KR100822028B1 - 정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 초산 2~4중량%, 개미산 0.05~0.15중량%, 프로피온산 0.05~0.15중량%, 쑥 성분 1~3중량%, 황산아연 0.01~1중량% 및 정제수 잔존량을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 정제된 목초액을 유효성분으로 함유하는 탈모방지용 약제가 제공된다. 본 발명의 정제된 목초액은 살균활성 및 항균성이 우수하고, 유해물질이 함유되어 있지 않아 독성이 없으며, 악취가 나지 않으며, 특히 느슨해진 두피조직에 탄력성을 부여하며 두피세정력이 뛰어나 탈모방지 및 발모촉진에 효과적이다.

조목초액, 목초정제액, 인산, 과산화수소수, 아세트산, 과아세트산, 메탄올, 포름산

Description

정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제{A pharmaceutical agent for preventing of alopecia and promoting hair restoration containing refined wood vinegar}

도 1은 본 발명의 정제된 목초액의 합성경로도를 나타내며,

도 2a는 본 발명의 정제된 목초액의 항균효과를 나타내는 사진이며,

도 2b는 비교예로서 에탄올의 항균효과를 나타내는 사진이이며,

도 3a는 음성 대조군에 대하여 C3H 마우스 헤어 재성장 시험결과를 나타내는 사진이며,

도 3b는 본 발명의 정제된 목초액 1.5%에 대하여 C3H 마우스 헤어 재성장 시험결과를 나타내는 사진이며,

도 3c는 본 발명의 정제된 목초액 3.0%에 대하여 C3H 마우스 헤어 재성장 시험결과를 나타내는 사진이며,

도 3d는 본 발명의 정제된 목초액 6.0%에 대하여 C3H 마우스 헤어 재성장 시험결과를 나타내는 사진이며,

도 3e는 양성 대조군에 대하여 C3H 마우스 헤어 재성장 시험결과를 나타내는 사진이며,

도 4a는 음성 대조군 적용시 C3H 마우스의 조직병리학적 검사결과를 나타낸 사진이며,

도 4b는 본 발명의 정제된 목초액 1.5% 적용시 C3H 마우스의 조직병리학적 검사결과를 나타낸 사진이며,

도 4c는 본 발명의 정제된 목초액 3.0% 적용시 C3H 마우스의 조직병리학적 검사결과를 나타낸 사진이며,

도 4d는 본 발명의 정제된 목초액 6.0% 적용시 C3H 마우스의 조직병리학적 검사결과를 나타낸 사진이며, 그리고

도 4e는 양성 대조군 적용시 C3H 마우스의 조직병리학적 검사결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제에 관한 것이며, 보다 상세하게는 쑥 분말을 이용하여 목초액의 탄내가 제거되고 황산아연을 이용하여 pH가 조절된 정제 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제에 관한 것이다.

조목초액은 목재의 탄화과정에서 발생되는 연기를 냉각시켜 얻어지는 액체를 장시간 숙성시키고 정제하여 얻어지는 액으로서 주성분은 아세트산이며, 퍼푸릴 산(furfuryl acid)등의 다양한 유기산류; 메탄올, 에탄올등의 알코올류등을 포함하는 혼합조성물이다.

즉, 목재를 숯가마 같이 공기가 적은 곳에서 300-400℃로 가열하면 탄화현상이 일어나 백색 연기가 발생되면서 목재는 숯으로 변한다. 이때 발생되는 연기가 냉각되어 얻어지는 액체가 조목초액이며, 조목초액에는 타르, 메탄올, 페놀 및 벤조피렌등의 유해물질이 함유되어 있다.

목초액은 세포내 활성산소의 제거능력이 우수하며, 아토피성 피부, 알레르기 및 여드름등의 피부질환, 당뇨, 변비, 소화불량, 무좀, 중이염, 암등 여러가지 질환에 대하여 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며 피부에 바르거나 혹은 음용시 함께 이용되어 왔다.

그러나, 상기와 같이 조목초액에는 타르, 페놀, 메탄올, 크레졸, 벤조피렌등과 같은 유해성분이 함유되어 있으며 또한, 목초액 고유의 탄내로 인하여 그 적용이 제한되고 있다. 따라서, 목초액을 직접 피부에 바르거나, 식품, 음료 및 화장품등에 첨가제로 사용하기에 적합하도록 하기 위한 조목초액의 정제 및 탈취가 요구된다.

예를들어, 대한민국 특허 212472호에는 95~105℃에서 증류하고 활성탄을 이 용하여 조목초액에서 메탄올과 페놀을 제거하는 방법이 개시되어 있다.

대한민국 특허출원 2001-61278호에는 비파엽을 이용하여 숙성 및 증류시켜 음용가능한 목초액을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 6개월이상의 장기 숙성이 요구되는 것으로 비효율적이다.

대한민국 특허출원 2001-9198호에는 -40~-7atm의 매우 낮은 압력에서 증류하는 단계를 포함하는 목초액의 감압증류 정제방법이 개시되어 있으나, 상기한 바와 같은 낮은 압력으로 유지하기 위해서는 상당한 비용이 소요되는 문제점이 있다.

또한 목초액이 탈모방지에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 현재 사용되고 있는 목초액은 탄내가 많이 나고 목초액의 강한 산성(약 pH 2.2~2.8)으로 인해 두피와 같은 민감한 피부에는 자극적이어서 부작용이 일어날 수 있는 문제가 있다.

이에 본 발명의 목적은 유해성분 및 탄내가 제거된 정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제를 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 정제된 목초액을 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제 가 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

목재의 탄화과정에서 발생되는 연기를 냉각시켜 얻어지는 조목초액은 탄화로 인한 탄내와 유해물질을 포함한다. 따라서, 본 발명에서는 촉매를 이용하여 목초액중에 다량 함유되어 있는 산 및 알코올 성분으로부터 유효유기산이 형성되도록 함으로써 우수한 살균활성을 갖으며 유해물질과 탄내는 제거된 정제된 목초액을 이용한다.

