JP4633259B2 - ＮＦ−κＢの活性化を調節する化合物および方法 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、一般的に、核因子κＢ(nuclear factor κB)（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節する組成物及び方法に関するものである。本発明は、さらに詳しくは、リン酸化ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節する薬剤におよびＮＦ−κＢの活性化に関連する病気の処置方法に関するものである。本発明に包含される調節剤としては、Ｅ３ユビキチンリガーゼ類、ならびにこれらの一部及び変異体が挙げられる。
【０００２】
発明の背景
ＮＦ−κＢは、インターロイキン１、インターロイキン８、腫瘍壊死因子及びある細胞接着因子などの、免疫、炎症及び急性期応答遺伝子で観察される非常に特異的なパターンの遺伝子の発現に重要な役割を果たす転写因子である。転写活性化因子のＲｅｌ群の他のものと同様、ＮＦ−κＢは、ほとんどの細胞型の細胞質で不活性な形態で隔離される。マイトジェン、サイトカイン、抗原、ストレス誘発因子、ＵＶ光及びウィルス性タンパク質等の様々な細胞外刺激因子は、最終的にＮＦ−κＢの放出及び活性化を引き起こすシグナル伝達経路を開始する。
【０００３】
ＮＦ−κＢの活性化の重要な調節因子は、非刺激細胞の細胞質中のＮＦ−κＢと会合する(associate)（これにより、不活性化する）、タンパク質性阻害剤である、ＩκＢαおよびＩκＢβの（本明細書中では、ＩκＢと称する）である。ＮＦ−κＢの活性化及び核転座は、ＩκＢのシグナルで誘導されるリン酸化の後に起こり、これにより、ユビキチン経路を介したタンパク分解が生じる。ＩκＢαに関しては、３２及び３６番目のセリンでの刺激因子で誘導されるリン酸化により、阻害剤が２１及び２２番目のリシンでのユビキチン化のターゲットとなり、これにより分解が起こる。同様にして、１９及び２３番目のセリンでのＩκＢβのリン酸化により、阻害剤が９番目のリシンでのユビキチン化のターゲットとなる。しかしながら、ＩκＢの認識を仲介するユビキチンシステムの成分は同定されていなかった。
【０００４】
ユビキチン経路を介したタンパク質の分解は、以下の２種の別の連続した段階によって進む：（ａ）タンパク質基質への複数のユビキチン分子の共有結合、および（ｂ）２６Ｓプロテアソーム(proteasome)複合体による標的タンパク質の分解。ユビキチン経路は、協調してかつ階層的に作用する数種の成分から構成される（レビューとして、Ciechanover, Cell 79:13, 1994; Hochestrasser, Curr. Op. Cell. Biol. 7:215, 1995; Jentsch and Schlenker, Cell 82:881, 1995; Deshaies, Trends Cell Biol. 5:428, 1995を参照）。このような成分の一つである、シングルＥ１酵素は、ユビキチンの活性化を行なう。Ｅ２酵素の幾つかの主要なものは、哺乳動物細胞、植物、及び酵母で特徴が明らかにされている。Ｅ２酵素は、おそらく、リガーゼＥ３に結合し（Reiss and Hersko, J. Biol. Chem. 265:3685, 1990; Dohmen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7351, 1991）、各Ｅ２酵素は一以上のＥ３タンパク質と共に作用できると考えられる（Nuber et al., J. Biol. Chem. 271:2795; Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski et al., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen et al., J. Biol. Chem. 271:302, 1996）。
【０００５】
少数のＥ３酵素（ユビキチンリガーゼ）のみが記載されている。哺乳動物のＥ３α（酵母でのＵＢＲ１）及びＥ３βが、遊離Ｎ−末端アミノ酸残基を介してタンパク質基質を認識する（「Ｎ−末端ルール(N-end rule)」；Varshavsky, Cell 69:725, 1992; Hershko and Ciechanover, Ann. Rev. Biochem. 61:761, 1992）。Ｃｄｃ５３は、おそらく、リン酸化Ｇ１サイクリン(cyclin)を標的にするのに関わりのあるＥ３である（Willems et al., Cell 86:453, 1996）。Ｅ６−ＡＰはｐ５３の認識にかかわりがあり（Scheffner et al., Cell 75:495, 1993）、一連の独特なＥ６−Ａｐ相同タンパク質が同定された（Huibregtse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2563, 1995）。Ｎｅｄｄ４は上皮のＮａ⁺チャンネルの分解に関わりがあり（Staub et al., Embo J. 15:2371, 1996）、ＲＳＰ５（ＮＩＰ１）はパーミアーゼＧａｐ１及びＦｕｒ１を標識するのに関わりがある（Hein et al., Mol. Microbiol. 18:77, 1995）一方、Ｐｕｂ１はＣｄｃ２５を標的にする（Nefsky and Beach, EMBO J. 15:1301, 1996）。近年、単離された数種の他のＥ３酵素は、ｃ−Ｆｏｓ、筋肉タンパク質のサブセットの分解に、さらにはｐ１０５、ＮＦ−κＢ前駆体のプロセシングに関わりがあると考えられる（Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski et al., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen et al., J. Biol. Chem. 271:302, 1996）。したがって、これらのリガーゼは大きな、ほとんど解明された酵素群を表わし、「Ｎ−末端ルール(N-end rule)」リガーゼの認識の形態以外は、ユビキチンシステムのすべての他の既知の基質のモチーフは同定されていないと考えられる。
【０００６】
したがって、当該分野において、ユビキチン経路を介したＩκＢの分解をより理解し、さらにＮＦ−κＢの活性化に関連する病気を処置するのに使用されるこの分解プロセスの調節因子を同定する必要性がある。本発明は、これらの必要性を満足するものであり、さらに他の関連する利点を提供するものである。
【０００７】
発明の要約
簡単に述べると、本発明は、リン酸化ＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節することによって核因子κＢ(nuclear factor κB)（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節する組成物および方法を提供するものである。一態様においては、本発明は、単離されたヒトのＥ３ユビキチンリガーゼポリペプチドを提供するものである。このようなポリペプチドは、このポリペプチドが（ａ）リン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進する若しくは（ｂ）リン酸化ＩκＢに結合してリン酸化ＩκＢのユビキチン化を阻害するような、配列番号１６に列挙されるようなヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ配列、または一以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加により異なるこの一部若しくは変異体からなってもよい。特定の実施態様においては、このようなポリペプチドは、このポリペプチドがリン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進するような、配列番号１６に列挙される配列または配列番号１６の２０％以下のアミノ酸残基で一以上のアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換により異なるこの変異体を有していてもよい。さらなる実施態様においては、このようなポリペプチドは、一部がリン酸化ＩκＢに結合してリン酸化ＩκＢのユビキチン化を阻害する、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの一部、またはこのような一部の変異体からなってもよい。
【０００８】
本発明はさらに、一態様においては、上記したようなポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。特定の実施態様においては、このようなポリヌクレオチドは、上記したような、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの一部、またはこのような一部の変異体をコード化してもよい。このようなポリヌクレオチドと相補的である少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるアンチセンスポリヌクレオチドもまた提供される。このようなポリヌクレオチドからなる発現ベクター、およびこのような発現ベクターが形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞がさらに提供される。
【０００９】
さらなる態様においては、本発明は、上記したようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生理学的に許容できる担体と組合わせてなる薬剤組成物を提供するものである。
【００１０】
他の態様においては、本発明は、配列番号１６に列挙された配列を有するヒトのＥ３ユビキチンリガーゼに結合する、単離された抗体、およびこの抗原結合断片を提供するものである。このような抗体はモノクローナルである。
【００１１】
さらなる態様においては、上記したような抗体またはこの断片を生理学的に許容できる担体と組合わせてなる、薬剤組成物が提供される。
【００１２】
本発明はさらに、上記したような薬剤組成物を患者に投与することからなる。患者のＮＦ−κＢ活性の調節方法を提供するものである。
【００１３】
さらなる態様においては、本発明は、治療上有効な量の上記したような薬剤組成物を患者に投与することにより、ＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患を処置することからなる、ＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患に苦しめられる患者の処置方法を提供するものである。このような疾患としては、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌及びウィルス感染が挙げられる。
【００１４】
さらなる態様においては、本発明は、（ａ）ポリペプチド及び候補薬剤間の相互作用を可能にするのに十分な条件下及び時間、候補薬剤を、ポリペプチドがリン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進するような、配列番号１６に列挙される配列または一以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失若しくは付加により異なるこの一部若しくは変異体からなる、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼポリペプチドと接触させ；さらに（ｂ）その後、候補薬剤の不存在下でリン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進する当該ポリペプチドの所定の能力に対する、リン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進する当該ポリペプチドの能力を評価し；これによりＮＦ−κＢ活性を調節する薬剤を同定する段階からなる、ＮＦ−κＢ活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法を提供するものである。このようなスクリーニングに使用される候補薬剤としては、以下に制限されるものではないが、コンビナトリアルライブラリー(combinatorial library)内に存在する小分子が挙げられる。
【００１５】
本発明のこれらの及び他の態様は、下記詳細な説明および添付図面を参照して明らかになるであろう。本明細書に開示されるすべての引例は、それぞれを個々に導入して完全な状態で参考によって取り入れられる。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｄは、様々なＩκＢ Ｅ３認識モチーフの存在下で及び不存在下で行なわれるユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。特記しない限り、基質は、リン酸化されかつＮＦ−κＢ複合体が会合した³⁵Ｓ−標識された(labelled)、ＨＡ−標識(HA-tagged)ＩκＢポリペプチドであった。
【００１７】
図１Ａにおいて、レーン１は、３２及び３６番目の位置にアラニン残基を含むＩκＢαポリペプチド（Ｓ３２／３６Ａ；配列番号１３）のユビキチン化を示し、およびレーン２は、非リン酸化野生型ＩκＢαポリペプチド（配列番号１２）のユビキチン化を示す。レーン３〜１４において、ユビキチン化基質は、野生型ＩκＢα（配列番号１２）であった。レーン３において、ユビキチン化はＡＴＰの不存在下で行なわれ；さらに、レーン４〜１４においては、反応は、ＩκＢ Ｅ３認識モチーフまたは他のペプチドを用いて（レーン５〜１４）または用いずに（レーン４）、ＡＴＰγＳの存在下で行なわれた。示されるこれらのペプチドは以下のとおりである：４００μＭ ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；４００μＭ ３２及び３６番目のセリンをアラニンに置換したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン６）；４０μＭ ２箇所リン酸化した(doubly phosphorylated)ＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン７）；４００μＭ 非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９）、レーン８）；１００μＭ １箇所リン酸化した(singly phosphorylated)ＩκＢαペプチド（ｐｐ３２（配列番号９）、レーン９；ｐｐＳ３６（配列番号９）、レーン１０）；および４０μＭ より短い、２箇所リン酸化した(doubly phosphorylated)ＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン１１；ｐｐ１５（配列番号７）、レーン１２）；ｐｐ１１（配列番号６）、レーン１３；ｐｐ７（配列番号５）、レーン１４）。
【００１８】
図１Ｂにおいて、ユビキチン化基質は、遊離した野生型ＩκＢα（配列番号１２、レーン１〜３）または遊離したＳ３２／３６Ａ置換ＩκＢα（配列番号１３、レーン４〜６）であった。反応は、ＡＴＰγＳの不存在下で（レーン１及び４）または存在下で（レーン２、３、５及び６）行なわれた。４０μＭの２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９））をレーン３及び６に示されるサンプルで結合(conjugation)反応混合物に添加した。
