KR100866890B1 - 초소형 이종 식물 세포융합장치 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이종의 식물세포를 융합시키고 안정적으로 배양시킬 수 있도록 하는 초소형 이종 식물 세포융합장치 및 그 제조 방법을 개시한다.

본 발명은 이종 식물 세포의 융합 및 배양이 하나의 장치에서 구현되고, 초소형화 되어 저전압을 사용하는 하나의 이종 식물 세포 유합 장치를 제공함에 있다.

이를 위하여 본 발명은 실리콘 웨이퍼, 포토레지스트, 마스크, 에칭액, 자외선조사기를 사용하는 일반적인 반도체 제조 공정을 적용하여 원하는 구조만을 남기고 삭제한 후 이에 PDMS를 덮고 가압하여 경화시키며, 경화된 PDMS를 분리하여 줌으로써 주입공 및 배출공 그리고 마이크로 채널 및 배양액 투입공이 형성되도록 함으로써, 이종 식물 세포의 융합과 배양이 하나의 장치에 의하여 실시되도록 한 초소형 이종 식물 세포 융합장치를 제안한다.

이에 따라 본 발명은 융합 세포를 별도의 배양 장치로 이송하기 위한 일련의 조작 공정이 없이 하나의 융합장치에서 배양까지 완료된 이종 식물 융합 세포를 얻을 수 있게 되는 것이어서, 공정의 간소화를 도모하고 이송 과정 및 융합 공정에서 발생할 수 있는 융합 세포의 손상을 방지할 수 있게 되어 수율을 향상시키게 되는 효과가 있는 것이다.

아울러, 본 발명은 별도의 동력원 없이도 이종 세포가 혼합된 세포 융합 용액이 전극으로 이동하고 융합장치의 구조가 매우 단순화되어 제작비용을 크게 절감 할 수 있는 등의 효과가 있다.

Description

초소형 이종 식물 세포융합장치 및 그 제조 방법{Ultra Small Hybridization-cell Fusion device and Method Thereof}

도 1은 종래의 세포 융합 장치를 보인 설명도.

도 2는 인큐베이터가 구비된 종래의 인용발명을 보인 설명도.

도 3은 본 발명에 의한 초소형 이종 식물 세포 융합장치의 작동 원리를 보인 설명도.

도 4는 본 발명의 세포융합장치의 작동 과정을 보인 설명도.

도 5는 본 발명에 의한 초소형 이종 식물 세포 융합장치의 제조 방법을 보인 설명도.

*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

1:주입공 2:배출공

3:마이크로 채널 4:투입공

5:커버 6:전극

7:전원공급부

본 발명은 이종의 식물세포를 융합시키고 안정적으로 배양시킬 수 있도록 하는 초소형 이종 식물 세포융합장치 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

주지하는 바와 같이 이종(異種)의 식물 세포를 추출하여 이들을 근접시킨 상태에서 고전압을 가하게 되면 두 식물세포의 원형질막의 결합을 통해 두 세포가 융합하게 되며, 이에 따라 양자의 우성 형질을 갖춘 새로운 이종 핵세포 식물이 만들어지게 된다.

이를 위한 종래의 세포 융합 장치를 도 1로 도시하였다.

이에 도시된 바와 같이 종래에는 두 개의 셀 챔버(101) 내에 각각 이종 식물세포를 저장하고, 각각 두 세포의 생존에 필요한 배지가 공급되도록 다수개의 주입구(102)를 형성하며, 두 세포의 융합이 이루어지도록 고전압을 인가하는 전극부(103)가 구비된 세포융합장치(100)가 사용되었다.

이와 같은 세포융합장치(100)는 셀 챔버(101)에 각각 서로 다른 종류의 세포벽이 제거된 원형질체를 저장시키고, 이들의 하부에 채널(104)을 연결하되, 이 채널(104)에 다수개의 주입구(102)를 통하여 배양에 필요한 탄소(C), 수소(H), 산소(O), 질소(N), 유황(S), 인(P), 칼슘(Ca), 철(Fe), 마그네슘(Mg) 외에 식물호르몬인 오옥신(Auxin)과 시토키닌(Cytokinin) 등을 적절한 농도의 비율로 주입시키며, 전극부(103)에서 전압을 인가시켜 주면, 두 세포가 융합되면서 배출되는 것이 다.

