KR100873640B1 - ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 화합물, ＰＣＲ생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 칩, 및 그 칩을 이용하여ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ를 검출하는 방법 - Google Patents

ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 화합물, ＰＣＲ생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 칩, 및 그 칩을 이용하여ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 그 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 자기조립 박막층을 형성하고 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출할 수 있는 ds-DNA 검출용 칩, 및 상기 ds-DNA 검출용 칩을 이용하여 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure 112007025570864-pat00001
상기 화학식 I에서,
X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고,
Y는 ds-DNA 인터컬레이터이고,
n은 1 내지 9의 정수이며,
m은 1 내지 8의 정수이다.

Description

ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 화합물, ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ 검출용 칩, 및 그 칩을 이용하여 ＰＣＲ 생성물의 ｄｓ-ＤＮＡ를 검출하는 방법{Compounds for detecting ds-DNA in PCR products, chips for detecting ds-DNA in PCR products, and processes for detecting ds-DNA in PCR products using the same}
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라, 금 기판상에 화학식 I의 화합물이 고정되어 자기조립 단분자층을 형성한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 단면의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따라, 금 기판상에 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ⅱ의 화합물의 약 1:9 혼합물이 고정되어 혼합된 자기조립 단분자층을 형성한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 단면의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 화학식 I에 해당하는 화합물 1의 NMR 데이터이다.
도 4는 화학식 Ⅱ에 해당하는 화합물 2의 NMR 데이터이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율을 다양하게 하여 제조한 PCR 생성물 중의 ds-DNA 검출용 칩에 대해 PCR 생성물을 적용하기 전 후의 SPR 공명각의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합 물에 대한 비율을 1:9로 하여 제조한 PCR 생성물 중의 ds-DNA 검출용 칩에 대해 ss-DNA를 적용하기 전 후의 SPR 공명각의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율을 1:0, 1:9 및 0:1(비교예 1)로 하여 제조한 PCR 생성물 중의 ds-DNA 검출용 칩에 대해, 자기조립 박막층의 생성 전후, 정제된 PCR 생성물 적용 전후, 및 ss-DNA 적용 전후의 공명각의 변화를 측정한 결과를 나타낸 표이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율을 1:9 및 0:1(비교예 1)로 하여 제조한 PCR 생성물 중의 ds-DNA 검출용 칩에 대해, PCR 완충용액, 정제된 PCR 생성물, 및 비정제 PCR 생성물을 적용하기 전 후의 SPR 공명각 변화를 측정한 결과를 나타낸 표이다.
본 발명은 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하기 위한 신규 화합물, 그 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하기 위한 칩, 및 그 칩을 이용하여 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 형광 염료를 사용하지 않고 PCR에 의해 증폭된 이중 나선형 구조의 DNA 즉, ds-DNA를 검출하는데 사용될 수 있는 신규 화합물, 그 신규 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 형광물질을 사용하지 않고 검출할 수 있는 칩, 및 그 칩을 이용하여 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 형광물질을 사용하지 않고 검출하는 방법에 관한 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR' 이라고 한다)은 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시키는 반응으로서, PCR에 의해 원하는 산물이 얻어졌는지 확인하기 위해 이중가닥 DNA(ds-DNA)를 검출하는 작업이 필요하다. 일반적으로 PCR에 의해 증폭된 ds-DNA를 검출하기 위한 방법으로서 ds-DNA에 인터컬레이팅 되는 형광물질을 사용하거나 증폭 DNA 산물의 일부 특정염기서열과 상보적으로 결합 가능한 형광 표지 프로브를 이용하여 ds-DNA에 결합된 형광물질을 광학적으로 검출하는 방법을 이용한다. 그러나, 이러한 방법은 형광물질을 사용하여야 하므로 사용자의 편의성이 떨어지고 고가의 형광물질과 고가이면서 크기가 큰 광학 장비를 사용하여야 하는 단점이 있다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 최근 들어 많은 연구자들이 형광물질 등의 표지물질 없이 유전자를 검출하는 라벨-프리(label-free) 유전자 검출 기술을 연구하고 있다. 