【００１９】
図１Ｃには、ＨｅＬａ抽出物中のバルク細胞タンパク質のユビキチン化が示される。レーン１はＡＴＰの不存在下でのユビキチン化を示し、レーン５はＡＴＰの存在下でのユビキチン化を示す。レーン３〜５では、ＩκＢ Ｅ３認識モチーフまたは他のペプチドが以下のように添加された：４０μＭの２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン２）；４００μＭ ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン３）；および４００μＭ 非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９）、レーン４）。
【００２０】
図１Ｄでは、ユビキチン化基質は、リン酸化（レーン２〜７）または非リン酸化（レーン１）野生型ＩκＢβ（配列番号１４）であった。反応は、ＡＴＰγＳの不存在下で（レーン２）または存在下で（レーン１、３〜７）、さらにＩκＢ Ｅ３認識モチーフまたは下記の他のペプチドを用いて（レーン４〜７）または用いずに（レーン１〜３）行なわれた。示されるこれらのペプチドは以下のとおりである：４０μＭ ２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン４）；４００μＭ ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；４０μＭ ２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン６）；および４００μＭ 非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９）、レーン７）。
【００２１】
図２は、刺激されたＨｅＬａ細胞からの抽出物を用いて行なわれたインビトロのユビキチン依存性分解の結果を示すオートラジオグラムである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンにおいて、分解アッセイ後のリン酸化（上のバンド）及び非リン酸化（下のバンド）ＨＡ−標識ＩκＢαポリペプチド（配列番号１２）のレベルが示される。レーン１は、ＡＴＰを使用せずに行なわれた分解アッセイ後のこれらのポリペプチドのレベルを示すものである。レーン２〜６では、ＡＴＰを反応混合物中に含ませた。４０μＭの候補調節剤をレーン３〜６に示される反応に添加した：２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン３）；２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン４）；ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン５）；および非リン酸化ＩκＢαペプチド（ｐ２１（配列番号９）、レーン６）。
【００２２】
図３Ａは、調節剤カラムで分画されたＨｅＬａ細胞溶解産物のフロー−スリュー(flow-through)フラクションを用いて行なわれたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。それぞれの場合で、基質は、リン酸化されかつＮＦ−κＢ複合体が会合した³⁵Ｓ−標識された(labelled)、ＨＡ−標識(HA-tagged)ＩκＢポリペプチド（配列番号１２）であった。レーン１は、非分画抽出物を用いたユビキチン化のレベルを示すものである。レーン２〜９では、抽出物をペプチド−セファロース（登録）(Sepharose^R)カラムで分画した。使用したペプチドは以下の通りであった：ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン２）；３２、３６番目のセリンをアラニンに置換したＩκＢαポリペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン３）；２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン４〜６）；および２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン７〜９）。さらに、網状赤血球のフラクションＩＩ（１６０μｇ）をレーン５及び８に示されるユビキチン化反応に加え、さらにフラクションＩ（１６０μｇ）をレーン６及び９に示されるユビキチン化反応に加えた。
【００２３】
図３Ｂは、ＨｅＬａ細胞抽出物のバルク細胞タンパク質のユビキチン化を示すオートラジオグラムである。レーン１はＡＴＰの不存在下でのユビキチン化を示し、およびレーン２は候補調節剤を用いずにＡＴＰの存在下でのユビキチン化を示す。レーン３〜６では、下記候補調節剤を添加した：４０μＭ ２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ１９（配列番号８）、レーン３）；４００μＭ ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ（配列番号１０）、レーン４）；４００μＭ ３２、３６番目のセリンをアラニンに置換したＩκＢαポリペプチド（ｐｐ２１Ｓ／Ａ（配列番号１１）、レーン５）；および４０μＭ ２箇所リン酸化したＩκＢαペプチド（ｐｐ２１（配列番号９）、レーン６）。
【００２４】
図４Ａ〜４Ｆは、核ＮＦ−κＢ転座への候補調節剤の効果を示す顕微鏡写真である。図４Ａ〜Ｃでは、ｐｐ２１（図４Ａ及び４Ｂ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｃ）を、ＨｅＬａ細胞の細胞質中にマイクロインジェクションした。次に、細胞をＴＮＦαで即座に活性化し、抗ｐ６５抗体で免疫処置した。図４Ｄ〜Ｆでは、ｐｐ２１（図４Ｄ）またはｐｐＦｏｓ（図４Ｆ）をヒトの血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞質中に注入した。次に、細胞をＴＮＦαで即座に活性化し、抗Ｅ−セレクチン(E-selectin)抗体で免疫処置した。図４Ｅは、図４Ｄの位相差写真である。各顕微鏡写真において、注入された細胞は、大きな矢印で記される。注入されないＥ−セレクチン(E-selectin)ネガティブ細胞は、図４Ｄ及び４Ｅにおいて小さな矢印で記される。
【００２５】
図４Ｇ及び４Ｈは、図４Ａ〜４Ｆで示されるマイクロインジェクション実験の要約を表わすグラフである。図４Ｇには、核ｐ６５染色を発揮するＨｅＬａ細胞の割合（％）が示される。９０個及び４２個の細胞に、それぞれ、ｐｐ２１及びｐｐＦｏｓをマイクロインジェクションした。図４Ｈは、Ｅ−セレクチンを発揮するＨＵＶＥＣの割合（％）を示す。１６０個及び３６個の細胞に、それぞれ、ｐｐ２１及びｐｐＦｏｓをマイクロインジェクションした。各グラフについて、カラム１は、ＩκＢ Ｅ３認識モチーフまたは他のペプチド及びＴＮＦα活性化の不存在下でのレベルを示す。カラム２〜４は、ペプチドの不存在下での（カラム２）またはｐｐ２１（カラム３）若しくはｐｐＦｏｓ（カラム４）の存在下でのＴＮＦα活性化後のレベルを示すものである。
【００２６】
図５は、ＴＮＦαで活性化された細胞からのｐＩκＢα会合ユビキチンリガーゼ活性の免疫沈降を示すウェスタンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、プロテアソームで阻害し、ＴＮＦαで刺激されたまたは刺激されないＨｅＬａ細胞から免疫沈降し、これについてユビキチン、ＡＴＰ−γＳ及び下記成分の添加時にインビトロのユビキチン化を行なった：レーン１、ＵＢＣ５Ｃ；レーン２、ＵＢＣ５Ｃ及びＥ１；レーン３、なし；レーン４〜６、示されるようなＵＢＣ５Ｃ及びＥ１；レーン７、ＵＢＣ５Ｃ、Ｅ１及びｐＩκＢαペプチド；レーン８、ＵＢＣ５Ｃ、Ｅ１及びセリンが置換されたＩκＢαペプチド；レーン９、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ溶解産物のサンプル。細胞刺激は、ＴＮＦα列で示される。単量体及びユビキチン結合ＩκＢαを、図の左、下部及び上部に記す。
【００２７】
図６は、ＤＳＧＬＤＳ（配列番号８及び１９）部位でのＩκＢαのＩＫＫ−リン酸化後の、ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体とのユビキチンリガーゼの会合を示すオートラジオグラムである。非活性化細胞から免疫精製された(immunopurified)³⁵Ｓで標識されたＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、ＩＫＫ−２ＥＥ（上部に＋で記される）によってリン酸化され、Ｅ３源として非活性化ＨｅＬａ溶解産物と共にインキュベートされ、洗浄され、さらにＡＴＰγＳ、ユビキチン、Ｅ１、ＵＢＣ５Ｃ（排除された成分がAbst Ub-Enzで示される場合を除く）の存在下でのインビトロのユビキチン化を行なった。レーン２〜７はＩＫＫによるリン酸化を示す；レーン１及び３〜７はＨｅＬａ溶解産物によるインキュベーションの効果を示す；レーン４では、ｐＩκＢαペプチドをＨｅＬａ溶解産物とのインキュベーション中に添加した；レーン５では、セリンが置換されたＩκＢαペプチドをＨｅＬａインキュベーション中に添加した；レーン６では、Ｅ１をユビキチン化段階で使用しなかった；およびレーン７では、ＵＢＣ５Ｃをユビキチン化中使用しなかった。
【００２８】
図７Ａ及び７Ｂは、ユビキチンリガーゼ活性と関連するＩκＢα−結合タンパク質の同定を示すものである。図７Ａは、ＩκＢα／ＮＦ−κＢ及び関連タンパク質を含む免疫精製された(immunopurified)フラクションのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルサンプルのコロイドブルー染色(Colloidal Blue staining)を示す写真である。ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、ＩＫＫ−２ＥＥでリン酸化し（レーン２、３）または擬似的にリン酸化し(mock-phosphorylated)、これを用いてＨｅＬａ溶解産物由来のユビキチンリガーゼを吸着した（レーン１、２）。分子量マーカー（κＤ）を右側に示す。質量分析によって同定されたタンパク質を左側に示す。ユビキチンリガーゼ活性（ｐ５４及びｐ５８）と関連するバンドに相当するゲル部分を括弧で左側に記す。図７Ｂは、³⁵Ｓで標識されたＨｅＬａ細胞由来のｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ上に吸着されたタンパク質のオートラジオグラムである。放射線標識されたＨｅＬａ溶解産物をＩＫＫ−リン酸化抗体が固定化されたＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体と共にインキュベートした。次に、この免疫複合体を洗浄、溶出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィで分析した。レーン１は、ＨｅＬａ溶解産物とインキュベートされた非リン酸化ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を示し；レーン２〜４は、ＩκＢα−ペプチドの不存在下で（レーン２）若しくは存在下で（レーン３）またはセリンが置換されたＩκＢα−ペプチドの存在下で（レーン４）ＨｅＬａ溶解産物とインキュベートされたリン酸化ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を示す。分子量マーカー（κＤ）、Ｒｅｌ Ａ及びＩκＢαバンドが左側に示される；４種のｐＩκＢα−会合バンドが右側に示され、これらのうち３種はｐＩκＢαペプチドで置換された（矢印）。
【００２９】
図８Ａ〜８Ｄは、ユビキチンリガーゼ会合ｐ５４の質量スペクトル分析の結果を示すものである。図８Ａは、リガーゼポジティブレーン（図７Ｂのレーン２に等しい）から切り出された５４κＤのゲルバンドからの未分離のトリプシンペプチド(trypic peptide)混合物のナノエレクトロスプレー(nanoelectrospray)質量スペクトルを示すものである。矢印で示されるピークはフラグメント化され、β−ＴｒＣＰ由来のペプチドとして同定された。横棒はＣで拡大された領域を示す。図８Ｂ及び８Ｃは、ユビキチンリガーゼ活性と関連する（Ｃ）及び関連しない（Ｂ）５４κＤバンドのナノエレクトロスプレー(nanoelectrospray)スペクトルの比較を表わすものである。ｍ／ｚ ７１４．３８でのペプチドは配列決定用に選択された。図８Ｄは、図８Ｃで同定されたペプチドの断片化スペクトルである。配列タグは、一連の２重に荷電された断片イオンから集められ、マッチングパターン用のｎｒｄｂデータベースで調査された。読み出されたβ−ＴｒＣＰ配列：ＡＡＶＮＶＶＤＦＤＤＫＹＩＶＳＡＳＧＤＲ（配列番号２０）について算出された断片の質量を、完全な断片化スペクトルと比較したところ、一致が確認された。予想された断片イオンと一致するピークを丸で記す。
【００３０】
図９Ａ及び９Ｂは、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ（配列番号１５）をコード化するポリヌクレオチドの配列を表わすものである。
【００３１】
図１０は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼのタンパク質配列（配列番号１６）を表わすものである。
【００３２】
図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ群のものの結合及びユビキチン化特異性を示すウェスタンブロットである。これらの図において、ｍβ−ＴｒＣＰはマウスのβ−ＴｒＣＰを示し、ｈβ−ＴｒＣＰはヒトのβ−ＴｒＣＰを示し、Δβ−ＴｒＣＰはＦボックス領域が欠損したヒトのβ−ＴｒＣＰを示し、Ｓｌｉｍｂはドロソフィラ スライム(Drosophila Slimb)タンパク質を示すものである。図１１Ａは、ｐＩκＢαへの選択的な結合を示すものである。タンパク質は、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来のＦＬＡＧエピトープを介して免疫沈降され、予め示されるように処置された（−／＋ＩＫＫ）、免疫精製された(immunopurified)ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体と共にインキュベートされ、さらに結合材料は示された抗体によるウェスタンブロッティングによって分析された。上部のパネルは特異的なｐＩκＢα結合を示す；真中のパネルは基質のフロー−スリュー(flow-through)の１０％を示す；下部のパネルは免疫沈降されたタンパク質のブロットである；および分子量のサイズマーカー（ｋＤ）を左側に示す。図１１Ｂは、β−ＴｒＣＰ−ｐＩκＢα結合が、関連した非リン酸化ペプチド（ｐＳ／Ａ）によってではなく、ｐＩκＢα分解モチーフ（ｐｐ１０）を表示するホスホペプチドによって阻害されることを示す。図１１Ｃは、Ｅ３群のもののタンパク質によるｐＩκＢαのインビトロのユビキチン化を示すものである。免疫精製されたＦＬＡＧ−標識タンパク質を、³⁵Ｓで標識されたＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体と共にインキュベートし、示されるように処置され（−／＋ＩＫＫ）、さらにＡＴＰγＳ、ユビキチン、Ｅ１、ＵＢＣ５Ｃの存在下でユビキチン化を行なった。ＩκＢα基質（全長及び２種の分解産物から構成される）、ｐＩκＢα−ポリユビキチン結合体及び分子量サイズマーカーを左側に示す。
【００３３】
