KR100856335B1

KR100856335B1 - 지모로부터 분리된 화합물을 함유하는 호흡기 질환의 예방및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100856335B1
Application number: KR1020070055807A
Authority: KR
Inventors: 서은경; 장준; 이준; 배그린; 유재랑
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2008-09-04

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 화합물들은 RSV (Respiratory Syncytial Virus)에 대한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge), RSV (Respiratory Syncytial Virus), 항바이러스, 호흡기 질환, 약학조성물

Description

지모로부터 분리된 화합물을 함유하는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising the compounds isolated from Anemarrhena asphodeloides Bunge for the prevention and treatment of respiratory diseases}

본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 화합물을 함유하는 RSV 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytical virus: RSV)는 1차적으로 코와 목·입 등에 침입한 뒤 결막이나 코의 점막을 통하여 전파되며, 주로 바이러스에 오염된 손으로 눈이나 코를 만져 점막에 전파되거나 감염자의 기침·재채기 등에 의해 전파된다. 주로 겨울에 유행적으로 생기는데, 유아 및 소아의 바이러스성 하기도 (lower respiratory tract) 감염의 주요 원인으로서, 세계적으로 약 400만 소아들에게 감염되어 미국에서만 연간 100,000명의 환자 및 4,500명의 사망자를 발생시키고 있다. 이 바이러스에 감염되기 쉬운 집단은 선천적 질환이 있는 사람이 나 조산아·면역저하자 등이다. 어른은 감염되더라도 증상이 약하게 나타나지만 이 바이러스가 유행하는 동안에는 남에게 전염시킬 수 있다. RSV 감염은 소아들의 세기관지염의 회귀성 발작, 기관지 폐쇄 및 천식의 악화와 관련이 있다. RSV 감염에 의한 세기관지염의 발병율은 증가하고 있는 상태이다. RSV 감염에 대해 적용 가능한 유효한 예방법은 없는 상태이다. 포르말린-불활성화 RSV 백신을 이용한 백신을 개발하기 위한 시도들이 있어왔으나 이는 실패했을 뿐만 아니라 이후의 RSV 감염이 일어났을 때, 질병을 악화시켰다 (Chanock et al., Serious respiratory tract disease caused by respiratory syncytical virus: prospects for improved therapy and immunization, Prediatrics, 90, pp.137-143, 1992). 더욱이 RSV에 대한 치료법의 개발은 짧은 잠복기로 인해 제한되어 왔다. 따라서 RSV에 대한 치료방법의 개발은 세계적으로 매우 중요한 문제로 대두되어 왔다.

F 및 G 항원이 RSV에 대한 중화 항체의 대다수를 유도함에도 불구하고, RSV 항원의 대부분은 인간 및 마우스 내에서 면역원성이다 (Connors, et al., Respiratory syncytial virus (RSV) F, G, M2(22K), and N proteins each induce resistance to RSV challenge, but resistance induced by M2 and N proteins is relatively short-lived, J Virol, 65, p1634, 1991; Wyatt et al, Priming and boosting immunity to respiratory syncytial virus by recombinant replication-defective vaccinia virus MVA., Vaccine, 18, p392, 1999). 인간의 CLT 레퍼토리의 분석은 N, SH, F, M, M2 및 NS2 단백질이 강한 표적 항원임을 보여준다. 이와 유사하게, BALB/c 마우스에서, F, N, 및 특별히 M2 단백질은 CTL 활성의 주요 표적 항원인 것으로 나타났다 (Domachowske et al, Respiratory syncytial virus infection: immune response, immunopathogenesis, and treatment, Clin Microbiol Rev, 12, p298, 1999). 바이러스에 특이적인 세포독성 T 림프구는 RSV 감염의 면역매개제거(clearance)의 가장 중요한 역할을 한다. 혈청 및 점막의 항체 및 세포독성 T 림프구(CTLs)가 제한된 MHC-classⅠ은 RSV 감염에 대한 보호를 매개한다 (Brandenburg et al., Pathogenesis of RSV lower respiratory tract infection: implications for vaccine development, Vaccine, 19, p2769, 2001). 이미, 동물 및 인간 모델에서, 중화된 혈청 항체의 수동적인 투여는 RSV 질병의 위험을 감소시키는 것으로 나타났다 ( Hemming et al., Hyperimmune globulins in prevention and treatment of respiratory syncytial virus infections, Clin Microbiol Rev ., 8 (1), pp.22-33, 1995).