이와 같은 세포융합장치는 두 세포를 융합시키는 데에는 적절하게 사용할 수 있으나, 융합된 세포를 꺼내어 배양시키기 위한 챔버로 이동시 융합된 세포가 공기 중의 세균으로 인하여 감염되거나, 옮기는 과정에서 융합세포가 괴사하게 되는 경우가 빈번하게 발생하여 융합세포의 손실률이 높아지게 되는 문제점이 있었다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 본출원의 발명자는 대한민국특허등록 제695272호(발명의 명칭: 이종식물세포융합장치; 이하 '인용발명'이라 함)를 제안한 바 있으며, 이는 세포융합장치에 인큐베이터를 연결 설치하여 융합된 세포를 챔버로 옮기기 전에 성숙시켜 챔버로 옮기는 과정에서의 융합세포의 생존율을 높일 수 있도록 하였던 것이다.

이러한 인용발명을 도 2로 도시하였으며, 이에서 볼 수 있는 바와 같이 각각 다른 종류의 세포를 저장하는 두 개의 챔버(10)와, 전기적 융합이 이루어지는 전극부(20)와, 챔버(10)에 저장된 세포가 전극부(20)로 이송되도록 상기 챔버(10)와 전극부(20)를 연결하는 채널(11)과, 상기 세포의 생존에 필요한 배지가 전극부(20)로 공급되도록 채널(11)에 연결된 주입구(15)를 구비한 공지의 이종 식물 세포융합장치에 있어서,

상기 전극부(20)의 하방에 융합 세포가 일시 저장되는 인큐베이터(30)와, pH에 따라 부피가 팽창, 수축되어 상기 인큐베이터(30)의 출구를 개폐하기 위한 하이드로겔 댐 혹은 공압으로 작동되는 마이크로 밸브로 된 개폐 수단(40)이 구비됨을 특징으로 하는 이종 식물 세포융합장치가 된 바 있으며,

이는 세포융합장치에 인큐베이터를 연결 설치하여 융합된 세포를 챔버로 옮기기 전에 성숙시켜 챔버로 옮기는 과정에서의 융합세포의 생존율을 높일 수 있도록 하였던 것이다.

이와 같이 하여 인용 발명은 융합된 이종 식물세포를 인큐베이터에서 성장시킨 다음 배양 용기로 옮기도록 함으로써, 배양용기로 이송되는 과정에서의 세균 감염이나 융합세포의 괴사를 방지하여 생존율을 크게 향상시키므로 수율을 제고하여 소요 경비를 절약할 수 있음은 물론, 융합세포의 배양 상태를 양호하게 하여 우수한 형질의 이종식물을 얻을 수 있게 되는 유용한 효과가 있는 것이다.

반면에 이는 배양을 위하여 융합세포를 배양용기로 이송하는 공정이 여전히 필요할 뿐만 아니라, 취급상의 부주의가 발생하는 경우에는 융합 세포의 손상을 초래하는 문제점이 있는 것이다.

아울러, 이러한 인용발명은 식물세포와 융합 용액을 고정도의 실린지펌프 등에 의하여 정밀하게 주입, 펌핑 하여야 하는 것이므로 제작비용이 많이 들게 된다. 아울러, 세포 융합과정에서도 고전압을 사용하는 것이어서 융합 과정 중 세포의 손상으로 수율(收率)이 저하되는 문제점이 있어서 개체수가 적은 식물의 세포 융합이 어려운 문제점이 있는 등의 문제점이 있는 것이다.

