KR100817010B1 - 세포 주기 검사 유전자 및 이에 의해 암호화된 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 포유동물 세포 주기 검사 유전자/DNA 복구 유전자, cDNA 또는 게놈 DNA, 이에 상응하는 분리된 핵산, 이 핵산을 포함하는 발현 벡터, 이 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 핵산 또는 이로부터 발현된 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 이러한 조성물의 제형, 상기 핵산, 단백질 또는 약제학적 조성물을 사용하여 세포를 치료하는 방법 및 약제학적 제제를 조제하는데 있어서 상기 핵산 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.

Mus81 유전자, 세포 주기 검사 유전자, DNA 복구 유전자, 상보체, 안티센스 분자, 암, 신생물, 증식성 질환

Description

세포 주기 검사 유전자 및 이에 의해 암호화된 단백질 {Cell cycle checkpoint genes and proteins encoded thereby}

도 1은 사람 Mus81 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 이 해독 산물의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 1a는 551개 아미노산 단백질 Hmus81(1)을 암호화하는 소뇌 cDNA 라이브러리 유래의 PCR 산물의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열 1 및 2). 도 1b는 455개 아미노산 단백질 Hmus81(2)을 암호화하는 IMAGE 128349 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열 3 및 4). 도 1c는 424개 아미노산 단백질 Hmus81(3)을 암호화하는 소뇌 cDNA 라이브러리 유래의 PCR 산물의 서열을 도시한 것이다(서열 7 및 8). 도 1d는 552개 아미노산 단백질 Hmus81(4)을 암호화하는 소뇌 cDNA 라이브러리 유래의 PCR 산물의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열 9 및 10).

도 2는 마우스 Mus81 cDNA 분자의 핵산 뉴클레오타이드 서열 및 그 해독 산물의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 2a는 Mmus81(1)을 암호화하는 핵산 및 551개 아미노산 길이의 해독된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다(서열 11 및 12). 도 2b는 Mmus81(2)을 암호화하는 핵산 및 424개 아미노산 길이의 해독된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다(서열 13 및 14). 도 2c는 Mmus81(3)을 암호화하는 핵산 및 531개 아미노산 길이의 해독된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다(서열 15 및 16). 도 2d는 Mmus81(4)를 암호화하는 핵산 및 521개 아미노산 길이의 해독된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다(서열 17 및 18).

도 3은 마우스(Mm)(Mmus81; 서열 12), 사람(Hs)(Hmus81; 서열 10), 에스. 폼베(Sp)(Spmus81; 서열 6) 및 에스. 세레비지에(Sc) Mus81(Scmus81; 서열 5) 아미노산 서열을 정렬하여 명확하게 나타낸 것이다. 모든 단백질에서 보존된 아미노산은 흑색으로 강조하고 두 개 이상의 단백질에서 보존된 아미노산은 회색으로 표시하였다. 적색으로 밑줄친 서열은 XPF 패밀리의 엔도뉴클레아제의 보존적 촉매 도메인에 상응한다.

도 4는 사람 Mus81의 게놈 구조 및 스플라이싱 변이체를 도시한 것이다. 굵은 선은 게놈 서열을 나타내고 박스는 엑손의 위치를 나타낸다. 엑손 및 인트론의 크기(bp)는 각각 게놈 단편의 위와 아래에 표시하였다. 엑손 13과 14 주위에서 일어나는 선택적인 스플라이싱은 Mus81₁, Mus81₄, 및 Mus81₃에 상응하는 것으로, 가는 선으로 표시하였다. Mus81₂는 확인된 엑손을 모두 이용한다.

도 5는 FISH 분석에 의한 사람 Mus81의 염색체내 위치를 도시한 것이다. (A)는 형광성 Mus81 cDNA 프로브(좌측 패널)로 표지된 염색체 중기 스프레드 및 상응하는 DAPI 염색(우측 패널)을 나타낸다. (B) 10개의 대표적인 중기 스프레드로부터 하이브리드화 시그날의 위치를 나타낸 염색체 11의 이디오그램을 나타낸다.

도 6은 사람 Mus81의 노던 블롯 분석을 나타낸다. 사람 조직(H1 및 H2)과 암세포주(C)를 나타낸다.

도 7은 Mus81-GFP[GFP: 녹색 형광성 단백질, 예 아쿠아레아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래] 융합 단백질의 세포내 위치를 나타낸다. A549 세포는 유도후 3일째 Hmus81-GFP 융합체를 발현하는 레트로바이러스로 감염시켰다.

도 8은 사람 Mus81 및 Cds1의 동시면역침전을 나타낸다. Mus81 및 Cds1의 태그된 형태를 각각 그리고 함께 발현하는 세포 유래의 용해물(L) 및 면역침전물(IP)의 웨스턴 블롯을 나타낸다. Mus81 및 Cds1에 상응하는 밴드는 화살표로 표시한 것이다. 윗쪽 패널에서 HA 항체와 교차반응하는 단백질에 해당하는 밴드는 별표로 표시하였다. 아래쪽 패널에서 면역글로불린 중쇄는 화살표머리로 표시하였다.

본 발명은 일반적으로 의약 분야에 관한 것이며, 보다 자세하게는, 신규한 단백질, 이들 단백질의 변이체 및 이들을 암호화하는 핵산을 사용하여 조직의 세포 형성을 포함한 세포 성장 및 사멸을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

게놈의 보전은 분열하는 세포에 가장 중요한 것이다. DNA 손상에 반응하여 진핵 세포는 복잡한 조절 시스템에 의존하여 세포 주기의 진행을 지연시킨다. 정상적인 진핵 세포 주기는 4-기(순차적으로 G1, S, G2, M)로 나누어지며 이들은 독 특한 세포 형태 및 생화학적 활성과 상호관련이 있다. 세포 주기로부터 이탈된 세포는 G0 또는 비주기 상태라고 말한다. 세포 주기에 속하는 세포가 활발하게 복제할 때, DNA의 복제는 S기에서 일어나며, 세포의 활발한 분열은 M기에서 일어난다[일반적인 참조 문헌: Benjamin Lewin, GENES VI, Oxford University Press, Oxford, GB, Chapter 36, 1997]. DNA는 진핵 세포에서 순차적으로 점점 더 고등한 수준으로 조직화하여 결국 염색체를 형성한다. 비-성염색체는 정상적으로 한 쌍으로 존재하지만, 세포 분열 동안에는 각 염색체의 DNA는 복제하여 한 쌍의 염색분체를 형성한다[일반적인 참조 문헌: Benjamin Lewin, GENES VI, Oxford University Press, Oxford, GB, Chapter 5, 1997].

진핵 세포 주기는 여러 기를 통한 일정한 진행을 보장하는 고유 메카니즘과 비정상적이거나 불완전하게 어셈블리된 구조의 존재하에서 주기를 억제하는 감시 메카니즘에 의해 엄격히 조절된다. 이러한 소극적인 조절 감시 메카니즘은 검사(checkpoint)라는 용어로 사용되어 왔다[참조: Hartwell and Weinert, 1989, "Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events' Science, 246: 629-634]. 유사분열 검사는, 모든 염색체가 유사분열 방추사에 결합될 때까지 세포가 유사분열을 하지 못하도록 억제하는 반면, 복제 및 DNA 손상 검사로 분류될 수 있는 DNA 구조 검사는 DNA 손상 또는 불완전하게 복제된 DNA의 존재하에서 세포 주기의 여러 시점을 정지시킨다[참조: Elledge, 1996, "Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis." Science, 274: 1664-1672]. 이러한 정지는 복제가 완료되거나 DNA 복구가 일어나도록 시간을 허용하는 것으로 믿고 있다. DNA 손상, 불완전하게 복제된 DNA 또는 부적당한 유사분열 방추사 어셈블리의 존재하의 세포 주기는 종양 발생의 초기 단계인 게놈 불안정성을 유도할 수 있다. p53, ATM 및 Bub1 검사 유전자 생성물의 불활성화에 기인하는 결손 검사 메카니즘은 몇몇 사람 암에 연루되어 왔다.

검사 지연은, 손상된 DNA가 S기에서 복제하기 이전 및 M기에서 염색분체의 분리 이전에 그 손상된 DNA의 복구를 위한 시간을 제공한다[참조: 상기 Hartwell and Weinert, 1989]. 많은 경우에 있어서, DNA-손상 반응 경로는 사이클린-의존성 키나제의 활성을 억제함으로써 정지를 일으킨다[참조: 상기 Elledge, 1997]. 사람 세포에서 DNA-손상 유도된 G2 지연은 주로 Cdc2의 억제 인산화에 의존하며[참조: Blasina et al., 1997, "The role of inhibitory phosphorylation of cdc2 following DNA replication block and radiation induced damage in Human cells." Mol. Biol. Cell 8: 1013-1023; Jin et al., 1997, "Role of inhibiting cdc2 phosphorylation in radiation-induced G2 arrest in human cells." J. Cell Biol., 134: 963-970], 이에 따라 Cdc2에 작용하는 대응하는 키나제 및 포스파타제의 활성이 변화하는데 그 원인이 있는 듯하다. 그러나, 이들 효소의 활성이 DNA 손상에 반응하여 실질적으로 변형된다는 증거는 없다[참조: Poon et al., 1997, "The role of cdc2 feedback loop control in the DNA damage checkpoint in mammalian cells." Cancer Res., 57: 5168-5178].

독특한 세 개의 Cdc25 단백질이 사람 세포에서 발현된다. Cdc25A는 특이적으로 G1-S 전환에 필요한 반면[참조: Hoffmann et al., 1994, "Activation of the phosphatase activity of human CDC25A by a cdk2-cyclin E dependent phosphorylation at the G-1/S transition." EMBO J., 13: 4302-4310; Jinno et al., 1994, "Cdc25A is a novel phosphatase functioning early in the cell cycle" EMBO J., 13: 1549-1556], Cdc25B 및 Cdc25C는 G2-M 전환에 필요하다[참조: Gabrielli et al., 1996, "Cytoplasmic accumulation of cdc25B phosphatase in mitosis triggers centrosomal microtubule mucleation in HeLa cells" J. Cell Sci., 109(5): 1081-1093; Galaktionov et al., 1991, "Specific activation of cdc25 tyrosine phosphatases by B-type cyclins: evidence for multiple roles of mitotic cyclins" Cell, 67: 1181-1194; Millar et al., 1991, "p55CDC25 is a nuclear protein required for the initiation of mitosis in human cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10500-10504; Nishijima et al., 1997, J. Cell Biol., 138: 1105-1116]. M기 진행으로의 Cdc25B 및 Cdc25C의 정확한 역할은 알려져 있지 않다.

검사 조절에 대한 현재 알고 있는 지식의 대부분은 발아(budding)[사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)] 및 분열(fission)[쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)] 효모를 사용한 연구에 의해 수득되었다. 현재 효모와 고등 진핵세포 중의 세포 주기 검사에 관한 이해를 보고하는 다수의 문헌들은 최근 공개되었다[참조: Hartwell & Kastan, 1994, "Cell cycle control and Cancer" Science, 266: 1821-1828; Murray, 1994, "Cell cycle checkpoints" Current Opinions in Cell Biology, 6: 872-876; Elledge, 1996, 상기 문헌 참조; Kaufmann & Paules, 1996, "DNA damage and cell cycle checkpoints" FASEB J., 10: 238-247]. 분열 효모의 경우, 6개 유전자 산물인 rad1⁺, rad3⁺, rad9⁺, rad17⁺, rad26⁺, 및 hus1⁺ 이 DNA 손상 의존적 검사 경로 및 DNA 복제 의존적 검사 경로 양자의 성분으로 확인되었다. 또한, cds1⁺은 효모에서 DNA 복제 의존적 검사에 필요하고, rad27⁺/chk1⁺은 DNA손상 의존적 검사에 필요한 것으로 확인되었다.