図１２Ａ及び１２Ｂは、Δβ−ＴｒＣＰ、優性のネガティブ分子の過剰発現によるＩκＢα分解及びＮＦ−κＢ活性化の阻害を示すものである。図１２Ａは、κＢ−Ｌｕｃレポータープラスミド及び示される発現ベクター（即ち、左から右方向に、ベクター単独、ヒトのβ−ＴｒＣＰをコード化するベクター、Ｆボックス領域が欠損したヒトのβ−ＴｒＣＰをコード化するベクター及びドロソフィラ スライム(Drosophila Slimb)タンパク質をコード化するベクター）がトランスフェクションされたＰ／Ｉ−刺激ジャーカット細胞(Jurkat cell)におけるκB−依存性ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。ＮＦ−κＢ活性は相対的な（倍）ルシフェラーゼ活性として示され、この際、刺激されなかった空のＦＬＡＧベクターを対照（１倍）とした。図１２Ｂは、空のＦＬＡＧベクターまたはΔβ−ＴｒＣＰがトランスフェクションされたホルボールエステル(phorbol-ester)及びＣａ⁺⁺イオノホア［Ｐ／Ｉ］−刺激及び非刺激ジャーカット細胞(Jurkat cell)のＩκＢαのウェスタンブロット分析を結果を示すものである。刺激後の間隔（分）を示す。
【００３４】
発明の詳細な説明
上述したように、本発明は、一般的に、核因子κＢ(nuclear factor κB)（ＮＦ−κＢ）の活性化を調節するのにおよびこのような活性化に関連する病気を処置するのに有用である組成物及び方法に関するものである。特に、本発明は、リン酸化ＩκＢ（即ち、ＩκＢαおよび／またはＩκＢβ）のユビキチン化を調節する薬剤に関するものである。このようなユビキチン化により、ＮＦ−κＢの放出及び活性化が生じる。
【００３５】
本発明は、部分的に、リン酸化されかつＮＦ−κＢと会合するＩκＢを認識するヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの同定及び特徴付けに基づくものである。このＥ３ユビキチンリガーゼ、さらにはこの一部及び他の変異体からなるポリペプチドは、インビトロでまたは患者のＮＦ−κＢ活性を調節するのに使用される。このようなポリペプチドはまた、例えば、ＮＦ−κＢ活性を調節する、および異常なＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患を処置するのに使用される薬剤（小分子など）を同定するのにも使用される。
【００３６】
ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の明細書において、５４ｋＤタンパク質として移動するヒトのＥ３ユビキチンリガーゼは、リン酸化ＩκＢα（リン酸化ＩκＢαはまた本明細書中ではｐＩκＢαとも称される）に結合し、このｐＩκＢαのユビキチン化を促進することが分かった。ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼをコード化するポリヌクレオチドの配列は、図９及び配列番号１５に提供される；さらに、全長のヒトのＥ３ユビキチンリガーゼのタンパク質配列は、図１０及び配列番号１６に提供される。ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼはまた、本発明の明細書において、β−ＴｒＣＰ(Margottin et al., Mol. Cell 1:565-574, 1998)及びドロソフィラ スライム(Drosophila Slimb)タンパク質(Jiang and Struhl, Nature 391:493-496, 1998を参照)を含むＦボックス／ＷＤタンパク質の群の一員であることが分かった。下記により詳細に説明するが、この群の他のものはＥ３の特定の性質を共有し、このようなタンパク質及びこれらの変異体はＥ３について本明細書中に提供されるある方法中で使用されてもよい。
【００３７】
本発明に包含されるヒトのＥ３ユビキチンリガーゼポリペプチドとしては、天然のヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ（本明細書では、「Ｅ３」とも称する）、さらにはこの一部及び変異体が挙げられる。Ｅ３の変異体は、変異体が本明細書に記載されるようにＩκＢポリペプチドに結合してこのポリペプチドのユビキチン化を促進する限り、本明細書に記載されるように、一以上のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入により天然のＥ３とは配列が異なるものであってもよい。好ましくは、Ｅ３の変異体は、配列番号１６に列挙される残基の、２０％以下の、好ましくは１５％以下の、より好ましくは１０％以下のアミノ酸置換を含む。変異体としてはさらに、切断(truncated)ポリペプチド及びポリペプチドの活性に最小限の影響を与えるさらなるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼポリペプチドは、列挙される性質を保持する限り、いずれの長さであってもよい。換言すると、このようなポリペプチドは、オリゴペプチド（即ち、ペプチド結合によって結合した、８〜１０残基等の、比較的少数のアミノ酸残基から構成される）、全長のタンパク質（若しくはその変異体）または中間の大きさのポリペプチド（例えば、２０、５０、２００若しくは４００アミノ酸残基）であってもよい。
【００３８】
特定の変異体としては、同類置換を含むものがある。「同類置換」は、アミノ酸が同様の性質を有する他のアミノ酸に置換されるものであり、この際、ペプチド化学の分野における当業者は実質的に変化のないポリペプチドの二次構造及び水治療性質(hydropathic nature)を実質的に変化させないことを予想できるであろう。アミノ酸置換は、通常、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性が同等であることに基づいてなされる。例えば、ネガティブに荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸があり；ポジティブに荷電されたアミノ酸としては、リシン及びアルギニンがあり；さらに、同等の親水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンがある。保守的変更を表わすアミノ酸の他の基としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。変異体はまた、あるいはこれに代えて、非保守的変更を有するものであってもよい。変異体はまた（あるいはこれに代えて）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造及び水治療性(hydropathic nature)に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって、修飾されてもよい。
【００３９】
上述したように、特定のＥ３ポリペプチドは、アミノおよび/またはカルボキシ末端にさらなるアミノ酸配列を含むものであってもよい。例えば、Ｅ３配列が、タンパク質の転移を翻訳と同時に(co-translationally)または翻訳後に行なうタンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列に結合されてもよい。ポリペプチドはまた、あるいはこれに代えて、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定を容易にするために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を促進するためにリンカーまたは他の配列に結合されてもよい。例えば、ポリペプチドは免疫グロブリンＦｃ領域に結合されてもよい。
【００４０】
Ｅ３ポリペプチドのリン酸化ＩκＢへの結合能は、当該分野における通常の知識を有するものに既知の結合アッセイを用いて容易に測定される。例えば、ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、固定化Ｅ３ポリペプチドと共にインキュベートし、ＩκＢα結合レベルを抗ＩκＢα抗体を（例えば、ウェスタンブロットに）用いて評価してもよい。このようなアッセイでは、Ｅ３ポリペプチドはＩκＢαに検出可能で結合しなければならない；好ましくは、Ｅ３ポリペプチドは、天然のヒトのＥ３に対して実質的に減少しないレベルで結合する。換言すると、変異体のリン酸化及び複合化ＩκＢαへの検出可能な状態での結合能は、天然のポリペプチドに対して、促進されても若しくは変化がなくてもよく、または天然のポリペプチドに対して、５０％未満、好ましくは２０％未満で減少してもよい。他の適当な基質がこのようなアッセイにおいてｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体の代わりに使用されてもよいことは明らかである。
【００４１】
Ｅ３ポリペプチドのリン酸化ＩκＢのユビキチン化の促進能は、本明細書中に記載されるように、ＡＴＰγＳ、ユビキチンＥ１及びユビキチンＥ２に加えて、ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体と共にポリペプチドをインキュベートし、ＩκＢαに特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによってゆっくり移動するＩκＢα−ユビキチン結合体を検出することによって評価される。通常、Ｅ３ポリペプチドにより、このようなアッセイにおいてユビキチンの検出可能なレベルを生じる；好ましくは、ユビキチンのレベルは、同量の天然のヒトのＥ３によって生じるユビキチンのレベルに対して実質的に減少しない。
【００４２】
リン酸化ＩκＢへの結合能を保持するが、ＩκＢのユビキチン化の促進能を保持しないＥ３の一部または他の変異体からなるポリペプチドペプチドもまた、本発明に包含される。このようなポリペプチドは、本明細書中で提供される結合アッセイ及びユビキチン化アッセイを用いて容易に同定され、ＩκＢのユビキチン化を阻害するのに一般的に使用される。このようなポリペプチドとしては、そのＦボックス領域（即ち、ユビキチンカスケードの１以上の成分と相互作用するタンパク質の領域）が既に検出されたものが挙げられる。Ｆボックス領域は、通常、機能により（即ち、Ｆボックス領域の欠失により、末端を切断してユビキチン機構部(machinery)の適当な成分を漸増する(recruit)タンパク質が得られる）及びＦボックス領域の共通配列(Patton et al., Trends in Genet. 14:236-243, 1998を参照)の存在に基づいて同定される。このようなポリペプチドによっては、配列番号１６の１２２〜１６８番目のアミノ酸の欠失を含む。特定の実施態様においては、Ｅ３の一部は、配列番号１６に列挙される配列の１０〜３７４番目の連続したアミノ酸残基、好ましくは５０〜２５０番目の連続したアミノ酸残基からなる。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書中に提供されるＥ３ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを提供するものである。このようなポリペプチド、または本明細書中に記載されるようなこの一部若しくは変異体をコード化するポリヌクレオチドが本発明に包含される。このようなポリヌクレオチドは、１本鎖（コーディング若しくはアンチセンス）または２本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコーディングまたは非コーディング配列は、必ずしも必要ではないものの、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずしも必要ではないものの、他の分子および／または支持材料に連結してもよい。
【００４４】
ヒトのＥ３、またはこの一部をコード化する天然のＤＮＡ配列は、当該分野における通常の知識を有するものには既知である、様々なハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて単離される。このような技術において、プローブまたはプライマーは、本明細書で提供されるＥ３配列に基づいて設計されてもよく、購入または合成されてもよい。適当な組織からのライブラリーをスクリーニングしてもよい。次に、増幅された部分または部分的なｃＤＮＡ分子を用いて、既知の技術を用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーからまたはｃＤＮＡライブラリーから全長の遺伝子を単離してもよい。または、全長の遺伝子を、複数のＰＣＲ断片から構築してもよい。このような配列を有する部分的な及び全長のポリヌクレオチド、全長のポリヌクレオチドの他の部分、およびこのような全長の分子のすべてまたは一部に相補的な配列は、特に本発明に包含されるものである。さらに、他の種由来の同族体は特に包含され、通常、本明細書に記載されるのと同様にして調製される。
【００４５】
列挙された配列を有するポリヌクレオチド変異体は、１以上の置換、欠失、挿入および／または付加で天然のＥ３ポリペプチドと異なってもよい。好ましい変異体は、ヌクレオチド位置の２０％以下、好ましくは１０％以下のヌクレオチドの置換、欠失、挿入および／または付加を含む。特定の変異体は、天然の遺伝子、またはこの一部若しくは補体と実質的に相同性を有する。このようなポリヌクレオチドの変異体は、Ｅ３タンパク質（または相補的な配列）をコード化する天然に発生するＤＮＡ配列に適度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成できる。適当な適度にストリンジェントな条件とは、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予め洗浄し；５０℃〜６５℃で、５×ＳＳＣで一晩ハイブリッド形成した後；２×、５×及び０．２×の０．１％ＳＤＳを含むＳＳＣのそれぞれで２０分間、６５℃で２回ずつ洗浄することからなる。このようなハイブリッド形成ＤＮＡ配列もまた本発明の概念に含まれる。
【００４６】
遺伝暗号の縮重の結果、本明細書中に記載されるポリペプチドをコード化する多くのヌクレオチド配列が存在することは、当該分野における通常の知識を有するものに考えられるであろう。これらのポリヌクレオチドによっては天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有するものもある。にもかかわらず、コドンの使用の相違により異なるポリヌクレオチドは特に本発明に包含される。
【００４７】
上述したように、本発明はさらに、アンチセンスポリヌクレオチド及び上記いずれかの配列の一部を提供するものである。このようなポリヌクレオチドは、通常、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成(phosphoramidite chemical synthesis)等の当該分野で既知の方法によって調製される。または、ＲＮＡ分子は、適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６など）を下流に有するベクター中に組み入れられるＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボの転写によって得てもよい。ポリヌクレオチドの特定の一部を用いて、本明細書中に記載されるような、コード化されたポリペプチドを調製してもよい。これに加えて、またはこれの代わりに、一部がプローブ（例えば、サンプル中のＥ３発現を検出するための）として機能してもよく、放射性核種、蛍光色素及び酵素等の、様々なレポーター基によって標識されてもよい。このような一部は、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の好ましい実施態様においては、プローブとして使用される一部がＥ３遺伝子に独特である配列を有する。コーディング配列に相補的である配列（即ち、アンチセンスポリヌクレオチド）の一部もまたプローブとしてまたは遺伝子の発現を調節するのに使用されてもよい。アンチセンスＲＮＡに転写されうるＤＮＡ構築物を、アンチセンスＲＮＡの製造を容易にするために細胞または組織中に導入してもよい。
