KR100862645B1 - 펩타이드 디포밀레이즈 저해 및 항균활성을 갖는 신규후미마이신 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 후미마이신 화합물과 그 화합물의 펩타이드 디포밀레이즈(Pepetide deformylase;PDF)을 저해하여 단백질 생합성 저해 활성을 갖는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 Staphylococcus aureus의 PDF 효소에 대하여 우수한 저해활성을 나타내며, Staphylococcus aureus 뿐만 아니라 methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 와 Quinolone-resistant Staphylococcus aureus (QRSA) 등 내성균에 대하여도 항균활성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 화합물은 기존의 항생제와는 전혀 다른 새로운 작용기전의 항생물질로서 내성균 및 여러 병원 미생물의 치료를 위한 항생물질로 사용할 수 있다.

펩타이드 디포밀레이즈 저해제, 항균활성, Staphylococcus aureus, 후미마이신

Description

펩타이드 디포밀레이즈 저해 및 항균활성을 갖는 신규 후미마이신 화합물{New fumimycin compound with peptide deformylase-inhibitory activity and antimicrobial activity}

도 1은 후미마이신의 S. aureus PDF 효소에 대한 Lineweaver-Burk 플롯 (A)과 그것의 Ki determination (B)을 나타낸다.

도 2는 후미마이신 물질의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 3은 후미마이신 물질의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 4는 후미마이신 물질의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 세균의 단백질 생합성효소 peptide deformylase (PDF)에 저해하여, 항균 활성을 나타내는 신규 후미마이신 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 새로운 peptide deformylase (PDF) 저해 물질을 탐색하기 위하여 전국의 토양, 식물체 등으로부터 분리된 곰팡이 및 방선균 균주의 배양액으로 부터 신규 단백질 생합성효소 peptide deformylase (PDF) 저해 활성물질을 스크리 닝하던 중, Aspergillus fumisynnematus F746 균주로 부터 신규 후미마이신 을 발견하였다. 본 발명에서는 후미마이신 물질의 화학구조 규명, 생물활성 특성 규명과 함께 그 제조방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

일반적으로 1990년 중반부터 시작한 병원 미생물 유전체 연구 결과, 새로운 항생제 타겟이 발굴되어 새로운 개념의 항생제 개발 가능성을 열어 주고 있다. 미생물 유전체 정보를 활용하여 발굴 검증된 새로운 항생제 타겟 중의 하나로서 단백질 생합성효소 peptide deformylase (PDF)가 있다. 세균이 단백질 합성을 위해 tRNA에 methionine이 결합된후 transformylase에 의해 formylation이 되고 단백질 합성이 다 끝난 후 peptide deformylase (PDF)에 의해 formyl기가 떨어지면서 활성 단백질이 된다. 이와 같이 PDF는 세균의 생육에 필수적인 효소이면서, 대부분의 병원균에 존재함으로써 항균 스펙트럼도 broad spectrum을 나타내어 훌륭한 항생제 target이다. 또한 사람에서는 미토콘드리아에서 유사한 유전자가 존재하나 아무런 기능도 하지 않는 것으로 밝혀져 사람에 대한 독성도 낮을 것으로 알려져 있다 (Drug Discovery Today 6(18) 954-961, 2001).

또한, PDF는 말라리아을 일으키는 Plasmodium falciparum 충과 같은 Apicomplexa에 존재하는 것으로 알려져 있다. 실제로 기존의 PDF 저해제인 actinonin이 Plasmodium falciparum 의 생육을 저해하는 것으로 보고되어 PDF 저해제는 말라리아 치료제로서도 유망하다.

지금까지 알려진 PDF 저해제로는 hydroxamate작용기를 가진 peptide 화합물인 actinonin와 다국적 제약회사인 Norvatis 사가 개발하여 임상 1상 중에 있는 reverse-hydroxamate 작용기를 가진 펩타이들 계열의 화합물인 LBM-415 와 BB-83698 화합물등이 알려져 있다. 그러나 이 화합물은 in vitro 항균 활성은 좋지만, peptide 화합물이기 때문에 인체 흡수 와 인체 내에서의 안정성의 문제점을 가지고 있다. 따라서 비 peptide 성의 새로운 PDF 저해제 개발이 요청되고 있다 (Curr. Med. Chem. 12: 1607-1621, 2005).

이에 따라 본 연구진은 미생물, 식물 등 천연물로부터 비 peptide 성의 새로운 PDF 저해물질 탐색연구를 수행하는 중 Aspergillus fumisynnematus F746 라는 토양 곰팡이로부터 독특한 구조의 새로운 물질을 발견하여 그 이름을 후미마이신(fumimycin)이라 명명하였고, 그 항균활성을 확인하여 본 특허를 완성하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 도출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 PDF 저해 항균 활성물질을 제공하는 것이다.