그리하여 개발된 라벨-프리 유전자 검출 기술로는 SPR(surface plasmon resonance technology), SAW(surface acoustic wave), QCM(quartz crystal microbalance), 또는 바이오FET(field effect transistor)를 이용한 방법이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 PCR 반응 후의 생성물이 포함하고 있는 ds-DNA 이외의 이물질인 폴리머라제, dNTP, 프라이머 등을 제거하는 과정을 거쳐야 하기 때문에 번거롭고 시간을 많이 소비해야 하는 단점이 있다. 또한, 바이오FET와 같이 유전자가 갖는 음전하를 이용하여 전기적으로 검출하는 방법의 경우는 PCR 시에 이용된 완충용액 자체가 갖는 염의 전하가 노이즈(noise)로 작용하여 오차가 발생되는 등의 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 형광물질을 사용하지 않고, PCR 생성물을 정제할 필요도 없이 PCR에 의해 증폭된 ds-DNA를 검출하는 방법에 대해 연구한 결과, ds-DNA를 특이적으로 캡쳐할 수 있으면서, PCR 생성물 중의 ds-DNA 이외의 이물질의 비특이적 결합을 저지할 수 있는 새로운 화합물을 개발하고, 그 화합물을 고체 지지체 상에 고정시킨 ds-DNA를 검출용 칩을 제작함으로써, PCR 생성물을 형광물질을 사용하지 않으면서도 정제 과정을 수행할 필요도 없이 간편하게 PCR에 의해 증폭된 ds-DNA를 검출할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 형광 물질을 사용하지 않으면서 정제할 필요도 없이 검출할 수 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 ds-DNA를 검출할 수 있는 신규 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 형광 물질을 사용하지 않으면서 정제할 필요 없이 검출할 수 있는 ds-DNA 검출용 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ds-DNA 검출용 칩을 이용하여 형광 물질을 사용하지 않으면서 정제할 필요 없이 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공 한다:
[화학식 I]
Figure 112007025570864-pat00002
상기 화학식 I에서,
X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고,
Y는 ds-DNA 인터컬레이터이고,
n은 1 내지 9의 정수이며,
m은 1 내지 8의 정수이다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
고체 지지체; 및
상기 고체 지지체 상에 형성된 상기 화학식 I의 화합물의 자기조립 박막층을 포함하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩을 제공하다.
본 발명은 또한 더 나아가
상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 자기조립박막을 PCR 생성물과 접촉시켜 반응시키는 단계;
상기 PCR 생성물과 반응한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩을 세척하는 단계; 및
상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 자기조립 박막층에 대해 상기 PCR 생성물과의 반응 전후의 물리화학적 변화를 측정함으로써 인터컬레이터와 결합된 ds-DNA의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, PCR 생성물의 ds-DNA를 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 형광 물질을 사용하지 않으면서 정제할 필요도 없이 검출할 수 있도록 하기 위해 PCR 반응 산물인 ds-DNA를 특이적으로 캡쳐하고 ds-DNA 이외의 물질과는 결합하지 않도록 하는 신규 화합물을 개발하였다. 그러한 신규 화합물로서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112007025570864-pat00003
상기 화학식 I에서,
X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고,
Y는 ds-DNA 인터컬레이터이고,
n은 1 내지 9의 정수이며,
m은 1 내지 8의 정수이다.
상기 화학식 I의 화합물은 세 가지의 중요한 기능을 담당하는 작용기 X, Y 및 3 개 내지 10 개의 에틸렌글리콜기를 포함하고 있다. 상기 X는 티올 또는 C1-C3 알콕시로 치환된 실란으로서, 고체 지지체 상에서 자기 조립 박막을 형성할 수 있는 작용기이다.
Y는 ds-DNA 인터컬레이터로서 ds-DNA를 다른 물질 즉 ss-DNA나 다른 프라이머, 폴리머라제, d-NTP에 대해서 차별적으로 캡쳐할 수 있는 그룹이다. 여기에서 "인터컬레이터"라 함은 ds-DNA 염기쌍 사이로 삽입될 수 있는 물질을 말한다. 이러한 인터컬레이터로서 사용될 수 있는 물질은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 그 종류 또한 다양하다. 따라서, 상기 화학식 I에서 Y는 ds-DNA의 염기쌍 사이로 삽입됨으로써 ds-DNA를 특이적으로 캡쳐할 수 있는 물질이기만 하면 가능하다. 이러한 ds-DNA 인터컬레이터의 예로는 벤젠고리 2 내지 6개를 포함하며 이들 벤젠고리는 펜던트 방법으로 연결되어 있거나 벤젠고리들 일부 혹은 전부가 융합되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 ds-DNA 인터컬레이터는 파이렌, 안트라센, 페난트렌, 나프탈렌, 크라이센, 테트라센, 아크리딘, 에티디움, 프로플라빈, 도노마이신, 독소루비신, 또는 탈리도마이드를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 파이렌 또는 안트라센을 포함한다.
상기 화학식 I에서 X 및 Y를 연결하는 링커인 3 개 내지 10 개의 에틸렌글리콜기는 이후에 화학식 I의 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어, 고체 지지체 표면을 친수성으로 만들어 주어, PCR에 이용되어 PCR 생성물에 ds-DNA와 함께 함유되어 있는 이물질인 폴리머라제, dNTP, 및 프라이머가 고체 지지체의 표면에 비특이적인 흡착에 의한 결합을 억제하는 역할을 한다. 이러한 폴리에틸렌글리콜기의 존재에 의해 PCR 생성물의 정제 없이 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 선택적으로 검출하는 것이 가능하다.
