KR100756689B1

KR100756689B1 - 엔에프-카파비의 활성을 조절하는 화합물과 방법

Info

Publication number: KR100756689B1
Application number: KR1020017007719A
Authority: KR
Inventors: 엠.안토니 만닝; 프랭크 머쿠리오; 샤론 아미트; 이논 벤-네리아; 마티 데이비스; 아다 해츠바이; 이리스 라본; 아브라함 야론
Original assignee: 시그날 파마소티칼 아이엔씨; 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2007-09-07
Also published as: CN102816743A; ES2361660T3; ATE499445T1; US20040203098A1; US20030166587A1; EP1135504B1; CN1346406A; WO2000034447A3; KR20020007284A; US8263326B2; KR20070050995A; IL187254A; WO2000034447A2; JP2002539766A; IL143516A0; AU779893B2; US20090233855A1; AU2004240212B2; AU2004240212A8; IL143516A

Abstract

핵내인자 κB(nuclear factor κB, NF-κB)의 활성을 조절하는 방법과 조성물이 재공되어 진다. 조성물은 인산화된 IκB α그리고/또는 IκBβ의 유비큐틴화(ubiquitination)의 조절하는 하나 또는 그 이상의 약제를 포함한다. 그러한 조성물은 NF-κB 활성과 관련된 질병을 치료하는데 사용되어 질 수 도 있다. 조절제에는 인간 E3 유비큐틴(ubiquitin) 리가제(ligages), 그것의 항체 및 그와 관련된 단백질 뿐만아니라 그것의 변종이 포함된다.

NF-κB, 유비큐틴화, 인산화, IκB, 유비큐틴 리가제, 트랜스로캐이션, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체

Description

엔에프-카파비의 활성을 조절하는 화합물과 방법{Compounds and methods for modulating activation of NF-κB}

본 발명은 핵내인자 κB(nuclear factor κB, NF-κB})의 활성을 조절하는 방법과 조성물에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 인산화된 IκB α그리고/또는 IκB β의 유비큐틴화(ubiquitination)의 조절제와 NF-κB와 관련된 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 완성된 조절제에는 E3 유비큐틴(ubiquitin) 리가제(ligages)와 그것의 일부분 및 변종이 포함된다.

핵내인자 카파비(NF-κB)은 인터류킨 1(interleukin 1), 인터류킨 8(interleukin 8), 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 그리고 특정세포고착인자(certain cell adhesion molecules)와 같은 면역반응유전자, 염증반응유전자 그리고 급성반응유전자에서 관찰되는 고도로 특이적인 양상으로 유전자 발현이 되는 곳에서 중추적인 역할을 하는 전사인사(transcription factor)이다. 전사활성화인자인 렐(Rel)족의 다른 것들과 마찬가지로, NF-κB는 대분분의 세포에서 세포질에 불활성 폼(inactive form)으로 존재한다. 분열촉진물질(mitogens), 사이토카인(cytokine), 항원(antigens), 스트레스 유발제(stress inducing agents), UV 광 그리고 바이러스 단백질(viral proteins)과 같은 다양한 세포외 자극에 의하여 궁극적으로 NF-κB가 방출하여 활성화되는 정보전달경로(signal trnasduction pathway)가 개시된다.

NF-κB 활성의 주요조절인자는 IκBα와 IκBβ(이하에서는 이들은 IκB라고 한다)라는 억제 단백질(inhibitor protein)이다. 이들은 자극이 유발되지 않은 세포의 세포질에서 NF-κB(그래서 불활성화되어 있다)와 결합하고 있다. IκB의 인산화(signal-induced phosphorylation)를 신호로 하여 결과적으로 NF-κB의 핵내로의 이동과 활성이 일어나고, 이로 인해 유비큐틴 경로(ubiquitin pathway)를 통한 단백질분해가 일어난다. IκBα의 세린(serine) 잔기 32와 36에서의 자극 유도된 인산화가 되면 억제제가 리신(lysine) 잔기 21과 22에 유비큐틴화가 되는 것의 표적이 되어, 결과적으로 분해가 된다. 유사하게, IκBβ의 세린(serine) 잔기 19와 23에서 인산화가 되면 억제제가 리신(lysine)잔기 9에서 유비큐틴화가 되는 것의 표적이 된다. 그러나 IκB를 조절하는 유비큐틴(ubiquitin) 시스템(system)의 구성요소가 모두 밝혀진 것은 아니다.

유비큐틴 경로(ubiquitin pathway)를 통한 단백질의 분해는 2개의 별개이나 연속적인 단계에 의해 진행된다; a) 단백질 기질에 다양한 유비큐틴(ubiquitin) 분자가 공유결합하는 단계 그리고 b) 26 프로테오좀 복합체(proteosom complex)에 의해 표적이 되는 단백질를 분해하는 단계이다. 유비큐틴 경로(ubiquitin pathway)는 서로 헙력하고 계통적(hierarchical)으로 작용하는 여러 가지 구성요소들로 이루어져 있다(for reviews, see Ciechanover, Cell 79:13, 1994; Hochstrasser, Curr. Op. Cell. Biol. 7:215, 1995; Jentsch and Schlenker, Cell 82:881, 1995; Deshaies, Trends Cell Biol. 5:428, 1995). 그런 구성요소중에 하나가 단독의 E1 효소(single E1 enzyme)으로 유비큐틴(ubiquitin)을 활성화하는 효소이다. E2 효소의 여러가지 주요종이 포유동물의 세포, 식물 그리고 효모에서 작용을 한다. E2 효소는 리가제(ligase) E3에 결합되어 있는 것으로 추정되고(Reiss and Hersko, J. Biol. Chem. 265:3685, 1990; Dohmen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7351, 1991), 각각의 E2효소는 하나 또는 여러개의 E3 단백질에 작용할 수 있는 것으로 밝혀지고 있다.(Nuber et al., J. Biol. chem. 271:2795, 1996; Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707,1995; Stancovski et al., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen et al., J. Biol. Chem. 271:302,1996).

단지 몇개의 E3 효소(유비큐틴 리가제, ubiquitin ligase)만이 밝혀지고 있다. 표유동물의 E3α(효모에서는 UBR1)와 E3β는 프리 N-말단 아미노산 잔기(free N-terminal amino acid residues)를 통해 단백질 기질을 인식한다,("N-end rule"; Varshavsky, Cell 69:725,1992; Hershko and Ciechanover, Ann. Rev. Biochem. 61:761, 1992). 인산화된 G1 사이클린(cyclins)을 표적으로 하고 있는 cdc53도 아마 E3 효소 중에 하나일 것이다(Willems et al., Cell 86:453, 1996). p53을 인식하는 E6-AP도 E3 효소 중에 하나이고(Scheffner et al., Cell 75:495, 1993), 일련의 독특한 E6-AP 상동 단백질(homologous proteins)들에 관한 것도 밝혀지고 있다 (Huibregtse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2563, 1995): 상피조직의 Na⁺ 채널(epithelial Na⁺ channel)을 분해하는 nedd4도 E3 효소에 포함된다.(Staub et al, Embo J. 15:2371, 1996) 그리고 퍼마아제(permease) Gap1 과 Fur1을 표지하는(tagging) RSP5 (NIP1)도 이에 포함되며 (Hein et al., Mol. Microbiol. 18:77, 1995), 반면에 Pub1는 Cdc25를 표적으로 한다.(Nefsky and Beach, EMBO J. 15:1301, 1996). 최근에 분리되고 있는 여러가지 E3 효소들은 근육단백질의 일부인 c-Fos를 분해하거나 NF-κB의 전구체인 p105를 프로세싱(processing)하는데 관여하는 것으로 밝혀지고 있다.(Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski et al., Mol, Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen et al., J. Biol. Chem. 271:302,1996). 그러므로 리가제는 대부분 큰 언라블드(unraveled) 효소집단으로 나타내어 지고, 'N-말단 규칙'을 따르는 리가제(E3α와E3β)의 인식 모티브를 제외하고는, 유비큐틴 시스템의 기질은 알려져 있으나, 기질을 인식하는 모티브에 대해서는 밝혀지지 않았다.

따라서 유비큐틴 경로를 통한 IκB 분해에 관한 이해가 필요하고, NF-κB의 활성화와 관계되는 질병을 치료하기 위하여, 분해 공정의 조절제를 분리할 필요가 있다. 본 발명은 상기 목적을 달성하였고, 이와 관련된 다른 이점을 더 제공한다.

