KR100836033B1

KR100836033B1 - 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유한미백용 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR100836033B1
Application number: KR1020020029401A
Authority: KR
Inventors: 황재성; 최현정; 신현정; 안수미; 김지현; 이종찬; 이병곤; 장이섭
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2002-05-27
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2008-06-09
Also published as: KR20030092204A

Abstract

본 발명은 멜라닌 생성을 억제하는 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate) 또는 그 유도체를 함유하는 미백용 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부세포를 이용한 실험 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트가 자외선에 의한 글루타치온 생성감소를 억제하였고, 멜라닌 색소의 합성양을 감소시켰으며 동시에 자외선에 의한 세포 티로시나아제(tyrosinase) 활성증가를 방지하는 효능을 확인하였다. 또한 동물시험을 수행한 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트가 자외선에 의해 유도된 색소침착을 개선하는 효과를 확인하였고, 인체시험에서 자외선에 의한 색소침착을 억제함을 확인하였다. 따라서, 프럭토스 1,6-디포스페이트를 함유하는 조성물은 멜라닌 생성을 줄이고, 자외선이나 염증에 의한 색소 침착을 차단할 수 있다.

프럭토스 1,6-디포스페이트, 미백제, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 바륨염, 마그네슘염, 트리사이클로 헥실아민염

Description

프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유한 미백용 피부외용제 조성물{Whitening composition for external applications to the skin containing D-fructose 1,6-diphosphate or derivatives thereof}

도 1은 자외선 조사후 멜라닌 형성세포에서 글리타치온의 양의 변화를 보여준다.

도 2는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 보여준다.

도 3은 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 티로시나아제 활성 억제 효과를 보여준다.

도 4는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 멜라닌 생성 저해 효과를 보여준다.

도 5는 기니아 피그를 통한 주별 미백효과를 보여준다.

도 6은 기니아 피그를 통한 종합 미백효과를 보여준다.

도 7은 기니아 피그를 통한 주별 미백효과(크로마미터)를 보여준다.

도 8은 기니아 피그를 통한 종합 미백효과(크로마미터)를 보여준다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다. 이렇게 피부 내,외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 되고, 또한 레져 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나게 되었다. 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제 개발이 필요하게 되었고 그 동안 많은 노력들이 이루어졌다.

멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나아제(tyrosinase)의 작용이 가장 중요한 것으로 알려져 있다. 티로시나아제는 구리를 조효소로 갖는 효소로서, 사람을 포함하여 각종 동물, 식물, 미생물에 넓게 분포하며, 아미노산 중 L-티로신(tyrosine)을 L-도파(L-DOPA)로 하이드록실화 하고, 이를 다시 도파퀴논 (dopaquinone)으로 산화시키는 폴리페놀 옥시다제(polyphenol oxidase)의 일종이다. 이후 도파퀴논은 여러 단계의 산화와 중합 과정을 거친 후 단백질과 결합하여 멜라닌을 생성하게 되는데, 멜라닌 과생성 및 침착 저해를 통한 피부 미백 및 피부암 예방을 위한 연구의 대부분이 티로시나아제의 활성 저해에 초점을 맞추고 있다.

현재까지 개발된 티로시나아제 활성 저해제로는, 티로시나아제 활성자리의 구리 이온에 대한 킬레이트 형성 물질, 퀴논류를 페놀류로 환원시키는 비타민 C(ascorbic acid) 또는 코지산(kojic acid) 등의 환원제, 그리고 글루타치온 (glutathione) 등이 알려져 있다. 하이드로퀴논은 대표적인 미백제로 사용되지만 티로시나아제에 대해 강한 저해 효과를 나타내는 반면, 멜라닌 세포의 변성 또는 치사를 유발하는 등, 세포 독성으로 인한 피부자극 또는 피부염증을 유발하므로 그 이용에 제한이 생기는 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 세포의 내인적인 산화/환원을 조절함으로써 세포내 산화적 스트레스를 조절하는 물질이 멜라닌 생성을 저해할 수 있다고 생각하여 이를 이용한 미백제를 개발하고자 하였다. 그 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트(D-fructose 1,6-diphosphate)가 자외선이나 염증 등으로 인한 멜라닌의 생성을 억제할 수 있음을 발견하고, 미백제로서 사용 가능하다는 것을 인지하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 멜라닌 생성을 억제하는 프럭토스 1,6-디포스페이 트를 사용하여 세포독성이 없는 미백용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 프럭토스 1,6-디포스페이트의 유도체를 함유하는 미백용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 멜라닌 생성을 억제하는 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하는 미백용 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 프럭토스 1,6-디포스페이트는 미국 시그마사(St. Louis, MO, USA)에서 제조한 제품으로, 본 발명에서는 이 프럭토스 1,6-디포스페이트를 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼20 중량%를 함유한다.