상기 화학식 I의 화합물은 유기화학분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 유기 화합물 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 일 구현예에 따르면, X가 티올이고, Y가 파이렌인 상기 화학식 I의 화합물인 화합물 1a은 하기 일련의 반응식을 거쳐 제조할 수 있다:
Figure 112007025570864-pat00004
상기 반응식에 따르면, 화합물 Ia는 상기 화합물 Ⅳ를 출발물질로 하여 제조할 수 있다. 우선 화합물 Ⅳ을 1-히드록시파이렌과 반응시켜 화합물 Ⅳ의 히드록시 말단에 파이렌이 도입된 화합물 Ⅷ을 생성시킨다. 촉매로서 PPH3 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트(DIAD)의 존재 하에서 반응시킬 수 있으며, 용매는 상기 반응에 영향을 주지 않는다면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 톨루엔이 이용될 수 있다. 실온에서 2 일간 교반하면서 반응시킴으로써 화합물 Ⅸ을 수득할 수 있다.
파이렌이 도입된 화합물 Ⅷ을 티오아세트산과 반응시켜 알케닐 말단에 아세틸 티오기를 도입할 수 있다. 이러한 아세틸티오기의 도입은 이후에 말단에 티올기를 형성시키기 위한 것이다. 이 반응에서는 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산)이 촉매로서 사용될 수 있으며, 용매는 상기 반응에 영향을 주지 않는다면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 테트라하이드로퓨란이 이용될 수 있다. 자외선을 조사하면서 실온에서 밤새 교반하면서 화합물 Ⅸ를 생성시킬 수 있다.
상기 화합물 Ⅸ는 염기로 아세틸티오기의 아세틸 기를 이탈시킴으로써 화합물 1a를 생성시킬 수 있다. 용매 중에서 화합물 Ⅸ를 염기의 존재 하에서 실온에서 밤새 교반하여 반응시킨 다음, 산으로 중화시킴으로써 화합물 Ia를 생성시킬 수 있다. 이때 사용 가능한 염기로는 예를 들어 소듐메톡사이드, 소듐 에톡사이드 등이 이용될 수 있으며, 중화를 위한 산은 염산, 황산 등의 임의의 산이 이용될 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 화합물 Ia의 제조방법은 당해 유기 화학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 지식에 따라 제조될 수 있는 것이며, 화합물 Ia를 포함한 화학식 I의 화합물 또한 당해 유기 화학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있는 지식에 따라 제조될 수 있다.
상기 화학식 I의 화합물은 고체 지지체 상에 고정되어 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서,
고체 지지체; 및
상기 고체 지지체 상에 형성된 상기 화학식 I의 화합물의 자기조립 박막층을 포함하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩을 제공한다.
상기 고체 지지체는 특별히 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 I의 화합물이 고체 지지체 상에 자기조립 박막층을 형성할 수 있거나 고체 지지체 상에 부가적인 가공을 함으로써 화학식 I의 화합물의 자기조립 박막층을 형성할 수 있다면 어떤 재질로 된 기판이라도 가능하다. 화학식 I의 화합물에서 X가 티올기일 경우, 고체 지지체는 금 또는 백금으로 이루어지는 것이 바람직하며, X가 알콕시실란기일 경우 고체 지지체는 실리콘 또는 유리로 이루어지는 것이 바람직하며, 이러한 경우 화학식 I의 화합물은 고체 지지체 상에 자기조립 단분자층이 형성될 수 있다.
상기 고체 지지체의 형태 및 크기 또한 특별히 제한되는 것은 아니며, 평판, 웨이퍼, 화이버, 비드, 입자, 사슬, 겔, 시트, 구, 패드, 필라, 슬라이드, 박막, 플레이트 등 어느 형태라도 가능하며, 바람직하게는 평판 또는 비드의 형태를 가지며, 가장 바람직하게는 평판의 형태를 갖는다.