[발명의 요약]

간단히 요약하면, 본 발명은 인산화된 IκBα그리고/또는 IκBβ의 유비큐틴 화를 조절하여 핵내 인자 κB(NF-κB)의 활성화를 조절하는 방법과 조성물을 제공한다. 본 발명은 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드를 단리하여 제공한다. 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:16에 열거된 인간 E3 유비큐틴 리가제 시퀀스(human E3 ubiquitin ligase sequence)를 포함하거나, 그 일부만을 포함하거나 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 그리고/또는 첨가에 의해 달라진 변종이다. 그런 폴리펩티드는 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 활성화시키거나 인산화된 IκB에 결합하여 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 억제한다. 본 발명의 실시예에서, SEQ ID NO:16 의 시퀀스를 그대로 가지고 있는 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:16 의 아미노산 잔기 중에서 20% 이내의 아미노산이 하나 또는 그 이상 결실, 삽입 또는 치환되어 달라진 폴리펩타이드의 변종은 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시킨다. 또다른 실시예에서는, 인간 E3 유비큐틴 리가제의 일부를 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 일부만을 포함하는 폴리펩티드의 변종은 상기 폴리펩티드의 일부에 인산화된 IκB가 결합하여 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 저해한다.

본 발명은 더 나아가, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 단리하여 제공하는 것이다. 실시예에서 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 E3 유비큐틴리가제의 일부를 암호화하거나 상기와 같이 일부의 변종을 암호화하기도 한다. 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 최소한 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드도 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터와 상기 발현벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 주세포도 또한 제공한다.

본 발명은 또한 생리학적으로 허용되는 담체와 결합시킨 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약제조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:16의 시퀀스를 가지고 있는 인간 E3 유비큐틴 리가제에 결합하는 항체와 그들의 단편(fragment)에 결합하는 항원을 단리하여 제공하는 것이다. 상기 항체는 단일클론(monoclonal) 일 수도 있다.

본 발명은 또한 생리학적으로 허용되는 담체와 결합되어 있는 상기 항체와 그들의 단편을 포함하는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 약제조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 NF-κB활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 약제 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여는 것을 포함하고, 그 것에 의하여 NF-κB 활성화와 관련된 질병을 치료하는 NF-κB 활성화와 관련된 질병을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법 제공한다. 상기 질병에는 염증성 질병, 자가면역질병, 암 그리고 바이러스 감염이 포함된다.

본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO:16에 열거된 시퀀스 전부를 포함하거나 일부를 포함하거나, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 또는 첨가되어 달라진 변종을 포함하는 폴리펩티드로서 인산화된 IκB 의 유비큐틴을 활성화시키는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드를 후보약제와 반응이 일어나도록 충분한 시간과 조건하에서 접촉시키는 단계; 그리고 (b) 후보약제가 없을 때 인산화된 IκB 유비큐틴화를 증가시키는 미리 측정된 폴리펩티드의 정도와 비교하여 인산화된 IκB 의 유비큐틴화를 증가시키는 폴리펩티드의 정도를 측정하는 단계; 그리하여 NF-κB 활성을 조절하는 약제를 식별하는 단계를 포함하는 NF-κB 활성을 조절하는 약제를 스크리닝(screening)하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 스크리닝에 사용되는 후보약제에는, 이것으로만 제한되는 것은 아니지만, 조합 라이브러리(combinatorial library)내에 있는 소분자들이 포함한다.

본 발명은 하기 도면과 상세한 설명에 의하여 좀더 상세힌 설명된다. 본 명세서에 공지된 참고문헌은 각각 개별적으로 끼워넣은 것 같이 왼전한 형태로 합쳐져 있다.

도 1A-ID는 다양한 IκB E3 인식 모티브가 없는 경우와 있는 경우에 시행된 유비큐틴화를 분석한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 자동방사선사진이다. 다르게 명시되지 않았다면, 기질은 NF-κB 에 결합되어 있고, ³⁵S - 라벨(labelled)되어 있고, 인산화되어 있는 HA-태그된(tagged) IκB 폴리펩티드이다.

도 1A에서, 1레인은 32번과 36번 위치에 알라닌 잔기를 포함하고 있는 IκB α폴리펩티드의 유비큐틴화를 나타낸 것이다(S32/36A; SEQ ID NO:13). 2레인은 인산화되지 않은 야생형의 IκBα폴리펩티드(SES ID NO:12)의 유비큐틴화를 나타낸 것이다. 3-14레인에서 유비큐틴화의 기질은 야생형의 IκBα(SEQ ID NO:12)이다. 3 레인에서, 유비큐틴화는 ATP 없이 실시하였고; 4-14레인에서 반응은 ATPγS의 존재하에서 IκB E3 인식 모티브 또는 다른 펩티드가 없는 경우(4 레인) 또는 있는 경우에 (레인 5-14) 시행된 것이다. 상기 펩티드는 다음과 같다: 400μM c-Fos 포스포펩티드(ppFos(SEQ ID NO:10), 레인 5); 400μM 세린 32, 36이 알라닌(alanine)으로 치환된 IκBα펩티드(pp21S/A(SEQ ID NO:11), 레인 6); 40μM 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 7); 400μM 인산화되지 않은 IκBα펩티드(p21 (SEQ ID NO:9), 레인 8); 100μM 단독으로 인산화된 IκBα펩티드(pp32 (SEQ ID NO:9), 레인 9); ppS36 (SEQ ID NO:9), 10 레인); 그리고 40μM 보다 짧고, 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp19 (SEQ ID NO:8), 레인 11); pp15(SEQ ID NO:7), 12레인; pp11(SEQ ID NO:6), 레인 13; pp7(SEQ ID NO:5), 14 레인).

도 1B에서, 유비큐틴화의 기질은 프리(free) 야생형 IκBα(SEQ ID NO:12, 레인 1-3) 이거나 프리(free) S32/36A 으로 치환된 IκBα(SEQ ID NO:13, 레인 4-6)이다. 이 반응은 ATPγS가 있는 조건(2,3,5 그리고 6 레인) 또는 없는 조건(1레인과 4레인)에서 수행된다. 40μM 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9))를 3레인과 6레인에서 나타난 시료에 있는 컨쥬게이션 반응(conjugation reaction) 혼합물에 첨가한다.

도 1C에는 HeLa 추출물에서 벌크(bulk) 세포 단백질의 유비큐틴을 나타내고 있다. 1 레인은 ATP가 없는 경우에 유비큐틴화를 나타내고 있고, 5 레인은 ATP가 있는 경우에 유비큐틴화를 나타내고 있다. 3-5 레인에는, IκB E3 인식 모티브 또는 다른 펩티드가 첨가된다: 40μM 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 2); 400μM c-Fos 포스포펩티드(ppFos (SEQ ID NO:10), 레인 3); 400μM 인산화되지 않은 IκBα펩티드(p21 (SEQ ID NO:9); 4레인).

도 1 D에서 유비큐틴화의 기질은 인산화된 ( 2-7 레인) 또는 인산화되지 않은 (1 레인) 야생형 IκBβ(SEQ ID NO:14)이다. 반응은 ATPγS가 없거나(2 레인), 있는 조건(1, 3-7 레인)에서 수행되었고, IκB E3 인식 모티브 또는 다른 펩티드가 있거나 (4-7 레인), 없는 조건(1-3 레인)에서 수행되었다. 상기 펩티드는 다음과 같다: 40μM 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 4); 400μM c-Fos 포스포펩티드(ppFos (SEQ ID NO:10), 레인 5), 40μM 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp19 (SEQ ID NO:8), 레인 6); 그리고 400μM 인산화되지 않은 IκBα펩티드(p21 (SEQ ID NO:9), 레인 7).

도 2는 자극이 되어진 HeLa 세포로 부터 추출된 추출물을 이용하여 in vitro로 수행된 유비큐틴-의존적인 분해반응을 분석한 결과를 도시한 자동방사선사진이다. SDS-PAGE의 각 레인은 분해반응 다음에 인산화된(상부 밴드) 그리고 인산화되지 않은(하부 밴드) HA-표지된 IκBα폴리펩티드 (SEQ ID NO:12)의 레벨(level)을 나타낸다. 레인 1은 ATP 없이 수행된 분해반응에 따른 상기 폴리펩티드들의 레벨(level)을 보여준다. 레인 2-6에서 ATP는 반응 혼합물내에 포함되어 있다. 40 μM 의 후보 조절제를 레인 3-6에서 보여준 반응들에 첨가하였다: 이중으로 인산화된 IκBα펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 3); 이중으로 인산화된 IκBα(pp19 (SEQ ID NO:8), 레인 4);c-Fos 포스포펩티드(phosphopeptide) (ppFos (SEQ ID NO:10), 레인 5); 인산화되지 않은 IκBα펩티드 (p21 (SEQ ID NO:9), 레인 6).