최근의 연구 결과에 따르면 유아에서뿐만 아니라 면역 기능이 저하된 노인들도 RSV 감염에 의해 심각한 하부 호흡기 질환을 앓게 되고 감염에 의한 사망률도 인플루엔자보다 높다는 사실이 보고되었다 (Falsey A.R. et al., Relationship of serum antibody to risk of respiratory syncytial virus infection in elderly adults, J Infect Dis, 177, pp.463-466, 1998)

현재 RSV 감염을 예방할 수 있는 백신은 개발되어 있지 않으며, 95% 인간화된 항-F 단일클론항체 (제품명: Synagis, MedImmune)가 예방제재로 1998년에 승인되어 2003년에는 $849 million의 매출을 기록한 바 있고, 광범위 항바이러스 제재인 리바비린 (Ribavirin)이 RSV 감염질환의 증상 완화 목적으로 유일하게 승인되어 현재 사용되고 있으나 임상적 이득율 (clinical benefit)이 매우 적어 일부 면역 저하된 환자에서만 사용되고 있다 (Guerguerian, A. M. et al., Ribavirin in ventilated respiratory syncytial virus bronchiolitis. A randomized, placebo-controlled trial, Am J Respir Crit Care Med, 160, pp.829-834, 1999).

이에 본 발명자들은 임상적 이득율이 높은 항바이러스 제제를 검색하던 중, 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 화합물들이 RSV에 뛰어난 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항바이러스 효과를 나타내는 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 화합물을 함유하는 RSV 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 하기 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 RSV (Respiratory Syncytial Virus) 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

(Ⅰ)

상기식에서,

R₁ 및 R₃은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기, C₁ 내지 C₃ 저급 알콕시기로부터 선택된 하나 이상의 치환기이고,

R₂는 수소원자, 에틸렌기, 에틸기 또는 메틸기이며,

“

”은 단일결합 또는 이중결합이다.

본 발명은 바람직한 일반식 (Ⅰ)의 화합물은 (-)-4'-O-메틸니아졸, (-)-니아졸, (-)-3”-메톡시니아졸 및 브로우소닌 A를 포함한다.

상기 RSV 감염으로 유발되는 호흡기 질환은 일반적인 호흡기 질환을 포함하며, 바람직하게는 감기증후군, 급성 기관지염, 급성 세기관지염, 비인두염, 급성 후두기관지염 (크룹) 및 폐렴을 포함한다.

또한 본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 RSV 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글 리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 상기 화학식 (1) 내지 화학식 (4)로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 RSV (Respiratory Syncytial Virus) 감염으로 유발되는 호흡기 질환 질환의 예방 및 개 선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물은 호흡기 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 인지 기능 장애의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르 탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예 에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 화합물 구조 결정

하기의 화합물들은 분석 TLC(analytical TLC)를 이용하여 각 성분의 순도를 평가하였으며, 단일 활성 성분임이 확인된 상태에서 각종 분광학적 IR(Bio-Rad Lavoratoories사, USA), Mass(JOEL사, Japane), ¹H-NMR(Varian사, CA), ¹³C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, 편광계 (Jasco P-1010), CD(Jasco J-810) 등을 실시하여 화합물의 구조를 결정하였다.

