KR100869083B1 - 다이어트 효과를 갖는 캡사이신의 변화물질을 생산하는 바실러스 서브틸리스 균주 및 캡사이신에 의한 다이어트 효과와 동일한 매운맛이 완화된 캡사이신의 변화물질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

캡사이신 분해능이 우수하여 식품 소재의 매운맛을 완화할 수 있는 균주가 개시되어 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 발효식품으로부터 분리된, 캡사이신 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 발효방법이 제공된다.

캡사이신, 고추, 매운맛, 바실러스 서브틸리스

Description

다이어트 효과를 갖는 캡사이신의 변화물질을 생산하는 바실러스 서브틸리스 균주 및 캡사이신에 의한 다이어트 효과와 동일한 매운맛이 완화된 캡사이신의 변화물질을 생산하는 방법 {Bacillus subtilis producing capsaicin-transforming substance having diet effect and method of preparating the substance having moderate hot-taste}

본 발명은 캡사이신 분해능이 우수한 균주 및 이를 이용하여 식품소재의 매운맛을 완화하는 방법에 관한 것이다.

현재까지 고추 발효물의 항비만 효과에 대한 검증은 이루어진 바 있으나 이를 소재화한 제품 생산의 개발은 미흡하다. 고추 발효물에는 생체에서의 기능이 다양한 성분들이 존재할 것으로 기대되나 이러한 성분들을 다량 생산할 수 있는 미생물의 선정과 생산 최적화에 따른 발효기술 및 생체조절 활성성분에 대한 정확한 활성연구 및 screening 기술, 물질의 분리 및 정제기술은 발전단계에 있으며, 활성성분의 본체규명과 구조결정기술, in vivo test, 독성실험 등은 취약한 단계이다.

또한 활성성분의 작용기작 및 생체에서의 정확한 기능 파악이 어려워 이들을 이용한 기능성 식품의 개발 또는 의약품 제제로서의 응용에 큰 진전을 보지 못하고 있다. 고추 발효물에 대한 연구가 국내에서 제한적으로 진행되고 있으나 발효 과정 중에 매운맛이 감소되는 기작, 발효과정 중의 매운맛 성분 외의 항산화활성을 가질 것으로 기대되는 폴리페놀(polyphenol) 화합물의 변화 등과 같은 구체적인 성분 변화에 대한 과학적인 접근은 아직 이루어지지 않고 있다.

고추의 성분은 정유, 매운 성분, 유기산, 섬유, 전분, 수지, 점액물 등으로 이루어져 있다. 그 중 매운맛의 대표적인 성분은 캡사이신(capsaicin)으로서 여러 종류의 동족체가 있으며, 이를 총칭하여 캡사이시노이드(capsaicinoids)라 한다.

상기 캡사이신은 알칼로이드의 일종으로, 약용과 향료로 이용된다. 화학식은 C₁₈H₂₇NO₃이다.

고추 과실의 부분별 캡사이신 함량을 보면 씨가 붙어있는 태좌부, 격벽 등에는 1.93% 정도 들어있고. 종자에는 0.12%, 과실 껍질에는 0.24% 들어있으며, 과실전체로 보았을 때는 과실 길이를 3등분하여 꼭지 쪽은 0.24%, 중간은 0.39%, 고추 끝머리 부분은 0.15% 들어있다.

매운맛을 지닌 고추나 생강 등을 사용한 식품을 섭취하면 체온이 오르거나 땀을 흘리는 등 여러 생리현상이 나타나게 된다. 한편, 고추 매운맛의 주성분인 캡사이신은 체내에서 잘 흡수되지 않는데다 지나치게 먹으면 간 또는 신장에도 부담을 줄 수 있다. 또한, 식도, 위, 장을 거쳐 배설될 때까지 자극을 주므로 위장 장애 및 치질 등이 있는 사람은 피해야 하는 경우가 많다.

따라서, 고추 등의 매운맛을 감소시킴으로써 다양한 생리활성을 이용할 수 있게 하는 방안이 필요한 실정이나, 아직까지 매운맛은 감소시키고 생리활성은 보전한 소재로서의 활용과 관련된 연구는 거의 없는 편이다.

