예 4에서 3일 동안 시험물질과 vehicle을 처치한 실험동물의 피부 조직을 8㎜ 펀치로 절편하여 0.25% 트립신(trypsin)을 함유한 인산완충염액이 담겨있는 페트리 디쉬(Petri Dish)에 진피가 아래로 가도록 하여 담근 다음 상온에서 90~120분 동안 방치하였다. 표피층을 조직에서 분리하고, 증류수로 세척한 후 여과지를 이용하여 물기를 제거한 뒤 중량을 측정하였다. 거의 건조된 각질을 블리-다이어 용액(Bligh-Dyer, 메탄올: 클로로포름: 물= 4: 2: 1.6) 5㎖에 넣어 교반 후 하루 동안 방치한 다음, 부유액을 모으고, 다시 각질층을 포함하고 있는 침전물에 클로로포름: 메탄올(2:1) 용액을 4㎖ 첨가하여 교반한 후, 별도로 모아 둔 부유액과 함께 여과지로 여과하였다. 여과액에 다시 증류수 6㎖을 넣어 교반한 후, 2000rpm으로 10 분간 원심분리한 하층액만을 취해 35℃에서 질소가스로 건조시키고 클로로포름: 메탄올(2:1) 용액 일정량에 녹여 보관하였다. 각 시료들을 CAMAG사의 ATS (Automated TLC sampler)를 이용하여 실리카겔 박층 크로마토그래피(Silicagel Thin Layer chromatography) 판에 점적하고, 자동화 다중 전개조(AMD, Automated Multiple Development)를 이용하여 표 1과 같은 조성비의 전개 용매로 전개하였다.

[표 1] 박층 크로마토그래피 전개 용매 조건

	전개 용매조성(㎖)	용매이동거리(㎝)
1차	클로로포름 50 아세톤 20 메탄올 30	5
2차	클로로포름 70 아세톤 5 메탄올 25	7
3차	클로로포름 72 에테르 6 에틸아세테이트 20 메탄올 2	9

박층 크로마토그래피 판을 전개 시킨 후 덴시토메터(TLC Scanner-II, CAMAG 사: densitometer)를 이용하여 570㎚ 파장에서 각 밴드(band)의 크기를 측정하였다. 비처치군의 지질생성량을 100%로 환산하여 각처치군의 지질 생성량을 도 9에 나타내었고, 비처치군의 세라마이드 생성량을 100%로 환산한 각 처치군의 세라마이드 생성량은 도 10에 나타내었다. 도 9에서 비교한 전체의 지질 증가량은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의하여 지질이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 표피에 존재하는 지질성분 중 가장 많은 양을 차지하는 세라마이드의 경우에도, 도 10에서 보는 것과 같이 세라마이드의 생성량이 비처치군이나 vehicle 처치군에 비해 현저하게 증가되는 것을 알 수 있었다. 또한 아세톤에 의한 피부장벽의 손상과 피부표피층의 지질이 많이 소실되어 있는 상태에서 장벽손상이 회복되어 지질의 재생산이 월등히 증가됨을 볼 수 있었다.

[시험예 7] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 인체에서 피부 보습력 증가 측정

실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1에서 제조한 화장수의 피부 보습력 개선 효과를 측정하였다. 피부건조증을 나타내는 50-60대의 성인 남,녀 50명을 5개조로 나누어, 각 조에 비교예 1과 실시예 1 내지 실시예 4의 화장수를 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점, 그리고 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 코니오미터로 피부 수분량을 측정하였다. 하기 표 2는 시험개시 직전에 측정한 코니오미터 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다. 이와 별도로 시험을 종료한 시점에 시험 대상자들로 하여금 설문지를 작성하게 하여 기기적인 평가와 동시에 주관적인 효능 평가도 실시하였다.

[표 2] 피부 수분 증가율

도포군	수분증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
비교예 1	29	32	34	12
실시예 1	34	36	41	35
실시예 2	36	41	44	37
실시예 3	42	46	52	43
실시예 4	45	50	57	48

코니오미터는 표피의 전기전도도 값을 측정하여 피부에 존재하는 수분량을 측정하는 피부수분측정기이다. 프럭토스 1,6-디포스페이트가 함유된 실시예 1-4의 물질을 도포한 군에서는 비교예 1을 도포한 군에 비해서 피부수분량이 더 증가되었으며, 그 정도는 농도의존적이었다. 또한, 시험물질의 도포를 중지한 2주 후에 피부수분을 측정한 6주 경과 후의 수치가 1주~2주 경과후의 수치와 유사하게 나타나, 시험물질을 도포하지 않아도 어느 정도는 프럭토스 1,6-디포스페이트 도포에 의해 피부수분이 지속적으로 유지됨을 알 수 있었다.