실시예 1. 지모 ( Anemarrhena asphodeloides Bunge ) 조추출물의 제조

옴니 허브 닷컴 (www.omniherb.com)에서 구매한 지모 5.4 kg을 100% 메탄올 25ℓ에 넣고 환류 냉각 장치를 이용하여 수욕조 상에서 24시간 동안 추출하였다. 이 과정을 5회 이상 반복하여 상층액을 모은 후, 감압 농축하여 지모 조추출물 1kg을 수득하였다.

실시예 2. 지모 극성 및 비극성 용매 분획물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 지모 조추출물 1kg을 증류수 1ℓ에 현탁시킨 후, 헥산 1ℓ를 첨가하여 용해한 다음 이를 헥산층에 용해되는 성분만 분리하여 진공 건조하였다. 이 과정을 10회 반복하여 헥산 분획물 49g를 수득하였다. 남음 수층에 에틸아세테이트 1ℓ를 첨가하여 에틸아세테이트층에 용해되는 성분만 분리해서 진공 건조하였다. 이 과정을 10회 반복 수행하여 에틸아세테이트 분획물 30g를 수득하였다. 상기와 동일한 과정으로 수행하여 n-부탄올 분획물 428g 및 수층 490g를 수득하였다.

실시예 3. (-)-4'-O- 메틸니아졸 ((-)-4'-O- methylnyasol )의 분리 정제

상기 실시예 2에서 얻은 용매 분획 중 가장 활성이 높은 에틸아세테이트 분획 40g를 클로로포름: 아세톤 혼합용매 (99:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하여 14개의 분획으로 분리하고, 이들 분획 중 2번 분획 550㎎을 다시 메틸렌 클로라이드: 아세토니트릴 혼합용매 (99:1 → 9:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카겔 60, 230 내지 400메쉬, Merk사)를 실시하였다. 이로부터 나온 6번 분획에서 활성 성분인 (-)-4'-O-메틸니아졸 (4-[(1R,2Z)-1-ethenyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenyl], 화합물 1이라 명명함) 15㎎을 분리하였다.

(1)

화합물 (1): (-)-4'- O - Methylnyasol

무색 수지 (Colorless gum)

C₁₈C₁₈O₂ _.[α]²⁰ _D= -65.7˚ (c = 0.75, MeOH). CD (MeOH, c = 0.15 × 10^-2M): []₂₂₈ +12.5, []₂₅₂ -52.9.

EI-MS: m/z (%) = 266.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.81 (3H, OMe), 4.53 (1H, dd, J = 6.0, 9.6 Hz, H-3), 4.79 (1H, br s, OH), 5.15 (1H, d, J = 2 Hz, H-5a), 5.19 (1H, dt, J = 1.6, 8.8 Hz, H-5b), 5.70 (1H, dd, J = 10.2, 11.4 Hz, H-2), 6.05 (1H, ddd, J = 6.0, 10.4, 17.2 Hz, H-4), 6.55 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-1), 6.78 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3"/H-5"), 6.88 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-3'/H-5'), 7.11 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-2"/H-6"), 7.23 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2'/H-6').

¹³C NMR (100MHz, CDCl₃) δ 47.0 (C-3), 55.5 (OMe), 113.9 (C-3"/C-5") 115.3 (C-5), 115.6 (C-3'/C-5'), 128.9 (C-1), 129.1 (C-2"/C-6"), 130.1 (C-2'/C-6'), 132.0 (C-2), 135.9 (C-1"), 141.0 (C-4), 154.3 (C-4"), 158.8 (C-4').

실시예 4. (-)- 니아졸 ((-)- Nyasol )의 분리 정제

상기 실시예 2에서 얻은 용매 분획 중 가장 활성이 높은 에틸아세테이트 분획 40g를 클로로포름: 아세톤 혼합용매 (99:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하여 14개의 분획으로 분리하고, 이들 분획 중 3번 분획 504㎎을 다시 클로로포름: 아세토나이트릴 혼합용매 (49:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하고, 이로부터 나온 9번에서 12번까지의 분획을 합친 분획 42㎎을 다시 메탄올: 물 혼합용매 (7:3 → 10:0)를 사용하여 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(ODS-A 실리카겔 12 nm, S-150 , YMC-gel)를 실시하고 이로부터 나온 6번 분획에서 활성 성분인 (-)-니아졸 ((-)-4,4'-(3-ethenyl-1-propene-1,3-diyl)bis-, 화합물 2라 명명함) 565㎎을 분리하였다.