조목초액은 대부분, 구체적으로는 약 60중량%의 아세트산, 퍼프릴산등을 포함하는 다양한 산류와 메탄올, 에탄올등의 알코올류등으로 이루어진다. 본 발명에서는 다양한 산류와 알코올류가 포함된 조목초액이 출발물질로 사용된다.

본 발명에 따라 조목초액중의 다양한 성분중 특히 아세트산 및 메탄올이 각각 과아세트산과 포름산인 유효 유기산으로 전환되고 포름산의 흡착력에 의해 조목초액이 정제된다. 본 발명의 조목초액 정제방법의 합성경로도를 도 1에 나타내었다.

조목초액 성분중 아세트산과 메탄올이 과아세트산 및 포름산등의 유효 유기 산으로 산화되도록 조목초액을 과산화수소수와 반응시키되, 인산존재하에서 30~70℃, 바람직하게는 50~70℃로 반응시킨다. 이때 과산화수소수는 산화제로서 인산은 촉매로서 사용된다.

조목초액을 인산존재하에서 과산화수소수와 30~70℃로 반응시키면, 하기 화학식 1과 같이 목초액중 아세트산은 과아세트산으로 그리고 하기 화학식 2와 같이 메탄올은 포름산으로 산화된다. 상기 산화반응시 조목초액중에 미량 포함되어 있는 퍼푸릴산은 퍼푸릴아세트산(furfural acetic acid)으로, 페놀은 카르보아세트산(carbolic acetic acid)으로 그리고 에탄올은 아세트산(Acetic acid)으로 각각 전환되나, 이중 퍼푸릴아세트산 및 카르보아세트산은 미량으로 존재하며, 후속적인 증류단계에서 제거되고 아세트산은 과아세트산으로 산화된다.

하기 반응식 1과 같이 목초액중 아세트산은 과아세트산으로 그리고 하기 반응식 2와 같이 메탄올은 포름산으로 산화된다. 상기 산화반응시 조목초액중에 미량 포함되어 있는 퍼푸릴산은 퍼푸릴아세트산(furfural acetic acid)으로, 페놀은 카르보아세트산(carbolic acetic acid)으로 그리고 에탄올은 아세트산(Acetic acid)으로 각각 전환되나, 이중 퍼푸릴아세트산 및 카르보아세트산은 미량으로 존재하며, 후속적인 증류단계에서 제거되고 아세트산은 과아세트산으로 산화된다.

[반응식 1]

CH₃COOH + H₂O₂ --> CH₃COOOH + H₂O

[반응식 2]

CH₃OH + H₂O₂ --> HCOOH + 2H₂O

생성된 카르복실산에 과산화수소(H₂O₂)의 첨가는 환원작용이 강한 활성수소(H₂)와 전기음성도가 큰 산소(O₂)를 공급해 주는 효과를 제공하여, 아래 화학식 1-3과 같은 안정된 수소결합의 이합체(dimer)를 형성하게 되어 의약적 활성도가 높은 살균력을 발휘하며 활성수소에 의해 활성산소를 감소시켜주므로 부작용이 저감된다.

[화학식 1]

초산이합체 구조도

[화학식 2]

포름산이합체 구조도

[화학식 3]

프로피온산이합체 구조도

과아세트산은 균류 및 곰팡이류에 대한 우수한 제거능 및 억제성을 그리고 포름산은 우수한 살충성을 가지므로, 본 발명의 정제방법에 의해 아세트산이 과아세트산으로 그리고 메탄올이 포름산으로 산화된 목초액은 우수한 살균, 살충 및 항진균성등이 항균효과를 나타낸다.

또한, 포름산(HCOOH)은 고무성 물질 및 유기 단백질류등을 응집시키는 작용을 하는 산으로 상기 반응식 2의 반응에 의해 형성된 포름산에 의해 조목초액에 포함되어 있는 타르, 페놀, 크레졸, 벤조피렌등과 같은 유해성분을 포함하는 불순물등이 탄화현탁물로 응집되고 응집된 탄화현탁물은 여과에 의해 용이하게 제거된다. 상기 포름산에 의해 탄화현탁물이 응집제거됨에 따라 탄내 또한 동시에 제거된다.

아세트산 및 메탄올의 과산화수소수를 이용한 산화반응은 약 30~70℃, 바람직하게는 50~70℃에서 행하여진다. 상기 반응은 반응온도가 30℃ 미만이면 반응에 장시간이 소요되며, 약 70℃를 초과하면 저비점 알코올류가 휘발되므로 바람직하지 않다.

또한, 상기 산화반응은 약 8-12시간정도 행한다. 반응시간이 8시간 미만이면, 아세트산과 메탄올이 과아세트산과 포름산으로 충분이 산화되지 않으며, 12시간정도 반응시키면 상기 화학식 1 및 2에 따른 산화반응이 충분히 진행되어 더 이상 반응이 진행되지 않음으로 12시간이상 반응시키는 것은 비경제적이다.

상기 산화반응 후, 약 36~40시간 방치하는데, 방치시 시간경과에 따라 포름산에 의해 조목초액중에 포함되어 있는 탄화현탁물이 응집된다. 방치시간이 36시간 미만이면 탄화현탁물이 충분히 응집되지 않으며, 40시간을 초과하더라도 더 이상 응집되지 않음으로 약 36~40시간동안 방치하므로써 탄화현탁물이 충분히 응집된다.