이러한 유전자 중 몇 가지는 발아 효모에서 구조적 동족체를 갖는다. 또한, 에스. 폼베 검사 유전자의 몇 가지 사람 동족체, 예를 들어 에스. 폼베 rad3⁺과 관련된 2가지 유전자, 즉 ATM(운동실조 모세관확장증 변이유전자)[참조: Savitsky et al., 1995, "A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase" Science, 268: 1749-1753] 및 ATR(운동실조 모세관확장증 및 rad3⁺ 관련유전자)[참조: Bentley et al., 1996, "The Schizosaccharomyces pombe rad3 checkpoint genes" EMBO J., 15:6641-6651; Cimprich et al., "cDNA cloning and gene mapping of a candidate human cell cycle checkpoint protein" 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2850-2855]; 및 에스. 폼베 rad9⁺의 사람 동족체, Hrad9[참조: Lieberman et al., 1996, "A human homolog of the Schizosaccharomyces pombe rad9+ checkpoint control gene" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13890-13895], Hrad1[참조: Parker et al., 1998, "Identification of a human homologue of the Schizosaccharomyces pombe rad17+ checkpoint gene" J. Biol. Chem., 273:18340-18346; Freire et al., 1998, "Human and mouse homologs of Schizosaccharomyces pombe rad1(+) and Saccharomyces cerevisia RAD17: linkage to checkpoint control and mammalian meiosis" Genes Dev. 12: 2560-2573; Udell et al., 1998, "Hrad1 and Mrad1 encode mammalian homologues of the fission yeast rad1(+) cell cycle checkpoint control gene" Nucleic Acids Res. 26: 2971-3976], Hrad17[참조: 상기 Parker et al., 1998], Hhus1[참조: Kostrub et al., 1998, "Hus1p, a conserved fission yeast checkpoint protein, interacts with Rad1p and is phosphorylated in response to DNA damage" EMBO J. 17: 2055-2066], Hchk1[참조: Sanchez et al., 1997, "Conservation of the Chk1 checkpoint pathway in mammals: linkage of DNA damage to Cdk regulation through Cdc25" Science 277: 1497-1501] and Hcds1[참조: Matusoka et al., 1998, "Linkage of ATM to cell cycle regulation by the Chk2 protein kinase" Science 282(5395): 1893-1897; Blasina et al., 1999, "A human homologue of the checkpoint kinase Cds1 directly inhibits Cdc25 phosphatase" Curr. Biology 9(1): 1-10]의 클로닝에 의해서 진핵세포에서 교차 보존되는 것으로 제시되었다.

효모 및 포유동물 세포에 존재하는 검사 단백질의 유전자적 및 생화학적 분석은, 검사 응답 반응이 통상적인 시그날 전달 경로를 통해 전달된다는 것을 제시한다. Hrad1, Hrad9, Hrad17 및 Hhus1은 손상되거나 불완전하게 복제된 DNA 유래 의 시그날을 중심 키나제 ATM 및 ATR로 전달하고, 이는 결과적으로 하류의 키나제인 Chk1과 Cds1을 활성화시킨다. 이 DNA 구조 검사 응답 반응은 궁극적으로 유사분열 유도 포스파타제인 Cdc25의 Chk1 또는 Cds1에 의한 인산화를 유도한다. 이러한 인산화 과정은 핵에서 세포질로 방출되기 위해 Cdc25를 표적으로 하는 14-3-3 단백질에 대한 결합 부위를 만들어, 사이클린 의존성 키나제인 Cdc2로부터 억제성 포스페이트가 제거되지 않도록 방지한다. 이러한 억제성 포스페이트의 제거는 모든 세포 주기에서 G2에서 유사분열기로 진행되는데 필요하다. 상기 DNA 구조 검사 응답 반응은 상기 진행이 일어나지 않도록 하여 G2/M 정지를 초래한다.

Chk1 단백질은 에스. 폼베에서 G2/M DNA 손상 검사에 필요한 것으로 밝혀져 있는 반면, 복제 검사는 Cds1과 Chk1 모두의 활성을 필요로 한다. 복제가 리보뉴클레오타이드 리덕타제 억제제인 하이드록시우레아(HU)로 처리하여 차단되는 경우, 야생형 세포는 유사분열 전에 정지된다. cds1chk1 이중 돌연변이체는 HU의 존재하에 정지되지 않지만, 각각의 단일 돌연변이체는 정상적으로 정지된다[참조: Russell, 1998, "Checkpoints on the road to mitosis" Trends in Biochemical Sciences 23(10):399-402]. 에스. 폼베 Chk1 및 Cds1은 둘다 Cdc25를 인산화하여 14-3-3 단백질의 결합에 대해 표적화할 수 있다. 또한, HU에 의한 에스. 폼베 Cds1 단백질 키나제의 활성화는 Wee1에 대한 결합 및 인산화를 향상시키고, Mik1을 축적시킨다. 이러한 2가지 단백질 키나제는, 검사 매개된 세포 주기 정지를 위한 Cdc25C 인산화의 대안으로 생각되고 있는, 세포가 유사분열기로 들어가지 못하도록 하는 Cdc2의 억제성 인산화에 필요한 것이다. 최근, Cds1도 또한 S기에서의 DNA 손상 검사에 필요한 것으로 밝혀져 있다[참조: Rhind and Russell, 1998, "The Schizosaccharomyces pombe S-phase checkpoint differentiates between different types of DNA damage" Genetics 149(4): 1729-1737; Lindsay et al., 1998, "S-phase-specific activation of Cds1 kinase defines a subpathway of the checkpoint response in Schizosaccharomyces pombe" Genes Dev. 12(3): 382-395]. ATM 의존적 방식으로 DNA 손상과 HU에 의해 활성화되고 시험관내에서 Cdc25C를 인산화시킬 수 있는 에스. 폼베 Cds1의 사람 동족체가 최근 확인되었다[참조: Matsuoka et al., 1998, 상기 문헌 참조; Blasina et al., 1999, 상기 문헌 참조]. 이러한 사람 cDNA는 에스. 폼베 동족체처럼 키나제 도메인의 N-말단에 포크헤드 관련(FHA) 도메인을 포함하는 543개 아미노산 단백질을 암호화한다. FHA 도메인은 에스. 세레비지에 Cds1 진성체 (orthologue) Rad53을 비롯한 몇몇 다른 단백질에서 발견된다. Rad53은 2개의 FHA 도메인을 포함하는데, 이중 하나는 DNA 손상의 존재하에 DNA 손상 검사 단백질 Rad9와 상호작용하는데 필요한 것이다[참조: Sun et al., 1998, "Rad53 FHA domain associated with phosphorylated Rad9 in the DNA damage checkpoint" Science 281(5374): 272-274].

암과 같은 질병이나 노화의 효과를 경감시키기 위한 새로운 보다 효과적인 치료법과 치료제를 개발하기 위하여, 포유동물, 특히 사람의 검사 단백질을 동정 및 특성화하고 그 단백질의 활성의 매개인자를 확인하는 것이 중요하다. 본 발명 은 에스. 폼베 Cds1 FHA 도메인과 상호작용하는 에스. 폼베 Mus81 단백질에 대해 유의적 상동성이 있는 사람 Mus81(Hmus81) 및 쥐의 Mus81(Mmus81) 단백질을 암호화하는 사람 및 쥐의 핵산에 대한 동정 및 특성화을 교시하는 것이다. 에스. 세레비지에 진성체는 감수분열 및 DNA 복구에 관여하는 것으로 보고되어 있다.

하기 기술되는 바와 같이, Hmus81 유전자는 검사/복구 유전자로서 작용하며 DNA 복구에 관여한다. 검사/복구 지연은 손상된 DNA가 S기에서 복제되기 전, 및 M기에서 염색분체가 분리되기 전에 복구할 수 있는 시간을 제공하며, Hmus81은 공지된 다른 검사/복구 유전자와 유사하게 상기 두 과정에 작용하는 것으로 보인다. 대부분의 경우에, DNA 손상 응답 반응 경로는 정지를 일으키고 세포가 분열하지 못하도록 한다. 하지만, 기능적 DNA 복구 메카니즘이 그 손상을 교정시켜 사실상 세포 분열이 일어날 수 있도록 한다.

사람에 있어서, 절제 복구는 2가지 주요 발암물질인 햇빛과 담배연기에 대한 중요한 방어 메카니즘이다. 절제 복구가 손상된 개체는 높은 발암률을 나타내는 것으로 확인되었다[참조: Sancar, A, 1996, "DNA Excision Repair" Ann. Rev. Biochem. 65:43-81]. DNA 복제의 오류를 교정하고 분기성 DNA 서열 간의 재조합을 차단하여 세포 게놈을 안정화시키는 부정합 복구와 같은 기타 다른 메카니즘도 또한 DNA 복구와 유사한 방식으로 작용한다. 이러한 활성을 암호화하는 유전자의 불활성화는 자발적인 변이성 및 종양 발생의 소인을 크게 증가시킨다[참조: Modrich & Lahue, 1996, "Mismatch Repair in Replication Fidelity, Genetic Recombination and Cancer Biology" Ann. Rev. Biochem. 65: 101-33]. DNA내의 적 합도 유지의 중요성은 다양한 복구 메카니즘 및 복구될 수 없는 경우에는 세포 분열의 저지에 의해 상세하게 예시되어 있다[참조: Wood, RD, 1996, "DNA Repair in Eukaryotes" Ann. Rev. Biochem. 65:135-67].

표적화된 악성 세포의 DNA를 붕괴시키거나 손상을 유발하는 많은 화학치료제가 디자인되어 있다. 알킬화제, 항대사물질, 기타 다른 화학 유사체 및 화학 물질과 같은 항신생물제는 일반적으로 뉴클레오타이드 생합성 또는 단백질 생합성을 억제하거나, DNA를 가교시키거나, 복제 또는 유전자 발현을 억제하도록 DNA에 삽입되어 작용한다. 예를 들어, 블레오마이신 및 에토포사이드는 특이적으로 DNA를 손상시키고 복구를 차단한다.

Hmus81 유전자 또는 단백질 활성의 억제는 항신생물제의 잠재능을 증폭시키고, 화학치료제로서 이의 용도의 효능을 향상시킨다. 이러한 향상은 표적 세포에 보다 철저하게 영향을 미칠 뿐만 아니라 효능 증가에 비례하여 감소된 투여량으로 사용될 수 있도록 하여, 바람직하지 않은 부작용을 감소시켜 유리하다. 안티센스 핵산 약제를 통한 Hmus81 또는 Mmus81 유전자 활성의 억제는 안티센스 핵산을 작제하기 위한 주형으로서 본 발명의 핵산을 사용하여 수행할 수 있다. 안티센스 결합과 이에 따른 억제에는 상기 핵산의 아미노 말단부를 표적화하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이것이 mRNA의 해독을 감소시키기 때문이다. Hmus81 단백질 활성의 억제는 손상된 DNA를 복구시키는 생화학적 연쇄증폭반응을 경쟁적으로 억제하거나 세포를 정지시키는 Hmus81 또는 Mmus81 단백질의 변이체 또는 단편을 사용함으로써 수행될 수 있다.

또한, 결손형 DNA 복구 메카니즘으로부터 질병이 유발될 수 있는데, 그 예로는 유전성 비용종 결장직장암(부정합 복구의 결손), 네이메겐(Nijmegen) 파괴 증후군(이본쇄 파괴 복구의 결손), 색소성 건피증, 코카인(Cockayne) 증후군 및 트로코티오이상증(핵 절제 복구의 결손)가 있다[참조: 예를 들어, Lengauer et al., 1998, "Genetic instabilities in human cancers" Nature 396(6712): 643-649; Kanaar et al., 1998, "Molecular mechanisms of DNA double stranded repair" Trends Cell Biol. 8(12): 483-489].

또한, Hmus81 유전자 또는 단백질 활성을 일시적으로 억제하면 노화 또는 질병으로 인한 세포 행동의 치료를 상당히 개선시키기에 충분할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 세포 분열의 DNA 검사/DNA 손상 정지의 일시적인 억제는 암과 같은 질병의 치료시 표적 세포에 보다 큰 손상을 일으키는 화학치료제를 보다 소량으로 함께 사용할 수 있도록 한다.