(2)

화합물 (2): (-)- Nyasol

황색 점액성 오일 (Yellow sticky oil)

C₁₇C₁₆O₂ _.[α]²⁰ _D = -75.3˚ (c = 0.5, MeOH).

CD (MeOH, c = 0.5 × 10^-2M): []₂₂₈ +7.2, []₂₅₂ -32.8.

EI-MS: m/z (%) = 252.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.50 (1H, dd, J = 6.0, 10.0 Hz, H-3), 4.89 (2H, br s, OH), 5.14 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-5a), 5.18 (1H, dt, J = 1.6, 7.2 Hz, H-5b), 5.68 (1H, dd, J = 10.0, 11.6 Hz, H-2), 6.01 (1H, ddd, J = 6.4, 11.2, 16.8 Hz, H-4), 6.53 (1H, d, J = 11.2 Hz, H-1), 6.79 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3"/H-5"), 6.80 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3'/H-5'), 7.11 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2"/H-6"), 7.18 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2'/H-6').

¹³C NMR (100MHz, CDCl₃) δ 47.0 (C-3), 115.3 (C-5), 115.4 (C-3'/C-5'), 115.6 (C-3"/C-5"), 128.8 (C-1), 129.1 (C-2"/C-6"), 130.1 (C-1'), 130.3 (C-2'/C-6'), 132.0 (C-2), 135.8 (C-1"), 140.9 (C-4), 154.3 (C-4"), 154.8 (C-4').

실시예 5. (-)-3”- 메톡시니아졸 ((-)-3”- Methoxynyasol )의 분리 정제

상기 실시예 2에서 얻은 용매 분획 중 가장 활성이 높은 에틸아세테이트 분획 40g를 클로로포름: 아세톤 혼합용매 (99:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하여 14개의 분획으로 분리하고, 이들 분획 중 3번 분획 504㎎을 다시 클로로포름: 아세토나이트릴 혼합용매 (49:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하고, 이로부터 나온 5번에서 8번까지의 분획을 합친 분획 219㎎을 다시 메탄올: 물 혼합용매 (7:3 → 10:0)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (ODS-A 실리카겔 12 nm, S-150 , YMC-gel)를 실시하고 이로부터 나온 9번에서 12번까지의 분획을 합친 분획 130㎎을 다시 메탄올 100% 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (세파덱스 LH-20)를 실시하여 이로부터 나온 2번 분획 50㎎을 벤젠: 에틸아세테이트 혼합용매 (19:1)를 사용하여 다시 분취 TLC (Preparative TLC)를 5회 반복 실시하여 1번 분획에서 활성성분인 (-)-3”-메톡시니아졸 ((-)-[(1R,2Z)-1-ethenyl-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenyl]-2- methoxy-, 화합물 3이라 명명함) 11㎎을 분리하였다.

(3)

화합물 (3): (-)-3”- methoxynyasol

무색 수지 (Colorless gum).

C₁₈C₁₈O₃ _.[α]²⁰ _D= -70.5˚ (c = 0.25, MeOH).

CD (MeOH, c = 0.25 × 10^-2M): []₂₂₉ +3.3, []₂₅₄ -27.2.

UV (MeOH) _max (log ) 207.0 (4.47), 257.0 (4.09)nm.

IR (KBr) 3500(br), 1680, 1610, 1510, 1460, 1376, 1282, 1128, 1022, 930, 810, 762cm^-1.