이와 동시에 설문조사를 통해서도 프럭토스 1,6-디포스페이트가 함유된 실시예 1 내지 실시예 4를 도포한 경우 피부건조증이 개선됨을 확인할 수 있었다(표 3).

[표 3] 피부 건조증 개선효과 설문조사결과

도포군	응답자 수 (인)
	매우 양호	양호	보통	미흡
비교예 1	1	3	4	2
실시예 1	2	4	2	2
실시예 2	1	6	3	0
실시예 3	3	8	1	0
실시예 4	5	5	0	0

[시험예 8] 접촉성 피부염 개선 효과

상기 실시예 5 내지 실시예 8에서 제조된 에멀젼 제형으로 계면활성제에 의한 접촉성 피부염 개선 효과를 비교하였다.

접촉성 피부염 개선 효과는 20-30대의 자원자 25명을 대상으로 홍반(Erythema) 발생정도로 측정하였다. 자원자의 전박부 5개소에 3% SLS(Sodium Lauryl Sulphate) 용액을 24시간 폐쇄첩포하여 계면활성제에 의한 접촉성피부염을 유발시키고, 첩포를 제거한 후, 각 자원자들에게 비교예 2와 실시예 5 내지 8을 홍반이 발생한 5개소에 매일 2회씩 1주간 도포하였다. 홍반의 발생정도는 첩포를 제거한 직후와 도포시작 1, 2, 4, 7일 후에 육안으로 표 4의 기준에 의거하여 평가하였다. 표 5에 나타난 바와 같이 SLS에 의해 발생된 접촉성피부염 증상이 프럭토스 1,6-디포스페이트 처치에 의하여 더 빨리 완화되는 것을 알 수 있다.

[표 4] 육안평가 기준

증상	점수
홍반이 전혀 없음	0
아주 가벼운 홍반	1
분명한 홍반	2
약간 심한 홍간	3
심한 홍반	4

[표 5] SLS에 의한 피부염 유발 후 회복력

처치군	피부염 증상 정도 (점수)
	첩포제거 직후	1 일	2 일	4 일	7 일
비교예 2	2.4	1.9	1.8	1.6	1.0
실시예 5	2.2	1.6	1.5	1.2	0.5
실시예 6	2.4	1.3	1.3	0.6	0.3
실시예 7	2.5	1.4	1.2	0.5	0.2
실시예 8	2.3	1.2	0.7	0.4	0.3

[시험예 9] 아토피성 피부염 개선 효과

아토피 증상 개선효과 측정시험은 전부터 아토피 증상(가려움, 진무름, 심한 건조증)이라 진단 받았거나, 육안관찰로 아토피 유사 증상을 보이는 10대∼50대 사이의 50명을 대상으로 하여 상기 비교예 2 및 실시예 5 내지 실시예 8을 그룹당 10명에게 제공하고, 아토피 증상을 보이는 부위에 4주 동안 도포하게 하였다. 효능 평가는 4주 처치 후 설문 조사를 통해 개선정도를 본인이 주관적으로 판단하게 하였고 그 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6] 아토피 개선 평가

도포군	응답자 수 (인)
	매우 양호	양호	보통	미흡
비교예 2	1	4	3	2
실시예 5	2	5	2	1
실시예 6	1	7	2
실시예 7	3	6	1
실시예 8	5	5

평가 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트가 함유된 제형을 도포한 실시예 5 내지 실시예 8 처치군이 대조군인 비교예 2의 도포군보다 전반적으로 가려움이나 짓무름 등의 아토피 증상이 더 개선되었음을 알 수 있었다.

이상의 실험예 및 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명이 제공하는 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하는 피부외용제조성물은 각질세포의 분화를 촉진하고, 표피 세포의 이상증식을 억제함으로써, 피부장벽손상 후의 회복을 촉진하고, 피부의 보습기능을 증가시켜, 피부건조증은 물론 아토피나 접촉성 피부염 등의 피부질환을 예방하거나 그 증상을 개선시키는 치료제로 사용할 수 있었다.

Claims (6)

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3. 삭제
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5. 프럭토스 1,6-디포스페이트; 또는

   프럭토스 1,6-디포스페이트의 바륨염, 디바륨염, 소디움염, 디소디움염, 트리소디움염, 테트라소디움염, 칼륨염, 칼슘염, 디칼슘염, 디마그네슘염 및 트리싸이클로헥실아민염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프럭토스 1,6-디포스페이트 유도체;

   를 유효성분으로 함유하는 피부 보습 증진용 피부 외용제 조성물.
6. 삭제

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