KR100826209B1

KR100826209B1 - 산뽕나무 추출물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR100826209B1
Application number: KR1020060138176A
Authority: KR
Inventors: 한규형; 김진수; 변상원; 김남경
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-04-30

Abstract

본 발명은 산뽕나무 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 노화방지용 조성물, 대사증후군 예방 또는 개선용 조성물, 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 조성물 또는 항산화제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 노화방지, 대사증후군 및 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 효과적인 SIRT3의 발현을 촉진시키고, 항산화효과를 갖는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)의 발현을 촉진시킬 뿐만 아니라, 인체에 무해한 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 또는 항산화제에 관한 것이다.

산뽕나무, SIRT3, 노화방지, 대사증후군, 알츠하이머병, 항산화

Description

산뽕나무 추출물을 포함하는 조성물{COMPOSITION COMPRING AN EXTRACT OF MORUS BOMBYCIS}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 산뽕나무 추출물의 세포독성을 측정한 그래프이고,

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 산뽕나무 추출물에 의한 SIRT3 유전자 및 SOD 유전자의 발현 촉진여부를 측정한 그래프이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 노화방지, 대사증후군 및 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 효과적인 SIRT3의 발현을 촉진할 수 있고 항산화효과를 갖는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)의 발현을 촉진할 수 있는 산뽕나무 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

최근 통계청이 발표한 2005년 총인구 중에서 65세 이상 노령인구의 비율은 9.1%를 차지하고 있고, 14세 이하 유년인구의 비중은 점차 줄어들고 있으며, 65세 이상 인구의 비중은 지난 2000년에 7.2%를 기록하여 우리 사회는 이미 고령화 사회로 진입한 것으로 평가된다. 또한, 2003년 기준으로 우리나라 국민의 평균수명은77.5세로 노령인구가 급격하게 증가되고 있는 추세이다. 한편, 통계청이 발표한 우리나라 1인당 GNI는 2004년 14,162달러였으며, 매년 10% 이상 증가하고 있어 삶의 질은 점차 나아지고 있다고 할 수 있다. 이러한 사회적 조건의 변화에 의해, 과거 주요한 사망원인인 전염성 질병에 의한 사망자 수는 급격하게 줄어들고 있는 반면에 암, 뇌혈관질환, 대사증후군에 의한 사망자 수는 꾸준히 증가하고 있다.

특히, 평균수명이 증가하고 사회의 고령화가 진행되면서 노화에 관한 관심 및 노화와 관련된 질병 특히, 뇌신경세포 손상과 관련된 퇴행성 신경질환 등에 대한 관심이 증대되고 있다. 또한, 산업화 및 식생활의 변화에 따라 대사증후군의 발병률 및 이에 따른 사망률이 증가되면서 당뇨 또는 비만 등의 대사증후군에 대한 관심이 증대되고 있다. 이와 함께, 노화의 원인 및 다양한 질병의 원인으로 생각되는 활성산소(free radical)에 대한 관심이 증대되면서 항산화효과를 갖는 물질에 대한 관심이 증대되고 있다.

노화와 관련하여 다양한 정의가 있으며, 세포 복제와 관련하여 사람의 정상 체세포가 가지는 한정된 복제 수명 즉, 한정된 세포분열 후에 더 이상 세포 분열을 할 수 없는, 결국 역행할 수 없는 성장의 멈춤 단계를 노화로 정의한다 (Tominaga et al., Mech. Ageing Dev. 123: 927936 (2002)). 노화는 신경퇴화 질환, 암 또는 당뇨병 등의 대사증후군 등의 질병과 관련이 있으며, 이러한 노화와 관련된 원인으로 유전학적 원인, DNA손상의 축적(Sedelnikova et al., Nat. CellBiol. 6: 168170 (2004)), 산화적 스트레스에 대한 반응(Campisi et al., Exp. Gerontol. 36: 607618 (2001)), 텔로미어의 손상(Harrington and Robinson, Oncogene 21: 592597 (2002))등이 알려져 있다. 생물체에는 개체의 노화와 수명에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 유전자 경로가 존재하는 것으로 보고되어 있고, 몇몇 실험동물의 경우 개체의 수명을 결정할 수 있는 유전자, 예를 들어 초파리의 methuselah, Indy 또는 Sir2 등이 보고되어 있다.

한편, 대부분의 생물은 병균, 해충 또는 바이러스 등의 생물학적 스트레스 뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 생기는 각종 환경 스트레스를 받으면 생명 유지에 필요한 필수 원소인 산소는 반응성이 높아 심각한 생리적 장애 등을 유발하는 활성산소종(reactive oxyzen species)으로 변하게 된다. 따라서 생체 내에는 이러한 활성산소종을 제거하는 시스템으로 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutasse, SOD, EC 1. 15. 1. 1), 퍼옥시다제(perosidase, POD), 카탈라제(catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E 또는 글루타치온(glutathion) 등의 항산화 물질 등이 많이 존재하게 된다.

이 중, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)는 거의 모든 생물에 존재하고, 활성산소종을 제거하는 생체 방어 기구에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.

상기와 같은 대사증후군 및 퇴행성 신경질환 등의 질병을 예방 또는 개선하는 물질 특히, 사람 개체의 노화를 방지할 수 있는 즉, 수명을 연장할 수 있는 물질이나 체내에서 활성산소종을 제거하거나 활성산소종의 활성을 약화시키는 물질을 검색하는 방법을 수립하기는 어렵다.