원래 프럭토스 1,6-디포스페이트는 해당과정(glycolysis)상의 고에너지 대사 중간체로서 당대사와 관련된 여러 효소들의 알로스터릭 조절제(allosteric regulator)로 작용하며, 종래 심혈관계 보호 작용 등의 다양한 생리활성을 지니고 있는 것으로 알려져 사용되었으나 본 발명자들은 이를 화장료에 응용한 것이다.

또한 본 발명에서 사용하는 프럭토스 1,6-디포스페이트 유도체는 프럭토스 1,6-디포스페이트 염으로서, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 바륨염, 마그네슘염 및 트리사이클로헥실아민염에서 1종 이상 사용할 수 있고, 그 사용량은 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼20 중량%가 적당하다.

본 발명의 피부외용제 조성물은 피부에 적용할 수 있는 통상적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 예를 들면 화장수, 크림, 로션, 스킨로션, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품뿐만 아니라 액상비누, 고형비누, 세안 폼(foam)과 같은 인체세정제 등으로 제형화될 수 있다. 이들 각 제형은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

이하 제형예 및 시험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[제형예 1] 로션제형

성 분	함량(중량%)
성 분	대조군	실시예 1	비교예 1
프럭토스 1,6-디포스페이트	-	1.00	-
비타민C	-	-	1.00
밀납	4.00	4.00	4.00
폴리솔베이트	1.50	1.50	1.50
솔비탄세스퀴올레이트	0.70	0.70	0.70
유동파라핀	5.00	5.00	5.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.00	5.00	5.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
부틸렌글리콜	3.00	3.00	3.00
프로필렌글리콜	3.00	3.00	3.00
카르복시비닐폴리머	0.10	0.10	0.10
트리에탄올아민	0.20	0.20	0.20
방부제	적량	적량	적량
색소	적량	적량	적량
향료 적량	적량	적량	적량
정제수	to 100	to 100	to 100

[시험예 1] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 글루타치온(glutathione, 이하 "GSH"라 합니다) 생성 촉진효과

사람의 멜라닌 형성세포(melanocyte)를 직경 10㎝ 형의 원형 세포배양 플레이트에 5×10⁵개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 18시간 후, 배양액을 제거한 후 각 well에 2㎖의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 멜라닌형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki社, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 well에 각질형성세포 배양액을 5㎖를 첨가하였다. 여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트를 다시 처리하고 일정 시간대별로 자외선 자극에 의해 변화하는 GSH의 양을 정량하였다. GSH 정량은 GSH가 5,5-디티오비스-2-니트로벤조산(5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid)에 의해 환원되면서 생성되는 5-티오-2-니트로벤조에이트(5-thio-2-nitrobenzoate)의 흡광도를 측정하는 것을 원리로 하는 Akerboom과 Sies의 방법에 따라 수행하였다(Akerboom & Sies, 1981, Methods Enzymol. Vol 77, pp373-382).

도 1은 프럭토스 1,6-디포스페이트에 의해 피부의 멜라닌세포의 GSH 양이 증가하였음을 보여준다. 피부 세포에서 GSH는 높은 환원력을 보유하고 있으므로 자외선에 의한 세포 손상이 유발되었을 때 발생하는 ROS 양을 줄일 수 있다. 도 1의 결과로부터 프럭토스 1,6-디포스페이트가 멜라닌 세포내의 산화적 손상을 억제하는 물질임을 알 수 있었다.