【００４８】
ポリヌクレオチドはさらにインビボの安定性を増すために修飾されてもよい。可能な修飾としては、以下に制限されるものではないが、５’および／または３’末端でのフランキング配列の付加；主鎖におけるホスホジエステラーゼではないホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチル結合の使用；および／またはイノシン、クエオシン(queosine)及びワイブトシン(wybutosine)、さらにはアセチル−、メチル−、チオ−及び他の修飾形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミジン及びウリジンなどの非伝承性の塩基の混入(inclusion)が挙げられる。
【００４９】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、確立された組換ＤＮＡ技術を用いて様々な他のヌクレオチド配列に結合させてもよい。例えば、ポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ誘導体及びコスミドなどの、様々なクローニングベクターのいずれかにクローニングしてもよい。特に有用なベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ形成ベクター(probe generation vector)及び配列決定用ベクター(sequencing vector)が挙げられる。通常、ベクターは、少なくとも一の有機体で機能する複製のオリジン、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位及び一以上の選択マーカーを含むであろう。例えば、簡単に発現するベクターの構築を容易にするさらなる開始、終結および／または介在ＤＮＡ配列を存在させてもよい。適当なベクターは、市販により得てもあるいは当該分野において既知の方法によって記載される配列から組み立ててもよい。ベクター中に存在してもよい他の要素は所望の用途によって異なるであろうし、また、当該分野における通常の知識を有するものには明らかであろう。
【００５０】
本明細書中に記載されるベクターは、通常、当該分野における既知の方法によって、哺乳動物細胞等の、適当な宿主細胞中にトランスフェクトされる。このような方法としては、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションが挙げられる。
【００５１】
Ｅ３ポリペプチドは、通常、標準的な自動合成技術を用いてまたは所望のポリペプチドをコード化する組換ＤＮＡの発現によって調製される。通常、ペプチドは、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を導入する、標準的な技術を用いて合成により調製される。合成中は、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体の活性基は、必要であれば、例えば、ｔ−ブチルジカルボネート（ｔ−ＢＯＣ）基またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を用いて保護されてもよい。アミノ酸およびアミノ酸類似体は、市販により（例えば、シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)；アドバンストケムテック(Advanced Chemtec)）購入されてもあるいは当該分野において既知の方法を用いて合成されてもよい。ペプチドは、ペプチドを、すべて市販されている、４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）、４−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル−及び４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）（ワング樹脂(Wang resin)）等の樹脂に、またはDe Grado and Kaiser, J. Org. Chem. 47:3258, 1982に記載されるのと同様にして合成できるｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー（オキシム樹脂）に結合させる、固相法を用いて合成されてもよい。当業者は、アミノ酸および／またはアミノ酸類似体の選択は、部分的に、所望の物理的、化学的または生物的特性に依存するであろうことを気付くであろう。このような特性は、一部、投与方法及び患者内での標的位置によって決定される。
【００５２】
ペプチドの反応性基の選択的な修飾はまた、所望の特性を付与できる。ペプチドを樹脂に結合させたまま操作して、アセチル化ペプチド等のＮ−末端が修飾された化合物を得ることもでき、またはフッ化水素若しくは同等の切断剤を用いて樹脂から除去した後修飾してもよい。Ｃ−末端カルボキシ基を含む合成化合物（ワング樹脂(Wang resin)）を、樹脂から切断した後、または場合によっては、液相合成(solution phase synthesis)前に、修飾してもよい。ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の修飾方法は当該分野において既知であり、例えば、Ｎ−末端のアセチル化またはＣ−末端のアミド化方法が挙げられる。同様にしてアミノ酸および／またはアミノ酸類似体の側鎖の修飾方法は、ペプチド合成の分野における当業者には既知である。ペプチドに存在する反応性基になされる修飾方法の選択は、所望の特性によって決定されるであろう。
【００５３】
Ｅ３ポリペプチドはまた環状ペプチドであってもよい。環状ペプチドは、例えば、ペプチドのＮ−末端のアミノ基及びＣ−末端のカルボキシル基間の共有結合の形成を誘導することによって得ることができる。または、環状ペプチドは、末端の反応性基及び反応性のアミノ酸側鎖間のまたは２種の反応性側鎖間の共有結合を形成することによって得ることができる。環状ペプチドは所望の性質に従って選択されることは当業者には明らかであろう。例えば、環状ペプチドによって、安定性の増加、溶解度の増加、免疫原性の減少またはインビボのクリアランスの減少が得られる。
【００５４】
新たに合成されたペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または大きさ若しくはチャージによる他の分離方法などの方法を用いて精製できる。さらに、精製されたペプチドは、アミノ酸分析や質量分析等の上記及び他の既知の方法を用いて特徴が明らかにできる。
【００５５】
または、ポリペプチドは、通常、既知の技術を用いて所望のポリペプチドをコードする核酸から調製されてもよい。内因性タンパク質を調製するために、単離されたｃＤＮＡを使用してもよい。変異ポリペプチドを調製するために、オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発(oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis)等の、標準的な突然変異誘発技術が使用され、さらにＤＮＡ配列のセクションを除去することによって、切断された(truncated)ポリペプチドが調製されてもよい。
【００５６】
通常、当該分野における通常の知識を有するものに既知の様々な発現ベクターを用いて、本発明の組換ポリペプチドを発現してもよい。発現は、組換ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクションされた適当な宿主細胞中で達成される。適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母、バキュロウイルスで感染させた昆虫細胞及び動物細胞が挙げられる。発現後、培養液中に組換タンパク質またはポリペプチドを分泌する宿主／ベクターシステムからの上清をまず市販のフィルターを用いて濃縮する。濃縮後、濃縮液を、アフィニティマトリックス等の適当な精製用マトリックスまたはイオン交換樹脂にのせてもよい。１以上の逆相ＨＰＬＣ段階を用いることにより、組換ポリペプチドをさらに精製することができる。
【００５７】
通常、本明細書中に記載されるポリペプチド及びポリヌクレオチドは単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その本来の環境から除去されるものである。例えば、天然に生じるタンパク質は、天然のシステムにおいて一緒に存在する材料のいくつかまたはすべてから分離されると、単離される。好ましくは、本明細書で提供されるポリペプチドは、少なくとも８０重量％の純度にまで、より好ましくは少なくとも９５重量％の純度にまで、最も好ましくは少なくとも９９重量％の純度にまで単離される。通常、このような精製は、例えば、硫酸アンモニウム分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて達成される。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部でないベクター中にクローニングされると、単離されたと考えられる。
【００５８】
抗体
本発明はさらに、Ｅ３ポリペプチドに特異的に結合する、抗体、およびこの抗原結合断片を提供するものである。本明細書で使用される、抗体、または抗原結合断片は、ポリペプチドと検出可能なレベル（例えば、ＥＬＩＳＡで）で反応し、関連しないタンパク質とは検出上は反応しない場合には、ポリペプチドに「特異的に結合する」と称される。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。好ましい抗体としては、Ｅ３活性を阻害または遮断しかつ本明細書中に記載されるユビキチン化アッセイにおける上記抗体がある。他の好ましい抗体（例えば、イムノキナーゼアッセイに使用される）としては、本明細書中で提供されるアッセイ等の、標準的なアッセイを用いて測定される場合の、活性Ｅ３を免疫沈降するものがある。
【００５９】
抗体は、当該分野における通常の知識を有するものに既知の様々な技術によって調製される（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照)。このような一技術においては、ポリペプチドを含む免疫原を、好ましくは一以上の追加免疫処置を含む所定のスケジュールに従って、まず適当な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ及びヤギ）に注射し、動物を定期的に飼育する。次に、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば、適当な固体支持体にカップリングされたポリペプチドを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製される。
【００６０】
モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976の技術、及びこれの改良方法を用いて調製される。簡単にいうと、これらの方法は、所望の特異性（即ち、有用なポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生できる不死の(immortal)細胞系の調製に関わる。このような細胞系は、例えば、上記したようにして免疫処置された動物から得られた脾細胞から生産される。次に、脾細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー、好ましくは免疫処置された動物と同系であるものとの融合によって、不死化する(immortalize)。例えば、脾細胞及びミエローマ細胞を、数分間、非イオン性界面活性剤と共に合わせた後、ミエローマ細胞ではなく、ハイブリッド細胞の成長を支持する選択培地に低密度で播種する。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用するものである。十分な時間、一般的には１〜２週間、経過後に、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択して、これについてポリペプチドに対する結合活性を試験する。高い反応性及び特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００６１】
モノクローナル抗体は、生育したハイブリドーマコロニーの上清から単離される。加えて、マウス等の、適当な脊椎動物宿主の腹腔中にハイブリドーマ細胞系を注射するなどの、様々な技術が、収率を促進するのに使用される。次に、モノクローナル抗体は、腹水または血液から集められる。コンタミは、クロマトグラフィー、ゲル瀘過、沈降、及び抽出などの、公知の技術によって抗体から除去される。
【００６２】
特定に実施態様においては、抗体の抗原結合断片の使用が好ましい。このような断片としては、Ｆａｂ断片があり、これは標準的な技術を用いて調製される。簡潔には、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラムによるアフィニティクロマトグラフィーによってウサギの血清から精製し(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)、これをパパインで消化して、Ｆａｂ及びＦｃ断片を得る。Ｆａｂ及びＦｃ断片は、例えば、プロテインＡビーズカラムによるアフィニティクロマトグラフィーによって分離される。
【００６３】
ユビキチン化アッセイ
上述したように、Ｅ３ポリペプチドのリン酸化ＩκＢのユビキチン化の調節能は、ＡＴＰγＳ、ユビキチンＥ１及びユビキチンＥ２に加えて、ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体（または他の適当な基質）と共にポリペプチドをインキュベートし、例えば、ＩκＢαに特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによってＩκＢα−ユビキチン結合体を検出することによって評価される。本明細書中に記載されるようなユビキチン化アッセイに使用されるＩκＢポリペプチドは、天然のヒトのＩκＢα（配列番号１）若しくはＩκＢβ（配列番号３）であってもよく、または天然のタンパク質の変異体であってもよい。ＩκＢのポリペプチド変異体は、通常、本明細書中に記載されるような変異体のユビキチン化アッセイにおけるリン酸化及びユビキチン化能が実質的に減少しないように修飾される。ＩκＢポリペプチドは標識されてもよい。例えば、³⁵Ｓを、標準的な技術を用いて、³⁵Ｓ−メチオニンの存在下でポリペプチドのインビトロ翻訳によってＩκＢポリペプチド中に導入してもよい。
【００６４】
ＩκＢポリペプチドは、通常、培養宿主細胞におけるＤＮＡの発現によってまたは小麦胚抽出物等のインビトロシステムを用いた翻訳によってポリペプチドをコード化するＤＮＡから調製される。宿主細胞を使用する際には、このような細胞は細菌、酵母、バキュロウイルスで感染させた昆虫細胞または動物細胞であることが好ましい。組換ＤＮＡは、当該分野における通常の知識を有するものに既知の技術を用いて、宿主細胞内で使用されるのに適当な発現ベクター中にクローニングされる。ポリペプチドのインビトロ翻訳は、通常、製造社の指示に従って製造される。