본 발명의 방법에서 산화제로 사용되는 과산화수소수는 목초액중의 아세트산 및 메탄올의 함량을 측정하고 이들이 상기 반응식 1 및 2에 따라 과아세트산과 포름산으로 충분히 전환될 수 있는 화학양론적 양으로 사용될 수 있다. 그러나, 실제 반응에서는 반응이 충분히 진행되도록 다소 과량, 예를들어, 약 5-10중량% 과량으로 첨가될 수 있으며, 이로써 한정하는 것은 아니나, 예를들어, 조목초액 100g 당 2.5~4.0g의 과산화수소수가 첨가될 수 있다.

촉매인 인산은 소량 사용될 수 있으며, 이로써 한정하는 것은 아니나, 예를들어, 조목초액 100g당 0.1~2.5g의 인산이 사용될 수 있다. 인산을 0.1g 보다 적게 사용하면 반응촉진 효율성이 낮아져 바람직하지 않고 2.5g이상 사용하면 반응촉진 효율성이 더 이상 향상되지 않으므로 비경제적이다.

포름산에 의해 응집되어 형성되는 탄화현탁물의 응집물은 고형물로서 여과제거된다. 즉, 목초액중의 유해성분인 타르, 페놀, 크레졸, 벤조피렌등이 응집물 형태로 제거될 뿐만 아니라, 탄내 또한 제거된다.

1차 증류후 증류물에 건조된 쑥 분말을 약 1-3중량%, 바람직하게는 약 2중량%의 양으로 첨가하고 70~90℃로 3.5~4.5시간동안 착향시킨 다음, 추가로 증류하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 이때 첨가되는 쑥 분말은 착향제로 작용하여 목초액의 탄내를 현저히 감소시켜준다. 쑥 분말의 첨가량이 1중량%미만인 경우에는 착향효과가 미미하며 3중량%를 초과하는 경우에는 너무 진한 쑥향으로 인해 오히려 거부감이 생길 수 있어 바람직하지 않다. 착향조건이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 적절한 쑥향이 제공될 수 없다. 또한 이러한 추가 증류시 수행조건은 이에 한정하는 것은 아니나 약 90-120℃에서 약 3.5-4.5시간동안 수행하는 것이 바람직하다. 바람직하게 상기 추가 증류는 수율이 약 80%에 이를때까지 수행한다.

또한, 본 발명의 조목초액의 정제방법은 2차 증류물의 pH를 3-3.5로 조절하는 단계를 포함한다. pH가 3.5를 초과하는 경우에는 황산아연을 첨가하여 pH를 3-3.5으로 조절하는 것이 바람직하다. 또한 만일 2차 증류물의 pH가 3미만인 경우에는 초산나트륨을 첨가하여 pH를 조절할 수 있다. 보다 바람직하게 상기 2차 증류물의 pH는 3.3-3.5으로 조절된다. 이와 같이, 정제된 목초액의 pH를 3-3.5으로 조절함으로써 초산, 개미산 및 프로피온산이 각각 혼재된 상태로 변성되지않고 유지될 수 있다.

이와 같이 정제된 본 발명의 목초액은 초산 2~4중량%, 개미산 0.05~0.15중량%, 프로피온산 0.05~0.15중량%, 쑥 성분 1-3중량%, 황산아연 0.01-1중량% 및 정제수 잔존량을 포함하여 이루어진다. 또한 상기 목초액은 초산나트륨을 미량 포함할 수 있다. 예를들어, 초산나트륨은 적량%로 포함될 수 있다.

상기 방법으로 정제된 유해물질 및 탄내가 제거된 목초액은 희석하여 음용할 수 있으며, 피부등에 직접 적용가능하며, 식품, 음료 및 기타 화장품등에 첨가제로 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 분야로의 활용이 기대된다. 예를들어, 식품, 음료 및 화장품등에 본 발명에 의한 방법으로 정제된 목초액은 10중량%이내의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 정제된 목초액은 식물, 음료 및 화장품등에 필요로 하는 작용, 효과등을 고려하여 적합한 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 식품첨가제는 현재 법규상 첨가량이 최고 5중량%로 규제되고 있으므로 정제된 목초액은 식품, 음료 및 화장품등에 5중량%이하로 첨가될 수 있다. 목초액은 또한, 의약품 합성시 주원료로 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 정제된 목초액은 특히 탈모방지에 효과적으로 사용될 수 있다. 상기 목초액은 탈모방지용 약제로 사용되는 경우 상기 목초액은 약제 전체 중량의 5-10중량%이하로 함유되는 것이 바람직하다. 또한 상기 목초액외에 일반적으로 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제학적 분야에서 통상적인 것으로, 예를들면, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있다. 본 약제의 통상적인 1회 투여용량은 경피투여하는 경우 1,000~3,0000mg/kg의 용량이 바람직하다. 그러나 본 약제의 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병증의 경중정도에 따라 달라질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

둥근플라스크에 조목초액 600g 을 첨가하고 이에 80% 인산 2g을 첨가하였다. 그 후, 상기 플라스크에 냉각 콘덴서 장치를 설치하고 상기 조목초액에 30% 과산화수소수 24g을 서서히 투입하고 110rpm으로 교반하면서 70℃로 가열하여 8시간동안 반응시켰다. 그 후, 상온에서 40시간 방치하고 방치함에 따라 형성되는 응집물을 여과한 다음 증류기에서 90-120℃로 4시간동안 가열증류하여 정제 목초액 410g(수득율 약 68%)를 얻었다.

상기 얻어진 정제된 목초액의 물리적 특성과 독성물질 함유 여부에 대하여 평가하였다.