도 3A는 조절제 컬럼상에서 분별증류되어진 흘러넘친(flow-through) 부분의 HeLa 세포 라이세이트(lysate)를 이용하여 수행된 유비큐틴화 반응의 SDS-PAGE 분 석의 결과를 도시하는 자동방사선사진이다. 각각의 경우에서, 기질은 ³⁵S-라벨(labelled)되어 있고, HA-태그된(tagged) IkBa 폴리펩티드 (SEQ ID NO:12)이며, 이는 인산화되어 있고, NF-kB 복합체-결합으로 되어 있다. 레인 1은 분별증류되지 않은 추출물을 이용한 유비큐틴화의 레벨(level)을 보여준다. 레인 2-9에서 추출물은 펩티드-세파로스 컬럼(peptide-Sepharose column)상에서 분별증류되어진다. 사용되어진 펩티드들은 c-Fos 포스포펩티드(phosphopeptide)(ppFos (SEQ ID NO:10), 레인 2); 세린 32번, 36번 잔기가 알라닌으로 치환되어 있는 IκBα펩티드(pp21S/A (SEQ ID NO:11),레인 3); 이중으로 인산화된 IkBa 펩티드(pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 4-6); 그리고 이중으로 인산화된 IkBa 펩티드(pp19 (SEQ ID NO:8), 레인 7-9)이다. 덧붙여, 레티쿨로사이트 프랙션II(reticulocyte Fraction II)(160 μg)를 레인 5와 8에 나타난 유비큐틴화 반응에 첨가하고, 프랙션 I(Fraction I) (160 μg)을 레인 6과 9에 나타난 반응들에 첨가하였다.

도 3B는 HeLa 추출물내에서 벌크(bulk) 세포 단백질의 유비큐틴화를 보여주는 자동방사선사진이다. 레인 1은 ATP가 존재하지 않을 경우의 유비큐틴화를 보여주며 레인 2는 ATP는 존재하지만 후보 조절제가 없을 경우의 유비큐틴화를 보여준다. 레인 3-6에서는 후보 조절제가 첨가되어진다: 40μM 두배로 인산화된 IkBa 펩티드 (pp19 (SEQ ID NO:8), 레인 3); 400μM c-Fos 포스포펩티드(phosphopeptide) (ppFos (SEQ ID NO:10), 레인 4); 400μM 세린 32, 36이 알라닌으로 치환된 IκBα 펩티드 (pp21S/A (SEQ ID NO:11), 레인 5); 그리고 40μM 이중으로 인산화된 IkBa 펩티드 (pp21 (SEQ ID NO:9), 레인 6).

도 4A-AF는 핵의 NF-kB의 핵으로의 이동(translocation)에 후보 조절제가 미치는 영향을 보여주는 현미경 사진이다. 도 4A-C에서, pp21 (도 4A and 4B) 또는 ppFos (도 4C)는 HeLa 세포의 세포질내로 미세 주입되었다. 그러자, 세포들은 TNFa에 의해서 즉각적으로 활성화되어졌고 항-p65 항체에 의해 이뮤노스테인(immunostained) 되어졌다. 도 4D-F에서, pp21 (도 4D) 또는 ppFos (도 4F)는 인체 인간 맥관 내피(human vascular endothelial cells (HUVEC))의 세포질내로 주입되어졌다. 그러자, 세포들은 TNFa 에 의해 즉각적으로 활성화되어졌고 항-E-선택 항체(anti-E-selectin antibodies)로 이뮤노스테인되어졌다. 도 4E는 도 4D의 사진과 대조되는 상이다. 각 현미경 사진에서, 주입된 세포들은 커다란 화살표로 마크(marked)되어졌다. 주입되지 않은, E-선택 네가티브 세포(E-selectin negative cell)는 도 4D 및 4E내에서 작은 화살표로 마크되어졌다.

도 4G와 4H는 도 4A - 4F내에서 보여준 미세 주입 실험의 요약을 제시해주는 도식이다. 도 4G에서는, 핵의 p65 염색(nuclear p65 staining)을 보여주고 있는 HeLa 세포의 비율을 보여준다. 90번과 42번 세포들은 pp21 와 ppFos으로 각각 미세 주입되어졌다. 도 4H는 E-선택 염색을 나타내는 HUVEC 의 비율을 보여준다. 160번과 36번 세포들은 pp21와 ppFos으로 각각 미세 주입되어졌다. 각 사진에서, 컬럼 1은 IkB E3 인식 모티브 또는 다른 펩티드가 존재하지 않고 TNFa 활성이 없을 경우의 레벨을 보여준다. 컬럼 2-4는 펩티드(컬럼 2)가 없는 경우 또는 pp21 (컬럼 3) 이나 ppFos (컬럼 4)가 존재하는 경우의 TNFa 활성화에 따른 레벨을 보여준다.

도 5는 TNFa-활성화된 세포들(TNFa-activated cells)로부터 pIkBa-결합된 유비큐틴-리가제 활성(pIkBa-associated ubiquitin-ligase activity)의 면역침전을 나타내는 웨스턴 블럿(Western blot) 분석의 결과를 보여주는 자동방사선사진이다. pIkBa/NF-kB 복합체는 프로테아롬-억제되어지고(proteasome-inhibited), TNFa-자극되어지고(TNFa-stimulated) 또는 자극되어지지 않은 HeLa 세포로부터 면역침전되어지고 유비큐틴, ATP-gS 및 하기 구성성분의 첨가하에 in vitro 유비큐틴화가 이루어진다: 레인 1, UBC5C; 레인 2, UBC5C와 E1; 레인 3, 없음; 레인 4-6, 지시되어진대로 UBC5C와 E1; 레인 7, UBC5C, E1 및 pIkBa-펩티드; 레인 8, UBC5C, E1 및 세린-치환된(serine-substituted) IkBa 펩티드; 레인 9, TNFa-자극된 HeLa 라이세이트(lysate)의 샘플. 세포-자극(Cell-stimulation)은 TNFa 줄(row)에 표시되어진다. 단량의(monomeric) 유비큐틴-컨쥬게이션된(ubiquitin-conjugated) IkBa 는 도면의 왼쪽, 하부 및 상부에 마크되어진다.

도 6은 DSGLDS (SEQ ID NOs:8 and 19) 위치(site)에서의 IkBa 의 IKK-인산화에 따른 유비큐틴-리가제의 IkBa/NF-kB 복합체와의 결합을 도시하는 자동방사선사진이다. 비활성화된(non-activated) 세포로부터 면역정제(immunopurified)되어진 ³⁵S-labeled IkBa/NF-kB 복합체는 IKK-2EE (상부에 +으로 마크되어진 곳)에 의해 인산화되어지고, E3 소스(source)로서 비활성화된 HeLa 라이세이트와 함께 배양되어진 뒤 씻어낸 후 ATPgS, 유비큐틴, E1, UBC5C(Ub-Enz의 요약서에 나타나 있는 허용 되어지지 않는 구성성분을 제외함)의 존재하에 in vitro 유비큐틴화가 이루어지게 된다. 레인 2-7은 IKK에 의한 인산화를 보여준다; 레인 1과 3-7은 HeLa 라이세이트와 함께 배양시킨 결과를 보여준다; 레인 4에서는, HeLa 라이세이트와 함께 배양시키는 동안 pIkBa 펩티드들이 첨가되어진다; 레인 5에서는, HeLa 배양 동안에 세린-치환된 IkBa 펩티드들이 첨가되어진다; 레인 6에서는, E1이 유비큐틴화 단계(stage)에서 빠진 것이다; 레인 7에서는, UBC5C가 유비큐틴화동안에 생략되어진다.