【００６５】
発現させたＩκＢポリペプチドは、インビトロ翻訳後は精製せずに使用してもよい。または、ポリペプチドを実質的に純粋な形態で単離してもよい。ＩκＢポリペプチドは、少なくとも８０重量％の純度にまで、好ましくは少なくとも９５重量％の純度にまで、より好ましくは少なくとも９９重量％の純度にまで単離されてもよい。通常、このような精製は、例えば、本明細書中に記載される代表的な精製方法または硫酸アンモニウム分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、及びアフィニティクロマトグラフィーの標準的な技術を用いて達成される。
【００６６】
特定のユビキチン化アッセイは、Ｅ３活性を有する調節因子の特徴を明らかにするために細胞性のＥ３を使用する。このようなアッセイでは、刺激を受けたまたは刺激を受けないジャーカット(Jurkat)、ＨｅＬａ、ＴＨＰ−１または内皮細胞からの細胞抽出物を、ＡＴＰ及びホスファターゼ阻害剤であるオカダイックアシッド(okadaic acid)の存在下でＩκＢポリペプチドと共にインビトロでインキュベートする。細胞抽出物は、通常、Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995の方法に従って調製される。インキュベーションは、ＩκＢポリペプチドのリン酸化（ＩκＢα及びその変異体では３２及び３６番目のセリンでのならびにこの変異体）および細胞性の誘導されたＮＦ−κＢ複合体とのリン酸化ポリペプチド（ｐＩκＢ）の会合を生じるのに十分な条件下で行なわれる。例えば、ＩκＢポリペプチドをＨｅＬａまたはジャーカット細胞抽出物、ＡＴＰ及びオカダイックアシッド(okadaic acid)と共にインキュベートする。３０℃で９０分間のインキュベーションが、通常、ＩκＢポリペプチドのリン酸化をするのに十分である。このインキュベーション後、ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995に記載されるようにして、例えば、抗ｐ６５抗体で免疫精製し、細胞を含まないシステムでインビトロのユビキチン化を行なう。次に、ユビキチン化のレベルは、オートラジオグラフィ後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの既知の技術を用いて評価される。
【００６７】
これらの条件下で、野生型の³⁵Ｓ−ｐＩκＢαポリペプチドは、ＡＴＰγＳの存在下で複数のユビキチン化物質を生成する（図１Ａ、レーン４を参照）。ＩκＢαの³⁵Ｓで標識されたＳ３２／３６Ａ変異体（レーン１）も非リン酸化野生型の³⁵Ｓ−ＩκＢα（レーン２）もユビキチン化されない。しかしながら、遊離形態の変異体または野生型のＩκＢαは容易に結合する（図１Ｂ）。同様にして、ＩκＢαの遊離（しかし、複合体と会合しない）リシン２１、２２変異体は、インビトロでユビキチン化されうる。ゆえに、遊離ＩκＢポリペプチドを用いて行なわれるユビキチン化アッセイとは異なり、本明細書で提供されるユビキチン化アッセイは、複合体を会合し、適当にリン酸化されるＩκＢポリペプチドのみを標的とする。
【００６８】
本明細書中に記載されるユビキチン化アッセイは、ＩκＢのユビキチン化を調節する物質の同定に使用される。調節剤としては、抗体（例えば、モノクローナル）、ペプチド、小分子（例えば、コンビナトリアルライブラリー由来）及びＩκＢαおよび／またはＩκＢβポリペプチドのユビキチン化を刺激する、または好ましくは阻害する他の薬剤が挙げられる。通常、このような薬剤は、上記したようにして行なわれてもよいが、候補調節剤をユビキチン化反応に含ませ、ユビキチン化のレベルに関する薬剤の効果を評価することによって同定される。このようなアッセイに使用される候補薬剤の適当な濃度は、通常、約０．１μＭ〜約１ｍＭの範囲である。ペプチドの候補薬剤では、ベスタチン（４０μｇ／ｍＬ）等のペプチド阻害剤を添加してもよく、ペプチドの量は約１０μＭ〜約１ｍＭの範囲であることが好ましい。ユビキチン化のレベルに統計学的に有意な効果をもたらす候補薬剤は、本発明に包含される調節剤である。
【００６９】
薬剤はさらに、適当な細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞またはヒトの血管内皮初代細胞）中に薬剤（例えば、約５ｍｇ／ｍＬのペプチド薬剤）をマイクロインジェクションすることによって評価されてもよい。マイクロインジェクション後、細胞を（例えば、ＴＮＦαで）刺激し、インキュベートしてＮＦ−κＢ活性化を行なう。ＨｅＬａ細胞では、ＴＮＦαは、核中へのＮＦ−κＢの迅速な核転座を誘導し、これはｐ６５に特異的な抗体で染色することによって検出される。調節剤は、ＮＦ−κＢ転座を統計学的に有意な減少を誘導し、このような転座を検出不可能なレベルにまで減少する。
【００７０】
ヒトの血管内皮初代細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンなどのＮＦ−κＢで調節される付着タンパク質の表面での発現によるＴＮＦα刺激に応答する(Read et al., Immunity 2:493, 1995; Chen et al., J. Immunol. 155:3538, 1995)。Ｅ−セレクチンの発現は、特に、ＮＦ−κＢ依存性であり、初期の好中球付着及び活性化内皮における回旋運動(rolling)に対する主要な誘導可能な内皮付着分子である。刺激された細胞を固定、染色することによって、一以上のＮＦ−κＢで調節される付着タンパク質の発現を検出する。ポリペプチドまたは他の調節剤のマイクロインジェクションにより、このような発現の統計学的を有意な阻害はするが、ＩＣＡＭ２等のＮＦ−κＢに非依存性の付着タンパク質の発現には影響を及ぼさない。
【００７１】
治療への用途
上述したように、本明細書中に記載される特定のＥ３ポリペプチド、ポリペプチド、抗体及び他の薬剤は、通常、細胞性のＮＦ−κＢの機能を特異的に阻害するまたは促進する調節剤として使用される。調節剤はまた、患者のＩκＢαおよび／またはＩκＢβのユビキチン化を調節することにより、インビボにおけるＮＦ−κＢの細胞機能を調節するのに使用される。本明細書中に使用される、「患者」は、ヒトを含む、いずれの哺乳動物であってもよく、ＮＦ−κＢ活性化に関連する病気に苦しめられていてもよく、または検出可能な病気にかかっていなくてもよい。したがって、処置は、現在ある病気に対してでもよくあるいは予防的なものであってもよい。ＮＦ−κＢ活性化に関連する病気としては、以下に制限されるものではないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌及びウィルス感染が挙げられる。
【００７２】
処置は、本明細書中に記載される調節剤の投与を意味する。患者への投与については、通常、一以上のこのような化合物を薬剤組成物として配合する。薬剤組成物は、さらに生理学上許容できる担体（即ち、活性成分の活性を妨げない無毒な材料）を含む、滅菌水溶液若しくは非水溶液、懸濁液または乳濁液であってもよい。当該分野における通常の知識を有するものに既知の適当な担体を、本発明の薬剤組成物中に使用してもよい。代表的な担体としては、生理食塩水、ゼラチン、水、アルコール類、天然若しくは合成油、糖類溶液、グリコール類、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル類またはこのような材料の組合わせが挙げられる。必要であれば、薬剤組成物は、さらに、保存剤および／または例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および／または不活性ガス等の他の添加剤、および／または他の活性成分を含ませてもよい。
【００７３】
または、薬剤組成物は、生理学上許容できる担体と組合わせて調節剤をコード化するポリヌクレオチド（この調節剤はｉｎ ｓｉｔｕで生成するように）を含んでもよい。このような薬剤組成物では、ポリヌクレオチドは、核酸、細菌及びウィルスの発現システム、さらにはリポソーム等のコロイド分散システムなどの、当該分野における通常の知識を有するものに既知の様々なデリバリーシステム内に存在してもよい。適当な核酸発現システムは、患者における発現に必要なポリヌクレオチド配列（例えば、適当なプロモーターや終結シグナル）を含む。ＤＮＡはまた、例えば、Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993に記載されるように、「裸で(naked)」あってもよい。
【００７４】
標的とされた患者の細胞中に核酸を導入するのに使用できる様々なウィルスベクターとしては、以下に制限されるものではないが、ワクシニア若しくは他のポックスウイルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、またはアデノウィルスが挙げられる。このようなベクター中にＤＮＡを取り込む技術は当該分野における通常の知識を有するものに既知である。好ましくは、レトロウィルスベクターは、以下に制限されるものではないが、マウスモロニー白血病ウイルス(Moloney murine leukemia virus)（ＭｏＭｕＬＶ）、マウスハーベイ肉腫ウイルス(Harvey murine sarcoma virus)（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイル（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのマウスまたはトリのレトロウィルスの誘導体である。レトロウィルスベクターはさらに、選択マーカー用の遺伝子（形質導入細胞の同定及び選択を補助するための）および／または特定の標的細胞のレセプターに対するリガンドをコード化する遺伝子（ベクターターゲットを特異的にするための）を転移させるまたは取り込ませてもよい。例えば、レトロウィルスベクターが、糖、糖脂質、またはタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を挿入することによってターゲットを特異的にしてもよい。ターゲッティングはまた、当該分野における通常の知識を有するものに既知の方法によって、抗体を用いて達成されてもよい。
【００７５】
ウィルスベクターは、具体的には、感染ベクター粒子を生産するために補助を必要とする、非病原性（欠損）、複製コンピテントウィルスである。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御を受けてレトロウィルスの構造遺伝子のすべてをコード化するが、パッケージングメカニズムが封入のためのＲＮＡ転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠失している、プラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることによって、提供されうる。このようなヘルパー細胞系としては、（以下に制限されるものではないが）、Ψ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が挙げられる。このような細胞中に導入されたレトロウィルスベクターはパッケージングされて、ベクタービリオンが生産できる。さらに、この方法によって生産されたベクタービリオンを用いて、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞等の、組織細胞系を感染させることによって、多量のキメラレトロウィルスビリオンを生産できる。
【００７６】
ポリヌクレオチドに関する他の標的デリバリーシステムとしては、コロイド分散システム(colloidal dispersion system)がある。コロイド分散システムとしては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソーム等の脂質を基にしたシステムが挙げられる。インビトロ及びインビボでのデリバリーベヒクルとして使用される好ましいコロイドシステムは、リポソーム（即ち、人工膜ベヒクル）である。０．２〜４．０μｍの大きさを有する、大きな単層ベヒクル（ＬＵＶ）が実質的な割合の大きな高分子を含む水性バッファーを封入できることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷のビリオンが、水性内部に封入されて、生物学的に活性のある形態で細胞にデリバーされうる(Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981)。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母及び細菌細胞中へのポリヌクレオチドのデリバーに使用された。リポソームを効果的な遺伝子転移ベヒクルとするためには、下記特性が存在しなければならない：（１）その生物学的な活性を低下させることなく高効率での有用な遺伝子の封入；（２）非標的細胞に比して標的細胞への好ましい及び実質的な結合；（３）高効率での標的細胞の細胞質へのベヒクルの水性内容物のデリバー；および（４）遺伝子情報の正確かつ効果的な発現(Mannino et al., Biotechniques 6:882, 1988)。
【００７７】
リポソームのターゲッティングは、解剖学的及び機械的な因子に基づいて分類されうる。解剖学的な分類は、選択性のレベルに基づき、例えば、器官特異的、細胞特異的、および／またはオルガネラ特異的であってもよい。機械的なターゲッティングは、受動的または能動的であるかによって区別されうる。受動的なターゲッティングは、洞様毛細血管を含む器官の網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利用するものである。これに対して、能動的なターゲッティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、若しくはタンパク質等の特定のリガンドにリポソームをカップリングすることによって、または局在化の部位を天然に生じる以外の器官及び細胞型を標的とするためにリポソームの組成若しくは大きさを変更することによってリポソームを変更することに関わる。
【００７８】
投与の経路及び頻度、さらには投与量は、患者ごとに異なるであろう。通常、薬剤組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、キャビティー内にまたは経皮的に投与される。１〜６回の投与量が毎日投与される。ＮＦ−κＢ活性化に関連する病気に苦しめられる患者の症状の改善を示すのに十分な量が適当な投与量である。このような改善は、炎症応答（例えば、浮腫、移植片拒絶、感覚過敏）をモニターすることによってまたは病気に関連する臨床的な症状の改善を介して検出される。通常、１回の投与量に存在する、または１回の投与量に存在するＤＮＡによってｉｎ ｓｉｔｕで製造される調節剤の量は、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ宿主の範囲である。適当な投与量の大きさは、患者の大きさによって異なるであろうが、具体的には、１０〜６０ｋｇの動物に対して約１０ｍＬ〜約５００ｍＬの範囲であろう。
【００７９】
下記実施例を詳細に説明するために記載するが、これは本発明を制限するものではない。
【００８０】
実施例
実施例１
ユビキチン化アッセイを用いたＩκＢ Ｅ３認識モチーフの同定
本実施例は、代表的なユビキチン化アッセイを詳細に説明するものであり、このようなアッセイの使用はペプチドについてＩκＢのユビキチン化の阻害能を評価するためものである。