본 발명의 제1목적은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이종 식물 세포의 융합 및 배양이 초소형화 된 하나의 이종 식물 세포 장치에 의하여 구현되도록 하기 위한 초소형 이종 식물 세포 융합장치 및 그 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제2목적은 이종 식물 세포 융합을 위한 일체의 동력원이 불필요하도록 한 초소형 이종 식물 세포 융합장치 및 그 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제3목적은 이종 식물 세포 융합 과정에서 고전압에 의한 세포 손상이 전혀 없도록 함으로써 수율을 증가시킬 수 있도록 한 초소형 이종 식물 세포 융합장치 및 그 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 제4목적은 이종 식물 세포 융합장치를 매우 작은 부피로 구현함으로써, 많은 수의 이종 식물 세포 융합장치를 하나의 작은 장치에 구현하여 다종, 다수의 이종 식물 세포 융합 작업이 작은 장치에 의하여 동시에 구현될 수 있도록 한 초소형 이종 식물 세포 융합장치 및 그 제조 방법을 제공함에 있다.

본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위하여 실리콘웨이퍼, 포토레지스트, 마스크, 현상액(developer), 자외선조사기를 사용하는 일반적인 반도체 제조 공정을 적용하여 원하는 구조만을 남기고 삭제한 후 이에 PDMS를 덮고 가압하여 경화시키며, 경화된 PDMS를 분리하여 줌으로써 주입공 및 배출공 그리고 마이크로 채널 및 배양액 투입공이 형성되도록 하고, 이종 식물 세포의 융합과 배양이 하나의 장치에 의하여 실시되도록 한 초소형 이종 식물 세포 융합장치 및 그 제조 방법을 제안한다.

이에 따라 본 발명은 융합 세포를 별도의 배양 장치로 이송하기 위한 일련의 조작 공정이 없이 하나의 융합장치에서 배양까지 완료된 이종 식물 융합 세포를 얻을 수 있게 되는 것이어서, 공정의 간소화와 함께 이송 과정에서 발생할 수 있는 융합 세포의 손상을 방지할 수 있게 되어 수율을 향상시키게 되는 효과가 있는 것이어서, 특히 개체수가 적은 식물인 경우에도 적용 가능하게 되는 것이다.

아울러, 본 발명은 별도의 동력원 없이도 이종 세포가 혼합된 세포 융합 용액이 전극으로 이동하고 전압에 의하여 이종 세포의 융합이 실시된 후에는 배지의 투입으로 융합세포의 배양이 실시되며, 배양 완료 후에도 별도의 동력원 없이 추가 용액 투입만으로 융합되고 배양된 융합 세포가 배출될 수 있도록 함으로써 융합장치의 구조가 매우 단순화되어 제작비용을 크게 절감할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 이는 반도체 웨이퍼 상에 구현된 미세 구조물에 의하여 매우 작은 크기의 PDMS(Polydimethysiloxane)로 된 것이므로, 전극 배치 간격이 인용발명에 비하여 1/10 이하의 크기로 되는 것이어서 적용되는 전압이 인용발명에 비하여 1/40 정도면 충분하므로, 소형 전지에 의하여 세포 융합 장치의 전원을 충분히 공급할 수 있게 되어 장소에 불문하고 사용가능한 포터블 형태로 제작가능하게 된다.

아울러, 본 발명은 전술한 바와 같이, PDMS로 된 것이며, 극소화된 크기로 구현 가능하므로 많은 수의 것을 하나의 장치에 설치하여, 여러 이종 식물 세포의 융합 공정을 동시, 다발적으로 시행할 수 있게 되므로 상업적 규모로 양산할 수 있게 되는 유용한 효과가 있다.

이러한 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 의하여 구현된 PDMS를 사용한 이종 식물 세포 융합장치의 종단면 구조를 도 3으로 예시하였다. 이에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명은 본체의 상방에 주입공(1) 및 배출공(2) 그리고 이들을 연통시키는 마이크로 채널(3)과, 마이크로 채널(3)의 중간에 설치되어 마이크로 채널(3) 내부와 외부를 연통시키는 배양액 투입공(4) 및 전술한 주입공(1), 배출공(2), 배양액 투입공(4)이 개폐되도록 하기 위한 커버(5)와, 마이크로 채널(3)의 중간에 세포 융합을 위한 전극(6) 및 전원 공급부(7)가 배열 된 것이다.