그러나, 최근에는 특정 질병 또는 노화와 관련이 있는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 개발함으로써 상기 질병을 예방 또는 개선하는 물질 또는 노화방지 물질을 개발하는 방법이 제시되고 있다. 식물이 환경 스트레스에 반응하여 생산하는 레스베라트롤 등의 폴리페놀 물질이 Sir2의 활성을 촉진시킴으로써 효모의 복제 수명과 꼬마선충 또는 초파리 등의 수명을 증가시키고 사람 세포의 생존능력을 향상시키는 현상이 보고됨으로써 상기 방법의 타당성이 입증되었다.

상기와 같은 타당성이 입증됨에 따라, SIRT3 유전자 등과 같이 특정 질환 또는 사람 개체의 수명과 밀접한 상관관계가 있는 유전자를 대상으로 이들 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 부작용의 위험성이 최소화된 천연물로부터 개발하려는 요구가 증대되고 있다.

또한, 활성 지속 기간이 길지 않은 문제점을 해결하기 위하여, 체내에서 활성산소종을 제거할 수 있는 SOD의 발현을 조절할 수 있는 물질을 부작용의 위험성이 최소화된 천연물로부터 개발하려는 요구가 증대되고 있다.

이러한 요구에 따라, SIRT3 유전자 및 SOD 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연식물 유래의 물질을 찾으려는 노력이 진행 중에 있다.

본 발명은 SIRT3 유전자 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자의 발현을 촉진하여 노화를 방지하고, 대사증후군 또는 퇴행성 신경질환을 예방 또는 개선할 수 있으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자의 발현을 촉진하여 항산화 효과가 있을 뿐만 아니라 인체 에도 무해한 천연식물인 산뽕나무 유래 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SIRT3(Silent information regulator 2 related protein gene 3) 유전자 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자 발현을 촉진하는 산뽕나무(Morus bombycis) 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노화방지, 대사증후군 예방 또는 개선 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자 발현을 촉진하는 산뽕나무(Morus bombycis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화제를 제공한다.

본 발명자는 SIRT3 유전자 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자의 발현을 촉진하여 노화방지, 대상증후군 또는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선 효과가 있으며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자의 발현을 촉진하여 항산화 효과가 있는 천연식물 유래의 물질을 연구하던 중, 산뽕나무 추출물이 SIRT3유전자의 발현을 직접 조절하고, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자의 발현을 간접적으로 조절하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 산뽕나무(Morus bombycis)란 천연，잡종 및 변종의 모든 산뽕나 무를 포함하고， 바람직하게는 한국에서 자생하는 천연 산뽕나무에 관한 것을 의미한다． 상기 산뽕나무는 쌍떡잎식물 쐐기풀목 뽕나무과의 낙엽소교목에 속하고,한국·일본·중국·타이완 및 사할린 섬 등지에 분포하며, 통상적으로 7 내지 8 미터의 높이까지 자라고, 나무껍질은 잿빛을 띤 갈색이며, 작은 가지는 잔털이 나거나 없고 점차 검은빛을 띤 갈색이 된다. 잎은 달걀 모양이거나 넓은 달걀 모양이며, 통상적으로 길이는 8 내지 15cm이고 너비는 4 내지 8cm이다. 꽃은 암수 다른 구루에서 피거나 웅성화로서 5월에 핀다. 수꽃이삭은 새가지 밑에서 아래로 처지고, 암꽃이삭은 녹색 타원형이며 꽃자루에 잔털이 나고 암술머리는 2개이다. 열매는 집합과로서 6월에 자줏빛을 띤 검은색으로 익으며, 육질로 되는 화피가 합쳐져서 1개의 열매처럼 된다.

상기 산뽕나무는 주로 기구재， 조각재， 조림수 등으로 사용되고 잎은 누에의 사료로 사용되며 나무껍질은 약용이나 제지용으로 사용된다． 산뽕나무는 한의학에서는 청열(淸熱)시키고, 이수(利水)시키는 효능이 강하며 특히 심장 쪽의 열을 많이 없애준다고 하고, 잎， 줄기， 열매 등이 모두 한약재로 널리 사용되어 왔다.

본 발명에서 추출물이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미하며, 통상적으로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조되며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출과정을 거친 추출액을 분획한 것도 포함된다.

본 발명의 추출물의 용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있으 며, 구체적으로는 물, 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저가 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있고, 가장 바람직하게는 70 내지 100% 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명의 추출대상은 산뽕나무이며, 구체적으로는 상기 산뽕나무의 꽃, 잎, 줄기, 껍질, 꽃봉우리, 뿌리, 열매 및 종자로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있고, 바람직하게는 줄기일 수 있다.

상기 산뽕나무 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 구체적으로는 상기 산뽕나무 추출물은 산뽕나무를 건조하는 공정 상기 산뽕나무 건조물을 분쇄하는 공정 및 용매로 추출하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되며, 상기 추출공정에 의해 얻어진 추출액을 여과하는 공정이나 상기 여과공정에 의해 얻어진 여과액을 농축하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 제조방법은 농축된 여과액을 건조시키는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 산뽕나무 추출물은 산뽕나무 줄기를 건조하고, 상기 건조된 산뽕나무 줄기를 분쇄하고, 상기 분쇄물에 물, 탄소수 1 내지 4의 저가 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 중량비 1:2 내지 1:5(분쇄물:용매)로 가하여 70 내지 80℃에서 3 내지 5시간 환류추출 후, 이를 여과하고 감압농축하여 농축물을 수득하는 방법으로 제조할 수 있으며, 상기 수득한 수득물을 동결건조하여 용매가 제거된 분말로 제조할 수 있다.