도 7A 및 7B는 유비큐틴-리가제 활성과 함께 결부되어진 IkBa-결합단백질(IkBa -binding proteins)의 동정을 도시한 것이다. 도 7A는 IkBa/NF-kB와 관련 단백질(associated proteins)을 포함하고 있는 면역정제된 부분의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 샘플(SDS-polyacrylamide gel samples)의 콜로이달 블루염색(Colloidal Blue staining)을 보여주는 사진이다. IkBa/NF-kB 복합체는 IKK-2EE (레인 2, 3)에 의해서 인산화되어지거나 가-인산화(mock-phosphorylated)되어지고 HeLa 라이세이트(레인 1, 2)로부터 유비큐틴-리가제를 흡착하는데 사용되어진다. 분자-크기 마커(molecular-size markers)(kD)는 오른쪽에 표시되어진다. 질량-분광분석기(mass-spectrometry)의 분석에 의해서 확인되어진 단백질은 왼쪽에 표시되어진다. 유비큐틴-리가제 활성(p54 and p58)과 관련된 밴드에 대응되는 겔-위치(gel-sites)는 괄호와 함께 왼쪽에 마크되어진다. 도 7B는 ³⁵S-라벨되어진 HeLa 세포들로부터 pIkBa/NF-kB 상에 흡착되어진 단백질의 자동방사선사진이다. 방 사성 동위 원소에 의해 라벨되어진 HeLa 라이세이트는 IKK-인산화되어진 항체-고정되어진(antibody- immobilized) IkBa/NF-kB 복합체와 함께 배양되어진다. 면역-복합체(immune-complexes)는 씻겨진 뒤, 용출되어지고 SDS-PAGE와 자동방사선사진에 의해서 분석되어진다. 레인 1은 HeLa 라이세이트와 함께 배양되어진 인산화되어지지 않은 IkBa/NF-kB 복합체를 보여준다; 레인 2-4는 pIkBa-펩티드가 없을 경우(레인 2) 또는 있을 경우(레인 3) 또는 세린-치환된 IkBa-펩티드가 있을 경우 (레인 4)에 HeLa 라이세이트와 함께 배양되어진 인산화된 IkBa/NF-kB 복합체를 보여준다. 왼쪽에 표시된 것은 분자 크기 마커(kD), Rel A 및 IkBa bands이다; 오른쪽에는 네 개의 pIkBa-결합된(associated) 밴드, 그 중에서 세 개의 pIkBa 펩티드(화살표)에 의해 나타내어지는 것들이 표시된다.

도 8A-8D는 p54와 결합된 유비큐틴-리가제의 질량스펙트럼 분석의 결과를 보여준다. 도 8A는 리가제-포지티브(ligase-positive) 레인(도 7B의 레인 2와 동일)로부터 삭제되어진 54 kD 겔(gel) 밴드로부터 분리되어지지 않는 트립틱(tryptic) 펩티드 혼합물의 나노일렉트로스프레이(nanoelectrospray) 질량 스펙트럼을 보여준다. 화살표에 의해 마크되어져 있는 피크들은 끝이 갈라져 있으며 b-TrCP으로부터 유도된 펩티드로 확인되어졌다. 막대(bar)는 C에 있는 확대된 영역을 나타낸다. 도 8B와 8C는 (C) 유비큐틴-리가제 활성과 관련이 있는 54 kD 밴드의 나노일렉트로스프레이 스펙트럼과 (B) 유비큐틴-리가제 활성과 관련이 없는 54 kD 밴드의 나노일렉트로스프레이 스펙트럼의 비교를 보여준다. m/z 714.38에서 펩티드는 염기서열화(sequencing)을 위해 선택되어진다. 도 8D는 도 8C에서 확인된 펩티드의 분열(fragmentation) 스펙트럼이다. 염기서열 태그는 일련의 이중으로 하전된 프래그먼트(fragment) 이온으로부터 조합되어지고 매칭 패턴(matching pattern)을 위한 nrdb 데이터-베이스(data-base)에서 서치(search)되어진다. 회수된 b-TrCP 염기서열 AAVNVVDFDDKYIVSASGDR (SEQ ID NO:20)를 위해 계산된 프래그먼트의 질량은 일치(match)의 확인을 위하여 전체적인 프래그멘테이션 스펙트럼과 비교되어진다. 기대되는 프래그먼트 이온들과 일치되는 피크들은 원에 의해서 마크되어진다.

도 9A와 9B는 인체 E3 유비큐틴 리가제 (SEQ ID NO:15)를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 보여준다.

도 10은 인체 유비큐틴 리가제 단백질 염기서열(SES ID NO:16)을 보여준다.

도 11A-11C는 E3 유비큐틴 리가제류(family)의 멤버들(members)의 바인딩(binding)과 유비큐틴 특이성을 나타내는 웨스턴 블럿(Western blots)이다. 상기 도면들내에서, mb-TrCP 는 마우스(mouse)의 b-TrCP를 가리키고 hb-TrCP는 인체의 b-TrCP를, Db-TrCP 는 F 박스(box) 영역을 삭제한 인체의 b-TrCP를 가리키며, 슬림(Slimb)은 드로소필라 슬림 단백질(Drosophila Slimb protein)을 가리킨다. 도 11A는 pIkBa에 대한 선택적인 결합을 도시한다. 단백질들은 트랜스펙션된 293T 세포들(transfected 293T cells)로부터 FLAG 에피토프(epitope)에 의해 면역침전(immunoprecipitated)되어지고, 제시되어진대로 처리되어진(-/+ IKK) 면역정제(immunopurified)된 IkBa/NF-kB 복합체와 함께 배양되어지고 경계의 물질은 제시되어진 항체로 웨스턴 블럿에 의해 분석되어진다. 위 칸은 특이한 pIkBa. 의 바인딩을 보여준다; 중간 칸은 기질 플로우-쓰루(flow-through)의 10%를 보여준다; 밑 칸은 면역침전된 단백질의 블럿이다; 그리고 분자 크기 마커(kD)는 왼쪽에 표시되어져 있다. 도 11B는 b-TrCP-pIkBa 바인딩이 관련된 인산화되지 않은 펩티드(pS/A)에 의해서가 아닌, pIkBa 분해(degradation) 모티브(motif)¹ (pp10)를 나타내는 포스포펩티드에 의해서 없애짐을 보여준다. 도 11C는 E3류(family)의 멤버인 단백질에 의한 pIkBa 의 in vitro 유비큐틴화를 도시한다. 면역정제되어진 FLAG-태그된 단백질은 제시되어진대로 처리(-/+ IKK)된, ³⁵S-labeled IkBa/NF-kB 복합체와 함께 배양되어지고 ATPgS, 유비큐틴, E1 및 UBC5C의 존재하에 유리큐틴화되어진다. IkBa 기질(전체 길이와 두 개의 분해 산물로 이루어진), pIkBa-폴리유비큐틴(pIkBa-polyubiquitin) 콘쥬게이트들(conjugates) 및 분자 크리 마커들은 왼쪽에 표시되어진다.

도 12A와 12B는 Db-TrCP의 과도 발현(overexpression), 우세한 네가티브 분자에 의한 IkBa 분해(degradation)과 NF-kB 활성화(activation)의 억제를 도시한다. 도 12A는 kB-Luc 리포터(reporter) 플라스미드와 지시되어진(indicated ) 발현벡터로 트랜스펙션된, P/I-자극된 주캐트 세포(P/I-stimulated Jurkat cells)내에서 kB-의존적인 룩시퍼라제(luciferase) 분석의 결과를 나타낸 그래프이다(즉, 왼쪽으로부터 오른쪽으로. 벡터 단독, 인체의 b-TrCP를 인코딩하는 벡터, 인체의 b-TrCP를 F 박스(box) 영역의 삭제와 함께 인코딩하는 벡터 그리고 드로소필라 슬림단백질(Drosophila Slimb protein)을 인코딩하는 벡터이다). NF-kB 활성은 참고가 되는 (단일-접힌) 자극되어지지 않은 빈(empty) FLAG 벡터에서 루시퍼라제(luciferase)의 상대적인 활성(fold)으로 나타낸다. 도 12B는 빈 FLAG 벡터나 Db-TrCP로 트랜스펙션된 자극되어지지 않은 주캐트(Jurkat) 세포들과, 포볼-에스터(phorbol-ester)와 Ca⁺⁺ 이오노포어(ionophore) [P/I]-자극되어진 세포들의 IkBa에 대한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다. 후-자극(post-stimulation)의 간격(min)이 표시되어진다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 핵내 인자 κB(NF-κB)의 활성화를 조절하는 방법과 조성물, 상기 활성화에 관련된 질병을 치유하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인산화된 IκB (즉, IκBα그리고/또는 IκBβ)의 유비큐틴화를 조절하는 약제에 관한 것이다. 상기 유비큐틴화에 의해 NF-κBr가 방출되어 활성화된다.

본 발명은, 부분적이기는 하나, 인산화되어 있고, NF-κB와 결합되어 있는 IκB를 인식하는 인간의 E3 유비큐틴 리가제를 동정(identification)하고 그 특징을 알아낸는 것을 기초로 하고 있다. 상기 E3 유비큐틴 리가제를 구성하는 폴리펩티드, 그 일부 또는 그들의 변종은 in vitro 또는 in a patient 에서 NF-κB의 활성을 조절하는 데 이용될 수 있다. 예컨대 상기 폴리펩티드는 NF-κB의 활성을 조절하는 약제(작은 분자와 같은) 그리고 비정상적인 NF-κB 활성에 관계되는 질병을 치료하는 약제를 확인하는데 사용될 수 있다.