본 발명의 일 구현예 따라, 상기 화학식 I에서 X가 티올기이고, 고체 지지체가 금 기판일 경우, 단순히 화학식 I의 화합물을 에탄올 등의 용액에 녹인 후 금 기판의 표면을 그 용액에 장시간(예: 밤새) 담그어 방치하는 것만으로 금 기판에 화학식 I의 화합물의 자기조립 단분자층이 형성될 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따라 상기 화학식 I에서 X가 트리메톡시실란이고, 고체 지지체가 실리콘 혹은 유리 기판일 경우, 화학식 I의 화합물을 에탄올 등의 용액에 녹인 후 실리콘 기판 또는 유리 기판을 그 용액에 담가둔 다음, 세척하고 오븐에서 베이킹 함으로써 기판 상 화학식 I의 화합물의 자기조립 단분자층이 형성될 수 있다. 고체 지지체 상에 화학식 I의 화합물의 박막층을 형성시키는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 바에 따라 당업자가 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 금 기판상에 화학식 I의 화합물이 기판 상에 고정되어 자기조립 단분자층을 형성한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 단면의 모식도를 도 1에 나타내었다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩에서 상기 화학식 I의 화합물과 함께 하기 화학식 Ⅱ의 화합물이 고체 지지체 상에 자기조립 박막층을 형성할 수 있다:
[화학식 Ⅱ]
Figure 112007025570864-pat00005
상기 화학식 Ⅱ에서,
X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고,
n은 1 내지 9의 정수이며,
m은 1 내지 8의 정수이다.
상기 화학식 Ⅱ의 화합물이 화학식 I의 화합물과 함께 고체 지지체 상에 박막을 형성하면, 화학식 I의 화합물 사이에 화학식 Ⅱ의 화합물이 배치되어 화학식 I의 화합물이 적절한 간격을 두고 배치될 수 있으며, 이러한 경우 ds-DNA를 선택적으로 캡쳐하여 ds-DNA를 검출할 수 있는 능력이 향상될 수 있다. 이와 같이, 화학식 I의 화합물이 적절한 간격을 두고 배치되는 경우가 화학식 I의 화합물이 너무 조밀하게 배치되는 경우보다 ds-DNA를 캡쳐하는 능력이 향상하기 때문에, 화학식 Ⅱ의 화합물이 화학식 I의 화합물과 함께 박막층을 형성하는 것이 ds-DNA 검출능에 있어서 더 바람직한 것으로 여겨진다.
상기 고체 지지체 상에 고정되는 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ⅱ의 화합물의 비율은 특히 제한되는 것은 아니나, PCR 생성물 중의 ds-DNA의 검출능을 위해, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율은 바람직하게는 1:19 이상, 보다 바람직하게는 1:2 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 약 1:9이다.
상기 화학식 I의 화합물을 화학식 Ⅱ의 화합물과 함께 고체 지지체 상에 자기 조립 박막층을 형성시키기 위해서는, 화학식 I의 화합물의 용액을 제조 시 화학식 Ⅱ의 화합물을 함께 부가하여, 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ⅱ의 화합물의 혼합용액을 제조한 다음, 상기 화학식 I의 화합물을 이용하여 고체 지지체 상에 자기조립 박막층을 형성하는 경우와 동일한 방식으로 하여 형성시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 금 기판상에 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ⅱ의 화합물의 약 1:9 혼합물이 기판 상에 고정되어 혼합된 자기조립 단분자층을 형성한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 단면의 모식도를 도 2에 나타내었다.
상기 본 발명이 제공하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩은 PCR 생성물 중의 ds-DNA를 선택적으로 캡쳐함으로써, 형광 물질을 사용하지 않고, PCR 생성물을 정제할 필요도 없이, PCR 생성물 중의 ds-DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. ds-DNA가 선택적으로 캡쳐된 칩상의 자기조립 박막층은 캡쳐되기 전후의 물리화학적 성질이 달라지므로 그러한 변화를 측정함으로써 ds-DNA의 존재 유무 및 그 함량에 대해 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은
상기 본 발명에 따른 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 PCR 생성물과 접촉시켜 반응시키는 단계;
상기 PCR 생성물과 반응한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩을 세척하는 단계; 및
상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 자기조립 박막층에 대해 상기 PCR 생성물과의 반응 전후의 물리화학적 변화를 측정함으로써 인터컬레이터와 결합된 ds-DNA의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, PCR 생성물의 ds-DNA를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명에 따른 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 PCR 생성물과 접촉시키면 PCR 생성물 중의 ds-DNA가 자기조립 박막층의 상부에 존재하는 ds-DNA 인터컬레이터가 ds-DNA를 캡쳐하여 ds-DNA를 자기조립 박막층 상에 고정시킬 수 있다. PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 PCR 생성물과 접촉시키는 것은 PCR 생성물의 용액에 ds-DNA 검출용 칩을 단순히 담금으로 써 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 ds-DNA 검출용 칩상에 형성된 자기조립 박막층에 PCR 생성물이 충분히 접촉하면 어떠한 방식이든 무관하다. 이러한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 PCR 생성물과 접촉시키는 반응은 상온에서 이루어질 수 있다.