이에 따라 본 발명자들은 미생물의 대사 산물로부터 새로운 PDF 저해 활성물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, PDF를 강하게 억제하는 물질을 생산하는 곰팡이를 발견하고 생산균주의 미생물학적 특성을 규명함과 동시에 그 균주의 배양액으로부터 새로운 구조의 후미마이신 물질을 순수하게 분리 정제한 후 화학구조를 결정하고 활성을 검토 확인함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식를 갖는 화합물을 제공한다.

본 발명의 상기 화학식를 갖는 화합물은 펩타이드 디포밀레이즈 저해 항균물질을 가진다.

또 본 발명은 유효성분으로서 상기의 화합물 또는 입체 이성질체를 포함한 그의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Staphylococcus aureus , methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 와 Quinolone-resistant Staphylococcus aureus (QRSA) 대한 항-세균제 또는 말라리아 치료제로서 사용되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 a) 본 발명의 화합물 생산균주를 배양하는 단계; b) 상기 a)단계에서 얻어진 균주 또는 이의 배양액을 얻는 단계; c)상기 단계에서 얻어진 균주 또는 이의 배양액을 추출하여 추출물을 얻는 단계; 및 d) 상기 추출물을 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 본 발명의 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 본 발명의 화합물을 생산하기 위한 곰팡이 Aspergillus fumisynnematus F746 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유 하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산 암모늄, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서는 식염, 칼륨, 마그네슘,코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 바람직하게는 26-30℃에서 배양한다. 또한, 배양기간은 진탕배양, 정치배양의 경우 모두 통상 4 일 내지 7일간 배양할 때 본 발명의 화합물의 생산이 최고에 달하였다.

상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 배양하면 본 발명의 화합물을 얻을 수 있는데, 본 물질은 배양액뿐만 아니라 균체 부분에도 존재하므로 다음의 방법에 따라 효율적으로 추출, 정제를 실시할 수 있다. 즉, 배양액 및 균사체에 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로로 용매추출한다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매층을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 클로로포름:메탄올을 10:1-1:1인 용매를 사용한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 실시한다. 이와 같이 얻어진 활성분획을 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에서 정제한 후 재차 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 얻을 수 있다.

이상과 같이 정제된 본 발명의 화합물의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다.

1)물질의 성상 : 흰색 분말

2) 고분해능 질량분석스펙트럼(HR-ESIMS): 356.07275 (M+Na)+

3) 편광도([α]D) : -11.9 (c 0.26, MeOH)

4) 분자식 : C₃₀H₄₄O₁₀

5)자외선흡수스펙트럼

: 212(4.38),239 (4.26), 257 (4.13), 266 (3.98), 316 (3.46)

6) 적외선(IR) 흡수 스펙트럼: 3429, 2927, 1797, 1637, 1315, 1151 cm-1

7)핵자기 공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : 클로로포름과 메탄올(CDCl3+ CD3OD)을 용매로하고 테트라메칠실란 (TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS 스펙트럼은 각각 도 2, 도 3, 도 4에 도시하였다.

본 발명은 상기의 이화학적 특성을 갖는 본 발명의 화합물은 물론 이들의 무기 또는 유기염,에스테르, 수화물 및 용매화물과 이성질체를 포함한 모든 유도체까지도 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나, 이 실시예에 본 발명이 국한되는 것은 아니며, 배지의 종류, 배양조건, 추 출정제 방법 등을 바꾸어도 본 물질을 얻을 수 있다.

< 실시예 1> Aspergillus fumisynnematus F746 균주의 분리

본 발명자들은 펩타이드 디포밀레이즈 저해활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 전국 토양으로부터 세균, 곰팡이, 방선균 를 분리한 후 강력한 펩타이드 디포밀레이즈 저해 항균활성을 갖는 곰팡이 F746 균주를 분리하였다. 상기 신규 후미마이신 화합물을 생산하는 F746 균주는 MEA에서 grayish green의 mycellium을 형성하였고, 노랑색의 색소를 방출하였다. conidiophores는 synnemata를 형성하면서 만들어졌고, conidial head는 grayish green 색이었다. vesicle은 hemispherical, 직경은 13.3-20.2 um이였다. Phialides의 4.7-6.3 x 1.4-2.1 um 이였고, conidia는 broadly ellipsoidal 형태의 2.4 -2.9 x 1.8 - 2.1 um 이였으며 smooth 하거나 finely roughen 형이었다. 이러한 배양, 형태학적 결과로부터 본 균주는 Aspergillus fumisynnematus으로 동정되어 Aspergillus fumisynnematus F746로 명명하였다. 본 발명자들은 상기 균주를 2007년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 유전자원센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 11090BP).