인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드와 폴리뉴크레오티드

본 발명에서 54 kD의 단백질인 인간의 E3 유비큐틴 리가제는 인산화된 IκBα(이하에서는 인산화된 IκBα는 pIκBα로 나타낸다.)에 결합하여 유비큐틴화를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 인간의 E3 유비큐틴 리가제를 암호화한 폴리뉴클레오티드의 시퀸스는 도 9와 SEQ ID NO:15에 나타내었고, 인간 E3 유비큐틴 리가제 단백질의 전장(full length)는 도 10과 SEQ IC NO:16에 나타내었다. 본 발명에서인간 E3 유비큐틴 리가제는 β-TrCP 를 포함하는 F-box/WD 단백질(Margottin et al., Mol. Cell 1:565-574, 1998) 의 패밀리중에 하나이고, 초파리의 스림브 단백질(the Drosophila Slimb protein) (see Jiang and Struhl, Nature 391:493-496, 1998) 패밀리 중에 하나임이 밝혀졌다. 하기에서 상세히 설명되는 바와 같이, 상기 패밀리의 구성원들은 E3의 특성을 공유하며, 상기 단백질과 그들의 변종은 여기에서 정한 특정한 방법내에서 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드는 인간 E3 유비큐틴 리가제(이하에서는 "E3"로 나타낸다) 그대로 뿐만 아니라 그들의 일부 그리고 변종도 포함된다. E3의 변종이 IκB 폴리펩티드에 결합하여 유비큐틴화가 촉진된다면, 본래의 E3에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 그리고/또는 삽입되어 시퀀스가 본래의 E3와 다르더라도 무방하다. E3의 변종은 SEQ ID:16 시퀀스의 20% 범위 내에서 아미노산 치환이 일어나는 것이 바람직하며, 15% 범위내가 더 바람직하고, 10% 내의 범위에서 아미노산 치환이 일어나는 것이 가장 바람직하다. 또한 변종에는 폴리펩티드가 절단된 것도 포함되며, 폴리펩티드의 활성에 최소한의 영향만을 미치는 아미노산 시퀀스가 첨가된 것도 포함된다. 인간 E3 유비큐틴 리가 제 폴리펩티드는 상기한 특성을 가지기만 한다면 길이가 얼마이든지 상관없다. 즉, 상기 폴리펩티드는 올리고펩티드(즉 펩티드 결합에 의해 8-10 정도의 비교적 적은 수의 아미노산으로 구성되어 있는 펩티드), 전장의 단백질( 또는 그들의 변종) 또는 중간 크기의 폴리펩티드(예컨대 20,50, 200 또는 400 아미노산 잔기)일 수도 있다.

일부 변종에는 보존적인 치환(conservative substitutions)을 하는 경우도 있다. "보존적인 치환"이란 하나의 아미노산이 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환되는 것을 말하는 것으로, 이와 같은 것은 펩티드 화학(peptide chemistry)의 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 실질적으로 변화하지 않은 하이드로패틱(hydropathic) 본질과 2차 구조를 기대할 수 있게 한다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 그리고/또는 양극성의 유사여부를 기초로 이루어 진다. 예컨대, 음전하를 가지고 있는 아미노산에는 아스파르트산(aspartic acid) 그리고 글루탐산(glutamic acid)이 포함된다; 양전하를 가지고 있는 아미노산에는 리신(lysine) 그리고 아르기닌(arginine)이 포함된다; 유사한 친수성 값을 가지고 있는 하전되지 않은 극성 헤드(head) 그룹을 가지는 아미노산에는 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 그리고 발린(valine); 글리신(glycine)과 알라닌(alanine); 아스파라긴(asparagine)과 글루타민(glutamine); 그리고 세린(serine), 트레오닌(threonine), 페닐알라닌(phenylalanine) 그리고 티로신(tyrosine)이 포함된다. 보존적인 변화를 하는 다른 아미노산 그룹에는 다음과 같은 것이 포함된다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. 변종에는 또한 폴리펩티드의 항원성, 2차 구조 그리고 하이드로 패틱한 본질에 가장 영향을 적게 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변경(또는 대체하게되는)될 수도 있다.

일부 E3 폴리펩티드에는 아미노 그리고/또는 카르복시 말단에 부가된 아미노산 시퀀스를 가지고 있을 수도 있다. 예컨대, E3 시퀀스가 단백질이 해독과 동시에 이동될 것인지, 해독 후에 이동될 것인지를 결정하는 단백질의 N-말단에 있는 시그날(또는 리더(leader)) 시퀀스에 컨쥬게이트(conjugate)할 수도 있다. 폴리펩티드는 또한, 또는 대체하여, 링커(linker) 또는 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 분리를 촉진시키는 시퀀스 (e,g., poly-His)에 컨쥬게이트(conjugate)되거나 딱딱한 지지체에 폴리펩티드가 결합하는 것을 촉진시키도록 컨쥬게이트(conjugate)되어 있을 수 있다. 예를 들면, 하나의 폴리펩티드가 이뮤노글로블린 Fc 영역(immunoglobulin Fc region)에 컨쥬게이트될 수도 있다.

E3 폴리펩티드의 인산화된 IκB 에 결합하는 정도는 이 분야의 당업자에게 알려진 결헙력의 분석 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 예컨대, pIκBα/NF-κB 컴플렉스는 고정화된 E3 폴리펩티드와 함께 배양하여, IκBα의 결합정도를 anti-IκBα항체를 이용하여 측정할 수 있다(예컨대, 웨스턴 블럿(Western blot)). 상기 분석에 의해서, E3 폴리펩티드는 IκBα에 측정될 수 있을 정도로 결합되있을 것이다; E3 폴리펩티드의 결합정도가 본래의 사람 E3와 비교하여 실질적으로 감소되지 않는 것이 바람직하다. 즉, E3 변종의 인산화되어 있고 복합체가 되어 있는 IκBα 에 결합하는 정도는 본래의 폴리펩티드와 비교하여 감소되지 않거나 증가하는 것이 바람직하다. 또는 본래의 홀리펩티드와 비교하여 50% 내에서 감소가 될 수는 있으나 20% 내가 바람직하다. 상기 분석의 방법에 의한다면 다른 적절한 기질이 pIκBα/NF-κB 컴플렉스를 대신할 수 있음은 당연하다.

E3 폴리펩티드의 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 촉진시키는 정도는 폴리펩티드를 pIκBα/NF-κB 컴플렉스, ATPγS, 유비큐틴 E1 그리고 유비큐틴 E2와 함께 배양하고, IκBα-특정 항체를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 천천히 -이동되어 IκBα-유비큐틴 컨쥬게이트된 것(the slow-moving IκBα-ubiquitin conjugates )을 검출하여 측정한다. 일반적으로 E3 폴리펩티드 상기 분석에서 측정될 수 있을 정도로 유비큐틴화가 발생하였다; 유비큐틴화의 정도가 본래의 인간 E3 에 의해 발생되는 유비큐틴화와 비교하여 실질적으로 감소되지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 IκB의 유비큐틴화를 촉진하는 능력을 가지고 있지는 못하더라도 인산화된 IκB에 결합하는 능력을 가지고 있는 E3의 일부 또는 변종으로 구성되어 있는 폴리펩티드를 포함하고 있다. 상기와 같은 폴리펩티드는 본 발명에서 제시하는 결합력의 분석방법과 유비큐틴화의 분석방법을 이용하여 쉽게 분리가 되고, 이와 같은 폴리펩티드는 일반적으로 IκB의 유비큐틴을 억제하게 된다. 상기 폴리펩티드에는 F-박스 영역(F-box region)(즉, 유바큐틴 개스캐이드의 하나 또는 그 이상의 구성성분과 작용하는 단백질 영역)이 결실된 것을 포함한다. F-박스 영역은 일반적으로 기능적으로 분리될 수 있으며(즉, F-박스 영역의 결실은 유비큐틴 장치의 적절한 구성요소가 강화되어야 한다는 꼬리표를 달린 단백질이 되게 한다.), F-박스 영역의 콘센서스 시퀀스(consensus sequence)가 있다 (see Patton et al., Trends in Genet. 14:236-243, 1998). 상기 폴리펩티드에는 SEQ ID NO:16의 122-168 아미노산이 결실된 것이 포함된다. 본 발명의 실시예에서는, SEQ ID NO:16의 연속적인 아미노산 잔기 중에서 10-374의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되는 E3의 일부가 제공된다.

본 발명은 E3를 암호화한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 또는 그 일부 또는 그 변종을 암호화한 것도 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥(coding 또는 antisense)일 수도 있고, 이중가닥일 수도 있으며, DNA(genomic, cDNA 또는 synthetic) 분자일 수도 있고 RNA 분자일 수도 있다. 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드에는 필요하다면 코딩 또는 논-코딩 시퀀스(coding or non-coding sequences )가 부가될 수 있으며, 다른 분자 그리고/또는 지지물질에 결합되어 있을 수도 있다.