(1) 물리적 특성

정제 목초액은 국립산림과학원 고시 제2004-04호(2004.6.22)의 목초액의 규격과 품질 제9조 품질기준 및 품질시험 기준에 의한 방법으로 시험하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

보메비중 (g/ml)	산량 (%)	pH	용해타르 (%)	굴절률 (% Brix)	색상
0.8	3.7	2.5	0.01	2.6	투명한 연미색

(2) 독성물질 함유여부

GC-ECD법으로 정제된 목초액중 독성물질 함유여부를 측정(한국화학시험연구원)하였으며 그 결과, 상기 정제된 목초액에서 α- BHC, β-BHC, γ-BHC, δ-BHC, o.p-DDT, p.p-DDT, o.p-DDD, p.p-DDD, o.p-DDE, p.p-DDE, 알드린(aldrin), 다이엘 드린(Dieldrin) 및 엔드린(Endrin)이 검출되지 않았다.

실시예 2

둥근플라스크에 조목초액 600g을 첨가하고 이에 83% 인산 1g을 첨가하였다. 그 후, 상기 플라스크에 냉각 콘덴서를 설치하고 조목초액에 30% 과산화수소수 20 g을 서서히 투입하고 100rpm으로 교반하면서 60℃로 가열하여 6시간동안 반응시켰다. 그 후, 가열을 중단하고 40시간동안 방치하여 탄화현탁물이 응집되도록한 다음 응집된 탄화현탁물을 여과하여 제거하였다

탄화현탁물이 제거된 목초액에 숯가루 2g을 첨가하고 24시간동안 상온에서 방치한 다음 9.0 mbar로 감압여과하여 숯가루를 제거하였다. 여과 후, 증류기에서 90-120℃로 약 4시간동안 가열증류하여 정제 목초액 390g(수득율63%)를 얻었다.

상기 얻어진 목초액의 항균성, 물리적 특성 및 유해물질 함유여부에 대하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

(1) 항균성

항균성은 KS K 0692에 따른 할로 테스트(Halo Test)로 측정하였다.

즉, 항균성 시험은 사면배지(Sabouraud Dextrose Agar)에 저장중인 트리코피톤 러브럼(Trichophyton rubrum)균으로부터 포자현탁액을 제조한 다음 포자현탁액 200㎕를 로드 배양(rod culture)하고, 배지 중앙에 멸균 디스크를 올려놓은 다음 본 실시예에서 정제된 목초액 50㎕과 대조시료로서 70% 에탄올 50㎕를 각각 떨어뜨린 후, 24-26℃에서 7일동안 배양한 다음 억제대(Inhibition Zone)의 지름을 측정하여 항균성을 평가하였다. 본 실시예에서 정제된 목초액을 사용한 경우의 억제대를 나타내는 사진을 도 1a에, 그리고 에탄올을 사용한 경우에 형성되는 억제대를 나타내는 사진을 도 1b에 나타내었다. 도 1a에서 알 수 있듯이 본 실시예에서 정제된 목초액의 경우에는 중앙으로부터 투명한 넓은 항균억제대가 형성됨에 반하여, 알코올이 사용된 도 1b는 항균억제대가 거의 형성되지 않았는 바, 이로부터 목초액의 우수한 항균성을 알 수 있다.

(2) 물리적 특성 및 유해물질 함량

목초액의 산도 및 고형분은 국립산림과학원 고시 제2004-04호 목초액의 규격과 품질 제9조 품질기준 및 품질시험기준에 따라 시험하였으며 기타 유해물질함량에 대하여는 식품공전 식품첨가물 공전에 준한 방법으로 한국생활환경시험연구원에 의뢰하여 행하였으며, 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

시험항목	시험 결과
산도(%)	2.9
고형분(%)	0.03
납 (mg/kg)	불검출
카드뮴 (mg/kg)	불검출
철 (mg/kg)	불검출
타르색소	불검출
메틸 알코올(mg/kg)	743
페놀 (%)	불검출
살리실산 (mg/kg)	불검출

실시예 3

둥근플라스크에 조목초액 500g을 첨가하고 이에 83% 인산 2g을 첨가하였다.

그 후, 상기 플라스크에 냉각 콘덴서를 설치하고 상기 조목초액에 30% 과산화수소수 15g을 서서히 투입하고 100rpm으로 교반하면서 30℃로 가열하여 10시간동안 반응시켰다. 그 후, 가열을 중단하고 35시간동안 방치하여 탄화현탁물이 응집되도록한 다음 응집된 탄화현탁물을 여과하여 제거하였다.

탄화현탁물이 제거된 목초액에 활성탄 분말 5g을 첨가하고 25시간동안 상온에서 방치한 다음 9.0 mbar로 감압여과하여 활성탄 분말을 제거하였다. 여과 후, 증류기에서 90-120℃로 약 3시간동안 가열증류하여 정제 목초액 300g(수득율 60%)를 얻었다.

상기 1차증류후 증류물에 건조된 쑥 분말을 2중량%의 양으로 첨가하고 80℃로 4시간동안 2차증류를 수행하였다. 2차증류된 증류물의 pH를 초산나트륨 또는 황산아연을 이용하여 3~3.5로 조절하여 정제 목초액 240g(수득율 80%)을 얻었다. 본 발명자들은 이와 같이 얻어진 본 발명에 따른 정제 목초액을 '비네사린(vinesalline)'이라 명명하였다.

1) 랫드를 이용한 단회 경구투여의 독성시험

실시예 3에서 얻어진 본 발명에 따른 정제 목초액(이하, 비네사린이라 한다)을 이용하여 랫드에 대해 단회 경구투여의 독성시험을 수행하였다. 시험은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에 의뢰하여 이루어졌으며, 시험방법은 식품의약품안전청고시 제1999-61호 '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

시험물질의 급성경구투여의 독성을 조사하기 위하여 SD 계통의 랫드에 암수 각각 5마리씩 0 및 20ml/kg의 용량으로 단회 경구투여한 후 15일간의 사망률, 일반증상, 체중변화와 부검소견을 관찰하였다. 시험의 결과는 다음과 같다.