상기 PCR 생성물을 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층과 상온에서 충분히 접촉 반응시킨 다음에는 ds-DNA 검출용 칩을 세척하는 단계를 수행한다. 구체적으로는 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 세척하는 것이다. 이러한 세척은 ds-DNA 검출용 칩 상의 인터컬레이터에 의해 캡쳐된 ds-DNA 이외에 비특이적으로 결합될 수 있는 폴리머라제, dNTP, 또는 프라이머와 같은 이물질을 제거하기 위한 것이다. PCR 생성물을 상기 ds-DNA 검출용 칩과 접촉에 의해 반응시킬 때, 상기한 바와 같은 이물질은, 고체 지지체 상의 자기조립 박막을 형성하는 화학식 I의 화합물에서 3 내지 8 개의 에틸렌글리콜기에 의해 고체 지지체의 표면을 친수성으로 개질시키므로, 상기 이물질이 ds-DNA 검출용 칩상에서 설령 일시적으로 비특이적인 결합을 이룬다고 하더라도, ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 세척하면 거의 모두 제거될 수 있다.
세척에 의해 PCR 생성물 중의 ds-DNA만이 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층에 고정되면, ds-DNA가 고정되기 전 후에 물리화학적 특성에 차이가 나타난다. 따라서, 이러한 물리화학적 특성의 차이를 측정하면 ds-DNA 검출용 칩상에 ds-DNA가 고정되었는지 여부를 확인할 수 있다. ds-DNA 검출용 칩상에 ds-DNA가 고정되었는지 여부를 확인할 수 있는 물리화학적 특성으로는 ds-DNA 검출용 칩상의 자기 조립 박막층에 대한 공명각의 변화, 질량의 변화, 또는 음전하의 변화 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 물리화학적 특성의 변화는 종래에 당해 기술분야에 공지되어 있는 분석 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 공명각의 변화는 SPR(surface plasmon resonance technology)을 이용하여, 질량의 변화는 SAW(surface acoustic wave) 또는 QCM(quartz crystal microbalance), 전하량의 변화는 바이오-FET(field effect transistor)를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 본 발명이 제공하는 PCR 생성물의 ds-DNA를 검출하는 방법을 이용하면, 형광물질 이용할 필요가 없으며, PCR 반응 후에 ds-DNA만을 정제할 필요도 없이, 화학식 I의 화합물의 자기조립 박막층이 형성된 ds-DNA 검출용 칩을 이용하며 접촉반응시키고 세척한 후, 접촉 반응 전후의 물리 화학적 변화만을 측정함으로써 이루어질 수 있으므로, 쉽고 빠르게 PCR 생성물의 ds-DNA를 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 화학식 I의 화합물의 제조
A. 화합물 4의 제조
Figure 112007025570864-pat00006
THF 100 mL 중에 헥사에틸렌글리콜(3) 11.5 g(40.77 mmol)을 부가하여 용액을 제조한 다음, 광유 중의 60% NaH (0.6 g, 15.08 mmol)을 0℃에서 부가하였다. 80℃에서 2 시간동안 교반한 다음, 실온으로 냉각하였다. 그런 다음, 11-브로모운데센3.17 g(13.59 mmol)을 부가한 다음, 80℃에서 밤새 교반하하고 나서, 실온으로 냉각시켰다. 용매를 제거하고, 물을 부가한 다음, n-헥산으로 추출하였다. 그리하여 얻어진 추출물을 함수로 세척하고 황산 마그네슘으로 건조하고 여과한 다음, 농축하였다. 그 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 4를 획득하였다(4.37 g, 황색 오일, 수율= 74%).
B. 화합물 8의 제조
Figure 112007025570864-pat00007
상기 얻어진 화합물 4(1.19 g, 2.75 mmol), 1-히드록시파이렌(0.4 g, 1.83 mmol), 트리페닐포스핀 0.82 g(3.11 mmol), 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트 0.63 g(3.11 mmol)을 톨루엔 30 mL 중에 용해하였다. 2 일간 실온에서 교반한 다음, 물을 부가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 황산 마그네슘으로 건조한 다음, 여과하고 농축하였다. 그리하여 얻어진 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 8을 획득하였다(1g, 진한 갈색 겔, 수율= 80%).
C. 화합물 9의 제조
Figure 112007025570864-pat00008
상기 얻어진 화합물 8 (1 g, 1.57 mmol), 티오아세트산 2.79 g(36.6 mmol), 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) 0.154 g(0.55 mmol)을 THF 20 mL 중에 용해하였다. 그런 다음, 253.7 nm의 자외선을 조사하면서 실온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 용매를 제거하고, 에틸 아세테이트 중에 용해하고, 함수 및 물로 세척하였다. 황산마그네슘으로 건조하고 여과한 다음 농축하였다. 그 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 9를 갈색의 오일로서 획득하였다. 추가의 정제 과정을 수행하지 않고 다음 단계를 수행하였다.