인간 E3 또는 그들의 일부를 인코딩(encoding)하는 본래의 DNA 시퀀스는 이 발명의 기술분야의 당업자에게 알려진 여러가지 하이브리디제이션(hybridization) 또는 증폭(amplification) 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 상기 기술에서, 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)는 본 발명의 E3 시퀀스를 기초로 하여 제작될 수 있고, 구입하거나 합성할 수도 있다. 적절한 조직으로부터 라이브러리(labrary)를 스크린 할 수도 있다. 공지된 기술을 이용하여, 증폭된 부분 cDNA는 게놈 DNA 라이브러리( genomic DNA library) 또는 cDNA 라이브러리로부터 전장의 유전자를 분리하는데 이용할 수 있다. 또 다른 방법으로 전장의 유전자는 다양한 PCR 프래그먼트(fragments)로 부터 만들수도 있다. 본 발명에는 부분 그리고 전장의 폴리뉴클레오티드, 상기 전장의 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 상보적인 시퀀스가 포함된다. 게다가, 다른 종의 상동성이 예상되어 지는데, 일반적으로 본 발명에 의하여 제조될 수 있다.

상기 시퀀스의 변종 폴리뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상이 치환, 결실, 삽입 그리고/또는 첨가되어 본래의 E3 폴리뉴클레오티드와 다른게 될 수 있다. 20% 이내의 뉴클레오티드만이 치환, 결실, 삽입 그리고/또는 첨가되어 생성된 변종이 바람직하다. 뉴클레오티드의 10%내만이 달라져 생성된 변종이 더욱 바람직하다. 변종중에는 본래 유전자 또는 그의 부분 또는 그의 컴프리먼트와 실질적으로 상동성을 가지는 것도 있다.

이 분야의 당업자라면 어떤 아미노산 그리고/또는 아미노산 유도체를 선택할 지는 물리적 특성, 화학적 특성 또는 생물학적인 특성에 의하여 결정해야 한다는 것을 알것이다. 상기 특성은 환자내에 표적의위치 그리고 투여방법에 의하여 결정된다.

펩티드에 있는 반응성 그룹(reactive group)이 어떤 변형이 되느냐에 따라 특성이 결정될 수 있다. 또한 아세틸화된 펩티드같이 N-말단이 변형된 컴파운드(compound)가 되도록 펩티드가 레진에 부가되도록 조작할 수 있고, 불화 수소 또는 다른 절단제를 이용하여 레진에서 제거한 다음에 변형시킬 수도 있다. C-말단에 카르복실 그룹(carboxy group)(Wang resin)을 가지도록 합성된 컴파운드는 레진으로 부터 제거한 후에 변형시키거나, 어떤 경우에는 솔루션 페이스 합성(solution phase synthesis)에 선행하여 변형시킬 수 있다. 펩티드의 N-말단 또는 C-말단을 변형시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, N-말단의 아세틸화(acetylation) 또는 C-말단의 아미드화(amidation) 방법과 같은 것이다. 아미노산 또는 아미노산 유사체의 사이드 체인(side chain)을 변형하는 방법은 펩티드 합성 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 펩티드에 있는 반응성 그룹 원하는 특성이 따라 변형시킨다.

E3 폴리펩티드는 사이클릭 펩티드(cyclic peptide)일 수도 있다. 사이클릭 펩티드는 N 말단의 아미노 그룹과 C 말단의 카르복실 그룹 사이에 공유결합에 의해 만들어진다. 사이클릭 펩티드는 말단의 반응성 그룹과 반응성 아미노산의 사이드 체인(side chain) 또는 2개의 반응성 사이드 체인 사이에 공유결합이 되어 만들어질 수있다. 시클릭 펩티드는 원하는 특성에 의해 선택되는 것은 당업자에게 자명하다. 예컨대 시클릭 펩티드는 in vivo에 안정성의 증가, 용해도의 증가, 항원성의 감소 또는 혈장제거율의 감소가 되도록 한다.

새롭게 합성된 펩티드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는 크기나 전하에 의해 분리되는 다른 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 이에 더 나아가, 정제된 펩티드는 아미노산 분석과 질량 스펙트로메트리(spectrometry) 같은 공지된 방법에 의해 특징을 찾아 낼 수 있다.

폴리펩티드는 일반적으로 공지된 기술에 의하여 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로 만들어 질 수도 있다. 내재성 단백질을 만들기 위하여, 분리된 cDNA를 사용할 수 도 있다. 변종 폴리펩티드를 만들기 위하여 올리고뉴클레오티드-디렉 티드 사이트-스페시픽 뮤타제네시스 같은 일반적인 돌연변이 유발기술을 사용할 수도 있고, 절단된 폴리펩티드를 만들기 위하여 DNA 시퀀스의 일부를 제거할 수도 있다,

일반적으로, 당업자에게 알려진 여러가지 발현벡터에서 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 발현될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 시퀀스를 가지는 발현 벡터를 적절한 숙주세포에 형질전환시키거나 형질도입하여 발현시키다. 적절한 숙주세포에는 원핵생물, 효모, 바규로바이러스(vaculovirus)-감염된 곤충세포 그리고 동물세포가 포함된다. 발현이 된 다음에는, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 배양배지로 넣어 분비된 숙주/벡터 시스템의 상등액을 판매되고 있는 필터를 이용하여 농축한다. 농축한 다음에는 농축물을 친화성 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환 레진 같은 적절한 정제 매트릭스에 넣어 정제한다. 한단계 또는 여러단계의 역상 HPLC를 하여 재조합 폴리펩티드를 더욱 정제한다.

일반적으로, 본 발명에서 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이다. 즉, "분리한" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 자연상태에서 이를 뽑아낸 것을 말한다. 예컨대, 자연계에서 공존하고 있는 물질의 전부 또는 일부로 부터 분리하는 것이다. 본 발명에서 폴리펩티드는 중량비로 최소한 80%의 순도로 분리되는 것이 바람직하다. 중량비로 최소한 95%의 순도로 분리되는 것이 더 바람직하고, 중량비로 99%의 순도로 분리되는 것이 가장 바람직하다. 황산 암모늄 분획, SDS-PAGE 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피와 같은 일반적인 기술을 이용하여 상기와 같은 정제가 이루어 진다. 자연환경의 일부는 아니라도 벡터로 클론된 다면 분리되 었다고 한다.

항 체

본 발명은 특히 E3 폴리펩티드에 결합하는 항체, 그리고 항원과 결합하는 프래그먼트를 제공한다. 본 발명에서, 항체 또는 항원과 결합하는 프래그먼트는 폴리펩티드에 검출될 정도를 반응한다면(예컨대, ELISA로) 폴리펩티드에 "특히 반응"한다라고 하고, 관계없는 단백질은 검출될 정도로 반응하지 않는다. 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal) 일수도 있다. 본 발명의 유비큐틴화 분석내에서 E3 활성을 억제하는 항체가 바람직하다. 다른 항체(예컨대, 항원 키나체 분석에 사용되는)로는 표준 분석을 이용하여 결정되는 면역침강의 활성 E3 항체가 바람직하다.

항체는 당업자에게 알려진 다양한 기술에 의해 만들어 진다(see, e.g, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 상기 기술에는, 미리 예정된 스케쥴에 따라 하나 또는 그 이상의 부스터(booster) 예방접종을 하여, 적절한 동물(예컨대, 쥐, 생쥐, 토끼, 양 그리고 염소)에 폴리펩티드로 구성된 면역원을 주입하여, 정기적으로 동물에서 채혈하는 방법이 있다. 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체는 예컨대 적절한 고체 지지체에 결합된 폴리펩티드를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 항혈청으로 부터 정제될 수 있다.

모노클로날 항체는 Kohler and Milstein, Eur. J. Immuno1. 6:511-519, 1976, 의 기술 그리고 여기에서 더 개선된 기술을 이용하여 제작된다. 간단히 말하 면, 상기 방법들에는 원하는 특이성(즉, 원하는 폴리펩티드에 대한 반응성)을 가지고 있는 항체를 생산할 수 있는 불사 세포 라인(immortal cell line)을 만드는 것이 포함된다. 상기 세포 라인(cell line)은 예컨대 면역된 동물의 비장세포로부터 만들어 질 수 있다. 비장세포는 세포융합 파트너인 골수종, 바람직하게는 면역이된 동물과 동질유전자인 세포와 융합되어 불사되게 된다. 예컨대, 비장세포와 골수종 세포는 수분동안 비이온성 계면활성제를 사용하여 융합되고 나면, 골수종 세포가 아닌 잡종 세포가 성장하도록 선택된 배지에서 낮은 밀도로 플레이트된다. 선별기술로는 HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) 선별을 사용하는 것이 바람직하다. 충분한 시간이 지나면(대개 1 내지 2주 정도), 잡종세포가 관찰된다. 하나의 콜로니를 선별하여 폴리펩티드에 대한 결합 활성정도를 측정한다. 높은 방응성과 특이성을 가지는 혼성세포가 바람직하다.