본 발명은 세포 성장, 분열 및 사멸을 변형시키는데 유용한 신규 유전자 및 이에 의해 암호화된 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 한 가지 양태는 신규한 포유동물, 예를 들어 사람 또는 쥐의 검사/복구 단백질, 이것을 암호화하는 핵산 및 이 단백질의 변이체, 핵산 작제물, 및 포유동물 Mus81 암호화 유전자 및 단백질의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "검사 유전자"는 세포 분열의 검사/복구 조절시 작용하는 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 이러한 단백질은 복제 및 DNA 손상 검사 활성 모두에 영향을 미칠 수 있는데, 즉 검사/복구 활성이 있다. 포유동물 Mus81 단백질 암호화 핵산의 구체적인 특성화와 이들의 세포 주기 조절에 대한 역할은 표적 세포내에서 포유동물의 세포 주기를 조절하는데 유용한 신규 화합물을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같은 "사람 Mus81 유전자", "Hmus81 암호화 유전자" 및 "Hmus81 유전자"는 인체에서 나타날 수 있지만 여전히 동일한 단백질을 암호화하는 유전자의 대립유전자 변이체, 그 유전자의 스플라이스 변이체 및 이러한 게놈 유전자 유래의 전사체, 이 전사체를 암호화하는 cDNA, 및 Hmus81 단백질을 암호화할 수 있는 기타 다른 핵산을 포함하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "사람 Mus81 단백질", "Hmus81" 및 "Hmus81 단백질"은 일반적으로 Hmus81을 암호화하는 핵산으로부터 발현된 단백질을 의미하는 것으로서, Hmus81 암호화 유전자에 의해 암호화된 단백질의 해독 및 프로세싱으로부터 발생되는 단백질의 스플라이스 변이체 및 글리코실화 변이체를 포함하며, 특히 서열 2, 4, 8 및 10에 제시된 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진 사람 Mus81 단백질을 포함한다. 바람직한 구체예로서, 본 발명의 분리된 핵산은 사람 Mus81 단백질을 암호화하는 cDNA에 상응한다. 본 발명의 특별하게 분리된 핵산은 모두 사람 Mus81 단백질의 한 형태만을 암호화하는 것이 바람직하다.

다음에 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명의 사람 Mus81 암호화 핵산은 본원에 개시되고, 사람 Mus81₁("Hmus81(1)"; 서열 1), 사람 Mus81₂("Hmus81(2); 서 열 3), 사람 Mus81₃("Hmus81(3)"; 서열 7), 및 사람 Mus81₄("Hmus81(4)"; 서열 9)로서 특정하게 표시된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포괄하는 것이다. 상기 핵산들은 모두 사람 Mus81 단백질 및 그 등가물을 암호화한다. 따라서, 본 발명은 Hmus81 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산, 구체적으로 서열 1, 3, 7, 9 및 25에 제시된 서열의 암호화 도메인 분절에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 서열 25에 제시된 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 가진 Hmus81 단백질의 2가지 형태를 암호화하는 핵산도 포함한다. 이 핵산은 서열 4에 제시된 아미노산 잔기 서열을 가진 Hmus81 단백질을 암호화하는데, 이 서열은 종결 코돈을 포함하는 서열 25의 서열 1274에서 1474 위치의 201개 뉴클레오타이드가 결실되어 DNA의 보다 긴 암호화 도메인 분절 서열을 해독할 수 있게 한다. 또한, 서열 25에 제시된 바와 같은 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산은 인트론을 남기면서 보다 짧은 암호화 도메인 분절로부터 유래되는 서열 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가진 보다 짧은 Hmus81 단백질을 암호화한다.

따라서, 바람직한 구체예로서, 본 발명은 사람 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산, 특히 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 23 내지 1675로 표시된 서열; 서열 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 185 내지 1549로 표시된 서열; 서열 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 26 내지 1297로 표시된 서열; 서열 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 26 내지 1681로 표시된 서열; 또는 서열 25에 규명된 바와 같은 서열에 상응하는 암호화 도메인 분절 서열을 가진 핵산을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 "쥐 Mus81 유전자" 및 "Mmus81 유전자"는 신규한 쥐의 Mus81 암호화 유전자를 의미하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "쥐 Mus81 단백질", "Mmus81" 및 "Mmus81 단백질"이란 용어는 일반적으로 Mmus81 유전자의 단백질 산물을 의미하는 것으로서, 특히 서열 12, 14, 16 및 18에 제시된 서열에 상응하는 아미노산 잔기 서열을 가진 쥐 Mus81 단백질을 의미한다.

"쥐 Mus81 유전자", "Mmus81 유전자" 및 "Mmus81 암호화 유전자"란 용어는 Mmus81 유전자, 특히 본원에 개시되고, 마우스(쥐) Mus81₁("Mmus81(1)"; 서열 11), 마우스 Mus81₂("Mmus81(2); 서열 13), 마우스 Mus81₃("Mmus81(3)"; 서열 15), 및 마우스 Mus81₄("Hmus81(4)"; 서열 17)로서 표시된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산, 및 본원에서 암호화된 단백질 암호화 도메인 분절을 포괄하는 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 분리된 핵산은 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 cDNA에 상응한다. 본 발명의 특별하게 분리된 핵산은 모두 쥐의 Mus81 단백질의 한 형태만을 암호화하는 것이 바람직하다.

또 다른 바람직한 구체예로서, 본 발명은 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산, 특히 서열 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 42 내지 1694로 표시된 서열; 서열 13에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 15 내지 1323으로 표시된 서열; 서열 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 52 내지 1644로 표시된 서열; 또는 서열 17에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클 레오타이드 52 내지 1614로 표시된 서열에 상응하는 암호화 도메인 분절 서열을 가진 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명은 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 작제물, 벡터, 플라스미드, 코스미드, 레트로바이러스 또는 바이러스 작제물 등도 포함한다. 특히, 본 발명은 서열 1, 3, 7, 9 또는 25로 표시되는 핵산의 Hmus81 암호화 도메인 분절의 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 단백질로서 발현할 수 있는 핵산 벡터 작제물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 11, 13, 15 또는 17로 표시된 핵산의 Mmus81 암호화 도메인 분절을 함유하는 핵산 벡터 작제물을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같은 "발현할 수 있는 형질도입 유전자(transgene)"는 Hmus81 또는 Mmus81 단백질과 동일한 기능 및/또는 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가진 Hmus81 단백질 또는 Mmus81 단백질의 발현을 유도하는 적합한 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 형질도입 유전자는 예를 들어, 게놈에 통합된 DNA 또는 염색체외 상태의 DNA를 비롯하여 포유동물 세포(예, 사람 또는 마우스)로부터 분리된 게놈 핵산 또는 합성 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질도입 유전자는 본원에 제시된 바와 같은 본 발명에 따른 단백질 또는 이 단백질의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 생물학적 활성 단백질은 Mus81 전체 단백질의 모든 단백질 활성은 갖지 않더라도 일부 활성을 갖는 Mus81 단백질의 융합 생성물, 단편, 분해 단편, 분절, 도메인 등을 의미하는 것으로 간주되어야 하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 생물학적 활성 단백질은 생화 학적 기능을 갖는 포유동물 Mus81 단백질의 생물학적 기능성 부분을 포함한다.

본 발명은 진핵세포 또는 원핵세포에 관계없이 바이러스 벡터에 도입시키기에 적합하거나 생체내 또는 시험관내 단백질 발현에 적합한, 숙주 세포의 형질도입에 적합한 핵산 벡터를 포함한다. 단백질을 원핵세포에서 발현시키기에 특히 바람직한 숙주 세포로는 이. 콜라이와 같은 세균 세포가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 단백질을 진핵세포에서 발현시키기에 적합한 숙주 세포로는 사람 또는 쥐 기원의 포유동물 세포, 또는 효모 세포를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에 있어서, 하기 기술되는 바와 같은 단백질의 발현은 사람의 무한증식 세포의 바이러스 벡터 형질도입에 의해 이루어진다.

본 발명은 또한 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 융합 단백질 생성물의 생성을 위한 다른 핵산과 직렬 또는 다른 방식으로 접합하여 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 사람 Mus81 융합 단백질은 서열 1, 3, 7 및 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 표시된 암호화 도메인 분절로서 나타낸 핵산에 의해 암호화된 단백질의 하나 이상의 분절을 포함할 것이다. 이와 마찬가지로, 쥐 Mus81 융합 단백질은 서열 11, 13, 15 및 17에 제시된 핵산의 암호화 도메인 분절에 의해 암호화된 단백질의 하나 이상의 분절을 포함할 것이다.

또한, 본 발명은 분리된 핵산, 또는 표적 세포에 혼입시켜 발현시키기 위한 나출형 DNA 형질도입 벡터로서 사용할 수 있도록 조작된 핵산 분절을 함유하는 핵산 벡터 작제물을 제공한다. 또한, 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 핵산 전사체의 억제제, 예를 들어 안티센스 DNA, 3중 나선형 핵산, 2중 나선형 RNA 등도 제공 한다. 생물학적으로 활성인 안티센스 DNA 분자 제제는 표적 뉴클레오타이드 서열의 연속 또는 불연속 부분에 대한 상보성 유무에 관계없이 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편에 상보성인 것으로, 세포내에서 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질 발현의 억제제이다. 이러한 억제제 및 억제작용은 세포 주기 검사 경로의 시험관내 분석, 억제 또는 강화 화합물의 검정 및/또는 평가, 및 생체내 치료법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 목적에 유용하다.

또한, 본 발명은 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 유전자의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 암호화하는 변형된 뉴클레오타이드 또는 치환된 주쇄 성분을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산의 적어도 일부분의 상보체인 핵산을 함유하는 안티센스 핵산의 용도를 제공한다. 또한, 펩타이드 핵산, 메틸포스포네이트 및 2-O-메틸 리보핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 안티센스 분자의 생물학적 활성 유사체도 제공한다. 본 발명의 안티센스 분자는 포스포로티오에이트 유사체일 수 있다.

또한, 본 발명은 세포로 유입되어 Hmus81 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 안티센스 핵산 유사체를 포함하는, 세포내 Hmus81 단백질 발현 또는 기능을 억제하는 약제학적 제제를 제공한다. 상기 안티센스 핵산은 약제학적으로 허용되는 담체내에 존재하며 서열 1, 3, 7, 9 또는 25에 제시된 핵산의 적어도 일부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 또한, 이러한 약제 학적 제제는 서열 2, 4, 8 또는 10에 제시된 아미노산 잔기 서열 중 적어도 아미노산 잔기 1 내지 50개를 암호화하는 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가진 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 약제학적 제제는 서열 1, 3, 7, 9 또는 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중에서 암호화 도메인 분절의 적어도 뉴클레오타이드 1 내지 20에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 안티센스 핵산은 서열 1, 3, 7, 9 또는 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열내의 암호화 도메인 분절 중 적어도 뉴클레오타이드 1 내지 10개에 상보적인 서열을 가진 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명은 3문자 코돈의 지식에 의한 동류의 코돈 치환에 근거하여 서열 2, 4, 8 또는 10에 제시된 서열과 같은 아미노산 서열을 가진 Hmus81 단백질을 암호화하며, 암호화하는 아미노산이 서열 1, 3, 7, 9 또는 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 암호화 도메인 분절을 기초로 하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 특정 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 대등한 동류의 핵산 암호는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 추론할 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 코돈은 표적 숙주 세포에 바람직한 것으로서 단백질 발현을 증가시키기에 최적인 것을 사용하는데, 예를 들어, 핵산이 서열 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 25에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 단백질 암호화 도메인 분절을 포함하도록 변형되는 경우 최소로 바람직한 코돈은 표적 숙주 세포에서 최대로 바람직한 코돈으로 치환한다. 사람 표적 숙주 세포의 경우, 최소로 바람직한 코돈은 ggg, att, ctc, tcc 및 gtc이다.