D. 화합물 1의 제조
Figure 112007025570864-pat00009
상기 제조된 화합물 9 약 0.3 g을 메탄올 20 mL 중에 용해한 다음, 과량의 메탄올 중의 28% 소듐 메톡사이드를 0℃에서 부가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 4 N 염산용액으로 중화한 다음, 에틸 아세테이트로 추출하고, 함수로 세척하였다. 그런 다음, 황산마그네슘으로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 그리하여, 얻어진 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 화학식 I의 화합물인 화합물 1을 수득하였다(0.18 g, 암갈색 오일, 수율(2단계)= 14%). 화합물 1의 NMR 데이터를 도 3에 나타내었다.
실시예 2: 화학식 Ⅱ의 화합물의 제조
A. 화합물 5의 제조
Figure 112007025570864-pat00010
상기 제조된 화합물 4 (4.37 g, 10.05 mmol), t-부틸디메틸실릴 클로라이드 9.3 g(61.55 mmol) 및 이미다졸 4.19 g(61.55 mmol)을 DMF 100 mL 중에 0℃에서 부가하였다. 실온에서 밤새 교반한 다음, 물로 급냉시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 그런 다음, 함수로 세척하고 황산마그네슘으로 건조하였다. 그리고 나서, 여과 및 농축을 수행하였다. 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 5를 얻었다(5.1 g, 황색 오일, 수율= 86%).
B. 화합물 6의 제조
Figure 112007025570864-pat00011
상기 얻어진 화합물 5 (1 g, 1.87 mmol), 티오아세트산 2.85 g(37.4 mmol), 및 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) 0.079 mg(0.281 mmol)을 THF 중에 부가하였다. 그런 다음, 253.7 nm의 자외선 하에서 실온에서 밤새 교반하고, 용매를 제거하였다. 그리고 나서, 에틸 아세테이트 중에 용해하고 함수 및 물로 세척하였다. 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과한 다음 농축하였다. 그리하여 얻어진 농축물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 6을 수득하였다(1g, 황색 오일, 수율 = 88%).
C. 화합물 7의 제조
Figure 112007025570864-pat00012
상기 얻어진 화합물 6 (6.4 g, 10.24 mmol)을 THF 200 mL 중에 용해하고, 메탄올 중의 1M의 Bu4NF 용액(11.26 mL, 11.26 mmol)을 0℃에서 부가하였다. 밤새 실온에서 교반한 다음, 그 반응 혼합물을 아세트산으로 급냉하고 용매를 제거하였다. 그리고 나서, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 7을 얻었다(4.8 g, 암갈색 오일, 수율= 80%).
D. 화합물 2의 제조
Figure 112007025570864-pat00013
상기 제조된 화합물 7 (4.8 g, 9.4 mmol)을 메탄올 50 mL 중에 용해한 다음, 메탄올 중의 28% 소듐메톡사이드 용액(6.34 g, 32.89 mmol)을 0℃에서 부가하였다. 그런 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 4N 염산 수용액으로 중화하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 함수로 세척한 다음, 황산마그네슘으로 건조하였다. 그런 다음, 여과 및 농축을 수행하고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리 하여 화합물 2를 얻었다(1.6 g, 암갈색 오일, 수율= 36%). 화합물 2의 NMR 데이터를 도 4에 나타내었다.
실시예 3: PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 제조(1)
상기 실시예 1에서 제조된 화합물 1을 에탄올에 0.2 mM의 농도로 녹인 후 금 기판을 이 용액에 담가 상온에서 밤새 방치하였다. 그런 다음, 에탄올로 세척하고 질소 기체로 건조시켜 본 발명에 따른 ds-DNA 검출용 칩을 제조하였다.
실시예 4 ~ 8: PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 제조(2)
상기 실시예 1에서 제조된 화합물 1과 상기 실시예 2에서 제조된 화합물 2의 1:2(실시예 4), 1:9(실시예 5), 1:19(실시예 6), 1:49(실시예 7), 1:99(실시예 8) 혼합물을 에탄올에 0.2 mM의 농도로 녹인 후 각각에 금 기판을 이 용액에 담가 상온에서 밤새 방치하였다. 그런 다음, 각각의 기판을 에탄올로 세척하고 질소 기체로 건조시켜 본 발명에 따른 ds-DNA 검출용 칩을 제조하였다.
비교예 1
상기 실시예 4~8에서 실시예 1에서 제조된 화합물 1과 실시예 2에서 제조된 화합물 2의 비율을 0:1로한 것만을 제외하고는, 상기 실시예 4~8과 동일한 방식으로 하여 칩을 제조하였다.