본 발명의 목적은 고추 등의 식품 소재의 매운맛을 완화하여 그 섭취에 부담을 줄일 수 있는 방안을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

캡사이신 분해능이 우수한 Bacillus subtilis P-1-3(기탁번호 KCTC 11321BP)를 제시할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면에 따르면,

상기 균주를 캡사이신을 함유하는 식품 소재의 발효에 이용하여 상기 식품 소재의 매운맛을 완화하는 방법을 제시할 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 의하여 매운맛이 완화된 식품 소재를 제시할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자 등은 고추발효에 적합한 균주를 기존에 생산되는 고추발효물 뿐만 아니라 고추와 관련된 고추 발효식품 (고추장, 고추 장아찌 등) 및 일반적인 발효 식품 제조에 사용되었던 균주를 대상으로 고추발효 숙성에 중요하게 관여할 수 있는 균주를 분리, 동정하고 분리균주를 starter로 활용하여 고추발효물을 생산에 이용하고자 하였다.

균주 분리원인 고추 장아찌는 청주 지역 식품판매점에서 10개의 제품을 구입하여 시료로 사용하였다.

이들 시료에서 분리한 67개의 균주를 캡사이신을 함유하는 배지에서 배양하고 이들 중 캡사이신 분해능이 우수한 10개의 균주를 선정하였다. 상기 1-2, 2-3, 2-5, 2-8, 3-1, 1-3, p-1, p-2, p-3, p-41의 10개 균주는 배양액의 캡사이신 함량 측정 결과에서 모두 우수한 캡사이신 분해능을 보이는 것을 확인하였다(표 1).

특히 P-3 균주는 1주일 배양시 캡사이신과 디히드로캡사이신의 양이 0.02±0.001 μg/ml과 0.25±0.04 μg/ml를 보임에 따라 가장 우수한 캡사이신 분해능을 가진 것으로 확인되었다. 따라서 캡사이신 분해능이 우수한 균주 P-3을 고추 발효물 제조 균주로 선정하였다.

상기 선발된 P-3 균주를 동정하기 위해 그 형태학적, 생화학적, 배양적 특성 및 당의 이용 등을 조사하였다. 그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 분리 균주는 간균, 그람 양성이었으며, 운동성이 있고, catalase 양성, 그리고 포자를 생성하는 것으로 관찰되었다. 또한, 상기 균주는 nitrate 환원반응과 citrate 이용반응, Voges-Proskuer test에서도 양성의 반응을 보였으며, propionate 이용반응, glucose와 nitrate로부터의 가스 생성반응은 음성을 보였다. 이와 같은 결과로부터, 상기 균주는 Bergey's manual of systemic bacteriology (Holt et al., 1986) 의 기준에 의하여 Bacillus subtilis으로 판명되었다.

또한, 확실한 균주동정을 위하여 16S rDNA 시퀀싱 결과에서도 Bacillus subtilis와 99% 일치하는 결과를 보였다.

그러므로, 상기 균주를 Bacillus subtilis P-1-3으로 명명하고 2008년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11321BP).

상기 기탁균주의 배양특성을 알아본 결과에서는 48 내지 96시간 배양한 이후에 캡사이신 함량이 크게 감소하였으므로, 상기 시간 범위 내에서 발효하는 것이 매운맛 제거나 완화에 효과적인 것을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 기탁균주 Bacillus subtilis P-1-3는 캡사이신을 함유하여 매운맛을 지니는 식품소재의 매운맛 제거나 완화에 크게 기여할 수 있다.

상기 캡사이신을 함유하는 식품 소재로는 고추, 고추올레오레진, 핫소스, 고추장, 고추가루 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 균주를 이용하여 매운맛이 제거 또는 완화된 식품소재 또한 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명에 따르면, 캡사이신의 분해능이 우수하여 매운맛의 제거나 완화에 효과적인 균주가 제공된다. 이를 이용하여 매운맛을 지니는 식품소재의 섭취에 대한 부담을 줄일 수 있으므로 식품 산업 분야에 널리 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1: 균주 분리 및 동정

1-1: 재료

균주 배양에 사용한 기본 배지는 glucose 2%, peptone 1%, MgSO₄-7H₂O 0.05% 로 조성된 것(not adjusted - pH 6.75, 30℃)을 사용하였으며, 균주의 분리원인 고추 장아찌는 청주 지역 식품판매점에서 10개의 제품을 구입하여 시료로 사용하였다.