본 발명의 산뽕나무 추출물은 상기 성분 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 산뽕나무 추출물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 산뽕나무 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

본 발명에서 포유동물의 Sir2 단백질인 SIRT(Silent information regulator 2 related protein, sirtuin)는 SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 및 SIRT7의 7 종류가 있는 것으로 보고 되어 있다. 이 단백질들은 모두 잘 보존된 NAD-dependent sirtuin core domain을 갖고 있으며 수명 조절 역할을 할 수 있는 것으로 보고 되고 있다. 일 예로서, 상기 SIRT3은 Accession No가 NM012239인 SIRT3일 수 있다.

상기 SIRT는 다양한 종류의 조직에서 두루 발현이 되며, 4 종류 즉, SIRT1 내지SIRT3으로 구성되는 class I, SIRT4로 구성되는 class II, SIRT5로 구성되는 class III 및 SIRT6과 SIRT7로 구성되는 class IV로 분류된다(Frye, Biochem. Biophys. Res. Commun. 273: 793798 (2000)).

이 중, class I에 속하는 포유동물의 SIRT1(Silent information regulator 2-related protein type 1)과SIRT3(Silent information regulator 2-related protein type 3)는 핵(SIRT1)과 미토콘드리아의 매트릭스에(SIRT3)에 존재한다는 점에서 차이가 있으나, 칼로리제한(calorie restriction)에 의하여 발현이 증가되고(Cohen et al., Science 305: 390-392 (2004); Shi et al., J Biol Chem. 280(14):13560-13657 (2005)), 공통적으로 대사 조절에서 중추적인 역할을 하는 PGC-1알파(PPAR gamma coactivator 1 alpha)를 활성한다는 공통점이 있다.

한편, 미토콘드리아는 세포에 에너지를 공급할 뿐 아니라 DNA 손상이나 산화 스트레스에 반응하여 세포사를 유도하는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 보다 상세하게는 특히 포유동물의 노화의 한 원인으로 보고되고 있는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 생산하는 미토콘드리아의 비정상적인 활성이 포유동물의 노화와 당뇨병 등의 대사질환 및 알츠하이머병 등의 퇴행성 신경질환 등의 다양한 질환과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보고되어 있다.

또한, Sir2 단백질과 노화 및 다양한 종류의 질병과의 관계에 대한 연구가 진행 중이며, 특히 최근에는 포유동물의 Sir2 단백질인 SIRT에 대한 연구 특히, class I 중에서 상기 SIRT1과 미토콘드리아에 존재하는 상기 SIRT3와 포유동물의 노화와 당뇨병 등의 대사증후군 및 알츠하이머병 등의 퇴행성 신경질환의 치료와 관계가 있는 것으로 확인되고 있다.

본 발명에서 노화란 노령화에 따라서 나타나는 생체의 퇴화적변화를 의미하는 통상적인 현상을 의미하며, 성장이 완료, 정지되고 그 이후에 일어나는 모든 과정을 의미할 수 있다.

상기 노화는 일반적으로 세포에 색소가 축적되거나 세포자체나 핵이 작아지 는 현상, 세포내 DNA가 끊어지거나 끊어진 경우 수복력이 감소하거나, 면역력이 저하하는 현상, 세포 내에 색소가 침착되는 현상을 포함하고, 신경퇴화 질환, 암 또는 당뇨병 등의 대사증후군 등의 질병과 관련이 있을 수 있다. 상기 노화의 원인으로는 유전학적 원인, DNA손상의 축적, 산화적 스트레스에 대한 반응 또는 텔로미어의 손상 등일 수 있다.

구체적으로, 즉, 칼로리제한(CR)만이 효모, 선형동물, 초파리 등의 하등생물은 물론 포유동물에서 노화를 지연시키고 암, 심혈관 질환, 당뇨병 등의 대사증후군의 발병을 감소시킴으로써 수명을 연장시키는 효과적인 방법으로 유일하게 보고되어 있다.

상기한 칼로리제한과 노화방지를 효모에서 측정한 결과, 칼로리제한을 수행한 효모에 의하여 수명이 20 내지 40% 증가되었으며, 이러한 수명의 증가는 NAD+-의존성 히스톤 디아세틸레이즈(NAD+-dependent histone deacetylase)를 발현하는 Sir2 유전자의 발현(silent information regulator 2)이 요구됨이 보고되었다(Lin et al., Science 289: 2126-2128 (2000)). 뿐만 아니라 Sir2 단백질의 농도를 증가시키면 수명이 연장되고 농도를 감소시키면 수명이 감소함도 보고되었다. 구체적으로 Sir2 유전자가 한 개 늘어난 효모는 수명이 50% 증가한 반면 Sir2 유전자가 제거된 효모는 수명이 줄어들었다(Kaeberlein et al., Genes Dev. 13: 25702580 (1999)).

효모 뿐만 아니라 다른 모델동물인 꼬마선충과 초파리에서도 상기와 같은 칼로리제한의 노화방지 효과 즉, 개체 수명 연장 효과(Tissenbaum and Guarente, Nature 410: 227-230 (2001); Rogina and Helfand, Proc Natl Acad Sci U S A. 101(45): 15998-16003 (2004)) 및 칼로리제한에 의한 노화방지 효과에 Sir2의 발현이 필수적으로 요구된다는 점이 보고되었다(Lin et al., Science. 289: 2126-2128 (2000); Rogina and Helfand, Proc Natl Acad Sci U S A. 101(45): 15998-16003 (2004) Wang and Tissenbaum, Mech Ageing Dev. 127(1): 48-56 (2006)). 상기 보고된 결과에서 특히, Sir2 활성이 NAD+ 의존한다는 것은 대사 상태가 개체의 수명 조절과 매우 밀접한 관계가 있음을 의미한다.