EI-MS: m/z (%) = 282.1264. calced. for [C₁₈C₁₈O₃]⁺: 282.1256).

¹H NMR (400MHz, CD₃OD) δ 3.79 (3H, OMe), 4.48 (1H, dd, J = 9.6, 6.0, H-3), 5.11 (1H, dt, J =10.6, 7.2 H-5a), 5.15 (1H, d, J =10.4, H-5b), 5.67 (1H, dd, J = 10.0, 11.8, H-2), 6.05 (1H, ddd, J = 6.0, 9.6, 16.4, H-4), 6.49 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-1), 6.66 (1H, dd, J = 2.4, 8.4, Hz, H-6″), 6.72 (1H, d, J = 8.4Hz, H-5″), 6.75 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-2″), 6.75 (2H, d, J = 2.4 Hz, H-3′/H-5′), 7.13 (2H, d, J = 2.0, 8.4 Hz, H-2′/H-6′).

¹³C NMR (100MHz, CD₃OD) δ 48.9 (C-3), 56.5 (OMe), 112.5 (C-2″), 115.1 (C-5), 116.2 (C-3′/C-5′), 116.4 (C-5″), 121.3 (C-6″), 130.0 (C-1), 130.1 (C-1′), 131.1( C-2′/C-6′), 132.5 (C-2), 136.6 (C-1″), 142.8 (C-4), 146.2 (C-4″), 149.2 (C-3″), 157.9 (C-4′).

실시예 6. 브로우소닌 A ( Broussonin A)의 분리 정제

상기 실시예 2에서 얻은 용매 분획 중 가장 활성이 높은 에틸아세테이트 분획 40g를 클로로포름: 아세톤 혼합용매 (99:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카 겔 60, 230 내지 400 메쉬, Merk사)를 실시하여 14개의 분획으로 분리하고, 이들 분획 중 4번 분획 1g를 다시 헥센: 에틸아세테이트 혼합용매 (9:1 → 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (실리카겔 60, 230 내지 400메쉬, Merk사)를 실시하였다. 이로부터 나온 4번 분획 219㎎을 다시 메탄올: 물 혼합용매 (1:1 → 8:2)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (ODS-A 실리카겔 12 nm, S-150 , YMC-gel)를 실시하고 이로부터 나온 7번 분획에서 활성 성분인 브로우소닌 A (2-[3-(4-hydroxyphenyl) propyl]-5-methoxy-, 화합물 4라 명명함) 55㎎을 분리하였다.

(4)

화합물 (4): Broussonin A

비결정성 고체 (Amorphous solid).

EI-MS: m/z (%) = 258.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.79 (2H, m, H-2), 2.50 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-3), 2.51 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-1), 3.72 (3H, OMe), 6.31 (1H, dd, J = 2.0, 7.6 Hz, H-5'), 6.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-3'), 6.70 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3"/H-5"), 6.86 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6'), 6.97 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2"/H-6")

¹³C NMR (100MHz, CDCl₃) δ 30.4 (C-1), 33.6 (C-2), 35.94(C-3), 55.72 (OMe), 99.89 (C-3'), 107.68 (C-5'), 116.10 (C-C-3"/C-5), 123.0 (C-1'), 130.4 (C-2"/C-6"), 131.3 (C-6'), 135.0 (C-1"), 156.2 (C-4"), 157.7 (C-2'), 159.8 (C-4').