가) 사망동물은 수컷에서는 관찰되지 않았고, 암컷 20ml/kg 투여군에서 1례 관찰되었다.

나) 일반증상의 경우 수컷동물 20ml/kg 투여군에서 안검하수가, 암컷 20ml/kg 투여군에서 자발운동저하, 안검하수 및 유루가 관찰되었다.

다) 체중변화의 경우 암수 모든 시험군에서 시험물질에 기인한 변화는 관찰되지 않았다.

라) 부검결과 암수 모든 시험군에서 시험물질에 기인한 육안적 부검소견은 관찰되지 않았다.

2) 랫드를 이용한 단회 경피투여의 독성시험

비네사린을 이용하여 랫드에 대해 단회 경피투여의 독성시험을 수행하였다. 시험은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에 의뢰하여 이루어졌으며, 시험방법은 식품의약품안전청고시 제1999-61호 '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

시험물질의 급성경피독성을 조사하기 위하여 SD 계통의 랫드에 암수 각각 5마리씩 0 및 2,000mg/kg의 용량으로 단회 경피투여한 후 15일간의 사망률, 일반증상, 체중변화와 부검소견을 관찰하였다. 시험의 결과는 다음과 같다.

가) 사망동물은 암수 모든 시험군에서 관찰되지 않았다.

나) 일반증상의 경우 암수 2,000mg/kg 투여군에서 유루가 관찰되었다.

다) 체중변화의 경우 암수 모든 시험군에서 시험물질에 기인한 변화는 관찰되지 않았다.

라) 부검결과 암수 모든 시험군에서 시험물질에 기인한 육안적 부검소견은 관찰되지 않았다.

3) 토끼를 이용한 피부자극시험

비네사린을 이용하여 토끼에 대해 피부자극시험을 수행하였다. 시험은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에 의뢰하여 이루어졌으며, 시험방법은 식품의약품안전청고시 제1999-61호 '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

New Zealand White계 수컷 토끼에 있어서 시험물질에 대한 피부자극성을 조 사하기 위하여 시험물질을 찰과 및 비찰과부위에 각각 24시간동안 적용한 후 72시간까지의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 국소자극성을 평가하였다. 시험의 결과를 요약하면 다음과 같다.

가) 시험기간 중 시험물질 적용에 기인한 사망동물은 관찰되지 않았다.

나) 일반증상 관찰결과, 시험물질의 적용에 기인된 이상소견은 관찰되지 않았다.

다) 체중측정 결과, 시험물질의 적용에 기인된 체중변화는 관찰되지 않았다.

라) 시험물질 도포종료 후 찰과 및 비찰과부위의 국소자극성을 관찰한 결과, 시험물질 적용에 의한 어떠한 이상소견도 인정되지 않았다. 따라서 본 시험물질의 1차 자극지수(primary irritation index)는 '0'으로서 무자극성 물질로 평가되었다.

이상의 결과에서 New Zealand White계 수컷 토끼에 있어서 실시예 3에서 얻어진 목초액의 피부적용은 찰과 및 비찰과부위에 어떠한 자극성도 유발하지 않는 것으로 판단되었다. 따라서 상기 실시예 3에서 얻어진 목초액은 무자극성 물질인 것으로 사료된다.

4) 토끼를 이용한 안점막자극시험

비네사린을 이용하여 토끼에 대해 안점막자극시험을 수행하였다. 시험은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에 의뢰하여 이루어졌으며, 시험방법은 식품의약품안전청고시 제1999-61호 '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

New Zealand White계 수컷 토끼에 있어서 시험물질에 대한 안점막자극성을 조사하기 위하여 시험물질 0.1ml를 처치한 후 7일간의 사망률, 일반 증상, 체중변화 및 국소자극성을 평가하였다. 시험결과를 요약하면 다음과 같다.

가) 시험기간 중 시험물질 적용에 기인한 사망동물은 관찰되지 않았다.

나) 일반증상 관찰결과, 시험물질의 적용에 기인된 이상소견은 관찰되지 않았다.

다) 체중측정 결과, 시험물질의 적용에 기인된 체중변화는 관찰되지 않았다.

라) 국소자극성을 관찰한 결과, 적용 후 4일째까지 결막의 경미한 이상소견이 관찰되었으나, 각막 및 홍채에서는 어떠한 이상소견도 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험물질의 급성안자극지수(acute ocular irritation index)는 비세안군이 '4.0', 세안군이 '6.0'으로 평가되었다.

이상의 결과에서 New Zealand White계 수컷 토끼에 있어서 실시예 3에서 얻어진 목초액의 안점막적용은 결막에서 경미한 이상소견을 유발하지만 각막 및 홍채에서는 어떠한 이상소견도 나타내지 않으며, 이를 안점막자극 분류에 따라 구분할 때 상기 실시예 3에서 얻어진 목초액은 저자극성 물질(mild-irritant)인 것으로 판단된다.

5) 기니픽(guinea pig)을 이용한 피부감작성시험

비네사린을 이용하여 기니픽에 대해 피부감작시험을 수행하였다. 시험은 한국화학연구원 부설 안전성평가연구소에 의뢰하여 이루어졌으며, 시험방법은 식품의 약품안전청고시 제1999-61호 '의약품등의 독성시험기준'에 준하여 실시하였다.