【００８１】
Ａ．インビトロのユビキチン化アッセイ
ＨＡ−標識ＩκＢαまたはＨＡ−標識ＩκＢβ ｃＤＮＡ(Haskill et al., Cell 65:1281-1289, 1991)を、製造社の指示(Promega, Madison, WI)に従って、³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で小麦胚抽出物中でインビトロで翻訳した。ＩκＢαまたはＩκＢβをリン酸化するために、１μｌの標識タンパク質を含む抽出物を、３０μｌの最終容積を有する、１００μｇのＨｅＬａまたはジャーカット細胞抽出物（Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995によって記載されるのと同様にして調製）、２ｍＭ ＡＴＰ及び１μＭ オカダイックアシッド(okadaic acid)を含む反応混合物中で、３０℃で９０分間、インキュベートした。このインキュベーション中、標識されたＩκＢポリペプチドを３２及び３６番目のセリンでリン酸化し、内因性のＮＦ−κＢ複合体と会合した（データ示さず）。
【００８２】
インキュベーション後、１μｌの抗ｐ６５血清を添加し、ＮＦ−κＢ免疫複合体をプロテインＡ−セファロース（登録）(Protein A-Sepharose^R)カラムに固定化し、Alkalay et al.によって記載されるのと同様にして、ＨｅＬａ細胞抽出物でインビトロのユビキチン化を行なった。ユビキチン化されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフィによって可視化した。
【００８３】
図１Ａに示されるように、野生型の³⁵Ｓ−ｐＩκＢαのみが複数のユビキチン化物質を生じた（レーン４）。ＩκＢαの³⁵Ｓ−標識Ｓ３２／３６Ａ変異体（レーン１）及び非リン酸化野性型³⁵Ｓ−ｐＩκＢα（レーン２）の双方ともユビキチン化されず、また、ｐＩκＢαのユビキチン化はＡＴＰの不存在下では見られなかった（レーン３）。
【００８４】
このアッセイの生理学的な関係をさらに、複合体と会合した(complex-associated)リン酸化基質に対する遊離³⁵Ｓ−ＩκＢのインビトロのユビキチン化の比較によって文書で証明した。複合体と会合した(complex-associated)Ｓ３２／３６Ａ変異体にはインビボでの宿命に従ってユビキチン結合がなされなかったが、遊離形態の変異型または野生型のＩκＢαは容易に結合した（図１Ｂ）。同様にして、ＩκＢαの複合体と会合したものではない、遊離したリシン２１、２２変異体のみがインビトロでユビキチン化した（データ示さず）。したがって、遊離ＩκＢαが識別不可能な状態でユビキチンシステムによって認識されるのに対して、複合体と会合した阻害剤は適切にリン酸化されない限りマスクされる。
【００８５】
Ｂ．ＩκＢα−ユビキチンリガーゼ認識モチーフの同定
ＩκＢα−ユビキチンリガーゼ認識モチーフを同定するために、様々なペプチドを、ペプチダーゼ阻害剤であるベスタチン（４０μｇ／ｍｌ）の存在下で反応混合物に様々な濃度で添加した。ペプチドは、タンパク質のＮ−末端のシグナルドメインをスパンし、一方の若しくは双方のセリン残基（３２及び３６番目）でリン酸化された、または修飾されなかった若しくはセリン置換された。これらのペプチドを異なる濃度でユビキチン化反応に含ませ、これについてｐＩκＢαに特異的なユビキチン化を試験した。遊離ＩκＢαの結合がモニターされたら、翻訳タンパク質をこの結合反応混合物に直接添加した。
【００８６】
３２及び３６番目のセリン双方でリン酸化されたペプチド（ｐＩκＢαペプチド）のみが効果的にｐＩκＢαユビキチン化を阻害した（図１Ａ、レーン７、１１１〜１４）。ｃ−Ｆｏｓホスホペプチド（ｐｐＦｏｓ、レーン５）、３２及び３６番目のセリンがアラニンに置換されたＩκＢαペプチド（ｐ２１ Ｓ／Ａ、レーン６）及び非リン酸化ペプチド（ｐ２１、レーン８）は、４００μＭの濃度でｐＩκＢαのユビキチン化に関する検出可能な効果を示さなかった。リン酸化ＩκＢαペプチドのＩＣ₅₀を算出し、代表的な阻害濃度を図１Ａに示す。２箇所にリン酸化されたＩκＢαペプチドは、５μＭのＩＣ₅₀でｐＩκＢα結合反応を阻害した（レーン７、１１〜１４）。これらのペプチドの配列は、上記表１に、及び配列番号５〜９に提供される。これに対して、１箇所リン酸化されたペプチド（レーン９、１０）は、４００μＭのＩＣ₅₀でｐＩκＢα結合を阻害した。シグナルリン酸化部位をスパンするのみである、最小サイズの試験ペプチド（ｐｐ７、レーン１４）は、幾分より高いＩＣ₅₀（１０μＭ）でであるが、ユビキチン化を効率良く阻害するのに十分であった。ゆえに、配列番号１の２１〜４１番目の残基を有するペプチドは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに関する認識ドメインを含む。興味深いことに、２１及び２２番目のリシンは阻害に必須ではないことから、ユビキチンシステムの認識部位は実際の結合部位から離れていることが示唆される。
【００８７】
ペプチドの特異性を、以下の２種の他のユビキチン結合反応で試験した：遊離野生型（図１Ｂ、レーン１〜３）またはＳ３２／３６Ａ変異型ＩκＢα（図１Ｂ、レーン４〜６）の結合およびＨｅＬａ抽出物における細胞タンパク質のバルクへのユビキチン結合（Alkalay et al.に従って¹²⁵Ｉ−標識ユビキチンによって検出、図１Ｃ）。反応は、ＩκＢα−ユビキチンリガーゼ認識モチーフまたはコントロールペプチドの添加によって影響を受けなかった。
【００８８】
ＩκＢα−ユビキチンリガーゼ認識モチーフを有するペプチドは、ｐＩκＢαに関連する基質であるｐＩκＢβのユビキチン化を阻害することが分かった（図１Ｄ）。ｐＩκＢαの結合と同様に、ｐＩκＢβの特異的な結合もまた、会合ＮＦ−κＢ複合体（示さず）及びＩκＢα相同性残基である１９及び２３番目のＳｅｒでの前リン酸化を必要とした。ホスファターゼ阻害剤の不存在下で調製されたＩκＢβ基質はユビキチン化されなかった（図１Ｄ、レーン１）。ペプチドは、ｐＩκＢαで観察されるのと同様のＩＣ₅₀でのｐＩκＢβユビキチン化に影響を与えた（図１Ｄ、レーン４〜７）。ゆえに、同様の酵素がユビキチン依存性分解について双方のＩκＢを標的にすると考えられる。
【００８９】
阻害ｐＩκＢαペプチドを、相補的ユビキチン依存性インビトロ分解アッセイ(Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski et al., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995)で試験した。このアッセイを用いると、刺激細胞由来のｐＩκＢαのみがユビキチンに依存してインビトロで分解されるが、同じ細胞抽出物由来の非リン酸化ＩκＢαは分解されない。分解アッセイに結合阻害ホスホペプチドを取り込むことによって、ｐＩκＢα基質が安定化された（図２、レーン３、４）が、非リン酸化ペプチド剤またはコントロールのホスホ−Ｆｏｓペプチドは特異的なｐＩκＢα分解に効果がなかった（レーン５、６）。２１／２２番目のＬｙｓでのペプチドのトリミングは分解阻害効果を減少しなかった（レーン４）ことから、これらのペプチドは結合可能な基質としてユビキチン−プロテアソームシステムを使い尽くすことによってｐＩκＢα分解を阻害しないことが示された。
【００９０】
実施例２
基質の認識に関わるユビキチンシステム成分の同定
本実施例は、ｐＩκＢαポリペプチドの認識に応答する特異的なＥ３の同定を詳細に説明するものである。
【００９１】
ｐＩκＢα−ユビキチン結合及び分解は下記ユビキチンシステム酵素の全補体が必要である：Ｅ１、ユビキチンシステムフラクションＩ、Ｅ２Ｆ１(Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995; Chen et al., Cell 84:853, 1996)由来の特異的なＥ２およびフラクションＩＩ−成分Ｅ３。基質の認識に関わるユビキチンシステム成分を同定するために、ＨｅＬａ溶解産物を、ＩκＢαホスホペプチドカラムで分画し、フロー−スリュー(flow-through)フラクションについてｐＩκＢα結合をアッセイした。ペプチドを、２ｍｇ／ｍｌの濃度で製造社の指示に従ってＮＨＳ−セファロース（登録）(Sepharose^R)カラム(Pharmacia)にカップリングさせた。１００μｇのＨｅＬａ抽出物を、４℃で１時間、０．１％ＮＰ４０及び３％オボアルブミンの存在下で２．５μｌのカップリング樹脂と共にインキュベートした。この樹脂を捨てて、非結合材料を上記ユビキチン化アッセイで試験した。
【００９２】
コントロールのホスホペプチドカラム及びＳ３２／３６Ａペプチドカラムからのフロー−スリューフラクションは全ＩκＢα結合能を保持した（図３Ａ、レーン２、３）が、２種の異なるｐＩκＢαペプチドからのフロー−スリューフラクションはそのＩκＢα特異的結合能を失っていた（レーン４、７）。失われた結合活性は、Ｅ３酵素(Ciechanover, Cell 79:13, 1994)のすべての既知のものを含む網状赤血球フラクションＩＩ（レーン５、８）によって補足された。補完は、フラクションＩまたはフラクションＩ及びＥ１（それぞれ、レーン６及び９）の添加によっては得られなかったことから、ペプチドカラムはＥ２またはＥ１ではなくＥ３を消耗していたことが示された。繰り返すが、ＩκＢαの２１及び２２番目のリシン残基はＥ３を保持するために必ずしも必要でなかった（図３Ａ、レーン７〜レーン４を比較）ことから、基質の認識及び結合部位の区別が強調される。ペプチドカラムの消耗は、すべてのフロー−スリューフラクションがランダムなＨｅＬａタンパク質結合において全活性を維持した（¹²⁵Ｉユビキチンの結合を測定することによって検出される際の、図３Ｂ）ので、ＩκＢ Ｅ３に特異的であることが分かった。これから、特異的なＥ３は同定モチーフとしてのｐＩκＢαの認識を応答可能であることが示される。
【００９３】
実施例３
細胞性ＮＦ−κＢ活性化に関する代表的なペプチドの効果
本実施例は、ＩκＢα−ユビキチンリガーゼ認識モチーフからなるペプチドのマイクロインジェクションによるＮＦ−κＢ活性化の阻害を詳細に説明するものである。
【００９４】
ＨｅＬａ細胞を、マイクロインジェクションする１８時間前にグリッドカバーガラス(Cellocate, Eppendorf)に播いた。マイクロインジェクションは、半自動化装置(Eppendorf)を用いて２２アミノ酸ｐＩκＢαペプチド（ｐｐ２１；表１及び配列番号９）またはコントロールのホスホ−Ｆｏｓペプチド（配列番号１０）を用いて行なわれた。ペプチドを、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）において５ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞の細胞質中に注射した直後に、２０分間（ＮＦ−κＢ転座では）または３時間（Ｅ−セレクチン発現では）、ＴＮＦα（２００単位／ｍＬ）で活性化した。活性化後、細胞を固定化し、ｐ６５特異的抗体(Mercurio et al., Genes & Dev. 7:705, 1993; Santa Cruz)または抗Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体(R & D Systems)で染色した。
【００９５】
ペプチドの不存在下では、ＴＮＦαは、９０％の細胞のｐ６５核染色によって示されるように、核中にＮＦ−κＢの迅速な核転座を誘導する（図４Ｇ、カラム２を参照）。ｐｐ２１ペプチドは、幾つかの実験において５０％〜７０％のマイクロインジェクションされた細胞でＴＮＦαで刺激されたＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図４Ａ及び４Ｂ；および図４Ｇ、カラム３の代表的な分野を参照）。これに対して、コントロールのｐｐ−Ｆｏｓペプチドバンドは、マイクロインジェクションされなかった細胞に比して、ＮＦ−κＢで誘導される核転座の速度に影響がなかった（図４Ｃ及び４Ｇ、カラム４）。
【００９６】
ＮＦ−κＢ阻害の機能的な結果をさらに評価するために、ＩκＢ−Ｅ３阻害ペプチドをヒトの初期血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Chen et al., J. Immunol. 155:3538, 1995）中にマイクロインジェクションした。これらの細胞は、Ｅ−セレクチン等の、ＮＦ−κＢで調節される付着タンパク質の表面での発現によるＴＮＦα刺激に応答する。ＨＵＶＥＣ細胞を、上記したようにして播種、マイクロインジェクション、及び刺激した。刺激してから３時間後に、細胞を固定化し、ＮＦ−κＢに依存性のＥ−セレクチンの発現を目的として染色した。７５％〜８５％のＨＵＶＥＣ細胞を、幾つかの実験においてＴＮＦαによる刺激後にＥ−セレクチンについてよく染色した。ｐｐ２１ペプチドのマイクロインジェクションによって、７０％〜８０％のマイクロインジェクションされた細胞でＥ−セレクチンの発現が阻害された（図４Ｄ；及び図４Ｈ、カラム３）。これに対して、コントロールのｐｐ−Ｆｏｓペプチドは、マイクロインジェクションされなかった細胞に比して、Ｅ−セレクチンの発現に効果がなかった（図４Ｆ及び４Ｈ、カラム４）。コントロール、Ｓ３２／３６Ａ置換されたＩκＢαペプチドのマイクロインジェクションは、Ｅ−セレクチンの発現の速度に効果がなかった。
【００９７】
これらの結果から、シグナルで誘導されるリン酸化ＩκＢα及びＩκＢβのサブユニットに特異的な分解が特異的なＥ３によって仲介されることが示される。Ｅ３ユビキチンリガーゼに関する認識ドメインは、第一の生物学的に関連のあるＥ３認識モチーフで代表される、双方のＩκＢで保存される２種のシグナル獲得ホスホセリン(signal-acquired phophoserine)の周辺を中心にした、短い配列である。ＩκＢ認識における特異性はリン酸化基質の内容によって支持される：会合した細胞複合体は非特異的なＥ３由来の基質をマスクする。この特徴により、特異的なリガーゼに部位特異的なリン酸化事象を介して暴露される、刺激後段階にＮＦ−κＢ阻害剤の分解が制限される。ＮＦ−κＢ活性化及びそれにより得られる機能は、本明細書で提供される調節剤を用いることにより、ＩκＢリガーゼのインビボの阻害によって特異的に阻害されうる。
【００９８】
実施例４
ＩκＢαのユビキチン化のさらなる特徴付け
本実施例は、ＩκＢαのユビキチン化と会合するユビキチンリガーゼの特徴付けを詳細に説明するものである。
【００９９】
Ａ．サイトカインの刺激がｐＩκＢα及び特異的なユビキチンリガーゼ間の会合を促進する
リン酸化ＩκＢα複合体によるユビキチン機構部(machinery)の成分の漸増をさらに研究するために、ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、プロテアソームで阻害され、ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ細胞から精製し、そのユビキチン化能を評価した。ＨｅＬａ細胞を、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮ（１５０μＭ）と共に１時間、予めインキュベートした後、ＴＮＦαで１０分間刺激した。ｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、ヤギ抗ＲｅｌＡ（ｐ６５）抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)及び、同起源のｐ６５ペプチド（ＥＬＦＰＬＩＦＰＡＥＰＡＱＡＳＧＰ（配列番号２１）、これは、合成でありかつAlfa-Diagnostic, Inc.から購入した後、ＨＰＬＣで精製し、質量分析で分析し、予想された構造を確認し、８５％超の純度であることが分かっていた）免疫アフィニティで精製した。