모노클로날 항체는 성장한 혼성세포의 상징액으로 부터 분리될 수 있다, 생쥐 같은 적절한 척추동물 숙주의 복막안으로 혼성세포라인(hybridoma cell line)을 주입하는 것과 같은 다양한 기술이 수율을 증대되도록 사용된다. 모노클로날 항체는 복수액 또는 혈액으로 부터 회수될 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 그리고 추출과 같은 전통적인 기술에 의해 항체로 부터 오염물질이 제거될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예로는 항체의 항원-결합 프래그먼트를 이용하는 것이다. 상기 프래그먼트는 일반적인 방법에 의해 만들어진 Fab 프래그먼트(Fab fragments)를 포함한다. 간략히 설명하면, 면역글로블린은 단백질 A 비드 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)에 의해 토끼 혈청으로 부터 정제되고, 파브 프래그먼트와 Fc 프래그먼트(the Fab and Fc fragments )를 만들기 위해 파파인에 의하여 분해된다. 파브와 Fc 프래그먼트는 예컨대, 단백질 A 비드 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된다.

유비큐틴화 분석

E3 폴리펩티드의 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 조절하는 정도는 ATPγS, 유비큐틴 E1 그리고 유비큐틴 E2과 IκBα/NF-κB 복합체를 기질(또는 다른 적절한 기질)로 하여 폴리펩티드를 배양하고, IκBα-특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 브럿하여 IκBα-유비큐틴 컨쥬게이트를 검출하는 것에 의하여 측정될 수 있다. 본 발명이 유비큐틴화 분석에서 사용되는 IκB 폴리펩티드는 본래의 인간 IκBα(SEQ ID NO:1) 또는 IκBβ(SEQ ID NO:3)일 수도 있고, 본래의 단백질의 변종일 수도 있다. IκB의 폴리펩티드 변종은 본 발명에 의한 유비큐틴화 분석에 의해 인산화되고 유비큐틴되는 정도가 실제로 감소되지 않게 변화된다. IκB 폴리펩티드는 표지되어 질 수도 있다. 예컨다, 일반적인 방법을 이용하여 ³⁵S-메티오닌(methionine)와 함께 폴리펩티드를 in vitro 에서 해독하여 ³⁵S를 IκB 폴리펩티드로 끼워 넣을 수 있다.

배양된 숙주세포에 있는 DNA의 발현에 의하여 또는 밀 배아추출물(wheat germ extract) 같은 in vitro 시스템을 사용하여 해독이 되는 것에 의하여 IκB 폴리펩티드는 이를 암호화하는 DNA에 의하여 만들어 진다. 숙주세포는 박테리아(bacteria), 효모, 바큘로바이러스-감염된 곤충세포(baculovirus-infected insect cells) 또는 포유동물의 세포 같은 것을 사용하는 것이 바람직하다. 재조합 DNA는 이 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 적절한 발현 벡터를 이용하여 숙주세포로 클론될 수 있다. 폴리펩티드의 in vitro 에서의 해독은 일반적으로 제조업자의 지시사항에 따라 시행하는 것이 바람직하다.

발현된 IκB 폴리펩티드는 in vitro 해독 후에 정제하지 않고 사용할 수 있다. 또한 폴리펜티드는 실질적으로 정제된 폼으로 단리될 수도 있다. IκB 폴리펩티드는 중량비로 최소 80%의 순도로 단리될 수 있으나, 중량비로 최소한 95% 순도로 분리되는 것이 바람직하고, 중량비로 최소 99%의 순도로 분리되는 것이 가장 바람직하다. 상기와 같은 정제는 본 발명에서 기술하는 대포적인 정제 방법에 의하거나, 황산 암모늄 분획, SDS-PAGE 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피와 같은 일반적인 방법에 의할 수도 있다.

본 발명의 유비큐틴 분석에서는 E3 활성의 조절제를 찾아내기 위하여 세포 E3를 사용하기도 한다. 본 발명에 의한 상기 분석에서, ATP와 탈인산가수분해효소억제제 오카다산(phosphatase inhibitor okadaic acid)이 있는 조건에서 자극이 되거나 자극이 되지 않은 쥬카트(Jurkat), 헬라(HeLa), THP-1 또는 내피세포의 세포 추출물을 IκB 폴리펩티드와 함께 넣고 in vitro 에서 배양한다. 세포추출물은 일반적으로 알카라이등의(Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995) 방법에 의하여 만들어 진다. IκB 폴리펩티드의 인산화( IκBα와 그들의 변종의 32와 36 세린잔기에)가 되고, 세포-유도된 NF-κB 와 인산화된 폴리펩티드(pIκB)가 작용하여 복합체가 형성될 수 있는 충분한 조건하에서 배양된다. 예컨대, IκB 폴리펩티드는 쥬카트(Jurkat) 또는 헬라(HeLa) 세포 추출액, ATP 그리고 오카다산(okadaic acid)와 함께 배양된다. 일반적으로 30℃에서 90분간 배양하면 IκB 폴리펩티드가 인산화된다. 알카라이등(Alkalay et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995)에 의해 기술된 바와 같이, 상기와 같이 배양한 다음에는, pIκB/NF-κB 컴플렉스가 안티-p65 항체와 함께 면역정제되어 지고, 무세포계(cell free system)에서 in vitro 유비큐틴화된다. 유비큐틴화의 정도는 공지된 SDS-PAGE와 자가방사선사진에 의해 측정될 수 있다.

상기와 같은 조건하에서, 야샹형의 ³⁵S-pIκBα폴리펩티드는 ATPγS 가 있는 경우에(see Figure 1A, lane 4) 다양한 유비큐틴화된 스페시즈(species)를 만든다. ³⁵S-표지된 S32/36A가 돌연변이된 IκBα(lane 1)도 인산화되지 않은 야생형의 ³⁵S-IκBα(lane 2)도 유비큐틴화되지 않았다. 그러나, 돌연변이든 야생형이든 IκBα의 프리 폼(free form)은 쉽게 컨쥬게이트된다(도1B). 유사하게, 프리(컴플렉스-결합되어 있지 않은 것)한 리신(lysine) 21, 22잔기에 돌연변이가 된 IκBα는 in vitro에서 유비큐틴화될 수 있다. 유비큐틴화 분석이 프리한 IκB 폴리펩티드를 이용하여 시행되기도 하였던 것과 달리, 본 발명의 유비큐틴화 분석은 컴플렉스-결합되어 있고, 적절하게 인산화되어 있는 IκB 폴리펩티드만이 표적이라고 정한다.

상기 유비큐틴화 분석은 IκB의 유비큐틴을 조절하는 약제를 찾는데 이용될 수 있다. 조절제는 항체(예:모노클로날), 펩티드, 소분자(예:조합 라이브러리부터) 그리고 IκB α그리고/또는 IκBβ폴리펩티드의 유비큐틴화을 자극하거나 바람직하 게는 억제하는 다른약제를 포함한다. 일반적으로, 상기한 바와 같이 시행되지 않았다고 하더라도, 유비큐틴화 반응에서 후보 조절제 중에서, 유비큐틴화에 미치는 영향을 평가하여 조절제를 식별할 수 있다. 상기와 같은 분석에 사용되는 후보약제의 적절한 농도는 일반적으로 약 0.1 μM 에서 0.1 mM이다. 유비큐틴화의 정도에 통계적으로 중요한 영향을 미치는 후보 약제가 본 발명에 의한 조절제가 된다.

상기 약제들은 적절한 세포(예:헬라 세포(HeLa cell) 또는 일차 인간맥관내 피세포(HUVEC)에 미세주입(예: 약 펩티드 약제 5mg/mL)되어 평가될 수도 있다. 미세주입 다음에는, 세포를 자극시키고(e.g., with TNFα), NF-κB가 활성화되도록 배양시킨다. 1). 헬라 세포에서, TNFα는 NF-κB가 핵속으로 빠르게 이동하도록 유도한다. 이는 p65-특이적인 항체로 염색하여 알아낼 수 있다. 조절제는 NF-κB의 이동을 통계적으로 감소시키고, 검출할 수 있을 정도는 아니지만 그런 이동이 감소될 수 있게 하는 것이다.