1-2: 균주 분리

캡사이신 분해능이 우수한 균주를 분리하기 위하여 각각의 시료 10 g을 생리 멸균수 90 ml를 취하여 진탕하고 10^-5~10^{- 7}으로 희석한 후 미리 준비한 nutrient agar skim milk (2%) 배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양한 후 배지에 나타난 콜로니 크기와 모양 및 환의 크기에 따라 균주를 분리하였다.

1-3: 배양 중의 캡사이신 분해 활성

기본 배지 (glucose 2%, peptone 1%, MgSO₄-7H₂O 0.05% (not adjusted - pH 6.75, 30℃), 25 ml in 100 ml flask)에서 1-2에서 분리된 각 균주를 전배양(preculture)하였다. 기본 배지 300 ml에 31.1 mg의 캡사이신 (natural capsaicin, Fluka 21750)을 혼합한 후 300 ml 삼각 플라스크에 각각 50 ml 분주하여 상기 전배양 배양액 4 ml 씩 접종하고 30℃에서 1주일 배양하였다. 배양 후의 캡사이신 양을 비교하여 그 분해능이 우수한 균주를 분리하였다. 대조군으로는 상기 배지조건과 동일하며 발효가 진행하지 않은 미발효물을 사용하였다.

고추장 장아찌에서 분리한 67개의 균주 중 캡사이신 분해능이 우수한 10개의 균주를 선정하여 배양액에서의 캡사이신 함량을 측정한 결과 (표 1), 10개의 균주 모두 우수한 캡사이신 분해능을 보였다.

특히 P-3 균주는 1주일 배양시 캡사이신과 디히드로캡사이신의 양이 0.02±0.001 μg/ml과 0.25±0.04 μg/ml를 보임에 따라 가장 우수한 캡사이신 분해능을 가진 것으로 확인되었다. 따라서 캡사이신 분해능이 우수한 균주 P-3을 고추 발효물 제조 균주로 선정하였다.

시료	Capsaicin (μg/ml)	Dihydrocapsaicin (μg/ml)
대조군	4.79±0.12	2.48±0.12
1-2	0.30±0.02	0.56±0.01
2-3	0.66±0.04	0.70±0.03
2-5	0.61±0.05	0.65±0.06
2-8	0.43±0.01	0.63±0.03
3-1	0.84±0.02	0.68±0.01
1-3	2.32±0.08	0.69±0.01
p-1	0.57±0.02	0.74±0.08
p-2	0.26±0.01	0.61±0.01
p-3	0.02±0.001	0.25±0.04
p-4	0.24±0.03	0.61±0.02

1-4: 균주 동정

1-3에서 분리된 P-3 균주의 형태학적 특징과 배양상의 특징을 검토하였으며, 균주의 생화학적 특성을 규명하고 이를 토대로 Bergey's manual of systematic bacteriology에 준하여 그 형태학적, 생화학적, 배양적 특성 및 당의 이용 등을 조사하였다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 상기 분리 균주는 간균, 그람 양성이었으며, 운동성이 있고, catalase 양성, 그리고 포자를 생성하는 것으로 관찰되었다. 또한, 상기 균주는 nitrate 환원반응과 citrate 이용반응, Voges-Proskuer test에서도 양성의 반응을 보였으며, propionate 이용반응, glucose와 nitrate로부터의 가스 생성반응은 음성을 보였다. 따라서, 상기 균주는 Bergey's manual of systemic bacteriology (Holt et al., 1986)의 기준에 의하여 Bacillus subtilis으로 판명되었다.