피부감작성을 조사하기 위하여 30마리의 Hartley계 수컷 기니픽을 이용하여 T1군(시험물질감작군, 10마리), V1군(시험물질에 대한 부형제의 감작군, 5마리), T2군(양성대조물질감작군, 10마리) 및 V2군(양성대조물질에 대한 부형제의 감작군, 5마리)의 4군으로 구성된 기니픽 극대화(guinea pig maximization) 시험을 수행하였다. 동물의 등 부위에 1주 간격으로 2차례의 감작(1차 감작: 피내투여, 2차 감작: 폐쇄첩포)을 수행하였으며, 2차 감작 후 2주째 옆구리 부위에 시험물질을 야기(폐쇄첩포)하여 피부반응을 관찰하였다.

관찰 기간을 통하여, 시험물질의 투여에 기인된 것으로 사료되는 일반증상이나 체중의 변화는 관찰되지 않았다. 시험물질 적용부의 홍반 및 부종으로 평가된 48시간째 평균피부반응은 0.0 그리고 감작율은 0%로 양성대조군의 피부반응 1.6, 감작율 100%에 비해 현저히 낮으며 부형제 대조군(평균피부반응: 0.0, 감작율은 0%)과 동일한 것으로 매우 약한 피부감작성이 관찰되었다. 72시간째의 관찰결과도 마찬가지로 시험물질 투여군의 평균피부반응은 0.3, 감작율은 30%를 나타내었다.

이상의 결과로 보아 Hartley계 기니픽에 있어서 실시예 3에서 얻어진 목초액의 피부감작성은 매우 약한(등급 1) 것으로 판단된다.

실시예 4

C3H 마우스를 이용한 발모촉진 효능시험

I. 목적

본 시험에서는 C3H 마우스를 이용하여 비네사린의 발모촉진효과에 대한 효능을 평가하고자 실시하였다.

II. 시험재료 및 방법

1. 시험물질

시험물질명 - 비네사린(실시예 3에서 얻어진 본 발명에 따른 정제 목초액)

2. 부형제

(1) 물질명 - 멸균증류수

(2) 보관조건 - 실온보관

3. 시험물질의 조제

시험물질은 부형제에 용해하여 용시조제하였다.

4. 양성대조물질의 조제

(주)한미약품의 목시딜액 5%(성분: Minoxidil)을 시험에 적용하였다.

5. 시험계

(1) 종 및 계통 - 마우스, C3H

(2) 구입처

명칭 - (주)중앙실험동물

주소 - 서울시 서초구 우면동 13-8 우정빌딩 3층

(3) 생산자

명칭 - Japan SLC, Icn.

주소 - 3371-8-Kotch-cho, Hamamatsu, Shizuoka Prefecture 431-1103

(4) 시험계 선정이유

C3H 마우스는 털의 재생과정 중 피부색이 변하므로 색의 변화를 측정함으로 쉽게 털의 재생과정을 알 수 있으며 또한 발모재생효능시험에 널리 사용되고 있어 비교할 많은 시험 기초자료가 축적되어 있어 선택하였다.

(5) 성별 및 투여 동물수 - 수컷, 40마리

(6) 구입시 주령 및 체중범위 - 7주령, 21.65 ~ 26.35g

(7) 반입동물의 개체번호표기법

입수시 체중 측정순으로 유성매직을 이용하여 개체식별법에 따라서 꼬리에 표기하였다.

(8) 검역·순화방법 및 기간

약 7일간의 검역·순화기간 중에 매일 1회 일반증상 관찰을 실시하였다. 반입시 및 검역·순화기간 종료시 시험 실시에 적합한 건강한 동물을 선발하였다.

(9) 군분리법

① 검역·순화기간 종료시 C3H 마우스의 등 부위를 전기 클리퍼와 전기 쉐이버를 이용하여 제모하였다.

② 제모부위에 상처가 많은 동물은 시험군에서 제외한 후 무작위법으로 군분리를 실시하였다.

(10) 개체식별방법

군분리 종료 후 사육상자에는 개체식별카드를 부착하고, 개체식별은 유성매직을 이용하여 개체식별법에 따라 꼬리에 표시하였다.

6. 환경조건

(1) 동물실번호 - 227

(2) 사육상자 종류 및 크기

- 폴리카보네이트 사육상자(260W × 350L × 210H(mm), Three-shine)

(3) 사육상자당 동물수 - 10마리(검역·순화)/8마리(투여시)

(4) 설정온도 - 22±3℃

(5) 습도(상대습도) - 50±30%

(6) 환기방식 및 회수 - 10~15회/시간

(7) 조명시간 및 명암주기 - 12hr 점등/12hr 소등(오전 8시~오후 8시 조명)

(8) 조도 - 150~300Lux

7. 사료

(1) 종류

퓨리나 실험용 쥐사료 5057

(2) 생산자

명칭 - (주)애그리브랜드 퓨리나 코리아

주소 - 경기도 평택시 장당동 627

(3) 급이방법 및 급이량

급이기에 고형사료를 넣고, 자유섭취시켰다.

(4) 사료 중의 혼합물, 오염물질에 대한 분석 및 확인

사료 중의 혼합물, 오염물질에 대한 분석은 생산자가 실시한 사료분석결과 및 (주)바이오톡스텍에서 년 2회, 한국화학시험연구원(대전광역시 대덕구 평촌동 539-3)에 의뢰하여 실시하며, 그 분석결과가 본사에서 정한 사료 중의 오염물질의 허용한계치 범위내에 적합한지를 급이전에 확인하였다.

8. 음수

(1) 종류

필터와 유수살균기를 이용하여 여과·살균된 정제수

(2) 급수방법

폴리카보네이트제 음수병(300ml)에 정제수를 넣어 자유섭취시켰다.

9. 투여

(1) 투여경로 및 투여횟수

임상에서의 적용경로가 피부이므로 피부에 2주간 주 7회, 1일 1회(오후) 실시하였다.