실험예 1. RS 바이러스 스탁 제조 및 항바이러스 활성 측정

RS 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus) A2 균주는 ATCC에서 구입한 HEp-2 사람세포주 (American Type Culture Collection, Manassas, VA; Cat. No. CCL 23)를 이용해서 2% FBS를 함유한 MEM 배지에서 증식시켰다. HEp-2 세포 감염 후 바이러스에 의한 세포독성 현상이 강하게 나타나는 72~96 시간 후에 감염된 세포와 상층액을 모두 회수하고 세포는 3회의 냉동-해동을 반복하여 파괴하고 여기에서 얻은 상층액을 배양상층액과 함께 모아 초원심분리 (100,000 x g)를 1시간 동안 시행하여 바이러스를 침전시키고 적절한 양의 배지에 현탁시킨 후 스탁으로 사용하였다. 바이러스 항체 역가 (titer)는 베로 세포주 (Vero cell line)를 이용해 플라크 에세이 (plaque assay)를 시행하거나 HEp-2 세포주에서 제한희석법 (limiting dilution)으로 TCID50을 결정해 사용하였다. IC₅₀을 측정하기 위해 96 웰 세포배양 플레이트에 80% 컨플루언시 (confluency)로 HEp-2 세포주를 분주하고 MOI (multiplicity of infection) 0.1에 해당하는 RS 바이러스를 양성 대조군으로서 리바비린 (ribavirin) 또는 테스트하고자 하는 상기 실시예 3 내지 6에서 분리한 화합물 (1) 내지 화합물 (4)의 시료와 함께 배지에 섞어 넣어주었다. 일반적으로 48시간에서 72 시간 사이에 플레이트에서 상층액만 회수하여 정량 RSV ELISA를 시행하였다.

실험예 2. 정량 RSV ELISA

탄산완충액 (carbonate buffer)에 1: 1000으로 희석시킨 생쥐 항-인간 RSV 융합 단백질 항체 (mouse anti-human RSV Fusion protein antibody, clone No. 8.F.248; US Biological사로부터 구입)를 Maxisorp™ ELISA 8-웰 스트립 (Maxisorp™ ELISA 8-well strips, Nalge Nunc International사)에 부착시켰다. 2% BSA가 함유된 PBS-Tween20 (PBST)을 완충액으로 블로킹 (blocking)한 후, 100㎕의 희석된 RS 바이러스 또는 활성 에세이에서 회수된 배양 상층액을 각각의 웰에 넣어주고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. PBST 완충액으로 4차례 세척 후 염소 항-RSV-HRP 콘쥬게이트 항체 (US Biological사)를 1: 1000으로 희석하여 넣어주고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 PBST 완충액으로 5회 세척 후 TMB 마이크로웰 페록시다제 (TMB microwell peroxidase, KPL사) 기질을 넣어주고 발색 시킨 후, 50㎕의 0.5 NH₂SO₄ 첨가로 반응을 중지시키고 ELISA 리더에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

화합물	RSV / HEp-2 세포
화합물	IC₅₀ (μM)
화합물 (1)	0.39
화합물 (2)	0.85
화합물 (3)	0.49
화합물 (4)	0.62
리바비린 (Ribavirin, 양성 대조군)	1.15

실험 결과, 본 발명의 화합물 (1) 내지 (4)가 양성대조군인 리바비린보다 낮은 농도로도 높은 항 RSV 활성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

(-)-4'-O-메틸니아졸 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

(-)-니아졸 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

(-)-3”-메톡시니아졸 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

브로우소닌 A 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

(-)-니아졸 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

(-)-4'-O-메톡시니아졸 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E (분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B₁ 0.25 g

비타민 B₂ 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 지모로부터 분리된 화합물들은 RSV에 뛰어난 항바이러스 활성을 나타냄으로서, RSV 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Claims

지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 (-)-4'-O-메틸니아졸, (-)-니아졸, (-)-3”-메톡시니아졸 또는 브로우소닌 A를 유효성분으로 함유하는 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus: RSV) 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus: RSV) 감염으로 유발되는 호흡기 질환은 감기증후군, 급성 기관지염, 급성 세기관지염, 비인두염, 급성 후두기관지염 (크룹) 또는 폐렴인 약학조성물.
지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge)로부터 분리된 (-)-4'-O-메틸니아졸, (-)-니아졸, (-)-3”-메톡시니아졸 또는 브로우소닌 A를 유효성분으로 함유하는 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus: RSV) 감염으로 유발되는 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.