실험예 1
A. PCR에 의한 ds-DNA의 생성
주형 DNA(KCCM에서 입수한 Staphylococcus aureus의 gDNA), 0.4 μM의 PCR 프라이머 세트(상향 프라이머: 5'-TAG CAT ATC AGA AGG CAC ACC C-3', 하향 프라이머: 5'-ATC CAC TCA AGA GAG ACA ACA TT-3', 0.5 mM의 dNTP 혼합물, Taq 폴리머라제(0.5 U/mL) 1 μL, 및 PCR 완충용액(750 mM의 Tris-HCl (pH 9.0), 150 mM의 (NH4)2SO4, 25 mM의 MgCl2, 및 1 mg/ml의 BSA의 혼합물)의 혼합물을 준비하였다. 249 bp의 Staphylococcus aureus 게놈 DNA(0.5 ng/μL) 2 μL를 주형 DNA로서 이용하였다.
PCR 튜브에 상기 반응 혼합물을 넣고 PCR을 수행하였다. PCR은 Applied Biosystems 9600을 이용하였으며, 95℃ 변성(denaturation)을 5초; 62℃ 어닐링(annealing)을 13 초; 72℃에서의 신장(extension)을 15 초로 하는 것을 1 주기로 하여 25 회 반복 시행하였고, 예비변성(Pre-denaturation)은 95℃에서 1 분간, 최종 신장(Last-extension)은 72℃에서 1 분간 수행하였다. 그 결과, 249 bp의 증폭산물이 얻어졌다.
B. PCR 생성물의 정제
위에서 얻어진 PCR 생성물은 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 정제하였다.
C. 공명각의 변화 측정
상기 B에서 얻어진 정제된 PCR 생성물에 상기 실시예 3 내지 8 및 비교예 1에서 제조된 칩을 각각 담그고 1 시간동안 상온에서 반응시키고, 750 mM Tris 완충용액 (1.6 몰/L NaCl)로 세척하였다. PCR 생성물과 반응시키기 전후의 공명각의 변화(이동각)를 SPR을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 따르면, 화학식 I의 화합물만으로 제조된 실시예 3의 칩보다는 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율이 1:9일 경우인 실시예 5의 칩에서 가장 큰 공명각의 변화를 나타내었음을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 PCR 생성물 검출용 칩을 제조 시 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율이 1:19 이상인 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.
실험예 2: ss-DNA에 대한 ds-DNA 검출용 칩과의 반응
본 발명에 따른 PCR 생성물 검출용 칩에서 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율이 1:9일 경우 가장 큰 공명각의 차이가 나타나므로, 이러한 비유로 제조된 본 발명에 따른 PCR 생성물 검출용 칩을 ss-DNA와 반응시킬 경우의 공명각의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 20 bp ss-DNA(3'-GGA GGA GGG GGG ACA GTC GT-5'를 750 mM Tris 완충 용액(1.6 mole/L, NaCl)으로 희석한 다음, 상기 실시예 5에서 제조된 칩을 담그고 1 시간동안 상온에서 반응시키고, 750 mM Tris 완충용액 (1.6 mole/L NaCl)으 로 세척하였다. PCR 생성물과 반응시키기 전후의 공명각의 차이를 SPR을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 따르면, PCR 생성물을 가장 장 검출하는 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율이 1:9일 경우의 본 발명에 따른 PCR 생성물 검출용 칩을 이용할 경우에도, ss-DNA를 적용할 경우에는 공명각의 변화가 0.07로 나타나 공명각의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 PCR 생성물 검출용 칩은 PCR-생성물 중의 ds-DNA를 ss-DNA와 차별적으로 검출하여 PCR 생성물 중에 PCR 산물이 ds-DNA가 생성되었는지 여부를 확인하는데 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 3
실시예 3, 5, 및 비교예 1에서 제조된 PCR 생성물 검출용 칩에 대해, 자기조립 박막층의 생성 전후, 정제된 PCR 생성물 적용 전후, 및 ss-DNA 적용 전후의 공명각의 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 따르면, 자기조립 박막층 생성 전후에 공명각의 변화가 유의적으로 나타났으므므로, 금 기판 상에 화합물 1 및/또는 화합물 2 의 자기조립 박막층이 형성되었음을 명확하게 알 수 있다. 또한, 정제된 PCR 생성물을 PCR 생성물 검출용 칩에 적용하기 전후의 공명각의 차이가 실시예 5(1.00±0.07)의 경우가 실시예 3(0.53±0.037)의 경우에 비해 현저히 높은 공명각의 차이를 나타내었으므로, 화학식 I의 화합물 단독 보다는 화학식 Ⅱ의 화합물과의 1:9이 비율로 조합할 경우 보 다 우수한 PCR 생성물 검출특성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, ss-DNA과 반응시키기 전후의 공명각의 변화는 거의 0으로 나타나, 본 발명에 따른 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩이 ss-DNA와 차별적으로 ds-DNA를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다.