이와 같이 된 본 발명에 의한 이종 식물 세포 융합 장치는 그 작동을 위하여 하등의 동력원을 설치하지 않고도 세포 융합 용액을 주입공(1)으로 주입하고 배출공(2)으로 배출할 수 있게 된다.

즉, 본 발명은 영-라프라스 등식(Young-Laplace Equation)에 의하여 계산되는 다음과 같은 원리에 의하여 마이크로 채널(3) 양측인 주입공(1)과 배출공(2) 사이에 발생되는 압력차에 의하여 세포 융합 용액이 이동하게 된다.

또한, 이때의 마이크로 채널(3)에서 세포 융합 용액이 이동하는 평균속도는 다음과 같다.

W: channel width , h : channel height L : channel length

즉, 도 3으로 보인 바와 같이 세포 융합 용액이 배출공(2)에 낙하되었을 시 그 하방에 작용하는 압력은 그 반지름이 클수록 감소하게 된다.

이에서 볼 수 있는 바와 같이, 주입공(1)에 낙하되는 방울의 직경은 배출공(2)에 낙하되는 방울의 직경보다 작으며, 이에 따라 전술한 등식 (1)에 의하여 확인되는 바와 같이 방울의 반지름이 작으면 압력이 증가하게 되어 세포 융합 용액은 주입공(1) 방향에서 압력이 낮은 배출공(2) 방향으로 이동하게 되게 되므로, 주입된 세포 융합 용액은 마이크로 채널(3)을 통하여 흐르는 펌핑 상태가 될 수 있는 것이다.

이러한 원리로 작동되는 본 발명을 도 4를 참조하여 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 먼저 배양액 투입공(4)을 PDMS 커버(5) 등으로 폐쇄한 다음 마이크로 채널(3)에 세포 융합 용액을 채운다.

이어서 배출공(2)에 세포 융합 용액 방울을 낙하시키고, 주입공(1)에도 세포 융합 용액을 낙하시키되 주입공(1)에 낙하된 세포 융합 용액의 직경이 배출공(2)에 낙하된 세포 융합 용액의 방울보다 작게 하여, 압력 편차가 발생하도록 한다.

아울러, 주입공(1)에 낙하되는 세포 융합 용액에는 융합 대상 이종 식물들의 세포를 포함시키며, 이러한 세포 융합 용액은 마이크로 채널(3)을 흐르게 되는 바, 이러한 과정에서 실제의 유량은 약 20㎕ 내지 30㎕의 극소량이며, 이후 주입공(1)으로 새로운 세포 융합 용액 방울이 낙하되지 않으면 평형 상태가 되어 더 이상의 흐름은 없게 된다.

이러한 상태에서는 융합 대상 이종 식물들의 세포가 전극(6)에 도달하게 되고, 이때 본 발명에서는 전극(6)에 전압을 공급하여 이종 식물의 세포들이 펄체인을 형성하고, 펄체인이 형성된 두 개 세포의 세포막이 융합되면서 새로운 융합세포가 만들어지게 하는 것이다.

이와 같이 융합된 새로운 세포가 만들어 진 후에는 재차 주입공(1)에 세포 융합 용액 방울을 낙하시켜 마이크로 채널(3) 내부에서 전술한 바와 같이 펌핑기능이 실시되도록 하며, 이에 따라 배출공(2)으로는 세포 융합 용액이 배출되는 것이다. 이러한 상태에서 주입공(1)과 배출공(2)을 PDMS 커버(5) 등 평면체로 막은 다음 배양액 투입공(4)의 PDMS 커버(5)를 벗겨 내고 배양액을 주입하고 다시 PDMS 커버(5)를 덮어 두며, 이러한 상태를 세포의 상태에 따라 3일 내지 7일을 유지하게 되고, 필요에 따라 배양액 투입공(4)을 통하여 배양액을 교환할 수 있는 것이다.