[시험예 2] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 멜라닌색소 합성억제효과

사람의 표피 조직에서 분리한 멜라닌형성세포(keratinocyte)를 6well 형 세포배양 플레이트의 각 well에 2×10⁵개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 18시간 후, 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 마이크로리터의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki社, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 well에 멜라닌형성세포 배양액(melanocyte growth media, Clonetics, BioWhittacker社, MD, USA) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트와 [³H]3,4-디하이드록시페닐알라닌([³H]3,4-dihydroxyphenylalanine)을 2.5 Ci/well이 되도록 첨가하고 48시간 배양하였다. 멜라닌 생합성의 측정은 배양액을 제거하고 세포를 수확한 다음, [³H]3,4-디하이드록시페닐알라닌이 도입된 멜라닌을 유리 필터(glass filter)에 부착시켜 방사능(radioactivity)을 액체섬광계측기(liquid scintillation counter)로 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여지는 바와 같이 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의한 멜라닌 생성을 10mM의 농도에서는 약 86.3%, 1mM에서는 약 64.7% 억제하였다. 그러므로, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의한 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[시험예 3] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 티로시나아제 활성 저해 효과

사람의 표피 조직에서 분리한 멜라닌형성세포(keratinocyte)를 6well 형 세포배양 플레이트의 각 well에 2×10⁵개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 18시간 후, 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 마이크로리터의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UV B) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki社, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 well에 멜라닌형성세포 배양액(melanocyte growth media, Clonetics, BioWhittacker社, MD, USA) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 프럭토스 1,6-디포스페이트와 [³H]티로신([³H]tyrosine)을 1Ci/well이 되도록 첨가하고 24시간 배양하였다. 티로시나아제 활성측정은 배양액에 0.2% BSA와 TCA를 가하여 반응을 정지시키고 원심 분리하여 상층액을 분리한 다음, 차콜(charcoal)을 넣고 상온에서 1시간 반응시킨 후 원심 분리하여 제거하고, 상층액을 취한 다음, 방사능량을 측정하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 프럭토스 1,6-디포스페이트는 자외선에 의해 증가되는 티로시나아제의 활성을 억제하였다.

[시험예 4] 프럭토스 1,6-디포스페이트 유도체들의 자외선에 의한 멜라닌 생성저해 효과

프럭토스 1,6-디포스페이트의 유도체들에 의한 멜라닌 생성 저해효과가 프럭토스 1,6-디포스페이트와 유사한지 평가하기 위하여 시험예 2와 동일한 방법으로 유도체들(바리움, 디바리움, 칼슘, 디칼슘, 포타슘, 소디움, 디소디움, 트리소디움, 테트라소디움, 디마그네슘 및 트리사이클로헥실아민)을 1mM 농도에서 시험한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 효과는 유사하였다.

[시험예 5] 기니아 피그(guinea pig)에서 프럭토스 1,6-디포스페이트(F-1,6-DP)의 멜라닌 생성억제효과

<실험 방법>

몸무게가 500g 내외인 갈색 기니아 피그의 등 부위 털을 제거하고 펜토바비탈(pentobarbital) 30 mg/kg로 마취시킨 후 500mJ의 자외선으로 태웠다. 태우는 부위는 지름 1㎝ 정도의 동그라미가 되게 하였다. 같은 방법으로 같은 부위에 일주일에 한번씩 3번 자외선 조사하였다. 마지막 자외선 조사가 끝나면 그 다음날부터 아침, 저녁으로 동그라미 하나 당 시료를 5ℓ씩 도포하였다. 시료는 비이클(vehicle, 에탄올: propylene glycol = 8:2)에 녹여서 만들었다. 태운 부위의 색깔 변화는 일주일에 한 번씩 크로마미터(chromameter) 방법과 눈으로 색깔의 차이를 관찰하여 상대값을 부여하는 방법으로 복수 측정하고 사진을 찍었다.