【０１００】
免疫精製されたフラクションに、様々なユビキチンシステムの成分を補足し、インビトロのユビキチン化を行なった。特に、このフラクションに０．２μｇの精製Ｅ１及び１μｇの精製組換ＵＢＣ５Ｃ(Jensen et al., J. Biol. Chem. 270:30408-30414, 1995)を補足し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、２０ｎＭ オカダイックアシッド(okadaic acid)、１ｍｇ／ｍｌ ウシのユビキチン(Sigma)及び５ｍＭ ＡＴＰγＳ(Sigma)を含む反応バッファー中で３７℃で９０分間、インキュベートした。次に、この反応混合物をＳＤＳ−バッファ中で沸騰し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８．５％）及びホスホ−イメージング(phosho-imaging)によって分析した。
【０１０１】
ユビキチン、精製Ｅ１及び特定のＥ２である、ＵＢＣ５Ｃの添加は、ＩκＢαに特異的な抗血清と反応する高分子量物質の蓄積で明らかである、十分なＩκＢα−ユビキチン結合活性能を生じる（図５、レーン２）のに十分であることが分かった。この活性は、Ｅ１依存性であり（レーン１および２を比較）、非刺激ＨｅＬａ細胞からの相当する免疫精製されたフラクションによっては提供されなかった（レーン４、５、６を比較）。刺激ＨｅＬａフラクションはリン酸化及び非リン酸化ＩκＢαの双方を含んでいたため、観察された結合体はいずれかのＩκＢ物質由来で有り得る。
【０１０２】
ＩκＢα結合体の源を決定するために、ユビキチン化反応を、ｐＩκＢαペプチド（ｐｐ１２；ＣＤＲＨＤＳ［ＰＯ３］ＧＬＤＳ［ＰＯ３］；配列番号２２）（レーン７）またはセリン／グルタミン酸置換ＩκＢαペプチド（ｐ１２Ｓ／Ｅ）（レーン８）の存在下で行なった。双方のペプチドとも、合成であり、Alfa-Diagnostic, Inc.から購入した後、ＨＰＬＣで精製し、質量分析で分析し、予想された構造を確認し、８５％超の純度であることが分かっていた。ＩκＢαペプチドを、ペプチダーゼ阻害剤である、ベスタチン（４０μｇ／ｍｌ）の存在下でこの反応混合物中に所定の濃度で添加した。ｐｐ１２のみがポリユビキチン−ＩκＢα結合体の形成を阻害したことから、ユビキチン化はｐＩκＢαに特異的であることが示された(Yaron et al., EMBO J. 16:6486-6494, 1997)。
【０１０３】
Ｂ．リン酸化は、特定のユビキチン化−リガーゼ活性を漸増するのに必要かつ十分である
Ｅ１及びＥ２は刺激ＨｅＬａフラクションのｐＩκＢα−結合を特異的に補足したが、非刺激フラクションは補足しなかったという知見は、以下のようにして幾つかで説明されうる：ａ）ＨｅＬａ刺激は特定のｐＩκＢα−ユビキチンリガーゼを活性化する、ｂ）ＨｅＬａ刺激は基質を修飾することにより、ユビキチン化されやすくする、またはｃ）ＨｅＬａ刺激は基質及びリガーゼ双方を修飾するのに必要である。これらの可能性を識別するために、組換、構成上活性のあるＩＫＫ２タンパク質（ＩＫＫ２−ＥＥ）を使用した(Mercurio et al., Science 278:860-66, 1997)。このタンパク質は、ＴＮＦαで活性化されたＩＫＫ−複合体と同様、３２／３６番目のセリンでＩκＢαをリン酸化する。
【０１０４】
組換³⁵Ｓで標識されたＩκＢαと共に予めインキュベートされた非刺激ＨｅＬａ溶解産物由来の³⁵Ｓで標識されたＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体の免疫精製後、この複合体を組換ＩＫＫ２−ＥＥによってリン酸化し、ｐ６５同起源ペプチドで溶出し、インビトロのユビキチン化を行なった。ＩＫＫ２−ＥＥと共にインキュベートした後、ほとんどすべての³⁵Ｓ−ＩκＢをリン酸化した。しかしながら、ユビキチン、Ｅ１及びＵＢＣ５Ｃの添加によっては、ｐＩκＢαのリン酸化は起こらなかった（図６、レーン２）。したがって、ＩＫＫによるＩκＢのリン酸化は、Ｅ１及びＥ２の存在下でのユビキチン化を促進するのに十分でなかった。おそらく、ｐＩκＢαのユビキチン化は、非刺激細胞から同時に免疫精製され(co-immunopurified)なかったＨｅＬａ溶解産物の更なる成分を必要とする。
【０１０５】
この仮定を確認するために、免疫結合したＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を、ＩＫＫ２−ＥＥによるリン酸化と同時にまたは後に、非刺激ＨｅＬａ溶解産物と共にインキュベートし、高塩バッファー(high-salt buffer)でよく洗浄し、ｐ６５ペプチドで溶出した。この際、ＨｅＬａ溶解産物との、非リン酸化ＩκＢ複合体（レーン１）ではなく、リン酸化ＩκＢ複合体（図６、レーン３）のインキュベーションが、ｐＩκＢα結合に必要なｐＩκＢ−リガーゼ成分を提供した。Ｅ１またはＥ２を反応から除外するとシグナルは得られなかったことから、ゲルの上部のシグナルはポリユビキチンＩκＢα−結合体を表わす（レーン５、６）ことが確認された。ＴＮＦαで刺激されたＨｅＬａ溶解産物は、必要なリガーゼ成分を提供するという点で非刺激溶解産物に比して優れていなかった。
【０１０６】
ｐＩκＢα−ユビキチン化に関するｐｐ１２の阻害効果（図５）から、必須なＨｅＬａ成分はインキュベーション期間中ｐＩκＢα認識モチーフと特異的にかつ安定して会合した後、ｐＩκＢ−ユビキチン結合で機能することが示唆された。この仮説を試験するために、我々は、フラクションを溶出する前に、ＨｅＬａ溶解産物と一緒に除去された、ｐｐ１２またはコントロールペプチドであるｐ１２Ｓ／Ｅをインキュベーション段階に含ませた。ｐ１２Ｓ／Ｅ（レーン５）ではなく、ｐｐ１２（図６、レーン４）の添加によって、基質の完全性を維持したまま、ｐＩκＢα−複合体に関連したユビキチンリガーゼ活性がなくなった。これは、ペプチドで処理されたフラクションがＥ３源としての網状赤血球フラクションＩＩの存在下でユビキチン化を受けられたことで明らかになった(Alkalay et al., Mol. Cell Biol. 15:1294-301, 1995)。いくつかの結論がこの実験から導かれる。
【０１０７】
１）ｐＩκＢαユビキチン化に必須なユビキチンリガーゼ成分は、ＩＫＫによるリン酸化後のＨｅＬａ溶解産物由来のＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体によって漸増される。
【０１０８】
２）この結合促進成分は、非刺激ＨｅＬａ溶解産物中に含まれることから、ＴＮＦ刺激によってユビキチンリガーゼを活性化する必要がない。
【０１０９】
３）この必須なリガーゼ成分は、特異的であると考えられ、ｐＩκＢ認識モチーフとの直接の相互作用を介してＩκＢと会合する（ｐＩκＢα−結合のｐｐ１２阻害によって示される）。
【０１１０】
Ｃ．ｐＩκＢαを認識する特異的なユビキチンリガーゼ成分の単離
ＨｅＬａ抽出物（２５０ｍｇ）を２５０μｌの抗ｐ６５イムノビーズ(immunobead)と共にインキュベートした。バッファーＡ（１Ｍ ＫＣｌ、０．５％ ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７．６、１ｍＭ ＤＴＴ）で４回洗浄及びバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ビーズの半分についてＩＫＫによるインビトロのリン酸化を行ない、半分に擬似的にリン酸化を行なった。ビーズをバッファーＡで２回及びバッファーＢで１回洗浄し、２５℃で３０分間、１μｍのオカダイックアシッド(okadaic acid)の存在下で１００ｍｇのＨｅＬａ抽出物と攪拌し、バッファーＡで４回及びバッファーＡで１回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのｐ６５ペプチドで溶出した。同様の実験を、１０ｍｇの³⁵Ｓ−代謝的に標識されたＨｅＬａ細胞溶解産物（１００μＣｉ／ｍｌ Ｍｅｔ／Ｃｙｓで８時間）及び２５μｌのｐ６５イムノビーズを用いて行なった。加熱及び冷却溶解産物双方由来の溶出液フラクションを混合し、ＳＤＳ−サンプルバッファー中で沸騰させ、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィで分析した。オートラジオグラムシグナルに相当するゲルスライスを切り出して、そのタンパク質バンドについて、下記に記載されるように、質量分析によって配列決定した。
【０１１１】
以下の３種の免疫アフィニティで精製されたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって比較した（図７）：１）ＩＫＫ２−ＥＥによってリン酸化されなかったが、ＨｅＬａ溶解産物と共にインキュベートされたｐＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体を含むフラクション；２）ＩＫＫ２−ＥＥによってリン酸化された後、ＨｅＬａ溶解産物と共にインキュベートされたフラクション；３）ＩＫＫ２−ＥＥによってリン酸化されたが、ＨｅＬａ溶解産物と共にインキュベートされなかったフラクション。すべてのインキュベーションを、イムノビーズで固定化された複合体上で行なった後、よく洗浄し、ｐ６５ペプチドで溶出した。
【０１１２】
これら３種のフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＩＫＫによるリン酸化によるまたはｐＩκＢα／ＮＦ−κＢタンパク質のさらなる免疫吸着によるパターンの変化が明らかになったが、ＩＫＫによるリン酸化後のＩκＢα−複合体に対して漸増したタンパク質を識別しなかった。タンパク質の染色の複雑さによって、免疫精製されたタンパク質に沿って移動する漸増したタンパク質(recruited protein)の存在が不明瞭になりうる。漸増したタンパク質を同定するために、質量分析をフラクション１及び２由来の１ダースのコロイドブルーで染色された(Colloidal Blue-stained)バンドで行なった。この分析から、Ｒｅｌ群のタンパク質及びＩκＢαのほとんど完全なスペクトルの存在が明らかになった：ＮＦ−κＢ１（ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ１００）、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｐ５０、ｐ４９、Ｃ−Ｒｅｌ、ＩκＢα及びＩκＢε。数種の他のタンパク質のみが、ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体、特にＧＲＰ７８／Ｂｉｐ、Ｈｓｐ７０及びＨｓｃ７０と共に同時に免疫沈降した(co-immunoprecipitated)。
【０１１３】
推定のｐＩκＢ−ユビキチンリガーゼの可能性のあるマスキングを回避するために、我々は、³⁵Ｓ−生合成により標識されたＨｅＬａ溶解産物でリガーゼ源を置換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びオートラジオグラフィによってＩκＢαと会合したタンパク質を追跡した（図７Ｂ）。平行して、様々なフラクションについて、そのユビキチンリガーゼ能を試験した。活性フラクションのバンドパターン（レーン２）を、非活性フラクションのもの（レーン１）と比較した。５４、５８、６１及び６４ｋＤの分子量を有する４種の³⁵Ｓ−タンパク質バンドがレーン２で識別された。これらのタンパク質バンドのうちいくつかはｐＩκＢαを直接認識するユビキチンリガーゼの成分を表わすが、他のものはｐＩκＢαと間接的にまたはＩＫＫでリン酸化された複合体の他の成分と会合したかもしれない。ｐＩκＢαを直接認識するリガーゼ成分を分類するために、ｐｐ１２またはコントロールペプチドであるｐ１２Ｓ／Ｅを放射線標識されたＨｅＬａ溶解産物に添加した後、免疫結合した(immuno-bound)ＩκＢα−ＮＦ−κＢ複合体と共にインキュベートした。溶出フラクションの比較によって、フラクション２でのみ存在する４種の特有のバンドのうち、３種のバンドが特定のｐｐ１２ペプチド（ｐ５４、ｐ５８及びｐ６１）によって除外されたが、６４ｋＤのバンドのみがｐｐ１２の存在下で残っていた（図７Ｂ、レーン２及び３を比較）。コントロールペプチドは、ｐＩκＢαとの特有のタンパク質のいずれの会合に影響を与えなかった（レーン４）。ｐＩκＢαと相互作用するタンパク質の２種である、ｐ５８及びｐ５４は、首尾一貫して存在し、常に特定のユビキチンリガーゼ活性と関連していた。
【０１１４】
実施例５
ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの同定
本実施例は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの単離及び特徴付けを詳細に説明するものである。
【０１１５】
前記実施例で記載された５４及び５８ｋＤのバンドをリガーゼポジティブ及びリガーゼネガティブ（非リン酸化ＩκＢα複合体と共にインキュベートされたＨｅＬａ溶解産物）レーンから切出し、タンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで消化し(Shevchenko et al., Anal. Chem. 68:850-858, 1996)、このよにして得られたトリプシンペプチドについて、ナノエレクトロスプレー(nanoelectrospray)質量分析によって配列を決定した(Wilm et al., Nature 379:466-469, 1996)。タンパク質バンドをゲル中で還元し、上記したのと同様にして、Ｓ−アルキル化し、過剰のトリプシンでゲル中で消化した（室温で一晩）(Shevchenko et al., Anal. Chem. 68:850-858, 1996; Wilm et al., Nature 379:466-469, 1996)。ゲルの切片を抽出して、得られたペプチド混合物を、５０ｎｌのポロスＲ２(Poros R2)材料(Perceptive Biosystems, Framingham, MA)を含むミクロカラムを用いて、濃縮し、脱塩した。ペプチドを、ナノエレクトロスプレー(nanoelectrospray)針中に直接１μｌの６０％メタノール、５％ギ酸で溶出した。ナノエレクトロスプレースペクトルを、４極子飛行時間質量分析計(quadrupole time-of-flight mass spectrometer)（ＱｑＴＯＦ、Parkin-Elmer Sciex, Tronto, Canada)で記録した。ペプチド配列タグ(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)を断片化スペクトルから集め、プログラムPeptideSearch(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)を用いてEuropean BioInformatics Institute(EBI, Hinxton Park, England)で維持される非多重複タンパク質配列データベース(non redundant protein sequence database)（ｎｒｄｂ）で検索した。
【０１１６】