실시예 2: Aspergillus fumisynnematus F746 균주의 배양

상기 F543 균주를 배양하기 위하여 종 배지로는 yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, tryptone 0.5%, glucose 1%을 함유한 배지를 멸균 전에 pH를 5.5로 조절한 후 사용하였다.

상기의 종배지 20ml가 담긴 100ml 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 F543 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금이를 접종하여 28℃에서 3 일간 진탕배양하여 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, tryptone 0.5%, glucose 1%을 함유한 멸균된 배지가 들어 있는 500ml용량의 삼각플라스크 (48 개)에 종배양액를 접종하여 28℃에서 7일간 진탕 배양하였다.

실시예 3: 본 발명의 화합물의 분리 및 정제

상기의 실시예 1에서 배양한 배양액 및 균사체의 아세톤 추출액를 에틸아세테이트로 3번 용매 추출하였다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매츨을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 클로로포름:메탄올를 1:1인 용매로 한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이와 같이 하여 얻어진 활성분획을 감압농축하여 오일성 조유효 성분을 얻은 뒤 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피을 실시하여 좀더 정제된 활성분획을 얻을 수 있었다. 활성 분획은 0.01% TFA를 함유한 50% methanol를 이동상으로 하는 HPLC (YMC ODS 150×20 mm, Flow rate : 4 ml/min, UV 300 nm)를 실시하여 흰색의 후미마이신 물질을 얻었다.

실시예 4: 본 발명의 화합물의 PDF 저해활성

효소 역가 측정을 위해서 PDF-FDH 커플된 어세이를 구축하였다. 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 S. aureus PDF을 사용하였다. 역가 측정은 50mM HEPES 완충용액(pH 7.5) 중에서 수행하며 기질로는 f-MAS (N-formylmethionine-alanine-serine) 4 mM, NAD 2mM, BSA 1mg/ml을 사용하고 PDF를 30-50nM 사용하고, FDH (formate dehydrogenase)는 0.05 Unit를 사용한다. 효소를 첨가하고 상온에서 60분 반응시킨 후 UV-spectrometer를 이용하여 340nm에서 NADH의 흡광도 증가를 측정한다. 저해능을 평가한 화합물은 디메칠설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 전체 반응액의 5% 이내로 첨가하여 효소 저해능을 평가한다. 효소 저해능은 시험 화합물이 없는 상태에서의 NADH 증가 정도에 대한, 시험화합물의 NADH 증가 정도를 백분율로 표시하며 50%의 효소 활성을 저해하는 각 시험 화합물의 농도를 IC₅₀으로 결정한다.

그 결과는 도 1에 도시하였다. 도 1는 본 발명의 화합물의 S. aureus PDF에 대한 저해활성을 보여 준다. 도 1에서 보는 바와 같이 후미마이신 화합물의 S. aureus PDF 에 대한 저해활성은 농도 의존적으로 PDF를 강력하게 저해하였다. 후미마이신 화합물의 PDF 에 대한 IC50은 4.1 μM이였다. 또한 기질에 대하여 mixed-type inhibition을 보였으며, Ki 값은 4.9 μM 이였다.

실시예 5: 본 발명의 화합물의 항균 활성

시험주를 배양할 때에는 tryptic soy broth에서 배양을 하였으며 MIC test는 Mueller Hinton Agar (MHA)를 사용하였다. 균액을 만들어서 multi spot을 이용하여 접종을 하였으며 약 10⁵ - 10⁶ cfu가 되도록 접종을 하였다. 화합물은 DMSO(dimethylsulxoside)에 희석하였고 DMSO의 농도는 1/100정도로 맞추어서 실험을 실시하였다. 시험균주는 2 균주의 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains (CCARM3167, CCARM3506), 2 균주의 S. aureus , 2 균주의 quinolone-resistant S. aureus (QRSA) strains (CCARM 3505, CCARM 3519) 이였다. 후미마이신 화합물은 S. aureus, MRSA, QRSA 균주의 생육을 농도 의존적으로 저해하였으며, 100 ug/ml의 농도에서 생육을 완전히 저해하였다.

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 화합물은 우수한 PDF에 대한 저해활성을 나타내어, S. aureus, MRSA, QRSA 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 나타낸다.

Claims (7)

1. 하기 화학식의 화합물.

   

   [화학식]
2. 제 1항에 있어서 상기 화합물은 펩타이드 디포밀레이즈 저해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
3. 유효성분으로서 제 1 항의 화합물을 포함하는 S. aureus, 메티실린-저항성 S. aureus, 또는 퀴놀론-저항성 S. aureus에 대한 항균 효과가 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 삭제
5. 제 1항의 화합물을 생산하는 Aspergillus fumisynnematus F746 (수탁번호 : KCTC 11090BP).
6. 삭제
7. 삭제

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