이와 같이 하여 세포의 배양이 종료된 경우에는 PDMS 커버(5)를 열고 마이크로 피펫으로 세포를 추출하게 되는 것이다.

이러한 본 발명을 적용하여 융합 가능한 식물세포는 감자, 토마토뿐만 아니라 고구마, 옥수수 등 필요에 따라 배양시키고자 하는 다양한 식물을 선택하여 적절하게 저장시킬 수 있음은 물론이며, 특히 본 발명은 높은 융합 효율을 갖는 것이므로 개체수가 극히 적은 수의 이종 식물 세포의 융합을 위하여 효과적으로 사용할 수 있게 되는 것이다.

이러한 본 발명에서는 배양액으로 ph 5.8인 물 1리터에 대하여 KH2PO4 27.2mg, KNO3 101mg, CaCl2.2H2O 1480mg, MgSO4.7H2O 246mg, Kl 0.16mg, CuSO4.5H2O 0.025mg가 함유되고 Murashige & skoog meduim 4.4g이 배합된 것을 사용할 수 있으며, 시기별로 융합세포가 생존하고 배양되는데 필요한 영양분을 충분히 공급하게 되는 것이다.

아울러, 세포 융합 용액으로는 Mannitol 0.5M, CaCl2.2H2O 0.01mM가 pH 5.8인 1리터의 물에 함유된 것을 사용할 수 있는 것이다.

이러한 본 발명에 의한 이종 식물 세포 융합장치는 그 규격이 매우 작은 것이어서 그 제작을 위하여 반도체 제조 기법을 응용하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명은 도 5로 도시한 바와 같이, 실리콘 웨이퍼위에 포토레지스트를 도포하는 단계(S1)와, 그 위에 포토레지스트를 재차 도포하는 단계(S2)와,

그 위에 마스크를 덮고 자외선을 조사하는 단계(S3)와,

그 위에 재차 포토레지스트를 도포하는 단계(S4)와,

그 위에 마스크를 덮은 후 재차 자외선을 조사하는 단계(S5)와,

에칭을 실시하는 단계(S6)와, 에칭 하여 몰더를 완성한 후 그 위에 PDMS를 부는 단계(S7)와, 그 위에 판체를 덮은 후 가압하여 경화시켜 형태를 안정화시키는 단계(S8)와, 판체와 실리콘 웨이퍼를 제거하는 단계(S9)를 거쳐서 몰더와 PDMS를 분리함으로써, 주입공(1), 배출공(2), 배양액 투입공(4) 및 박막상의 전극(6)을 갖는 마이크로 채널(3)을 완성하고, 각각의 주입공(1), 배출공(2) 및 배양액 투입공(4)에 PDMS로 커버(5)를 만들어 덮는 단계(S10)를 구성하여 세포의 융합과 배양이 하나의 장치에서 실시될 수 있는 본 발명에 의한 이종 식물 세포 융합장치를 제조할 수 있게 되는 것이며, 성형된 포토레지스트 위에 PDMS를 부는 단계(S7)와, 그 위에 판체를 덮은 후 가압하여 경화시켜 형태를 안정화시키는 단계(S8)와, 판체와 실리콘 웨이퍼를 제거하는 단계(S9)를 거쳐서 PDMS를 분리하는 과정을 반복함으로써, 이종 식물 세포의 융합과 배양이 하나의 장치에 의하여 실시되도록 되는 전술한 바의 이종 식물 세포 융합장치를 반복적으로 제조할 수 있게 되는 것이다.

또한, 본 발명에서 사용하는 본체의 재질은 PDMS로 하는 것이 바람직하며, 기타 재질로도 제작 가능하다.