또한, SIRT1 유전자의 발현과 노화와 관련된 연구결과에 의하면, SIRT1의 활성을 촉진시키는 것으로 알려진 resveratrol은 모델동물의 수명을 증가시키는 것으로 보고 되어 있다(Lagouge et al., Cell 127: 1109-1122 (2006)).

또한, SIRT3 유전자의 발현과 수명과의 상관관계에 대한 연구결과에 의하면, 단백질 1차구조에 변화를 유발하지 않는 G477T 트랜스버션 돌연변이가 남성 노인의 생존과 관련이 있음이 발견되었으며(Rose et al., Exp Gerontol. 38(10): 1065-1070 (2003)), 945명 (20-106세)의 사람에서 SIRT3 대립유전자의 분포를 분석한 결과, 90세 이상의 남성에서 5번 인트론의 인핸서(inhancer) 활성이 없는 대립유전자는 사실상 발견되지 않았으므로 사람 SIRT3 유전자의 발현정도와 수명 사이에서 상관관계가 있는 것으로 입증되었고(Bellizzi et al., Genomics 85(2): 258-263 (2005)), 상기 인트론에서는 72 염기쌍이 기본 단위인 variable number of tandem repeats (VNTR)가 발견되었으며, 이 VNTR이 인핸서로 기능한다는 것이 트랜스펙션 방법으로 조사되어 보고 되어 있다.

즉, 상기한 연구결과는 SIRT1 또는 SIRT3 유전자의 발현 및 활성을 증가시키는 것이 사람의 수명을 연장시켜 노화를 방지할 수 있는 것으로 보고하고 있다.

본 발명에서 퇴행성 신경질환이란 신경 특히, 뇌신경과 관련된 여러 가지 질병을 총칭하는 용어를 의미한다. 바람직하게는 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 치매, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis), 파킨스씨 병(Parkinson's disease, PD), 심근경색증(myocardial infarction) 또는 헌팅턴병일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병, 근위축측삭경화증, 파킨스씨 병, 심근경색증 또는 헌팅턴병일 수 있다.

상기 알츠하이머병(Alzheimer disease, AD) 등의 퇴행성 신경질환과 관련하여, 칼로리제한과 항산화제 투여 방법은 노화와 알츠하이머병의 모델 쥐에서 뿐만 아니라 일부 사람을 대상으로 한 알츠하이머병 임상 시험에서도 효과가 있음이 보고 되어 있다.

구체적으로, 알츠하이머병 모델의 신경세포의 미토콘드리아에 아밀로이드 베타(amyloid beta)가 축적됨이 발견되었고, 미토콘드리아에서 활성산소의 생성이 증가되면서 산화에 의한 손상(oxidative damage)이 유발됨이 보고되었으며, 이러한 산화에 의한 손상이 알츠하이머병의 발병과 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Manczak et al., Hum Mol Genet. 15(9):1437-49 (2006)); Reddy, J Neurochem. 96(1):1-13 (2006)).

또한, 간헐성 알츠하이머병(Sporadic Alzheimer disease)의 랫트 모델에서 SIRT1 활성을 촉진시키는 resveratrol은 인지능력 퇴화를 방지함이 발견되었 고(Sharma and Gupta, Life Sci 71: 2489-2498 (2002)), SIRT1은 쥐 신경세포에서 알파-세크라타제(alpha-secretase)의 활성을 증가시킴으로써 아밀로이드 베타의 축적을 방지하여 알츠하이머병을 예방할 수 있음이 in vitro 신경세포 배양 실험과 in vivo 형질전환 쥐 실험을 통하여 규명되었다(Qin et al., J Biol Chem. 281(31):21745-54 (2006)).

또한, SIRT1은 헌팅턴병(Huntington disease) 모델 쥐에서 신경세포를 보호함이 관찰되어, SIRT1은 헌팅턴병 및 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환 환자의 신경세포를 보호할 수 있는 것으로 보고 되어 있다(Parker et al., Nature Genet 37: 349-350 (2005); Sinclair, Nature Genet 37: 339-340 (2005)).

또한, 알츠하이머병의 경우 미토콘드리아에 아밀로이드 베타(amyloid beta)가 축적되어 산화 스트레스가 증가하는 것이 특징으로 보고되어 있고, SIRT3는 미토콘드리아의 활성산소의 생산을 감소시키고 전자전달을 증가시키므로, 산화 스트레스를 줄임으로써 아밀로이드 베타의 독성을 약화시킬 수 있어 알츠하이머병 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선에 효능이 있는 것으로 기대되고 있다.

본 발명에서 대사증후군이란 대사장애 특히 당대사장애로 인하여 발생하는 질병으로, 통상적으로 인슐린 저항성으로 인하여 발생하는 당뇨병, 비만, 고혈압, 뇌졸중, 고지혈증 및 심혈관 질환 등의 각종 성인병을 포함한다. 바람직하게는 상기 대사증후군은 비만, 당뇨병 또는 심혈관 질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비만 또는 당뇨병일 수 있다.

상기 당뇨병은 제1형 당뇨병으로 알려진 '인슐린 의존형 당뇨병' 및 제2형 당뇨병으로 알려진 '인슐린 비의존형 당뇨병'을 모두 포함한다. 상기 비만은 유전적 요인, 환경적 요인, 식습과 및 운동부족 등의 다양한 원인으로 발생하는 과체중현상 및 이에 수반하는 현상을 모두 포함한다.