또한, 본 발명은 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 적당한 핵산과 재조합 DNA 기술을 사용하여 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 적합한 발현 벡터에 적당한 뉴클레오타이드 서열을 도입시키기 위하여, 리보솜 결합 부위, 프로모터 및/또는 인헨서 인자와 같은 적합한 조절 인자를 유도성 또는 구성적으로 발현되도록 혼입시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 하나 이상의 부가 선택성 마커 또는 발현가능한 단백질을 보유하거나 보유하지 않는 발현 벡터의 용도를 제공한다. 본 발명은 적합하게 작제된 발현 벡터가 적합한 숙주 세포에 형질전환되거나 도입되는 방법을 제공하며, 이러한 숙주 세포에 의해 단백질이 발현된다. 또한, 본 발명은 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 생산할 수 있는 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터는 생체내에서, 예를 들어 유전자 요법에 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되고 생체내 또는 시험관내에서 발현되는 포유동물, 예를 들어, 사람 또는 쥐 Mus81 단백질, 융합 생성물 및 이의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 단백질의 생물학적 활성 부분은 유사한 조건하에서 비교하였을 때 포유동물 Mus81 전체 단백질의 효소 활성 또는 적어도 일부 효소 활성을 가진 단백질 분절 또는 단편이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 치환 또는 결실은 상기 핵산이 암호화하는 단백질 서열에 영향을 미치지 않거나 또는 본 발명에 따른 생물학적 활성의 기능성 단백질을 암호화하도록 통상의 기술을 사용하여 도입시킬 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 효소 분해의 결과로서 단편을 생성하기 위한 단백질의 조작, 또는 단백질을 암호화하는 핵산의 변형은 유사하게 포유동물 Mus81 단백질의 생물학적 활성 부분을 제공할 수 있다.

포유동물 Mus81 단백질의 완전한 단백질, 융합 생성물 및 생물학적 활성 부분은 치료제, 진단 시험 및 면역원, 예를 들어, 이 단백질에 대한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 소규모 또는 대규모로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생성되는 Hmus81 및 Mmus81 단백질을 포함한다. 본 발명은 진핵 세포 또는 원핵 세포에 의해 생산되는 글리코실화된 형태 또는 비글리코실화된 형태의 완전한 Hmus81 및 Mmus81 단백질을 포함한다. 본 발명은 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 적당한 형질전환 벡터를 사용하여 포유동물, 곤충, 식물, 세균, 진균 또는 다른 임의의 적합한 숙주 세포에 의해 발현된 Hmus81 및 Mmus81 단백질을 제공한다. 본 발명은 융합 단백질 생성물로서 생성되거나 고체 지지체에 접합된 Hmus81 및 Mmus81 단백질 또는 임의의 화학적 마커, 방사능 마커, 형광 마커, 화학발광 마커 또는 다른 검출가능한 마커로 표지된 Hmus81 및 Mmus81 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명은 천연 공급원에서 분리되어 천연에서 발견되는 것보다 순수하게 농축된 Hmus81 단백질 및 Mmus81 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제중에 함유된 Hmus81 및 Mmus81 단백질 제제 뿐만 아니라 Hmus81 및 Mmus81 단백질의 약제학적 제제를 제공한다.

본 발명은 또한 서열 2, 4, 8 또는 10에 제시된 아미노산 잔기 서열 또는 이 서열의 면역원성 단편을 가진 사람 Mus81 단백질 또는 서열 12, 14, 16 또는 18에 제시된 아미노산 잔기 서열을 가진 쥐 Mus81 단백질로 포유동물을 면역화시켜 생성된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 이들 모두로서 사람 Mus81 단백질 또는 쥐 Mus81 단백질에 특이적으로 결합하는 특정 항체를 생성하기 위한, 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편의 용도를 포함한다. 면역원성 단편은 면역원성 조건하에 면역학적으로 수용능인 숙주에 주입했을 때 면역반응을 유도하고 면역원성 단편에 특이적인 항체를 생성하는 것이다.

본 발명은 또한 사람 Mus81 단백질(서열 2, 4, 8, 10) 또는 쥐 Mus81 단백질(서열 12, 14, 16, 18)을 암호화하는 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 잔기 대신에 아미노산의 치환이 이루어진 등가의 단백질을 포함한다. 이러한 아미노산 치환은 등가인 것으로서 합리적으로 추론할 수 있는 유사한 아미노산 잔기의 보존적 치환, 또는 용해성, 글리코실화 또는 단백질 발현에 합리적으로 추론할 수 있는 효과를 가진 반보전적 치환을 포함한다. 예를 들어, 비극성(소수성 측쇄) 아미노산인 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌; 하전을 띠지 않은 극성 아미노산인 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 하전을 띤 극성 아미노산인 아스파르트산, 글루탐산; 염기성 아미노산인 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 치환시켰을 때 기능적으로 추론할 수 있는 효과를 갖는 것으로 당업자에게 이해된다. 또한, 아미노산 치환은 변형된 아미노산 잔기 또는 화학적으로 변형된 치환체로의 아미노산 잔기의 대체를 포함한다.

또한, 본 발명은 이러한 등가의 단백질을 암호화하는 핵산, 및 사람 Mus81 단백질 또는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 이의 구체예를 포함한다. 구체적인 변형은 변형된 핵산이 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 여전히 암호화하면서 표적 숙주 세포에 바람직한 코돈을 이용하도록 본 발명의 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 유전자에 상응하는 핵산에 사용된 코돈으로 이루어질 수 있다. 이것은 표적 숙주 세포에 의해 사용되는 바람직한 코돈의 수는 증가시키고/시키거나 덜 바람직한 코돈의 수는 감소시키는 보존적 동류 코돈의 치환에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 예를 들어, 뉴클레오타이드간 결합 변형, 염기 변형, 당 변형, 비방사능 표지, 핵산 가교 및 PNA(폴리펩타이드 핵산)을 포함하는 변형된 주쇄를 도입시킨 변형된 핵산을 포함한다.

Hmus81이 검사/복구 단백질로서 작용하고, DNA 복구에 관련이 있을 가능성이 가장 크다는 이해는 비정상적인 DNA 손상 검사/복구 기능이 관여하거나 또는 표적 세포에서 DNA 복구를 유리하게 억제하는 질환의 치료에서 본 발명의 화합물의 사용을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 암치료의 치료제로서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 본 발명의 정상적인 단백질 및/또는 유전자의 기능을 억제하는 제제 또는 억제제는 화학치료제, 방사선, DNA 손상제 또는 복제 억제제로 치료하기 위한 세포를 감작시키는데 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 진핵 세포의 Mus81 매개된 검사/복구 기능에 영향을 미치는 효능에 대해 시험 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 시험 화합물을 진핵 세포에 접촉시키는 단계 및 포유동물 Mus81 발현 또는 기능에 임의의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 화합물을 투여하는 단계 및 Hmus81 또는 Mmus81 유전자 발현 또는 기능의 변화 검출을 Hmus81 또는 Mmus81 mRNA 생성에 대한 분석이나 Hmus81 또는 Mmus81 단백질 발현의 분석으로 수행하는 선별 방법을 제공한다. 특정 유전자의 발현 수준의 변화를 검출하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특히, 본 발명은 포유동물 Mus81 단백질의 뉴클레아제, 인산화 또는 키나제 활성에 있어서의 임의의 변화를 선별하여 포유동물 Mus81 매개된 DNA 손상 검사/복구 또는 DNA 복구 기능을 변화시키는데 효과적인 후보 물질을 선별할 수 있게 한다. 본 발명의 검정법에서 동정된 화합물 또는 물질이나, 또는 이러한 화합물이나 물질에 상응하는 화합물은 약제학적 치료제 제조시 사용할 수 있다.

Mus81 의존적 세포 주기 경로를 변화시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법이 또한 제공된다. 이 방법은 시험하고자 하는 화학적 화합물을 숙주 세포에 투여하는 단계, 이 세포에서 포유동물 Mus81 단백질의 양을 검출하는 단계, 및 검출된 양과 처리되지 않은 정상 세포의 양을 비교하는 단계를 포함한다. 또한, Mus81 의존적 세포 주기 경로를 변화시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 시험하고자 하는 화학적 화합물을 Hmus81 단백질과 적합한 기질의 생화학적 혼합물에 투여하는 단계, 이 혼합물에서 Hmus81 단백질 활성의 수준을 검출하는 단계 및 검출된 활성과 처리되지 않은 정상 Hmus81 단백질의 생화학적 혼합물 중에서의 활성 수준을 비교하는 단계를 포함한다. 하기 실시예에 제시되는 바와 같이, 분리된 Hmus81 단백질 및 적합한 기질은 분리된 화학 반응으로 측정할 수 있다.

한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 또한 Hmus81 단백질, Hmus81 핵산 또는 Hmus81 안티센스 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료학적 Hmus81 단백질은 이 단백질의 바람직한 특성에 따라 정상적으로 글리코실화되거나 변형되거나 또는 글리코실화되지 않을 수도 있다. 이와 마찬가지로, Hmus81 단백질은 길거나 짧은 완전한 단백질, 융합 생성물 또는 이의 기능적 또는 면역원적 단편을 포함한다. Hmus81 핵산은 길거나 짧은 전체 단백질, 이 단백질의 일부분, 융합 단백질 생성물 및 이의 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다. 또한, 치환 염기 유사체, 변형 염기, PNA를 포함하는 유전자 및 바람직한 코돈을 사용한 유전자를 포함하는 핵산의 변형 형태도 제공한다. 안티센스 핵산은 DNA, RNA 또는 이의 유사 화합물일 수 있는 상보성 핵산 전체, 일부 또는 불연속 분절을 가진, 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 핵산을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 분석법에 의해 약제학적 제제 중에 치료제로서 사용하기에 적합한 것으로 확인된 화합물 또는 물질을 제공한다. 이러한 약제학적 조성물은 또한 암을 치료하는데 사용되는 화학치료제를 추가로 포함하거나, 또는 다른 항암 치료제의 투여와 함께 조화된 섭생으로 투여할 수도 있다. 본 발명은 한 가지 구체예로서, Hmus81 유래의 약제를 각각, 및 다른 화학치료제와 조합하여 사용하는 배합 화학치료법을 제공하고, 다른 한 가지 구체예로서, 단일 용량의 투여를 위해 다른 항암 치료제와 혼합물로서 사용하는 방법을 제공한다.

이와 마찬가지로, 쥐 Mus81 단백질 또는 이 단백질을 암호화하는 핵산은 쥐 또는 쥐를 제외한 포유동물 세포의 세포 주기를 변화시키는데 사용할 수 있다. 쥐의 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산은 사람 Mus81 단백질과 같은 방식으로 약제, 검출 방법과 키트, 및 분석 시스템에 사용하기 위하여 재조합 방법으로 쥐 Mus81 단백질을 생성하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 도 1a(서열 2), 도 1b(서열 4), 도 1c(서열 8) 및 도 1d(서열 10)에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 사람 Mus81 단백질, 또는 도 2a(서열 12), 도 2b(서열 14), 도 2c(서열 16) 및 도 2d(서열 18)에 예시된 아미노산 서열을 포함하는 쥐 Mus81 단백질, 또는 이의 생물학적 활성인 기능적 등가체 또는 생체전구체 또는 생물학적 활성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 발현할 수 있는 형질도입 유전자를 포함하는 형질도입된 세포, 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 제공한다. 또한, 이와같이 형질전환된 숙주 세포에 의해 생성된 분리된 단백질을 제공한다.