이와 같이 하여 본 발명은 종래의 세포 융합 장치들과 같이 실린지펌프 등 세포 융합 용액 이송 수단을 구비할 필요가 없으므로 그 구조를 대폭 간소화하여 제작비용을 줄일 수 있게 되는 것이며, 그 제작 공정이 간결하여 염가로 다량 제작 가능하게 된다.

특히, 본 발명에 의하면 하나의 장치에서 세포의 융합과 배양을 실시한 후 취출할 수 있게 되는 것이므로 이는 배양을 위하여 융합세포를 배양용기로 이송하는 공정이 완전히 불필요하게 될 뿐만 아니라, 취급상의 부주의로 인한 융합 세포의 손상을 방지하게 되는 이점이 있고, 크기가 매우 작은 형태로 제작하게 되는 것이어서 세포 융합을 위한 전극(6)의 전압을 1/10 정도로 낮출 수 있게 되어 융합 세포의 수율을 크게 향상시킬 수 있게 되는 것이어서 개체수가 적은 식물이라도 적용 가능하게 되는 것이다.

또한, 본 발명은 PDMS 커버(5)를 여닫으면서 배양액을 취출하고 새로 투입하는 것만으로 배양액을 교환할 수 있으므로 밸브를 수회 조작하여야 하는 종래의 것에 비하여 작업이 매우 용이하게 되는 것이다.

아울러, 본 발명에 의한 세포 융합장치는 그 크기를 매우 작게 할 수 있으므로 다수 개를 하나의 장치에 제작하여, 동시에 다종의 세포 융합 공정이 실시되도록 할 수 있으므로 융합 세포의 생산성 향상에도 기여할 수 있게 될 뿐만 아니라, 세포 융합 전극(6)의 전압을 낮게 할 수 있으므로 소형 배터리 등으로 작동 가능하여 포터블 형태로 제작함으로써, 장소에 불문하고 편리하게 사용할 수 있게 되는 유용한 효과가 있는 것이다.

Claims (2)

1. 본체의 상방에 형성된 주입공 및 배출공과, 본체의 내부에 주입공과 배출공을 연통시키는 마이크로 채널로 구성된 초소형 세포 융합 장치에 있어서,

   세포 융합 후 계속해서 배양할 수 있도록 전술한 마이크로 채널의 상방에서 마이크로 채널 내부와 외부를 연통시키는 배양액 투입공과,

   전술한 주입공, 배출공 및 배양액 투입공이 각각 개폐되도록 하기 위한 커버와,

   전술한 배양액 투입공 하단의 마이크로 채널 내에 세포 융합을 위한 박막상의 전극 및,

   전술한 전극에 전원을 공급하는 전원 공급부가 구비되어 세포 융합 및 배양을 일체화 함을 특징으로 하는 초소형 세포 융합 장치.
2. 청구항 1의 세포 융합 및 배양을 일체화 한 초소형 세포 융합 장치를 제조하는 방법에 있어서,

   실리콘 웨이퍼위에 포토레지스트를 도포하는 단계와, 그 위에 포토레지스트를 재차 도포하는 단계와, 그 위에 마스크를 덮고 자외선을 조사하는 단계와, 그 위에 재차 포토레지스트를 도포하는 단계와, 그 위에 마스크를 덮은 후 재차 자외선을 조사하는 단계와, 에칭을 실시하는 단계와, 에칭 후 몰더를 완성하여 그 위에 PDMS(Polydimethysiloxane)를 붓는 단계와, 그 위에 판체를 덮은 후 가압하여 경화시켜 형태를 안정화시키는 단계와, 판체와 실리콘 웨이퍼를 제거하는 단계를 거쳐서 몰더와 PDMS를 분리하여 주입공, 배출공, 배양액 투입공 및 박막상의 전극을 갖는 마이크로 채널을 완성하고, 각각의 주입공, 배출공, 배양액 투입공에 PDMS로 커버를 만들어 덮는 단계를 구성하여 세포의 융합과 배양이 하나의 장치에서 실시 되도록 함을 특징으로 하는 초소형 세포 융합 장치 제조 방법.

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