대사증후군과 관련하여, 칼로리제한과 과식 등에 의한 비만, 당뇨 등의 대사증후군은 서로 반대 개념이라는 전제에 의해 진행된 연구에서 SIRT1의 활성을 증가시키는 경우, SIRT1을 매개하는 탈아세트화(deacetylation)이 촉진되어 PGC-1알파를 활성화시켜 미토콘드리아의 기능을 향상시키고 음식에 의한 비만과 인슐린 저항성으로부터 보호할 수 있음이 보고되었으며(Guarente, Nature 444: 868-874 (2006)), SIRT1의 활성을 촉진시키는 것으로 알려진 resveratrol은 모델동물의 수명을 증가시키고 생쥐에서 미토콘드리아의 기능을 향상시키고 음식에 의한 비만과 인슐린 저항성 등 대사증후군으로부터 보호할 수 있음이 발견되었다(Lagouge et al., Cell 127: 1109-1122 (2006)).

또한, SIRT3와 비만 등의 대사증후군 예방 또는 개선과의 관계에 대한 연구에 의해서 SIRT3 유전자의 발현량 증가는 대사증후군의 치료에 효과적인 것으로 보고되어 있다.

구체적으로는 히스톤과 튜뷸린 등의 다양한 단백질을 대상으로 아세틸기를 제거하는 히스톤 디아세틸레이즈 활성을 갖고 있으며, 칼로리제한은 쥐의 백색 지방 조직과 갈색 지방 조직에서 SIRT3 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었음이 보고되었고, SIRT3는 수 종의 유전적 비만 쥐의 갈색 지방조직에서 발현이 감소함이 관찰되었음이 보고되어 SIRT3는 미토콘드리아 기능을 활성화시키고 갈색 지 방조직에서의 적응성 발열 작용에서 중요한 역할을 하는 것 즉, 비만 등의 대사성 질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다(Shi et al., J Biol Chem. 280(14): 13560-13657 (2005)). 또한, SIRT3는 SIRT1과 마찬가지로 칼로리제한에 의해 발현이 증가되고 PGC-1알파를 활성화하므로 대사증후군의 예방 및 개선에 효능이 있는 것으로 인정되고 있다.

또한, HIB1B 갈색 지방세포에서 SIRT3의 발현 증가는 PGC-1알파(PPAR gamma coactivator 1 alpha)를 포함한 다수의 미토콘드리아 관련 유전자의 발현이 증가되는 것으로 보고되었으며, SIRT3를 지속적으로 발현시키면 막전위와 활성산소의 생산은 감소되지만 세포 호흡은 증가하는 것으로 보고되어, 항산화와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고 되어 있으며(Shi et al., J Biol Chem. 280(14): 13560-13657 (2005)), 상기의 결과는 SIRT3의 발현량 증가는 대사증후군의 예방 및 개선에 효능이 있다는 것을 지지하는 것으로 인정되고 있다.

본 발명에서 항산화용 조성물이란 체내에서 생물학적으로 중요한 ROS 또는 다른 반응성 산소 종을 청소제거하거나 유리 라디칼 또는 다른 반응성 산소 종을 보다 약한 반응성 종으로 촉매적으로 전화변화시키는 작용을 하는 물질을 의미한다. 즉, 활성산소종을 제거하거나 활성산소종의 반응성을 약화시키는 물질을 의미한다. 상기 활성산소종은 O₂ ^-, H₂O₂, HO, HOCL, 페릴, 페록실, 페록시니트릴 및 알콕실로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 의미한다. 구체적으로는, 상기 항산화용 조성물이란 체내에서 활성산소종을 제거하는 역할을 하는 슈퍼옥사이드 디스 뮤타제(superoxide dismutase, SOD)의 발현량을 증가시키는 조성물을 포함하는 것이다. 일 예로서, 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)는 Accession No.가 NM000454인 SOD일 수 있다.

또한, 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 발현량을 증가시키는 경우, 암 특히, 유방암의 암세포를 저해하여 항암제로 이용될 수 있으며(Weydert et al., Free Radic Biol Med. 41(2):226-37 (2006)), 활성산소종에 의한 산화적 손상(oxidative stress)을 감소시켜 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis)이나 파킨스씨 병(Parkinson's disease, PD)과 같은 퇴행성 신경질환(chronic neurodegenerative disease)을 치유할 수 있는 것으로 보고되어있다(Pong K., Expert Opin Biol Ther. Feb;3(1):127-39 (2003) Maier CM et al., Neuroscientist. 8(4):323-34(2002)).

또한, 상기 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 발현량을 증가시키는 경우, 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하는 심혈관계 질환 및 상기의 신경퇴행성 질환을 포함하는 중추신경계 질환(central nervous system disorders)의 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 보고 되어 있다(Maier CM et al., Neuroscientist. 8(4):323-34(2002)).

즉, 산뽕나무 추출물은 SIRT3 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 발현량을 증가시킴으로써, 당뇨병, 비만, 고혈압, 뇌졸중, 고지혈증 또는 심혈관성질환 등의 각종 성인병을 포함하는 대사성 질환, 알츠하이머병, 치매, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis), 파킨스씨 병(Parkinson's disease, PD), 심 근경색증(myocardial infarction), 헌팅턴병 또는 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis) 등의 퇴행성 신경질환(chronic neurodegenerative disease), 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke) 또는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 포함하는 심혈관계 질환 및 유방암을 포함하는 암의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.