본 발명은 한 가지 양태로 신규한 포유동물 세포 주기 검사/복구 단백질, 예를 들어, 사람 Mus81 단백질 및 쥐 Mus81 단백질 등을 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 본 발명의 핵산은 재조합 DNA 기술을 사용하여 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질을 생성하거나, 나출형 핵산 벡터로서 표적 숙주 세포를 형질전환시키거나, 또는 프로모터, 인헨서 또는 억제인자와 같은 핵산 조절 인자와 함께 발현 벡터 작제물로서 작제하는 경우 유용하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자는 표적 세포의 세포주기 검사/복구 기능을 조절하거나, 암 및 다른 증식성 질환을 치료하기 위한 약제, 또는 그 약제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 분리 및/또는 재조합적으로 생산된 사람 및 쥐의 Mus81 단백질, 및 단백질 유사체를 제공한다. 재조합적으로 생산된 본 발명의 사람 Mus81 또 는 쥐 Mus81 단백질은 표적화된 숙주 세포의 세포 주기 및/또는 검사/복구 경로를 조절하기 위해 시험관내 또는 생체내에서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 분리된 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질은 사람 Mus81 단백질 및/또는 쥐 Mus81 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이러한 항체는 폴리클로날 항체이거나 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 단백질 분자는 표적 세포의 세포주기 검사/복구 기능을 조절하거나, 암 및 다른 증식성 질환을 치료하기 위한 약제, 또는 그 약제의 제조에 사용될 수 있다.

재조합적으로 생산되어 분리된 사람 및/또는 쥐의 Mus81 단백질은 또한 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질과 연관된 세포주기 검사/복구 메카니즘을 조절하는 능력에 대하여 화학적 화합물 또는 단백질 화합물을 시험 및/또는 평가하기 위하여 생체내 세포주기 검사/복구 경로의 효소적 단계를 모델링하는 시험관내 생화학 시스템으로서 다른 단백질과 함께 사용될 수도 있다. 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 단백질의 생화학적 혼합물은 분리된 효소, 적당한 이온 및/또는 보조인자, 및 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 생화학적 혼합물은, Mus81 단백질의 효소적 활성이 기질에 가해졌을 때, 예를 들어, 에너지 방출, 형광 방출, 방출된 광 에너지의 파장의 변화, 또는 Mus81 단백질의 특정 형태에 특이적인 항체 분자에 의한 결합의 변화를 통해 검출가능하게 변화하거나 상태 변화를 신호하는 적합한 기질을 포함한다.

본 발명의 분리된 핵산, 및 이 핵산에 의해 암호화된 뉴클레오타이드 서열은 시험관내 또는 생체내에서 핵산 중에 동일한 뉴클레오타이드 서열 또는 고도로 관 련된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 모방하거나 상보적으로 결합하고/하거나 다르게 표지할 수 있는, 분리된 DNA, RNA, 변형된 뉴클레오타이드 유사체, 또는 표지된 핵산 작제물을 제공한다. 본 발명의 핵산은 당해 기술 분야에 공지된 변형된 뉴클레오타이드 및 핵산 염기 유사체를 포함할 수 있을 것으로 예상된다[참조: 예를 들어, Verma et al., 1998, "Modified Oligonucleotides" Ann. Rev. Biochem. 67: 99-134]. 본 발명의 분리된 핵산은, 핵산의 상보적 결합시 표적 핵산에 하이브리드화하여 표적화된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 생물학적 활성의 안티센스 분자일 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 안티센스 분자는 표적 세포의 세포주기 검사/복구 기능을 조절하거나, 암 및 다른 증식성 질환을 치료하기 위한 약제, 또는 그 약제의 제조에 사용될 수 있다. 생물학적으로 활성인 적합한 안티센스 핵산은 상기 핵산의 안정화 또는 뉴클레아제에 대한 내성을 향상시키기 위해 변형된 뉴클레오타이드 염기 등, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 (2'-O-(2-메톡시)에틸(2'-MOE) 변형[참조: McKay et al., 1999, "Characterization of a potent and specific class of antisense oligonucleotide inhibitors of human PKC-alpha expression" J. Biol. Chem. 274: 1715-1722]을 포함한다. 바람직한 안티센스 핵산 분자는 길이가 최소 10개 이상인 잔기, 바람직하게는 20개 이상의 잔기이고, 유전자 전사체로부터 기능적 단백질의 해독을 억제시키는 유전자 전사체의 일부분으로 지시된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산의 연속된 일부분에 상보적인 약 15개 이상의 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열을 유리하게 제공한다. 이러한 상보 성 서열은 복제를 개시하거나, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 가진 핵산의 존재를 검출하거나, 또는 시료로부터 목적하는 핵산의 분절을 특이적으로 증폭시키기 위한 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 이러한 상보성 뉴클레오타이드 서열은 당해 기술 분야에 공지된 기술, 예를 들어 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 이와 같이 제조된 프라이머는 시료 중에서 표적 핵산의 일부분을 특이적으로 증폭시키기 위해 적당하게 배치되어 본 발명에 따른 핵산의 존재를 검출하기 위한 진단 키트 등에 사용될 수 있다. 이러한 테스트는 일반적으로 하이브리드화 조건하에서 시료와 프로브를 접촉시키는 단계 및 시료내 임의의 핵산과 프로브 사이에 형성된 임의의 2본쇄 또는 3본쇄의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

유리하게는, 본 발명을 구체화하는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 또는 합성 수단, 예를 들어, 일반적으로 클로닝하고자 하는 유전자 영역에 대한 약 15개 내지 50개 뉴클레오타이드일 수 있는 한쌍의 프라이머를 제조하는 단계, 이 프라이머를 사람 세포 유래의 mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA와 접촉시키는 단계, 목적하는 영역의 증폭을 일으키는 조건하에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 단계(및 필요한 경우에는 먼저 역전사 단계를 수행함), 증폭된 영역 또는 단편을 분리하는 단계 및 증폭된 DNA를 수거하는 단계를 포함하는 PCR 클로닝 메카니즘을 사용하여 제조할 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 핵산의 사람 대립유전자 변이체는, 예를 들어, 상이한 집단으로부터의 일정 범위의 개체 중에서 게놈 DNA 라이브러리를 탐침하는 방법 및 다른 유전자형 기술로 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 및 프로브는 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술, 예를 들어, 특정 증식성 질환 환자 의 모든 소인을 유리하게 확인할 수 있는 생거 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 환자 유래의 게놈 DNA를 서열분석하는데 사용할 수 있다.

서열 1, 3, 7 및 9에 상응하는 핵산에 사용된 코돈의 특이적 변형은, 변형된 핵산이 Hmus81 단백질을 여전히 암호화하면서 표적 숙주 세포에 의해 선호되는 코돈을 이용하게 할 수 있다. 이와 마찬가지로, 본 발명은, 변형된 핵산이 Mmus81 단백질을 여전히 암호화하면서 표적 숙주 세포에 의해 선호되는 코돈을 이용하도록 서열 11, 13, 15 및 17에 상응하는 핵산에 사용된 코돈의 특이적 변형을 포함한다. 본 발명은 또한 예를 들어 뉴클레오타이드간 결합 변형, 염기 변형, 당 변형, 비방사능 표지, 핵산 가교-결합 및 PNA(폴리펩타이드 핵산)을 포함하는 변형된 핵산 뿐만 아니라 표적 숙주 세포에 의해 사용되는 선호도가 떨어지는 코돈의 수는 감소시키고(또는) 바람직한 코돈의 수는 증가시키는 코돈 치환을 포함하는 변형된 핵산을 제공한다[참조: Zhang et al., 1991, "Graphic analysis of codon usage strategy in 1490 human proteins" Gene 105(1): 61-72; Zhang et al., 1993, "Low-usage codons in Escherichia coli, yeast, fruit fly and primates" J. Protein Chemistry 12(3): 329-335].

본 발명의 한 가지 양태에 따르면, 서열 2, 4, 8 또는 10에 예시된 바와 같은 아미노산 잔기 서열을 가진 Hmus81 단백질, 또는 이 단백질의 기능적 등가 단편 또는 생체전구체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열 12, 14, 16 또는 18에 예시된 바와 같은 아미노산 잔기 서열을 가진 Mmus81 단백질, 또는 이 단백질의 기능적 등가 단편 또는 생체전구체를 암호화하는 핵산이 제공된다.

핵산은 게놈 DNA 분자와 같은 DNA 분자인 것이 바람직하고, cDNA 분자인 것이 보다 바람직하다. 하지만, 이는 RNA일 수도 있다. 당업자에게 잘 알려져 있듯이, 3문자 코돈 유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 여전히 동일한 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 치환을 포함할 수 있다.

본 명세서에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 동족체를 동정하거나 또는 다른 종 유래의 뉴클레오타이드 서열을 동정하기 위하여 낮은 엄격한 조건하에서 본 발명의 핵산 유래의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화시킬 수 있다.

본 발명의 핵산은 발현 벡터에 도입시킨 뒤, 적합한 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키는데 사용할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 본 발명에 따른 핵산은 적합한 프로모터 등과 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 본 발명에 따른 단백질을 적합한 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있게 된다. 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 다른 적합한 벡터일 수 있다. 발현 벡터 및 이 벡터로 형질감염, 형질전환 또는 감염된 숙주 세포도 또한 본 발명의 일부를 구성한다. 숙주 세포는 진핵 세포 또는 세균 세포인 것이 바람직하고, 포유동물 세포 또는 곤충 세포인 것이 보다 바람직하다. 포유동물 숙주 세포는 본 발명에 따른 발현된 단백질에 필요한 해독후 변형, 예를 들어, 글리코실화 등을 제공하기 때문에 특히 유리한데, 이러한 변형은 상기 단백질에 최적의 생물학적 활성을 부여하여 분리하면 진단 키트 등에 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 일반적으로 프로모터의 하류에 작동가능하게 위치 된 Hmus81 유전자 또는 Mmus81을 포함한다. 프로모터는 포유동물, 예를 들어, 사람 세포에서 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81을 암호화하는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, 이러한 프로모터는 포유동물 세포, 예를 들어, 사람 세포에서 "작동성"이다.

본 발명을 구현하는 발현 벡터 및 플라스미드는 일반적으로 전사를 촉진시키는데 활성적인 포유동물 유전자 유래의 프로모터 또는 바이러스 프로모터와 같은 하나 이상의 구성형 프로모터를 포함한다. 구성형 바이러스 프로모터의 예로는 HSV, TK, RSV, SV40 및 CMV 프로모터가 있으며, 이 중에서 CMV 프로모터가 현재 선호되는 예이다. 구성형 포유동물 프로모터로는 다양한 하우스키핑 유전자 프로모터가 있으며, 그 예로는 β-액틴 프로모터를 포함한다.

유도성 프로모터 및/또는 조절 인자가 또한 본 발명의 발현 벡터에 사용될 수 있을 것으로 예측된다. 적합한 유도성 프로모터의 예로는 사이토크롬 P450 유전자, 열충격 단백질 유전자, 메탈로티오네인 유전자, 호르몬 유도성 유전자와 같은 유전자 유래의 프로모터가 있으며, 그 예로는 에스트로겐 유전자 프로모터 등을 포함한다. 이온화 방사선에 노출시 응답 반응으로 활성화되는 프로모터, 예를 들어, fos, jun 및 erg-1이 또한 사용될 수 있다. 테트라사이클린에 대해 응답성인 tetVP16 프로모터가 현재 선호되는 예이다.

조직 특이적 프로모터 및/또는 조절 인자는 특정 구체예에 유용할 것이다. 본 발명의 발현 벡터에 사용될 수 있는 상기 프로모터의 예로는 결장 상피세포에 특이적인 간 지방산 결합(FAB) 단백질 유전자 유래의 프로모터; 췌장 세포에 특이 적인 인슐린 유전자; 간 세포에 특이적인 트랜스피레틴, α1-안티트립신, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1형(PAI-1), 아포지단백질 AI 및 LDL 수용체 유전자; 과돌기신경교세포에 특이적인 미엘린 염기성 단백질(MBP) 유전자; 신경교 세포에 특이적인 신경교 원섬유 산성 단백질(GFAP) 유전자; 눈에 표적화하는데 특이적인 OPSIN; 및 신경 세포에 특이적인 신경 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터가 있다.