(2) 급수방법

시험물질을 등 부위에 떨어뜨린 후 중간 크기의 붓을 이용하여 피부에 누적되지 않도록 등 전체에 문질러 흡수되도록 하였다.

시험물질, 양성대조물질 및 음성대조물질을 제모부위에 0.1ml/head의 액량으로 도포하였다.

10. 군구성

[표 3]

	군	도포용량(%)	도포액량(ml/head)	마리수	개체번호
G1	음성대조군	0	0.1	8	1M01~1M08
G2	시험물질투여군 1	1.5	0.1	8	2M09~2M16
G3	시험물질투여군 2	3.0	0.1	8	3M17~3M24
G4	시험물질투여군 3	6.0	0.1	8	4M25~4M32
G5	양성대조군	5.0	0.1	8	5M33~5M40

11. 관찰 및 평가항목

(1) 육안관찰

시험물질 도포 일부터 부검 일까지 시험물질 도포 전, 시험물질 도포 후 7, 10 및 14일에 등 피부의 상태 및 털의 색깔 등 육안관찰을 실시하였다.

[표 4] 평가기준 1 - 육안피부변화에 대한 점수분류표

점수	등 피부 및 털 변화
	등 피부의 변화	털 재생 면적
0	제모직후와 동일한 피부색을 지님(핑크색)	제모부위에 재생한 털이 없음(제모직후와 동일)
0.5	제모부위의 0~1/3이 옅은 푸른색을 보임	제모부위의 0~1/3이 연모가 보이기 시작함
1.0	제모부위의 1/3이 진한 푸른색과 진한 푸른색을 보임	제모부위의 1/3이 연모와 경모가 보임
1.5	제모부위의 1/3~2/3가 옅은 푸른색과 진한 푸른색을 보임	제모부위의 1/3~2/3가 경모가 보임
2.0	제모부위의 2/3가 진한 푸른색을 보임	제모부위의 2/3가 경모가 보임
2.5	제모부위의 2/3~3/3이 옅은 푸른색과 진힌 푸른색을 보임	제모부위의 2/3~3/3이 연모와 경모가 보임
3.0	제모부위의 3/3이 진한 푸른색을 보임	제모부위의 3/3이 경모가 보임

육안평가의 최종점수기준= 등 피부의 변화 + 털 재생 면적

(2) 발모율(%) 측정

① 시험물질 최종 도포일에 사진촬영을 실시하였다.

② 사진을 파일링하여 이미지 분석기(Image-pro plus version 5.0, MediacCybernetics USA)로 분석하였다.

③ 발모율(헤어 재성장 면적의 %비율)을 계산하였다.

헤어 재성장 면적의 %비율 = (RAs - RAc)RAc × 100

RAs: 시료 또는 양성 대조군의 재성장 면적(Regrown area of sample or positive control)

RAc: 음성 대조군의 재성장 면적(Regrown area of negative control)

(3) 부검 및 조직병리학적 검사

도포종료 다음 날에 경추탈골을 하여 치사시킨 후 각 개체 당 최대 발모영역과 최소 발모영역 부위의 조직을 채취하여 조직병리학적 검사에 이용하였다.

① 채취된 조직을 10% 중성 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매하였다.

② 포매된 조직을 4㎛로 절단하였다.

③ Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다.

④ 광학현미경으로 종단면 및 횡단면의 털, 모낭, 피지선 및 한선을 관찰하였다.

12. 자료의 통계처리

모든 시험결과는 평균치와 표준편차를 사용하여 나타냈으며, 각 군간의 비교는 ANOVA 및 Student's t-test를 사용하였고 음성대조군과 비교하여 5% 유의수준에서 유의성을 검증하였다.

III. 시험결과

1. 육안관찰(도 3a-3e, 표 5)

모든 시험군에서 발모제에 의한 부작용으로 각질이나 비듬 및 피부발진 등과 같은 피부변화는 관찰되지 않았다. 양성대조군을 제외한 모든 시험군에서 시험물질 도포 10일째까지는 피부색의 변화와 털성장이 거의 보이지 않았으며 시험물질 도포 10일 이후부터 제모부위의 피부색이 푸른색을 띄기 시작하였으며 새로운 털이 성장하기 시작하였다. 시험물질투여군(G2~G4) 및 양성대조군에서는 음성대조군(1.8± 0.88)에 비교하여 뚜렷한 피부색의 변화와 털성장을 보였으며 특히 시험물질 투여군 3(3.3±1.31, p<0.05)과 양성대조군(5.4±0.52, p<0.001)에서 유의성을 나타내었다.

[표 5]

C3H 마우스의 등 피부에서 헤어 재성장 스코어의 변화(그룹 요약)

그룹/처리	일	헤어 재성장 스코어
		평균	표준편차	N
G1(음성 대조군)	0	0.0	0.00	8
	10	0.5	0.46	8
	14	1.8	0.88	8
G2(1.5% 비네사린)	0	0.0	0.00	8
	10	0.6	0.35	8
	14	2.1	1.12	8
G3(3.0% 비네사린)	0	0.0	0.00	8
	10	0.4	0.50	8
	14	2.7	0.84	8
G4(6.0% 비네사린)	0	0.0	0.00	8
	10	0.4	0.50	8
	14	3.3*	1.31	8
G5(5.0% Moxidil)	0	0.0	0.00	8
	10	2.8***	0.71	8
	14	5.4***	0.52	8

N: 동물수

0~14일: 투여적용기간

*: P<0.05, 음성 대조군(G1)과 유의하게 차이남

***: P<0.001, 음성 대조군(G1)과 유의하게 차이남

2. 발모율(%) 측정(표 6)

발모율을 측정하기 위하여 이미지 분석기 평가를 실시하였으며 시험물질 최 종도포(부검직전) 후 사진촬영을 토대로 분석하였다. 모든 시험물질 투여군 및 양성대조군은 음성대조군에 비해 높은 발모율을 보였으며 농도 의존적으로 나타났다. 또한 시험물질 투여군 1, 2 및 3은 26.7±7.0(p<0.05), 44.0±6.7(p<0.001), 62.2±10.2(p<0.001)으로 유의성있는 증가를 나타내었다.