형태학적 특성		생화학적 특성
형태	간균, 1.0-1.1×5.6-6.5μ	전분 가수분해	느린 가수분해
운동성	양성	카세인	빠른 가수분해
그람 염색	양성	젤라틴	빠른 가수분해
포자	양성	카르복실 메틸 셀룰로스	느린 가수분해
배양적 특성		펙틴	느린 가수분해
뉴트리언트 아가(Nutrient agar)	양성 재생산, slim material secretion	풀루란(Pullulan)	가수분해 되지 않음
생장 pH	5-8	카탈라아제	양성
생장온도	25-45℃	β-글루코시다제	양성
당의 이용(Utilization of sugars)		아르기닌 디하이드로라아제 (Arginine dihydrolase)	양성
글루코스	양성	라이신 디카르복실레이즈	양성
만니톨	음성	오르니틴 디카르복실레이즈	양성
이노시톨	음성	H2S 생산	음성
소르비톨	양성	N2 가스 생산	음성
람노스	음성	나이트레이트 환원 (Nitrate reduction)	음성
수크로스	양성	유레아제(Urease)	양성
멜리비오스	음성	아세토인(Acetoin)	양성
아라비노스	양성	옥시다아제(Oxidase)	양성
아미그달린	양성	트립토판 디아미다아제 (Tryptophane deamidase)	음성

보다 확실한 균주동정을 위하여 16S dDNA를 이용한 방법으로 균주를 동정하였다. Bacillus sp . 16S rRNA 유전자의 보존 영역을 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 얻은 후 clustal X를 이용하여 multiple alignment 하여 프라이머를 제작 (Forword primer: TAC AAA CTC TCG TGG TGT GAC, Reverse primer: GTG CCT AAT ACA TGC AAG T)하였으며 Bioneer Co. (Korea)에 주문하여 합성하였다.

분리균주의 16S rRNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하기 위하여 세균의 16S rRNA 유전자의 보존 영역의 염기서열 (염기서열 위치 1523-1542 지역)을 프라이머로 사용하고, Rodriquez와 Tait 방법으로 분리한 총 염색체 DNA를 주형으로 사용하였다. PCR 반응은 CM 유전자의 증폭은 NB agar에서 배양하여 분리한 균주의 P DRC의 염색체 DNA를 주형 DNA로 하여, 주형은 분리 균주를 용균(cell lysis)한 것을 사용하였으며 총 반응액을 50 μL로 하여 수행하였다.

반응 혼합액의 조성은 10×Tag^TM reaction buffer [50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂], 0.2 mM dNTPS (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 50~100 ng의 template DNA, 1 pmol의 3’과 5’프라이머, 2.5 unit의 Ex Taq^M DNA 중합효소이며, PCR 기기는 Mini Cycler^TM (MJ RESERCH, USA)를 이용하였다. 증폭과정은 95℃에서 2분 전변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 40초간 어닐링한 후, 72℃에서 30초간 연장 반응을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 마지막 연장반응시켰다. pGEM-T easy vector system kit (Promega)을 이용하여 위에서 얻은 PCR 산물을 라이게이션한 후, E. coli Top10에 형질전환하였으며, 원하는 DNA가 제대로 삽입되었는지를 확인하고 서울대 내 genome research center에 보내 Auto-read sequencing kit (Pharmacia)를 DNA 시퀀싱하였다. 그 결과, 16sRNA에 의한 동정결과도 Bacillus subtilis으로 판명되었다(표 3).

상기 균주를 Bacillus subtilis P-1-3으로 명명하고 2008년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11321BP).

Strain No.	증폭 단편 크기 (bp)	Species-Identification	Identity (%)
P-1-3	1389	Bacillus subtilis	99

실시예 2: 바실러스 서브틸리스의 발효 특성

상기 기탁 균주 Bacillus subtilis P-1-3를 이용하여 고추발효물 제조를 위한 발효 특성을 측정하였다. 이를 위하여 표 4의 성분을 혼합하여 균질기로 마쇄 후 거어즈로 여과한 착즙액을 고추 발효물을 위한 배지로 사용하였다. 상기 배지에 기탁균주를 접종하여 30℃, 교반속도는 120-150 rpm으로 하여 배양하고, 배양과정 중의 균수량, 환원당, 캡사이신, 디하이드로캡사이신 및 pH의 변화를 측정하였다.