본 발명의 상기 SIRT3(Silent information regulator 2 related protein gene 3) 유전자 발현을 촉진하는 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노화방지, 대사증후군 예방 또는 개선 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 용도로 하는 조성물 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자(superoxide dismutase) 발현을 촉진하는 산뽕나무(Morus bombycis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 산뽕나무추출물을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 SIRT3(Silent information regulator 2 related protein gene 3) 유전자 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자(superoxide dismutase) 발현을 촉진하는 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노화방지, 대사증후군 예방 또는 개선 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 용도로 하는 조성물 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자(superoxide dismutase) 발현을 촉진하는 산뽕나무(Morus bombycis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 또는 의약 조성물을 제공한다.

상기 SIRT3(Silent information regulator 2 related protein gene 3) 유전자 발현을 촉진하는 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 노화방지, 대사증후군 예방 또는 개선 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 용도로 하는 조성물 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자(superoxide dismutase) 발현을 촉진하는 산뽕나무(Morus bombycis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 또는 의약 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다.

본 발명의 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럼제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명인 상기 식품 조성물 또는 의약 조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 산뽕나무 추출물을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 상기 조성물은 식품으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 산뽕나무 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 산뽕나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 것외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.001 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 산뽕나무 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상 기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

또한, 노화방지, 대사증후군 예방 또는 개선, 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선 또는 항산화의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 산뽕나무 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 산뽕나무 추출물은 사람 HepG2 세포주에서 SIRT3 mRNA의 양을 증가시키는지 여부를 RT-PCR/real time PCR 방법으로 조사한 결과, 산뽕나무 줄기의 에탄올 추출물이 SIRT3 유전자의 발현을 촉진할 수 있음을 발견하였다. SIRT3 유전자는 조직 특이성이 없이 다양한 조직에서 발현되므로 SIRT3 유전자 발현을 측정하기 위하여 특정 조직에서 유래된 세포주를 사용할 필요가 없으므로, 간암세포주인 HepG2 세포주에서의 실험결과로부터 산뽕나무 추출물이 인체에서 SIRT3 유전자의 발현을 직접적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 산뽕나무 추출물은 노화 관련 질병의 발생 및 노화와 밀접하게 연 관되어 있는 산화 스트레스에 대응하는 대표적인 효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈superoxide dismutase (SOD)에 미치는 영향을 조사한 결과, SOD 유전자의 발현은 간접적으로 촉진할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: HepG2 세포주의 배양

HepG2 세포주(ATCC No. HB-8065)의 배양은 DMEM(Gibco BRL, USA)에 60℃ 항온조에서 30분간 열처리한 FBS(Gibco BRL, USA)를 10% 되게 첨가한 배양액에 배양하여 수행하였다. 구체적으로는 상기 HepG2 세포주를 100mm 배양접시(Corning, USA)에 10 ml로 유지하였고, 주기적으로 trypsin-EDTA 1ml을 첨가하였으며, CO2 배양기에서 1 내지 2분간 배양(incubation)한 후 DMEM(Gibco BRL, USA)에 60℃ 항온조에서 30분간 열처리한 FBS(Gibco BRL, USA)를 10% 되게 첨가한 배양액 5ml을 첨가하여 새 배양접시로 옮기는 방법으로 배양을 수행하였다.

실시예 2: 산뽕나무 추출물 제조

산뽕나무 줄기를 건조한 후, 상기 건조물을 최대 200 내지 300 메쉬로 분쇄하고, 분쇄물에 용매(70% 에탄올)를 1:3 중량비(분쇄물:용매)로 가하여 70 ℃에서 4 시간 환류추출 후, 이를 여과하고 감압농축하여 농축물을 수득하였다. 상기 수득물은 이후 동결건조하여 용매가 제거된 분말로 수득하였다.

실시예 3: MTT assay

산뽕나무 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여, 다양한 농도의 산뽕나무 추출물에서 대하여 통상의 방법으로 MTT assay를 수행하였다.

구체적으로는, 24-well plate에 한 well 당 3 x 104 세포가 되도록 준비한 후, 상기 실시예 2에서 제조한 산뽕나무 식물 추출물을 최종농도가 1X(4ng/μl), 0.3X(1.2ng/μl), 0.1X(0.4ng/μl) 및 0.03X(0.12ng/μl)가 되도록 처리한 후 24시간 동안 방치하였다. 24시간이 경과한 후, 상기 산뽕나무 추출물을 1X 생리식염수로 씻은 후에, MTT 용액을 최종농도가 0.5mg/ml가 되도록 처리한 뒤 60분간 배양하였다. 상기 MTT 용액을 처리한 배양액이 보라색 빛으로 변하는 것을 확인한 후에, 상층의 배양액을 제거하고 50% 이소프로파놀 700ul를 첨가한후 570nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 도 1에 나타난 바와 같이, 0.12ng/μl 및 0.4 ng/μl에서는 독성이 전혀 없었고 1.2 ng/μl에서는 84 %의 생존율이 4 ng/μl에서는 56 %의 생존율이 관찰되었다. 상기한 결과로부터 산뽕나무 추출물의 적정 사용량은 0.8 ng/ul으로 결정되었다.

실시예 4: HepG2 세포주로부터 mRNA 획득

HepG2 세포주로부터의 mRNA를 획득은 NucleoSpin RNA Ⅱ 키트(BD Bioscience, USA) 및 상기 키트의 제조사의 프로토콜(protocol)을 이용하여 수행하 였다.