발현 벡터 및 플라스미드의 작제 및 사용은 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 사실상 모든 포유동물 세포 발현 벡터가 본원에 따른 유전자와 관련하여 사용될 수 있다.

바람직한 벡터 및 플라스미드에는 하나 이상의 다중 클로닝 부위가 작제된다. 특정 구체예에서, 발현 벡터는 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 유전자 서열과 프로모터 사이에 작동성으로 위치된 다중 클로닝 부위를 포함한다. 다른 구체예에서의 용도들 외에도, 상기 벡터는 제2 단백질을 암호화하는 DNA 분절을 다중 클로닝 부위에, 포유동물 Mus81 암호화 뉴클레오타이드 서열에 인접하면서 프레임에 맞게 배치되도록 클로닝하여 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질을 작제하는데 사용할 수 있다.

다른 구체예에서, 발현 벡터는 발현가능한 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 서열의 하류에 작동가능하게 위치된 다중 클로닝 부위를 포함한다. 이 벡터는 이 벡터의 용도 외에, 제2 단백질을 암호화하는 DNA 분절을 다중 클로닝 부위에, 사람 Mus81 또는 쥐 Mus81 암호화 서열에 인접하면서 프레임에 맞게 배치되도록 클로닝하여 C-말단 융합 단백질을 작제하는데 사용할 수 있다.

또 다른 단백질 또는 RNA 암호화 핵산 분절(들)이 존재하는 벡터 및 플라스미드도 또한, 물론 핵산 분절 자체의 본질에 관계없이 본 발명에 포함된다.

본 발명의 발현 벡터에는 제2 리포터 유전자가 포함될 수 있다. 제2 리포터 유전자는 제2 전사 유니트내에 포함될 수 있다. 적합한 제2 리포터 유전자로는 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 제오신, 마이코페놀산, 히스티디놀 및 메토트렉세이트와 같은 제제에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다.

발현 벡터는 또한 다른 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, IRES 인자, 폴리아데닐화 시그날, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 시그날 등을 포함할 수 있다.

적합한 발현 벡터의 특정예는 재조합 아데노바이러스 시스템, 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 시스템 또는 재조합 레트로바이러스 시스템을 사용하여 발현에 적합화된 것이다. 특히, 백시니아 바이러스, 단순 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 결손성 B형 간염 바이러스 등이 사용될 수 있다.

특정 구체예로서, 본 발명은 신규 포유동물 검사/복구 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 포함한다. 또 다른 구체예로서, 본 발명은 Hmus81(사람 Mus81)로 불리는 사람 공급원 및 Mmus81(쥐 Mus81)로 불리는 쥐 공급원에서 분리된 핵산 유래의 신규 포유동물 검사/복구 단백질을 제공한다.

서열 2, 4, 8 또는 10으로 예시된 서열에 상응하는 아미노산 잔기 서열, 또는 기능적으로 등가인 융합 단백질 생성물, 이 단백질의 단편 또는 생체전구체의 아미노산 잔기 서열을 가진 분리된 단백질도 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 본 발명은 서열 12, 14, 16 또는 18에 예시된 서열에 상응하는 아미노산 서열, 또는 기능적으로 등가인 융합 단백질 생성물, 이 단백질 생물학적 활성 단편 또는 생체전구체의 아미노산 잔기 서열을 가진 분리된 단백질도 제공한다. 또한, 상기 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 상기 단백질의 용도도 포함된다. 당업자에게 잘 알려져 있듯이, 본 발명에 따른 단백질은 도 1 및 도 2에 따른 것과 상이한 아미노산을 포함하는 보존적 또는 반보존적 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질은 실질적으로 정제된 형태일 수 있는데, 이 경우에 본 발명의 폴리펩타이드는 제제 중에 폴리펩타이드 90% 이상, 예를 들어 제제 중에 95%, 98% 또는 99%로 폴리펩타이드를 함유하는 것이 일반적이다. 본 발명의 단백질은 예를 들어 정제를 돕기 위해 히스티딘 잔기를 첨가하거나 또는 세포로부터 분비를 촉진시키기 위하여 시그날 서열을 첨가하는 방법 등을 통해 변형시킬 수 있다. 서열 2, 4, 8 또는 10에 제시된 폴리펩타이드 단백질과 서열 동일성이 90% 이상, 예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 99%인 단백질은 서열 2, 4, 8 또는 10에 제시된 단백질의 아미노산 서열 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 단백질일 수 있으며, 또한 본 발명에 의해 제공된다. 이와 마찬가지로, 서열 12, 14, 16 또는 18에 제시된 폴리펩타이드 단백질과 서열 동일성이 90% 이상, 예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 99%인 단백질은 서열 12, 14, 16 또는 18에 제시된 단백질의 아미노산 서열 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 단백질일 수 있으며, 또한 본 발명에 의해 제공된다.

단백질 아미노산 잔기 서열의 동일성(%)은 문제의 서열과 참조 서열(즉, 서열 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18)을 비교하는 시판 알고리듬을 사용하여 계산할 수 있다. 상동성의 측정에는 디폴트 변수와 함께 사용될 수 있는 다음과 같은 프로그램 (National Center for Biotechnology Information, NCBI 제공)을 사용할 수 있다: BLAST, 갭형성된 BLAST, BLASTN 및 psi-BLAST. 본원에 사용된 바와 같은 "상동성" 또는 "상동성인"이란 용어는 적당한 조건하에서 2개의 뉴클레오타이드 서열이 재조합하기에 충분히 유사한 것만을 필요로 하는 "상동성 재조합"과 같은 이 용어의 표준적 사용은 유지되지만, 비교된 서열 사이의 모든 필수적인 진화적 관계를 암시하지는 않는다.

뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부분과 조회 서열 사이의 최대의 전반적 정합을 측정하는 다른 방법은 문헌[참조: Brutlag et al., 1990, "Improved sensitivity of biological sequence database searches" Compt. Appl. Biosci., 6: 237-245]의 알고리듬에 기초를 둔 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하는 것이다. 이 프로그램은 전체 서열의 정렬을 제공한다. 이러한 전체 서열 정렬의 결과는 동일성(%)으로서 나타낸다. 동일성(%)을 계산하기 위해 뉴클레오타이드 서열의 FASTDB 조회에서 사용된 적합한 변수들은 공지되어 있다.

조회 서열이 서열 2, 4, 8 또는 10의 서열과 적어도 90%의 동일성이 있는 것으로 측정되는 경우, 상기 서열은 Hmus81과 동일한 활성을 보유하는 단백질의 서열이며, 이러한 서열도 또한 본 발명에 포함된다. 이와 마찬가지로, 조회 서열이 서열 12, 14, 16 또는 18의 서열과 적어도 90%의 동일성이 있는 것으로 측정되는 경 우, 상기 서열은 Mmus81과 동일한 활성을 보유하는 단백질의 서열이며, 이러한 서열도 또한 본 발명에 포함된다.

바람직한 단편으로는, 본 발명에 따른 단백질의 에피토프를 함유하는 것을 포함한다. 이 에피토프는 예를 들어, 당해 기술 분야에 제시된 바와 같은 펩타이드 스캐닝 기술을 사용하여 결정할 수 있다[참조: 예를 들어, Geysen et al., 1986, "A priori determination of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant" Mol. Immunol., 23; 709-715].

본 발명에 따른 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 기술에 따라 생성할 수 있다[참조: 예를 들어, Immunochemical Protocols, 2nd.edition, Pound, J. D. ed., 1998, Methods in Molecular Biology Vol. 80, Humana Press, Totowa, N.J.]. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 숙주 동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 돼지, 소, 말, 햄스터, 래트 등에게 본 발명에 따른 단백질 또는 에피토프를 접종하고 면역 혈청을 회수하여 생성할 수 있다. 본 발명은 또한 결합 활성을 유지하는 전체 항체의 단편, 예를 들어, Fv, F(ab') 및 F(ab')₂ 단편 뿐만 아니라 일본쇄 항체도 포함한다.

본 발명의 핵산 및/또는 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어 유전자 요법에 사용될 수 있다. 이러한 본 발명에 따른 핵산은 나출 상태 또는 단백질 캡슐, 지질 캡슐, 리포좀, 막 기재 캡슐, 바이러스 단백질, 전체 바이러스, 세포 벡터, 세균 세포 숙주, 변형된 포유동물 세포 숙 주 또는 이와 같이 적합한 투여 수단에 포장되어 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산의 존재 유무를 생물 시료에서 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 하이브리드화 조건하에서 본 발명에 따른 핵산 또는 프로브를 포함하는 프로브와 상기 시료를 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 시료 중에 존재하는 임의의 핵산과 상기 프로브 사이에 형성된 임의의 2본쇄 또는 3본쇄의 존재를 통해 하이브리드화의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 단백질은 또한 (a) 항체-항원 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명에 따른 단백질의 에피토프에 대한 항체와 상기 시료를 접촉시키는 단계, 및 (b) 임의의 항원-항체 복합체의 존재를 모니터하는 단계를 통해 측정할 수 있다.

핵산 및 단백질을 검출하는 키트가 또한 본 발명에서 제공된다. 생물 시료 중의 본 발명에 따른 핵산의 존재를 검출하는 키트는 (a) 본 발명에 따른 핵산 또는 프로브를 포함하는 프로브와 상기 시료를 접촉시키는 수단 및 (b) 상기 시료 중에 존재하는 임의의 핵산과 상기 프로브 사이에 형성된 임의의 2본쇄 또는 3본쇄의 존재를 검출하는 수단을 포함할 수 있다.

*이와 마찬가지로, 생물 시료 중의 본 발명에 따른 단백질의 존재를 검출하는 키트는 (a) 항체-단백질 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 본 발명에 따른 단백질의 에피토프에 대한 항체와 상기 시료를 접촉시키는 수단 및 (b) 임의의 단백질-항체 복합체의 존재에 대해서 상기 시료를 모니터하는 수단을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 화합물이 포유동물 세포 주기 검사/복구 경로의 단백질의 발현 또는 활성의 억제인자인지 또는 활성인자인지를 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 경로내 이러한 단백질들을 발현하는 세포를 상기 화합물과 접촉시키는 단계 및 이 세포의 검사/복구 경로의 임의의 단백질의 발현 수준을 상기 화합물과 접촉시키지 않은 세포에 대하여 비교하는 단계를 포함한다. 동정된 모든 화합물은 암이나 증식성 질환을 치료하기 위한 약제로서 또는 그 약제의 제조에 유리하게 사용할 수 있다. 대안적으로, 이 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 세포 검사/복구 경로의 억제인자로서 확인된 모든 화합물 또는 이 화합물에 상응하는 모든 화합물은 세포독성제, 예를 들어, DNA 손상 화학치료제 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 세포주기 검사/복구 억제인자는 예를 들어, 항암요법에 사용되는 세포독성제의 화학치료 효과를 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 항암요법의 후보 물질을 선별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 키나제 활성을 나타내는 본 발명에 따른 단백질을 이 단백질에 대한 기질과 함께, 키나제가 기질에 작용할 수 있도록 하는 조건하에서 제공하는 단계, (b) 이 단백질 및 기질을 후보 물질과 접촉시키는 단계, (c) 단백질의 키나제 활성의 임의의 증가 또는 감소의 정도를 측정하는 단계, (d) 활성을 증가 또는 감소시키는 후보 물질을 선택하는 단계를 포함한다. 이러한 후보 물질은 또한 암이나 기타 다른 증식 세포 질환을 치료하기 위한 약제로서 또는 이 약제의 제조에 사용될 수 있 다.