실험예 4: PCR 생성물 중의 불순물에 의한 영향 평가
상기 실시예 5 및 비교예 1에서 제조된 PCR 생성물 검출용 칩에 상기 PCR 완충용액, 상기 정제된 PCR 생성물, 상기 정제되기 전의 PCR 생성물을 적용하기 전 후의 SPR 공명각 변화를 측정하여 도 8에 나타내었다.
도 8에 따르면, 실시예 5의 기판의 경우 PCR 완충용액만을 적용하기 전 후에서 SPR 공명각의 변화가 유의적인 값으로 나타났다. 이러한 값은 정제된 PCR 생성물의 공명각 변화 값에 더해져서, 비정제된 PCR 생성물의 공명각 변화 값에 반영되어 나타났다. PCR 완충용액만을 적용할 경우에도 SPR 공명각의 변화가 유의적인 값으로 나타나는 것은 PCR 완충용액 중에 존재하는 BSA(Bovine Serum Albumin)이 본 발명에 따른 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩에 형성된 자기조립 박막층에 소수성 작용에 의해 어느 정도 물리적 흡착이 이루어지기 때문인 것으로 여겨진다. 이러한 경우, PCR 완충용액을 단독으로 적용한 경우의 SPR 공명각의 변화 값을 블랭크 값으로 하여, 비정제된 PCR 생성물을 적용할 경우의 SPR 공명각의 변화 값에서 그 블랭크 값을 공제함으로써 PCR 완충용액 중의 불순물에 의한 오차를 줄일 수 있을 것이며, 정제되지 않은 PCR 생성물 중의 ds-DNA의 존재를 정확하게 검출할 수 있을 것이다.
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명에 다른 화학식 I의 화합물을 이용하여 자기조립 박막층이 형성된 PCR 생성물 중의 ds-DNA 검출용 칩을 이용하면, 종래의 형광 물질을 이용하지도 않고, PCR 생성물을 정제할 필요 없이, PCR에 의해 증폭된 ds-DNA를 ss-DNA와 차별적으로 검출할 수 있어, 보다 간편하고 신속하게 PCR에 의해 증폭된 ds-DNA를 검출할 수 있다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 I의 화합물:
    [화학식 I]
    Figure 112007025570864-pat00014
    상기 화학식 1에서,
    X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬이고,
    Y는 ds-DNA 인터컬레이터이고,
    n은 1 내지 9의 정수이며,
    m은 1 내지 8의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 ds-DNA 인터컬레이터는 벤젠고리 2 내지 6개를 포함하며, 이들 벤젠고리는 펜던트 방법으로 연결되어 있거나 벤젠고리들 일부 혹은 전부가 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 ds-DNA 인터컬레이터는 파이렌, 안트라센, 페난트렌, 나프탈렌, 크라이센, 테트라센, 아크리딘, 에티디움, 프로플라빈, 도노마이신, 독소루비신, 또는 탈리도마이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 고체 지지체; 및
    상기 고체 지지체 상에 형성된 제1항에 따른 화학식 I의 화합물의 자기조립 박막층을 포함하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩.
  5. 제 4 항에 있어서, 화학식 I의 화합물과 함께 하기 화학식 Ⅱ의 화합물의 자기조립 박막층이 형성된 것을 특징으로 하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩:
    [화학식 Ⅱ]
    Figure 112007025570864-pat00015
    상기 화학식 Ⅱ에서,
    X는 -SH 또는 -Si(OR1)3 이며, 여기에서 R1은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C3 알킬이고,
    n은 1 내지 9의 정수이며,
    m은 1 내지 8의 정수이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율은 1:19 이상인 것을 특징으로 하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩.
  7. 제 6 항에 있어서, 화학식 I의 화합물의 화학식 Ⅱ의 화합물에 대한 비율은 1:2 내지 1:10인 것을 특징으로 하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 평판 또는 비드 형태인 것을 특징으로 하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 평판은 금 기판 또는 실리콘 기판인 것을 특징으로 하는 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩.
  10. 제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩상의 자기조립 박막층을 PCR 생성물과 접촉시켜 반응시키는 단계;
    상기 PCR 생성물과 반응한 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩을 세척하는 단계; 및
    상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 자기조립 박막층에 대해 상기 PCR 생성물과의 반응 전후의 공명각, 질량, 및 음전하로 이루어진 그룹에서 선택된 물리화학적 변화를 측정함으로써 인터컬레이터와 결합된 ds-DNA의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, PCR 생성물의 ds-DNA를 검출하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 PCR 생성물의 ds-DNA 검출용 칩의 세척은 상기 PCR에 이용된 PCR 완충용액에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 PCR 생성물과의 반응 전후의 물리화학적 변화는 SPR(surface plasmon resonance technology), SAW(surface acoustic wave), QCM(quartz crystal microbalance), 또는 바이오-FET(field effect transistor)를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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