구체적으로는 6 well plate에 5 x 105 cells/ well의 세포를 준비한 뒤, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 24시간 동안 배양한 세포 배양액에 실시예 2의 산뽕나무 추출물을 최종농도가 0.8ng/μl이 되도록 처리하거나(실시예 4-1) 사이클로헥사마이드(cycloheximide, Sigma, USA)를 최종농도가 500μM/μl이 되도록 처리한 뒤, 1시간 후 실시예 2의 산뽕나무 추출물을 최종농도가 0.8ng/μl이 되도록 처리하였다(실시예 4-2). 세포배양액에 아무것도 처리하지 않은 것을 대조예로 하였다.

상기 실시예 4-1 및 4-2와 대조예의 배양액에 trypsin-EDTA(Gibco, USA)를 가하여 세포를 수득하였다. 상세하게는, 세포가 포함된 6 well plate의 각 well의 배양액을 제거하고 PBS로 두 번 씻어낸 후, 남아있는 PBS를 모두 제거하고 trypsin-EDTA 200ul를 첨가하였다. 상기 trypsin-EDTA를 첨가한 세포를 CO₂ 배양기(incubator)에서 1분간 방치한 후, 500μl의 실시예 1의 배양액을 사용하여 파이펫으로 세포들을 plate에서 떨어뜨리는 방법으로 수득하였다.

상기 수득된 세포를 각각 1.5㎖ microfuge 튜브로 옮긴 후, 5,000rpm으로 1분간 원심분리를 수행하고, 배양액을 제거하였다. 상기 배양액을 제거한 후, 원심분리에 의해 튜브에 가라 앉은 세포를 생리식염수 100㎕를 추가하여 풀어준 후 상기 키트에 포함되어 있는 RA1 용액(cell lysis, BD Bioscience, USA) 350㎕와 β-메카토에탄올(β-mercaptoethanol) 3.5㎕를 넣고 천천히 섞어 세포를 파괴시켰다.

상기 세포를 파괴시킨 혼합액에 70% ethanol 350㎕를 첨가하고 천천히 섞은 후 전체 용액을 상기 키트의 컬럼으로 옮기고 8,000rpm에서 30초간 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리를 수행한 컬럼에 350㎕ MDB(membrane desalting buffer, BD Bioscience, USA) 용액을 컬럼에 넣어주고 8,000rpm에서 1분간 원심분리 수행한 후, DNase 1 용액(BD Bioscience, USA) 95㎕를 상기 원심분리를 수행한 컬럼에 넣어주고 상온에서 30분간 반응시켰다. 상기 DNase 1 용액을 반응시킨 컬럼에 RA2 용액(DNase stop solution, BD Bioscience, USA)을 200㎕ 첨가하고 8,000rpm에서 30초간 원심분리를 수행하였다. 상기 원심분리를 수행한 컬럼에 RA3 용액(washing, BD Bioscience, USA)을 600㎕ 첨가하고 8,000rpm에서 30초간 원심분리를 수행하고, 다시 RA3 용액을 250㎕첨가하여 11,000rpm에서 2분간 원심분리를 수행하였다.

상기 원심분리를 수행한 컬럼을 RNase가 전혀 없는 1.5㎖ microfuge 컬럼으로 옮기고 RNase가 전혀 없는 증류수 50㎕를 컬럼에 첨가하였다. 상온에서 2분간 방치한 후, 11,000rpm에서 2분간 원심분리를 수행하여 mRNA를 획득하였다.

실시예 5: SIRT3 유전자 및 SOD 유전자 발현 촉진 여부 측정

SIRT3 mRNA 농도 및SOD mRNA 농도에 미치는 영향을 Reverse transcription과 Real time PCR을 수행하여 확인하였다. Reverse transcription과 Real time PCR을 수행하여 얻어진 mRNA 의 상대적인 농도는 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자의 mRNA 농도와 비교하여 구하였다.

5-1. 역전사( Reverse transcription )

역전사는 Omniscript RT 키트(Qiagen, Germany) 및 상기 키트의 제조사의 프로토콜(protocol)을 이용하여 수행하였다.

구체적으로는 300ng/μl로 정량하여 준비된 상기 실시예 4-1 및 실시예 4-2에서 얻은 mRNA 6㎕, 10X reaction buffer 2㎕(Qiagen, Germany), 5mM dNTP 2㎕, oligo d(T)(Qiagen, Germany) 2㎕, RNase inhibitor(Qiagen, Germany) 1㎕, reverse transcriptase(Qiagen, Germany) 1㎕ 및 RNase가 전혀 포함되어 있지 아니한 증류수 6㎕를 넣고 총 20㎕의 부피로 37℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다.

5-2. 실시간 PCR

SIRT3(assession No. NM012239) 및 SOD 유전자(assession No. NM000454)의 발현량을 확인하기 위하여 상기 실시예 5-1에서 제조된 DNA를 주형으로 하고 GENE CYCLER(Bio-rad, USA) PCR기기를 이용하여, PCR을 수행하였다. 상기 Real Time PCR 반응의 반응액은 10 X 반응 완충액(+75mM MgCl₂, Sigma, USA) 5㎕, dNTP mixture(2.5mM dNTPs, TAKARA) 4㎕, 5uM primer(Bioneer Corp) 각 1㎕씩, 실시예 5-1에서 얻은 주형 cDNA 5㎕, 1/5,000 X SYBR Green(ROCHE) 1㎕, 32.5㎕의 증류수 및 0.5㎕(2.5unit) 의 ExTaq polymerase(TAKARA)를 넣어 최종 부피가 50㎕가 되도록 제조하였다.