<실험 결과1>

도포를 시작한 주(0주)부터 각 주별로 8주 동안, 비처리군(아무 것도 바르지 않은 동그랗게 태운 부위)를 기준으로 하여 미백 효과를 보이는 정도에 따라 상대적으로 0.5, 1, 2, 3의 수치를 부여하였다. 도 5는 실험 동물 4마리를 각각 육안 판정하여 평균낸 값을 주별로 나타낸 것이고, 도 6은 8주 동안의 판정 수치를 종합하여 평균값으로 나타낸 것이다. 도 5를 보면 프럭토스 1,6-디포스페이트를 바른 동그라미의 경우 대조군(비이클을 바른 동그라미)에 비해 2-3주 사이 확실한 미백 효과를 나타내는 것을 알 수 있고, 시료 도포 중 부작용은 거의 보이지 않았다. 도 6에서 8주 동안의 육안 판정치를 종합해 본 결과, 프럭토스 1,6-디포스페이트는 대조군에 비해 약 2.3배 정도의 높은 미백 효과를 나타내었다.

<실험 결과 2>

도포를 시작한 주(0주)부터 각 주별로 8주 동안 크로마미터를 사용하여 각 도포 부위의 음영 정도를 수치화하였다. 시료를 도포하는 원 내부를 벗어나지 않는 범위에서 각각 3번씩 측정하고 평균을 내었다. 도 7은 실험 동물 4마리를 각각 크로마미터로 측정하고 각 시료별 평균값을 0주-8주까지 나타낸 것이고, 도 8은 각 시료에 대한 8주 동안의 측정 수치를 종합하여 평균값으로 나타낸 것이다. 디리놀릴시스타민은 위에서 제시한 육안 판정 결과와 같이 도포 2주 이후부터 계속해서 증가하는 미백효과를 보이고 있다(도 7). 상기 제형예 1에서 8주간의 결과를 종합해서 살펴보면 역시 비처리군이나 대조군에 비해 높은 수치를 나타내고 있는 것을 알 수 있다.

[시험예 6] 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 색소침착 억제 효과

실험 시점에서 한달 이전에 비스테로이드성 항염증제 및 기타 스테로이드 제제를 복용한 경력이 없는 건강한 자원자를 대상으로 프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선(UV B)에 의한 색소 침착 억제 효과를 측정하였다

건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 윗팔뚝 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 2배 정도의 자외선(UV B)을 SE 램프(파장 290∼320㎚, Toshiba)로 조사하여 색소침착을 유도하였다. 상기 각 실험 제형들은 하기 표 1의 비교예 1 및 실시예 1의 처방에 따라 제조하여 자외선을 조사하기 1시간 전과 자외선 조사 직후 도포하였다. 피부색을 자외선 조사 후 72시간 및 120시간에 평가하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

프럭토스 1,6-디포스페이트의 자외선에 의한 피부 색소침착 억제효과

실험군	L 값
실험군	72시간	120시간
대조군	48	43
실시예1	54	49
비교예1	50	45

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이 프럭토스 1,6-디포스페이트를 함유한 피부외용제는 자외선에 의한 색소 침착을 억제함을 알 수 있다.

피부세포를 이용한 실험 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체가 자외선에 의한 글루타치온 생성감소를 억제하였고, 멜라닌 색소의 합성양을 감소시켰으며 동시에 자외선에 의한 세포 티로시나아제(tyrosinase) 활성증가를 방지하는 효능을 확인하였다. 또한 동물시험을 수행한 결과 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체가 자외선에 의해 유도된 색소침착을 개선하는 효과를 확인하였고, 인체시험에서 자외선에 의한 색소침착을 억제함을 확인하였다. 따라서, 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체를 함유하는 조성물은 멜라닌 생성을 줄이고, 자외선이나 염증에 의한 색소 침착을 차단할 수 있었다.

Claims

프럭토스 1,6-디포스페이트; 또는 프럭토스 1,6-디포스페이트의 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 바륨염, 마그네슘 및 트리사이클로헥실아민염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프럭토스 1,6-디포스페이트 유도체;를 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼20 중량%로 함유하는 미백용 피부외용제 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체는 자외선에 의한 세포 손상을 억제시킴으로써 색소침착을 예방시키는 것을 특징으로 하는 미백용 피부외용제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 프럭토스 1,6-디포스페이트 또는 그 유도체는 글루타치온 생성 감소 억제, 멜라닌 생성 억제 또는 티로시나아제 활성 억제 작용을 하는 것임을 특징으로 하는 미백용 피부외용제 조성물.
삭제