따라서, 본 발명은 특히 (i) Hmus81 단백질, 융합 단백질 생성물 또는 이의 생물학적 활성 단편, (ii) Hmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산, (iii) Hmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 발현가능한 핵산을 갖는 발현 벡터 작제물, (iv) Hmus81 단백질을 암호화하는 핵산의 상보체에 상응하는 안티센스 핵산, (v) 변형된 Hmus81 단백질, (vi) Hmus81 단백질의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체, (vii) Hmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 발현할 수 있는 형질전환된 숙주 세포, 및 (viii) Hmus81 단백질에 결합하는 능력 및/또는 그 단백질의 활성에 영향을 미치는 능력을 선별하여 확인된 치료제를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (i) Mmus81 단백질, 융합 단백질 생성물 또는 이의 생물학적 활성 단편, (ii) Mmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산, (iii) Mmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 발현가능한 핵산을 갖는 발현 벡터 작제물, (iv) Mmus81 단백질을 암호화하는 핵산의 상보체에 상응하는 안티센스 핵산, (v) 변형된 Mmus81 단백질, (vi) Mmus81 단백질의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체, (vii) Mmus81 단백질, 융합 단백질 또는 이의 단편을 발현할 수 있는 형질전환된 숙주 세포, 및 (viii) Mmus81 단백질에 결합하는 능력 및/또는 그 단백질의 활성에 영향을 미치는 능력을 선별하여 확인된 치료제를 포함하는 치료학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 치료학적 조성물은 2종 이상의 Mus81 단백질의 혼합물, 이러한 단 백질을 암호화하는 핵산, 상기 단백질에 대한 항체, 또는 상기 단백질의 핵산 전사체의 억제인자를 배합할 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 Hmus81의 활성에 의해 매개된 DNA 검사/복구의 조절이 요구되는 개체를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 항신생물 치료가 요구되는 개체의 치료를 위한 약제의 조제시 본 발명의 치료학적 조성물의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 치료학적 조성물은 항신생물 치료가 요구되는 개체의 치료를 위하여 다른 1종 이상의 항신생물제와 배합되는 약제의 조제에 유용할 것으로 예측된다.

치료학적 조성물 또는 상기 치료학적 조성물을 함유하는 약제는 표적 세포의 Hmus81 매개의 활성과 관련된, 치료가 필요한 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신생물 증상의 치료법은 본 발명의 1종 이상의 치료학적 조성물과 치료가 요구되는 개체의 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 치료 방법은 신생물 증상을 치료하는 다른 치료제와 연속적으로, 동시적으로 또는 배합하여 1종 이상의 치료학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

당업자라면 잘 알고 있듯이, 본 발명의 조성물에 대한 많은 변형물과 등가물은 본 발명의 교시를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 쉽게 수득하고 생성할 수 있다.

하기 실시예에 제시된 바와 같은 기본 분자생물학 조작을 수행하기 위한 많은 방법 및 물질은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 다음과 같은 문헌들을 통해 찾아볼 수 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Berger et al., Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, In. (1987); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. (1986); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley & Sons, (1992); Goeddel Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, Inc., (1991); Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol 194, Academic Press, Inc., (1991); McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991); McPherson et al., PCR Volume 2, Oxford University Press, (1995); Richardson, C. D. ed., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 39, Humana Press, Inc., (1995)].

여러 양태의 본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

실시예 1 사람 Mus81(Hmus81) 클로닝

추정상의 사람 Mus81 ORF의 5'(ATGGCGGCCCCGGTCCG(서열 19) 및 3' (CTACGGCCCCTTGACCTGA)(서열 20) 말단에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 Hmus81FW(GACATGGCGGCCCCGGTCCG)(서열 21) 및 Hmus81REV(GACTCAGGTCAAGGGGCCGTAG)(서열 22)를 사용하여 마라톤-레디(Marathon- Ready) 사람 소뇌 cDNA 라이브러리 (제조원: Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 유래의 DNA 생성물을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시켰다. PCR은 Pfu 폴리머라제를 사용하여 다음과 같은 반응 조건에서 실시하였다: 95℃에서 30", 68℃에서 30", 72℃에서 1'30"(35x). 그 결과 수득되는 DNA 생성물을 pCR2.1-TOPO 플라스미드에 제조원 (Invitrogen, Carlsbad CA)의 권장에 따라 클로닝한 뒤, DNA를 서열분석하였다.

동정된 효모 서열을 사용하여 작제된 추정상의 ORF로부터 Hmus81의 5' 및 3' 말단에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 사람 소뇌 cDNA 라이브러리로부터 서열을 증폭시켰다. 그 결과, 효모 Mus81 서열(서열 5)과 상당한 유사성이 있는 551개 아미노산 단백질(서열 2)을 암호화하는 1653개 뉴클레오타이드 서열을 수득하였다. 보다 긴 1857개 뉴클레오타이드 서열은 455개 아미노산 단백질(서열 4)인 Hmus81의 보다 짧은 변이체를 암호화한다. 이것은 뉴클레오타이드 서열(서열 25)의 위치 1274 내지 1474의 DNA 삽입체내에 종결 코돈이 존재하기 때문이다.

실시예 2 마우스 Mus81 클로닝

추정상의 마우스 Mus81 ORF의 5' 및 3' 말단을 플랭킹하는 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 RJH030(GAGACTCTGAAGGAGCCAG)(서열 23) 및 RJH031(GCTAAAAGGCTAGCCAGCC)(서열 24)을 사용하여 마라톤-레디 마우스 뇌 cDNA 라이브러리(제조원: Clontech) 유래의 DNA 산물을 PCR로 증폭시켰다. 다음과 같은 조건을 사용하였다: 95℃에서 60", 60℃에서 60", 72℃에서 2'30"(35x). 그 결과 수득되는 PCR 산물을 pCR2.1-TOPO 플라스미드(제조원: Invitrogen)에 클로닝하고 DNA를 서열분석하였다.

사람의 cDNA 서열을 사용하여 상동성의 마우스 서열을 공개 데이터베이스에서 조사하였다. 사람 서열의 5' 말단 및 3' 말단과 유의적인 상동성이 있는 여러 EST가 확인되었다. 이로써 424개 내지 551개 아미노산의 단백질들을 암호화하는 여러 서열(아마도 스플라이싱 변이체를 나타냄)을 증폭시켰다(도 2).

사람 및 마우스 cDNA의 해독 산물은 효모 Mus81 아미노산 서열과 유의적 유사성이 있다. 최장의 사람(Hmus81₄) 해독 산물과 마우스(Mmus81₁) 해독 산물은 효모 단백질과 17 내지 20% 동일하고 30 내지 40% 유사하였다. 다른 어떤 포유동물 단백질도 상기 효모 단백질과 높은 유사성을 나타내지 못하였는데, 이것은 가장 근접한 동족체를 확인하였음을 시사하는 것이다. 마우스 서열은 사람 단백질과 81% 동일하고 87% 유사하였다. 포유동물 단백질과 효모 단백질의 정렬은 보다 높은 보존 영역을 상기 단백질의 중심 및 C-말단 영역에 보유하여 전체적으로 유사성이 있음을 입증하였다(도 3). 보존적인 중심 영역은 XPF 패밀리의 엔도뉴클레아제에서 발견되며 촉매 부위에 상응한다[참조: Aravind et al., "Conserved domains in DNA repair protein and evolution of repair systems" Nucleic Acids Res 27(5): 1223-1242, 1999].

실시예 3 노던 블롯 하이브리드화

사람 다중 조직 및 암세포주 블롯(제조원: Clontech)을 사람 Mus81 cDNA에 상응하는 1.7kb 프로브와 QuickHyb 방법으로 제조원(Clontech)의 설명에 따라 하이브리드화하였다. 이 블롯을 고도의 엄격함(0.1 X SSC, 0.1% SDS, 50℃, 2 x 20분)에서 세척하고 시그날을 자동방사능사진술로 검출하였다.

Hmus81 cDNA를 프로브로서 사용한 노던 블롯 분석은 대부분의 사람 조직에서 약 2.5 내지 3.0kb의 특정 전사체가 존재하고 폐, 간 및 신장에서는 그 농도가 좀 낮았다(도 6).

실시예 4 Cds1 FHA 도메인 결합 단백질의 동정

베이트(bait)로서 에스. 폼베 Cds1 FHA 도메인을 사용하고 프레이(prey)로서 에스. 폼베 cDNA 라이브러리를 사용하여 효모 이중 하이브리드 선별을 실시하였다. 베이트 단백질과 프레이 단백질 사이의 상호작용에 대한 선택 조건에서 증식하는 형질전환체를 분리하여 상호작용의 특이성에 대한 2차 선별에서 테스트하였다. 이 선별에서 분리된 형질전환체 중 하나는 572개 아미노산의 추정 단백질(PID g2213548)을 암호화하는 cDNA 서열을 포함하였다. 에스. 폼베 ORF SPCC4G3.05c(Spmus81)(서열 6) 및 에스. 세레비지에 ORF YDR386W(ScMus81)(서열 5)에 의해 암호화된 아미노산 서열을 비교하였고, 아미노산 서열 비교를 위한 효모 및 사람 서열의 해독 산물의 정렬은 프로그램 CLUSTALW로 수행하였다.

이러한 에스. 폼베 ORF(mus81⁺)의 해독 산물은 ORF YDR386w에 의해 암호화된 에스. 세레비지에의 추정 단백질과 유의적인 상동성이 있는 것으로 관찰되었다(25% 동일성 및 42% 유사성). 이 단백질은 사카로마이세스 게놈 데이터베이스에서 Mus81로 명명되었고 DNA 복구 단백질 Rad54와 복합체로 존재하는 것으로 보고되었다. 무효 돌연변이체(null mutant)는 생육성이지만, 감수분열 결손성이고 DNA 손상제 MMS 및 자외선에 민감한 것으로 보고되었다. 에스. 폼베 mus81⁺의 게놈 복사체는 3' 말단에서 부위 지시된 재조합을 통해 헤모인플루엔자 HA 에피토프의 3개의 직렬 복사체로 태그되었다.

HA 에피토프에 대하여 지시된 항체를 이용하여 비동시성 배양물로부터 폴리펩타이드를 검출하였는데, 이 폴리펩타이드들은 SDS-PAGE를 통해 약 65 내지 70kDa의 이동성으로 이동하였다. 계산된 추정 분자량은 약 65kDa이었다.

복수의 폴리펩타이드의 존재는, 이 단백질이 아마도 인산화에 의해 해독후 변형될 수 있음을 입증하는 것이다. 비동시성 배양물에서 이동이 보다 느린 폴리펩타이드의 비율은 세포를 S 기에서 세포 주기 정지를 일으키는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 억제제인 하이드록시우레아로 처리함으로써 증가하였다. 이는, 해독후 변형이 세포 주기 조절성이며 검사 의존성일 수 있음을 보여주는 것이다. Mus81의 변형 증가는 Cds1 및 Rad3 검사 돌연변이체 균주에서는 관찰되지 않았으나, rad54 돌연변이체 균주에서는 나타났다. Cds1과 Mus81 사이의 물리적 상호작용은 두 단백질의 공동면역침전법으로 생체내에서 확인되었다.

Mus81의 불활성화는 분열 효모가 자외선 조사에 더욱 민감하게 만든다. 또한, UV 유도된 손상의 모든 검출가능한 복구를 설명하는 2개의 복구 경로(뉴클레오타이드 절제 복구 및 UV 절제 복구)가 결손된 효모 균주에서도 관찰되었다. 이것 은 Mus81이 UV 손상에 내성을 나타내는데 필요하다는 것을 암시한다.

이 유전자에 의해 암호화된 생성물이 검사/복구 응답 반응에 관여하는지를 측정하기 위하여, mus81의 전체 ORF가 부위 지시된 재조합에 의해 결손된 에스. 폼베 균주를 제조하였다. 이 돌연변이체 균주는 UV 조사에 대해 증가된 감수성을 보였으나, DNA 손상의 존재하에서도 본래의 검사/복구 반응을 나타내는 것으로 관찰되었다.