상기 SIRT3 및 SOD 유전자의 발현량을 확인하기 위해 사용한 프라이머 쌍에 대하여 표 1에서 각각 기재하였다. 하기 표 1의 비교예는 housekeeping 유전자 중 하나인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH, assession No. NM002046)를 확인할 수 있는 프라이머를 사용하였다.

구분		염기서열	서열번호
SIRT3	정방향(forward, 19mer)	GTGGTTGATTTCCCCATGG	1
SIRT3	역방향(reverse, 19mer)	ACAAGGTCCCGCATCTCTT	2
SOD	정방향(forward, 19mer)	TGGGCAATGTGACTGCTGA	3
SOD	역방향(reverse, 19mer)	GGCCTCAGACTACATCCAA	4
비교예(GADPH)	정방향(forward, 19mer)	CCAACGTGTCAGTGGTGGA	5
비교예(GADPH)	역방향(reverse, 20mer)	CTGTAGCCAAATTCGTTGTC	6

상기 제조한 PCR 반응액을 표 2에 기재된 조건에서 PCR 반응을 수행하였다.

단계(step)	온도	반응시간
Denaturation	94℃	35sec
Annealing	57℃	25sec
Extension	72℃	25sec
Cycle	go to denaturation	40cycles

상기 PCR을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 vehicle로 표시된 것이 아무것도 처리하지 않은 대조예의 세포주로부터 얻은 결과이고, 산뽕나무로 표시된 것이 산뽕나무를 처리한 실시예 4-1의 세포주로부터 얻은 cDNA를 주형으로 한 결과이며, 산뽕나무 + CHX로 표시된 것이 산뽕나무 및 사이클로헥사마이드를 처리한 실시예 4-2의 세포주로부터 얻은 cDNA를 주형으로 한 결과이다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 산뽕나무를 처리한 실시예 4-1의 세포주로부터 얻은 cDNA를 주형으로 한 SIRT3 mRNA 농도는 대조예에 비하여 2.3배 증가함을 관찰할 수 있었다. 또한, 산뽕나무를 처리한 실시예 4-1의 세포주로부터 얻은 cDNA를 주형으로 한 SOD mRNA 농도는 대조예에 비하여 2.8배 증가함을 관찰할 수 있었다. 이와 유사한 패턴이 다른 세포주인 HeLa 세포주에서도 관찰되었다.

한편 산뽕나무 추출물에 의한 SIRT3와 SOD mRNA 양의 증가가 추출물의 직접적인 영향에 의한 것인지 여부를 조사하기 위하여 세포에 단백질 합성 억제제인 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX)를 먼저 처리한 후 산뽕나무 추출물을 처리한 실시예 4-2의 세포주로부터 얻은 cDNA를 주형으로 한 SIRT3 mRNA 농도를 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, SIRT3의 경우 사이클로헥사마이드 처리 후 1.7배 증가하였는데, 이는 사이클로헥사마이드를 처리하지 않았을 때의 2.3배 보다는 감소하였지만 아직도 SIRT3 mRNA 농도가 증가된 것으로 평가되었으며, 이 결과는 산뽕나무 추출물이 다른 단백질의 새로운 생산 과정이 필요 없이 직접적으로 SIRT3 유전자의 발현을 촉진하는 것을 나타낸다. 이에 비하여 SOD의 경우, 사이클로헥사마이드를 처리한 후 산뽕나무 추출물을 처리하여도 전혀 mRNA 양이 증가하지 않았으므로 다른 단백질의 생산이 SOD 유전자 발현의 촉진에 필요한 것으로 추정되며, 이는 산뽕나무 추출물이 간접적으로 SOD 유전자의 발현을 촉진하는 것을 나타낸다.

즉, 산뽕나무 줄기의 추출물은 GADPH 유전자의 발현양은 증가시키지 않는 반면, HepG2 세포주에서 사람의 수명 및 대사증후군과 퇴행성 신경질환과 상관관계가 있는 것으로 알려진 SIRT3 유전자의 발현을 직접적으로 촉진할 수 있는 것으로 보이며, 항산화와 연관이 있는 것으로 알려진 SOD 유전자의 발현을 간접적으로 촉진할 수 있는 것으로 나타나, SIRT3 및 SOD 유전자 발현양 증가에 특이적으로 효과가 나는 것으로 확인되었다.

실시예 6: 산뽕나무 추출물을 이용한 제제

제제예 1. 산제의 제조

산뽕나무 추출물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

산뽕나무 추출물 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

산뽕나무 추출물 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

산뽕나무 추출물 분말 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 식품의 제조

산뽕나무 추출물 분말 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B60.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산 제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1 인산칼륨 15 ㎎

제2 인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 산뽕나무은 사람의 수명 및 대사증후군과 퇴행성 신경질환과 상관관계가 있는 것으로 알려진 SIRT3 유전자의 발현을 직접적으로 촉진할 있고, 항산화와 연관이 있는 것으로 알려진 SOD 유전자의 발현을 간접적으로 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 인체에 부작용을 발생시키지 않으므로 이를 포함하는 조성물은 노화방지 및 상기 질병의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물 또는 의료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

산뽕나무 추출물을 포함하는 노화방지용 조성물의 제조방법으로서,

산뽕나무(Morus bombycis) 줄기를 70% 에탄올로 70 내지 80℃에서 3 내지 5시간 동안 추출하여 산뽕나무 추출물을 제조하는 단계를 포함하고,

상기 산뽕나무 추출물은 SIRT3(Silent information regulator 2-related protein type 3) 유전자 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD) 유전자발현을 촉진하는 것인

노화방지용 조성물의 제조방법.
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