성분	양
고추	45 g
미네랄 배지1 )	5 ml
트레이스 미네랄2 )	50 ul
MgSO4 ·7H2O	300 ul

¹⁾ 미네랄 배지 (1 L): (NH₄)₂SO₄ 1 g, Na₂HPO_{4 ·}12H₂O 9 g, KH₂PO₄ 1.5 g, MgSO_{4 ·}7H₂O 0.2 g (a separate addition of MgSO_{4 ·}7H₂O due to precipitation)

²⁾ 트레이스 미네랄 (per 1 L, 1 mL/trace mineral 1 L): H₃BO₃ 0.3 g, CoCl_·6H₂O 0.2 g, ZnSO_{4 ·}7H₂O 0.1 g, MnSO_{4 ·}5H₂O 0.03 g, (NH₄)₆Mo₇O_{24 ·}4H₂O 0.03 g, NiCl_{2 ·}6H₂O 0.02 g, CuSO_{4 ·}5H₂O 0.01 g

고추의 착즙액의 초기 pH는 약 5정도이고 바실러스 서브틸리스 배양의 최적 pH 범위는 6.5~8.0로, 발효과정 동안 pH 변화를 낮추기 위해 4 N NaOH를 이용하여 0 hr과 24 hr에 pH를 7.0으로 보정하였다.

고추의 발효 과정 중 기탁된 Bacillus subtilis의 생장률을 알아보기 위하여 24시간마다 시료를 채취하여 균수를 계수한 결과, 발효 48시간까지 증가하다가 48시간 이후 급속한 감소를 보이는 것을 알 수 있었다.

발효시작 전 배지의 캡사이신 함량 측정하고 매 24시간마다 수집하여 HPLC로 분석한 결과, 대조구(균을 접종하지 않은 것)의 경우 캡사이신 함량은 100~105 mg/100 g, 디하이드로캡사이신의 함량은 20 mg/100 g으로 매운맛의 감소에는 거의 영향이 없었으나 기탁 균주를 이용한 고추발효물의 경우 48시간까지는 캡사이신 함량이 100 mg/100 g으로 감소율이 낮았으나 48시간부터는 현저히 감소되었다.

즉, 발효과정 중 캡사이시노이드 함량 변화는 발효 전 100 mg/100 g에서 96시간 후 18 mg/100 g으로 82% 정도의 감소를 나타내었다(도 2). 따라서, 기탁균주 B. subtilis의 발효 과정 중 성장률과 매운맛의 경시적 측정 결과로부터 균의 성장 뒤 일정 시간이 경과한 후부터 캡사이신이 감소함을 알 수 있다.

고추 발효물의 발효 중 경시적인 환원당 변화는 DNS법에 의해 측정하였으며 고추발효물 환원당 함량은 초기 12 mg/mL에서 48시간(2 mg/mL)까지 감소하다가 72시간 (4 mg/mL)에서 다소 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 균 성장의 패턴과도 일치하는 결과이다.

고추발효물의 pH 변화는 24시간까지는 pH 5.5~5.4로 낮은 pH 범위를 보였으며 48시간 후에는 pH가 증가하다가 72시간부터는 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다.

상기한 배양결과로부터 발효물의 제조에 있어 본 발명의 균주를 이용하여 고추를 발효하는 시간은 48 내지 96시간이 바람직한 것을 알 수 있다.

이상 첨부된 표를 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

도 1은 본 발명의 기탁균주 Bacillus subtilis P-1-3의 현미경 사진이다.

도 2는 배양 과정 중 세포 성장의 변화, 환원당 함량의 변화, 캡사이신과 디히드로캡사이신의 함량 변화 및 pH 변화를 기록한 그래프이다.

Claims (5)

1. 캡사이신 분해능이 우수한 Bacillus subtilis P-1-3(기탁번호 KCTC 11321BP).
2. 제1항의 균주를 이용하여 캡사이신을 함유하는 고추, 고추올레오레진 또는 고춧가루를 발효시킴으로써 상기 고추, 고추올레오레진 또는 고춧가루의 매운맛을 완화하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 발효시간은 48 내지 96시간인 방법.
4. 삭제
5. 삭제

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