실시예 5 사람 Mus81 및 Cds1 사이의 상호작용

Hmus81₁ ORF를 HA 에피토프 태그의 하류 바로 뒤에 프레임에 맞게 위치시켜 포유동물의 일시적인 발현 벡터 pYC1HA[참조: Fu et al., "TNIK, a novel member of the germinal center kinase family that activates the c-Jun N-terminal kinase pathway and regulates the cytoskeleton" J. Biol. Chem. 274(43): 30729-30737, 1999]에 클로닝하였다. 이와 마찬가지로, 사람 Cds1 ORF는 FLAG 에피토프의 하류에 프레임에 맞게 위치시켜 pYC1FLAG[참조: Fu et al., 상기 문헌 참조 1999] 발현 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 사용하여 제조원(Qiagen)의 권장에 따라 Superfect 시약으로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후, 제조원 (Boehringer Mannheim)의 권장에 따라 Pefabloc

SC 및 Complete™ 프로테아제 억제제가 보충된 용해 완충액(1% NP40, 50mM TrisHCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM DTT)에서 세포를 수집하였다. 이 용해물을 10000g에서 15분(4℃) 동안 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거하였다.

에피토프 태그된 단백질을 일시적으로 발현하는 세포의 청징화된 상청액을 HA(제조원: Santa Cruz Biotechnologies) 또는 FLAG(OctA-probe™, 제조원: Santa Cruz Biotechnologies) 에피토프에 대하여 지시된 아가로스 비드에 결합된 항체와 4℃에서 여러 시간 동안 항온처리하였다. 이 아가로스 비드를 그 다음 용해 완충액으로 3회 세척하고, SDS 변성 완충액에 재현탁시킨 뒤 95℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 상청액과 면역침전물을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 막으로 전이시켰다. 이 막을 5% 탈지유를 함유하는 TTBS(150mM NaCl, 100mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween 20)로 차단하였다. HA-태그된 Mus81 단백질을 검출하기 위하여, 블롯을 0.1% 밀크를 함유하는 TTBS로 1:1000으로 희석한 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항HA 항체(제조원: Santa Cruz Biotechnologies)와 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. FLAG 태그된 Cds1을 검출하기 위하여, 블롯을 TTBS에 1:3000으로 희석한 항-FLAG

M2 항체(제조원: Sigma)와 항온처리하였다. 이 블롯을 TTBS로 세척한 다음 TTBS에 1:3000으로 희석한 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항마우스 Ig 항체와 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 블롯을 TTBS로 세척하고 시그날을 제조원(Amersham Pharmacia Biotech)의 지시에 따라 ECL-Plus 화학발광 검출 시스템을 사용하여 측정하였다.

사람 Mus81 및 Cds1이 상호작용할 수 있는지를 측정하기 위하여, 그 단백질을 각각 HA 에피토프 및 FLAG 에피토프로 태그화하고, 포유동물 세포에서 단독으로 또는 혼용하여 일시적으로 발현시켰다. 형질감염된 세포로부터 세포 용해물을 제조하고 에피토프 태그에 대한 항체를 가지고 면역침전을 실시하였다. 그 결과 수 득되는 면역침전물을 상호작용성 항체와 웨스턴 블롯으로 분석하였다. HA 항체는 사람 Mus81의 태그된 형태의 예상 크기인 65kDa 단백질을 Mus81 작제물로 형질감염된 세포 유래의 용해물에서만 인식하였다. 이와 마찬가지로, FLAG 항체는 Cds1-FLAG를 발현하는 세포 유래의 용해물에서만 태그된 Cds1에 상응하는 65kDa 단백질을 인식하였다(도 8). Mus81은 또한 Cds1 및 Mus81로 형질감염된 세포의 용해물로부터 FLAG 항체로 수득된 침전물에서 검출되었다. 하지만, Mus81은 단지 Mus81 또는 Cds1만을 발현하는 세포 유래의 침전물에는 존재하지 않았다. 이와는 반대로, Cds1은 2가지 태그된 단백질을 발현하는 세포로부터 HA 항체로 수득된 침전물에서만 검출되었다. 이러한 결과는 사람 Mus81 및 Cds1 단백질이 포유동물 세포에서 상호작용할 수 있다는 것을 시사한다. 이것은 Hmus81 단백질이 UV DNA 손상 복구에 관여한다는 것을 암시한다.

본 발명은 자외선 손상 내성에 관여하고 분열 효모 Cds1의 FHA 도메인과 상호작용하는, 효모 Mus81 단백질의 사람 및 마우스 동족체를 동정하였다. 사람 Mus81은 다양한 스플라이싱 동형태체로서 존재하고 대부분의 사람 조직과 암세포주에서 발현된다. Mus81-GFP 융합 단백질의 분석은 이러한 단백질이 주로 핵에 존재하는 반면 사람 Mus81 및 Cds1의 태그된 형태의 공동면역침전은 그 태그된 형태가 포유동물 세포에서 복합체를 형성하고 있다는 것을 제시한다.

실시예 6 사람 Mus81의 게놈 구조 및 염색체 위치

사람 cDNA를 사용하여 Mus81을 함유하는 연속하는 게놈 서열을 공개 데이터 베이스에서 동정하였다. 게놈 서열을 비교한 결과 다양한 cDNA 형태가 상이한 스플라이스 변이체에 상응하는 것으로 확인되었다. 그 결과로부터 5.8kb 게놈 영역내에 Mus81 서열을 암호화하는 18개 엑손을 확인하였다(도 4). 확인된 cDNA 내의 스플라이싱 차이는 엑손 13과 14를 포괄하는 영역에서 나타났다. 사람 Mus81₂(서열 3)을 암호화하는 핵산은 확인된 모든 엑손으로 구성된 것이었다. 사람 Mus81₁(서열 1)을 암호화하는 핵산은 엑손 13을 포함하지 않았고, 사람 Mus81₃(서열 7)을 암호화하는 핵산은 엑손 13과 14가 결실되어 있었다. 사람 Mus81₄(서열 9)을 암호화하는 핵산의 스플라이싱은 선택적인 스플라이싱 수용인자 부위의 이용으로 인하여 엑손 14의 5' 말단에 3개의 부가 뉴클레오타이드(CAG)를 포함한다는 점을 제외하고는 사람 Mus81₁(서열 1)을 암호화하는 핵산에서 발견되는 것과 동일하였다. 모든 인트론의 스플라이싱은 컨센서스 공여인자 및 수용인자 부위를 이용하였다.

형광성 원위치 하이브리드화(FISH) 분석은 표준 절차를 이용하여 수행하였다. 간략히 설명하면, 혈액으로부터 분리된 사람 림프구를 BrdU 0.18㎎/㎖의 존재하에 배양하여 동시성을 갖게 하였다. BrdU는 세척해내어 차단을 해제시키고 세포를 6시간 동안 배양한 뒤 수거하여 고정화시켰다. FISH 검출은 바이오티닐화된 dATP로 표지된 Mus81 cDNA 프로브로 수행하였다. 염색체 위치는 DAPI 밴드 패턴과 FISH 시그날을 비교하여 결정하였다.

프로브로서 사람 Mus81 cDNA를 이용한 FISH 분석 결과 100개의 유사분열 스프레드 중 70개에서 염색체 11q13에서 한쌍이 염색되었다(도 5). 이 위치는 Mus81 서열의 일부와 동일한 공개 EST(WI-18484)가 WICGR 방사선 하이브리드 지도 상에서 염색체 11에 종래 지정된 바 있는 위치를 통해 확인되었다.

실시예 7 사람 Mus81의 발현 및 세포내 위치

사람 Mus81₄ cDNA를 레트로바이러스 발현 벡터에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 개방 판독 프레임 유전자(ORF)의 하류에 프레임에 맞게 클로닝하였다. 이 레트로바이러스 발현 벡터는 관심 대상 단백질을 조절 발현하기 위하여 선택된 것으로서, 바람직한 구체예에서는 발현을 가시화하기 위하여 관심 대상 단백질을 GFP 또는 변형된 GFP에 융합시킨다. 또한, 동일한 발현 벡터로부터 별도의 단백질로서 Mus81 단백질과 GFP 단백질을 발현시킬 수도 있다.

Mus81 단백질의 발현에 적합한 시판용 벡터로는 예를 들어, pLNCX(제조원: Clontech) 레트로바이러스 발현 벡터에서 유래된 pRevTRE(제조원: Clontech)[참조: Gossen, M. & Bujard, H., 1992, "Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters" PNAS(USA) 89:5547-5551], 또는 GFP 융합 단백질을 발현하는 레트로바이러스 발현 벡터 pLEGFP-N1 및 pLEGFP-C1(제조원: Clontech)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

사람 Mus81-GFP를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 융합 단백질을 조절 발현시키기 위한 tTA 상호활성인자의 통합된 복사체를 함유하는 A549 폐암 세포를 감염시켰다. 이 세포를 융합 단백질이 발현되도록 증식시키고, 감염 3일 후에 형광 현미경으로 가시화하였다.

사람 Mus81은 A549 세포에서 GFP 단백질과 융합체로서 발현되었다. 형광성은 이 세포들의 핵에서 주로 검출되었다(도 7). Hmus81의 핵 위치는 DNA 복구 관련 기능에서 자신의 역할에 따른 것이다.

다양한 양태를 통해 상세하게 설명되고 청구된 본 발명은 본원의 교시에 따라 당업자라면 과도한 실험 없이도 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 실시예로 예시되고 있지만, 당업자에게는 자명하듯이 본 발명의 개념, 정신 및 범위을 벗어남이 없이 본원에 제시된 조성물과 방법에 다양한 변화와 변형을 실시할 수 있다.

본 발명에 따라 노화, 암 또는 증식성 질환 등의 치료제가 제공될 수 있다.

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Claims (53)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열 12에 기재된 아미노산 서열을 갖는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산.
4. 서열 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산.
5. 서열 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산.
6. 서열 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산.
7. 서열 11에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 42 내지 1694로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
8. 서열 13에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 15 내지 1323으로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
9. 서열 15에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 52 내지 1644로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
10. 서열 17에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 52 내지 1614로 표시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산.
11. 삭제
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13. 제3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
14. 제13항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
15. 제4항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
16. 제15항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
17. 제5항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
18. 제17항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
19. 제6항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
20. 제19항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
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34. 서열 12, 14, 16 및 18로 표시되는 아미노산 잔기 서열을 갖는 단백질 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 분리된 쥐 Mus81 단백질.
35. 제34항의 단백질의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체.
36. 제35항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
37. 제35항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
38. 쥐 Mus81 세포 주기 검사/복구 경로의 단백질을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 이 세포에 의한 쥐 Mus81 세포 주기 검사/복구 경로 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 및 이 측정된 수준과 상기 화합물에 접촉시키지 않은 세포의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 쥐 Mus81 세포 주기 검사/복구 경로 단백질 발현의 억제인자 또는 활성인자로서의 화합물을 확인하는 방법.
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48. 시험하고자 하는 화학적 화합물을 숙주 세포에 투여하는 단계, 이 세포에서 쥐 Mus81 단백질의 수준을 측정하는 단계 및 측정된 수준과 처리되지 않은 정상 세포의 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하여, Mus81 의존적 세포 주기 경로를 조절하는 화학적 화합물을 확인하는 방법.
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50. 시험하고자 하는 화학적 화합물을 숙주 세포에 투여하는 단계, 이 세포에서 쥐 Mus81 단백질을 암호화하는 핵산의 수준을 측정하는 단계 및 이와 같이 측정된 핵산 수준과 처리되지 않은 정상 세포의 핵산 수준을 비교하는 단계를 포함하여, Mus81 의존적 세포 주기 경로를 조절하는 화학적 화합물을 확인하는 방법.
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52. 시험하고자 하는 화학적 화합물을 쥐 Mus81 단백질과 적합한 기질의 생화학적 혼합물에 투입하는 단계, 및 이 혼합물에서의 쥐 Mus81 단백질 활성 수준이 처리되지 않은 정상의 쥐 Mus81 단백질의 생화학적 혼합물에서의 활성 수준으로부터 변화되었는지를 측정하는 단계를 포함하여, Mus81 의존적 세포 주기 검사 경로를 조절하는 화학적 화합물을 확인하는 방법.
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