[표 6] 이미지 분석기에 의한 C3H 마우스의 등 피부에서 헤어 재성장 면적의 비율

그룹/처리	헤어 재성장 면적의 비율
	평균	표준편차	N	%
G1(음성 대조군)	16.7	5.0	8	0.00
G2(1.5% 비네사린)	26.7	7.0	8	59.88*
G3(3.0% 비네사린)	44.0	6.7	8	163.47***
G4(6.0% 비네사린)	62.2	10.2	8	272.46***
G5(5.0% Moxidil)	86.1	6.5	8	415.46***

N: 동물수

%: 음성 대조군(G1)과 비교한 헤어 재성장 면적의 비율

*: P<0.05, 음성 대조군(G1)과 유의하게 차이남

***: P<0.001, 음성 대조군(G1)과 유의하게 차이남

3. 조직병리학적 관찰(도 4a-4e, 표 7)

전반적인 피부의 형태학적 구조는 모든 시험군이 유사하였으며 피부 종단면을 보면 털, 모낭 및 피지선을 볼 수 있으며, 진피에서는 모유두가 관찰되었다. 또한 성장이 진행되는 모낭 주변에서 소수의 새로운 모낭이 형성되는 것이 관찰되었다. 새롭게 형성된 모낭의 수는 양성대조군 및 시험물질 투여군에서 음성대조군에 비해 증가된 것을 볼 수 있었다. 피부조직의 횡단면에서 관찰한 모낭의 수는 양성 대조군(150.3±26.2), 시험물질투여군 2(137.9±20.2) 및 시험물질투여군 3(139.3±27.6)에서 음성대조군(127.0±36.7)에 비해 증가하는 경향을 보였으나 통계학적인 유의성은 나타나지 않았다.

[표 7] 비네사린으로 처리된 C3H 마우스의 모낭수

그룹/처리	모낭수#	N
G1(음성 대조군)	127.0±36.7	8
G2(1.5% 비네사린)	127.1±19.2	8
G3(3.0% 비네사린)	137.9±20.2	8
G4(6.0% 비네사린)	139.3±27.6	8
G5(5.0% Moxidil)	150.3±26.2	8

N: 동물수

#: 결과는 각각 점수가 매겨진 8마리 동물에 대해 평균±S.D로 표현되었다.

V. 고찰 및 결론

본 시험에서는 본 발명에 따라 정제된 목초액인 비네사린의 발모재생 효과에 대한 효능을 평가하고자 수컷의 C3H 마우스를 이용하여 시험물질을 도포하여 육안적 변화를 관찰하고 사진촬영을 통하여 발모율을 평가하였으며 부검 후 조직병리학적 관찰을 실시하였다.

육안적인 관찰에서 시험물질 도포 10일째부터 제모부위에 새로운 털이 성장하기 시작하였으며 시험물질투여군(1~3) 및 양성대조군은 음성대조군과 차이를 보이기 시작하였다. 시험물질 최종도포(부검직전) 후에 모든 시험물질투여군 및 양성 대조군은 음성대조군에 비해 높은 발모율을 보였다.

이미지 분석기를 이용한 평가에서 음성대조군에 비해 시험물질 투여군(1~3) 및 양성 대조군은 높은 발모율을 보였으며 시험물질 투여군에서는 6.0%의 농도에서 가장 좋은 발모율을 보였다.

조직병리학적인 면에서 모든 시험군에서 털, 모낭 및 부속기관인 피지선을 관찰 할 수 있었으며 모낭의 수에서는 음성대조군에 비해 양성 대조군, 시험물질 투여군 2 및 3이 증가되었다.

이상의 결과로 본 발명에 따라 정제된 목초액인 비네사린은 휴지기의 모주기를 성장기로 유도하여 발모를 촉진시키는 효과를 갖는 것으로 사료된다.

인산촉매를 이용한 본 발명의 조목초액 정제방법으로 조목초액중의 탄화현탁물 및 탄내가 단시간내에 효과적으로 제거되어, 고순도, 예를들어 99%이상의 고순도 목초액이 얻어진다. 또한, 본 발명의 방법으로 정제된 목초액은 살균활성 및 항균성이 우수하고 유해물질을 함유하지 않아 독성이 없고, 악취가 나지 않으며, 특히 느슨해진 두피조직에 탄력성을 부여하며 두피세정효과가 뛰어나 탈모방지 및 발모촉진에 효과적이다.

Claims (4)

1. 조목초액과 과산화수소수를 인산존재하에서 30~70℃에서 8~12시간동안 산화반응시키는 단계;

   산화반응 후, 36~40시간 방치하고 방치시 형성되는 응집물을 제거하는 단계;

   90~120℃로 3.5~4.5시간동안 1차 증류하는 단계;

   건조된 쑥 분말을 1차 증류물에 대해 1~3중량%의 양으로 첨가하고 70~90℃로 3.5~4.5 시간동안 착향시킨 다음, 90~120℃로 3.5~4.5시간동안 2차 증류하는 단계; 및

   2차 증류물에 황산아연을 첨가하여 pH를 3~3.5로 조절하는 단계

   에 의해 정제된 목초액을 유효성분으로 함유하는 탈모방지 및 발모촉진용 약제.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 목초액은 탈모방지용 약제 전체 중량의 1~10중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 약제.
4. 제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 약제.

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