５４ｋＤのゲルバンドの質量スペクトルから、いくつかのペプチドが断片化で選択された複合ペプチド混合物（図８Ａ）が示された。ペプチド配列タグ検索(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)によって同定されたタンパク質は、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０）、ＩκＢキナーゼα、ＩκＢε、ＲｅｌＢ、チューブリンベータ−１鎖、及び甲状腺レセプターイニシエーター結合タンパク質を含んでいた。Ｅ３活性と関連するタンパク質を同定するために、少量で存在する、さらなるペプチドを、活性フラクションからの５４ｋＤのバンドのスペクトルを非活性フラクションからの同様のバンドのスペクトルを比較することによって配列決定用に選択した（図８Ｂ）。ペプチド配列タグ（１５８７．８１）ＶＶＮＶ（配列番号２３）（１９９９．０９）を図８Ｃで示される断片化スペクトルから導き、ＡＡＶＮＶＶＤＦＤＤＫＹＩＶＳＡＳ（配列番号２４）として明確に同定した。さらに、スペクトルは、ペプチド、ＬＥＧＨＥＥＬＢＲ（配列番号２５）、ＬＶＶＳＧＳＳＤＮＴＩＲ（配列番号２６）、ＩＱＤＩＥＴＩＥＳＮＷＲ（配列番号２７）及びＶＩＳＥＧＭＬＷＫ（配列番号２８）を同定した。始めの４個の断片は、ヒトのＦボックス／ＷＤタンパク質であるβ−ＴｒＣＰ内に存在する配列を有する(Margottin et al., Mol. Cell 1:565-574, 1998)。しかしながら、５番目のペプチド（ＶＩＳＥＧＭＬＷＫ（配列番号２８））は、ヒトのβ−ＴｒＣＰと非常に相同性のある、ドロソフィラ スライム(Drosophila Slimb)タンパク質由来のペプチドのものと一致する（Jiang and Struhl, Nature 391:493-496, 1998を参照）。さらに、配列決定により、図９で提供されるヒトのＥ３ユビキチンリガーゼヌクレオチド配列（配列番号１５）が同定され、予想されたタンパク質配列を図１０に示す（配列番号１６）。したがって、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼは、相同タンパク質のβ−ＴｒＣＰ／スライム(Slimb)群の新規なものであると考えられる。
【０１１７】
実施例６
Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性のさらなる特徴付け
本実施例は、β−ＴｒＣＰ及びスライム(Slimb)のヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ群のもののユビキチンリガーゼ活性を詳細に説明するものである。
【０１１８】
これらのタンパク質のｐＩκＢαへの特異的な結合能及びユビキチン化の補助能を、細胞を含まないシステムで試験した。ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体をＨｅＬａ細胞から免疫精製し、免疫複合体を上記したのと同様にしてＩＫＫ２−ＥＥでリン酸化したまたは擬似的にリン酸化した。次に、これを、トランスフェクトされた２９３個の細胞から免疫沈降された下記固定化ＦＬＡＧ−標識Ｅ３群のものと共にインキュベートした：マウスのβ−ＴｒＣＰ（ｍβ−ＴｒＣＰ）、ヒトのβ−ＴｒＣＰ（ｈβ−ＴｒＣＰ）、１２２から１６８番目のＦボックス領域残基が欠失したヒトのβ−ＴｒＣＰ（Δβ−ＴｒＣＰ）及びドロソフィラ スライム(Drosophila Slimb)タンパク質。結合材料を抗ＩκＢα及び抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングによって分析した。これらのタンパク質はすべて、擬似的にリン酸化されたではなく、ＩＫＫでリン酸化されたＩκＢαにのみ結合した（図１１Ａを参照）。しかしながら、ヒト及びマウスのβ−ＴｒＣＰは、非常に相同性のあるドロソフィラタンパク質に比べてかなり良好にＩκＢαに結合した（レーン２、４、６及び８を比較）。Δβ−ＴｒＣＰは、野生型のタンパク質に比して良好にｐＩκＢαに結合したことから、Ｆボックス領域は結合に必ずしも必要でないであることが示された。さらに、β−ＴｒＣＰ結合は、コントロールペプチドによってではなく（レーン４）、ｐＩκＢα認識モチーフ（ｐｐ１０；ＤＲＨＤＳ（ＰＯ₃）ＧＬＤＳ（ＰＯ₃）Ｍ（配列番号２９）；図１１Ｂ、レーン３を参照）を表わすペプチドによって阻害されることから、保存されたＤＳ（ＰＯ₃）ＧＬＤＳ（ＰＯ₃）（配列番号３０）配列のｐＩκＢαの認識部位が特定された。
【０１１９】
ユビキチン化への結合の効果を評価するために、Ｅ３群のもの及び欠失変異体をｐＩκＢαユビキチン化においてＥ３活性の源として使用した。Ｅ１及びＥ２（ＵＢＣ５Ｃ）の存在下では、野生型のβ−ＴｒＣＰタンパク質は、非リン酸化ＩκＢαのではなく、ｐＩκＢαのユビキチン化を容易にした（図１１Ｃ、レーン１〜４を参照）。Ｆボックスタンパク質−タンパク質の相互作用モデュールが欠失した、Δβ−ＴｒＣＰは、その結合能（図１１Ａ、レーン６）にもかかわらず、ユビキチン化を促進しなかった（レーン７及び８）。スライム(Slimb)はｐＩκＢαのユビキチン化によっては容易にしたが、ヒト及びマウスのβ−ＴｒＣＰに比べて少なくとも１０倍効果が低く（同様のＦＬＡＧ−タグ発現レベルを基に）、これはより低い活性に相当した。
【０１２０】
これらの群のもののモジュラー設計及び本明細書中で記載されるインビトロの分析から、Ｆボックスの欠失によりインビボで優性なネガティブ分子として機能するタンパク質が得られることが示唆された。事実、Δβ−ＴｒＣＰの一時的な過剰な発現は、刺激されたジャーカット細胞における内因性のＩκＢαの分解を阻害し、これによりｐＩκＢαが蓄積した（図１２Ｂ）。その結果、ＮＦ−κＢの活性化が阻害された（図１２Ｂ）。ＮＦ−κＢの活性化は、Δβ−ＴｒＣＰがＮＦ−ＡＴレポーターの活性化に影響を与えなかったので、特異的であった。ＮＦ−κＢの阻害が野生型のスライム(Slimb)でも観察されたが、野生型のヒトのβ−ＴｒＣＰの発現は抑制性ではなかった（図１２Ｂ）という事実が特筆すべきものである。したがって、野生型のスライム(Slimb)の過剰な発現は、おそらくその比較的低いｐＩκＢαのユビキチン化活性に関連する、ＮＦ−κＢの活性化に対する優性のネガティブな効果を有する（図１１Ｂ）。
【０１２１】
前記から、本発明の特定の実施態様が詳細な説明を目的として本明細書で記載されてきたが、様々な修飾が本発明の精神及び概念から逸脱しない限りなされると考えられるであろう。したがって、本発明は添付された特許請求の範囲によって以外は制限されない。
【０１２２】
配列表の要約
配列番号１は、ＩκＢαのアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号２は、ＩκＢαのＤＮＡ配である。
【０１２４】
配列番号３は、ＩκＢβのアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号４は、ＩκＢβのＤＮＡ配列である。
【０１２６】
配列番号５は、ｐｐ７のアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号６は、ｐｐ１１のアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号７は、ｐｐ１５のアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号８は、ｐｐ１９のアミノ酸配列である。
【０１３０】
配列番号９は、ｐｐ２１のアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号１０は、ホスホ−Ｆｏｓペプチドのアミノ酸配列である。
【０１３２】
配列番号１１は、ｐｐ２１ Ｓ／Ａのアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号１２は、ＨＡで標識されたＩκＢαのアミノ酸配列である。
【０１３４】
配列番号１３は、ＨＡで標識されたＳ３２、３６ ＩκＢαのアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号１４は、ＨＡで標識されたＩκＢβのアミノ酸配列である。
【０１３６】
配列番号１５は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼのＤＮＡ配列である。
【０１３７】
配列番号１６は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼの予想されたアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号１７は、ヒトのβ−ＴｒＣＰのＤＮＡ配列である。
【０１３９】
配列番号１８は、ヒトのＥ３ β−ＴｒＣＰのアミノ酸配列である。
【０１４０】
配列番号１９は、ＩκＢαのリン酸化部位である。
【０１４１】
配列番号２０は、読み出された(retrieved)β−ＴｒＣＰ配列である。
【０１４２】
配列番号２１は、同起源のｐ６４ペプチドのアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号２２は、ｐＩκＢαペプチドｐｐ１２のアミノ酸配列である。
【０１４４】
配列番号２３は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼのペプチド配列タグである。
【０１４５】
配列番号２４は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ由来のペプチドである。
【０１４６】
配列番号２５は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ由来のペプチドである。
【０１４７】
配列番号２６は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ由来のペプチドである。
【０１４８】
配列番号２７は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ由来のペプチドである。
【０１４９】
配列番号２８は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ由来のペプチドである。
【０１５０】
配列番号２９は、ｐＩκＢα認識モチーフのアミノ酸配列である。
【０１５１】
配列番号３０は、保存されたｐＩκＢα配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｄは、様々なＩκＢ Ｅ３認識モチーフの存在下で及び不存在下で行なわれるユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。
【図２】 図２は、刺激されたＨｅＬａ細胞からの抽出物を用いて行なわれたインビトロのユビキチン依存性分解の結果を示すオートラジオグラムである。
【図３】 図３Ａは、調節剤カラムで分画されたＨｅＬａ細胞溶解産物のフロー−スリュー(flow-through)フラクションを用いて行なわれたユビキチン化アッセイのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すオートラジオグラムである。図３Ｂは、ＨｅＬａ細胞抽出物のバルク細胞タンパク質のユビキチン化を示すオートラジオグラムである。
【図４】 図４Ａ〜４Ｆは、核ＮＦ−κＢ転座への候補調節剤の効果を示す顕微鏡写真である。図４Ｇ及び４Ｈは、図４Ａ〜４Ｆで示されるマイクロインジェクション実験の要約を表わすグラフである。
【図５】 図５は、ＴＮＦαで活性化された細胞からのｐＩκＢα会合ユビキチンリガーゼ活性の免疫沈降を示すウェスタンブロット分析の結果を示すオートラジオグラムである。
【図６】 図６は、ＤＳＧＬＤＳ（配列番号８及び１９）部位でのＩκＢαのＩＫＫ−リン酸化後の、ＩκＢα／ＮＦ−κＢ複合体とのユビキチンリガーゼの会合を示すオートラジオグラムである。
【図７】 図７Ａ及び７Ｂは、ユビキチンリガーゼ活性と関連するＩκＢα−結合タンパク質の同定を示すものである。
【図８】 図８Ａ〜８Ｄは、ユビキチンリガーゼ会合ｐ５４の質量スペクトル分析の結果を示すものである。
【図９】 図９Ａ及び９Ｂは、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼ（配列番号１５）をコード化するポリヌクレオチドの配列を表わすものである。
【図１０】 図１０は、ヒトのＥ３ユビキチンリガーゼのタンパク質配列（配列番号１６）を表わすものである。
【図１１】 図１１Ａ〜１１Ｃは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ群のものの結合及びユビキチン化特異性を示すウェスタンブロットである。
【図１２】 図１２Ａ及び１２Ｂは、Δβ−ＴｒＣＰ、優性のネガティブ分子の過剰発現によるＩκＢα分解及びＮＦ−κＢ活性化の阻害を示すものである。
【配列表】

Claims (15)

1. 以下の配列からなる単離されたポリペプチド：
   （１）配列番号１６のアミノ酸配列；または
   （２）配列番号１６のアミノ酸配列に加えて、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするための、または固体支持体へのポリペプチドの結合を促進するためのリンカー配列をさらに含むアミノ酸配列。
2. 配列番号１６のヒトＥ３ユビキチンリガーゼ配列の一部からなり、該一部がＦボックス領域を欠損しており、該一部がリン酸化ＩκＢに結合しかつリン酸化ＩκＢのユビキチン化を阻害する、単離されたポリペプチド。
3. 配列番号１６の１２２〜１６８番目のアミノ酸を欠失している、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
5. 請求項２に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
6. 請求項３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチドを含むアンチセンスポリヌクレオチド。
7. 請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクションされた宿主細胞。
9. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドおよび生理学的に許容できる担体を含む組成物。
10. 請求項２に記載の単離されたポリペプチドおよび生理学的に許容できる担体を含む組成物。
11. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび生理学的に許容できる担体を含む組成物。
12. 請求項２に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび生理学的に許容できる担体を含む組成物。
13. 請求項６に記載のアンチセンスポリヌクレオチドおよび生理学的に許容できる担体を含む組成物。
14. （ａ）ポリペプチド及び候補薬剤間の相互作用を可能にするのに十分な条件下及び時間、候補薬剤を、請求項１に記載のポリペプチドと接触させ；さらに
    （ｂ）その後、候補薬剤の不存在下でリン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進する当該ポリペプチドの所定の能力に対する、リン酸化ＩκＢのユビキチン化を促進する当該ポリペプチドの能力を評価し；
    これによりＮＦ−κＢ活性を調節する薬剤を同定する段階からなる、ＮＦ−κＢ活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
15. 該候補薬剤はコンビナトリアルライブラリー内に存在する小分子である、請求項１４に記載の方法。

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