일차 인간 맥관 내피세포(HUVEC)는 ICAM-1, V-CAM-1 그리고 E-선별 (Read et al., Immunity 2:493,1995; Chen et al., J. Immunol 155:3538, 1995)과 같은 NF-κB에 의해 조절되어 지는 점착 단백질(adhesion proteins)의 표면발현(surface expression)에 의해 TNFα와 반응한다. E-선별 발현(E-selectin expression)은 특히 NF-κB에 의존적이고, 초기의 친핵성 부착과 활성화된 내피세포에 작용하기 위한 주요 유도성의 내피 점착 단백질이다. 자극이 유발된 세포는 고정되고, NF-κB에 의해 조절되어 지는 하나 또는 그 이상의 점착 단백질의 발현을 측정하도록 염색된다. 폴리펩티드 또는 다른 조절제의 미세주입은 상기 발현을 억제하지만, ICAM2와 같이 NF-κB에 독립적인 점착 단백질의 발현에는 영향을 미치지 않는다.

치료에의 응용

상기에서 살펴본 바와 같이, E3 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 그리고 상기한 약제는 세포성의 NF-κB 기능을 억제하거나 촉지하는 조절제로서 사용된다. 또한 조절제는 in vivo에서 IκBα그리고/또는 IκBβ기능을 조절하기 때문에, 환자에 NF-κB의 유비큐틴을 조절하는 데 사용되기도 한다. 상기 "환자"는 사람을 포함한 포유동물이며, NF-κB 활성과 관련된 질병으로 고생하고 있거나, 측정되는 질병이 없을 수도 있다. 따라서, 치료는 앓고 있는 질병에 대해서 일 수도 있고, 예방약일 수도 있다. NF-κB 활성과 관련된 질병에는 반드시 이에 국한되는 것은 아니지만, 염증성 질병, 자가면역 질병, 암 그리고 바이러스 감염이 포함된다.

치료에는 본 발명에 의한 조절제의 투여에 관한 것이다. 환자에게 투여하기 위기 위하여, 하나 또는 그 이상의 혼합물은 약제학적 조성물로 제조되어야 한다. 약제학적 조성물은 생리적으로 수용될 수 있는 담체(즉, 구성요소의 활성을 저해하지 않고 독성이 없는)가 부가된 살균한 수용액 또는 살균한 물을 함유하지 않은 용액, 현탁액 또는 유탁액일 수 있다. 당업자에게 알려진 어떤 담체라도 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 대표적인 담체로는 생리식염수, 젤라틴(gelatin), 물, 알콜, 천연 또는 인공 오일, 당용액(saccharide solutions), 글리콜(glycols), 에틸 올레인산(ethyl oleate) 같은 주입할 수 있는 유기 에스테르 또는 상기 물질의 조합물이 포함된다. 약제학적 조성물에는 방부제 그리고/또는 항미생물제, 항산화제. 킬레이트제 그리고/또는 불활성 가스 같은 첨가제, 그리 고/또는 다른 활성 성분이 선택적으로 포함된다.

대체적으로, 약제학적 조성물은 생리학적으로 수용될 수 있는 담체와 결합되어 있는 조절제(원래의 위치에서 만들어진 조절제 같은)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 이와 같은 약제학적 조성물에는 폴리뉴클레오티드가 동업자에게 공지된 여러가지 딜리버리 시스템(delivery systems)내에 있을 수 있다. 상기 딜리버리 시스템(delivery systems)에는 리포좀(liposomes)을 포함하는 콜로이드 분산 시스템 뿐만 아니라 핵산, 박테리아 그리고 바이러스 발현 시스템이 포함된다. 적절한 핵산 발현 시스템은 환자에서 발현되는 데 필수적인 폴리뉴클레오티드 시퀸스를 포함한다.(적합한 프로모터와 종결 신호 같은) DNA는 예컨대 울머등(Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993.)이 기술한 바와 같은 "네이키드(naked)" 일 수 있다.

표적이 되는 환자의 세포내로 핵산 시퀀스를 도입하는데 사용되는 다양한 바이러스 벡터에는, 이에 한정되는 것은 아니지만,아 또는 다른 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노바이러스가 포함된다. 상기 벡터에 DNA응 삽입하는 기술은 당업자에게 공지된 것이다. 레트로 바이러스 벡터는 이에 제한되는 것은 아니지만, 모로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus (MoMuLV)), 하베이 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV)), 설균목 동물 암 바이러스(murine mammary tumor virus (MuMTV)) 그리고 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus (RSV))를 포함하는 쥐 또는 닭의 레트로 바이러스의 유도체가 바람직하다.

레트로 바이러스 벡터에는 선택된 마커(형질유도된 세포를 분벽하거나 선택하는데 도움이되는)의 유전자 그리고/또는 특이적인 표적 세포(벡터에 특이적인 표적을 전해주는)의 수용체에 결합하는 리간드(ligand)를 암호화하는 유전자를 부가적으로 삽입할 수 있다. 예를 들면, 레트로 바이러스 벡터에 당, 당지질 또는 단백질을 암화화하는 뉴클레오티드를 삽입하여 특이적인 표적을 만들 수 있게 된다. 타게팅(targeting)은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 항체를 이용하여 이루어질 수 있다.

바이러스 벡터는 감염된 벡터 입자를 생산하기 위하여 도움이 필요한 전형적인 비병원성(불완전한), 복제 컴페턴트(competent) 바이러스이다. 예컨대, LTR 내에 있는 조절 유전자의 조절하에 있는 레트로 바이러스의 구조유전자 모두를 암호화하고 있으나, 캡슐화되는 데 필요한 RNA 전사체를 인식하는 패키징 메카니즘(packaging mechanism)을 할 수 있는 뉴클레오티드 시퀀스가 빠져버린 프라스미드(plasmids)를 가지는 헬퍼 세포 라인(helper cell lines)을 이용하여 상기 도움을 받을 수 있다.

상기 헬퍼 세포 라인(helper cell lines)에는 Ψ2, PA317 그리고 PA12가 포함된다(이것으로만 제한되지는 않다). 상기 세포가 삽입되어 있는 레트로 바이러스 벡터는 팩키지 될 수 있으며, 벡터의 비리온을 만들수도 있다. 상기 방법에 의하여 만들어진 벡터 비리온은 잡종 레트로 비리온의 많은 양을 만들기 위하여 NIH 3T3 세포같은 조직 세포 라인에 감염시키는 데 사용하 수 있다.

폴리펩티드에 사용되는 다른 딜리버리 시스템(delivery system)에는 콜로이 드 분산시스템(colloidal dispersion system)이 있다. 콜로이드 분산 시스템에는 고분자 컴플렉스(macromolecule complexes), 나노캡슐(nanocapsules), 미소립자(microspheres), 비드(bead) 그리고 수중 유적형의 유탁액( oil-in-water emulsions), 미셀(micelles), 혼합된 미셀(mixed micelles) 그리고 리포좀(liposomes)을 포함하는 지질을 바탕으로 하는 시스템이 포함된다. in vitro 와 in vivo 에서 딜리버리 베히클(delivery Vehicle)로 사용되는 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀(liposome)이다(즉, 인공적인 구성원의 베히클). 0.2-0.4 mm의 크기를 가지는 커다란 단일 라멜라 소포(unilamellar vesicles (LUV))는 커다란 고분자를 함유하는 수성 버퍼의 상당한 %를 캡슐화할 수 있는 것으로 밝혀지고 있다. RNA,DNA 그리고 손상되지 않은 비리온은 수성의 내부로 캡슐될 수 있으며, 생물학적으로 활성화된 폼이 되어 세포로 운반될수 있다(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). 리포좀이 유효한 유전자를 전달하는 베히클이 되기위하여는 다음과 같은 특징이 필요하다.: (1) 자신의 생물학적 활성이 변화되지 않으며, 고도의 효율로 관심이 되는 유전자를 캡슐화 (2) 표적이 되지 않는 세포에 비하여 표적이 되는 세포에 실질적으로 선호하여 결합(3) 고도의 효율로 표적이 되는 세포의 세포질로 베히클에 있는 물에 함유된 성분을 운반 (4) 유전정보의 정확하고 효율적인 발현(Mannino, et al., Biotechniques 6:882, 1988).

리포좀의 타게팅(targeting)은 해부학적인 요소와 기계학적인 요소를 기초로 하여 분류되어 진다. 해부학적인 분류는 선택도의 정도에 기초를 두고 있다. 예컨대 기관특이적, 세포특이적, 그리고/또는 세포소기관 특이적이 될 수 있다. 기계학 적인 타게팅(targeting)은 수동적인지 능동적인지에 따라 구별될 수 있다. 수동적인 타게팅(targeting)은 동굴모세혈관(sinusoidal capillaries)을 가지고 있는 세강내피계(reticuloendothelial system (RES))의 세포에 분포되어 있는 리포좀의 본래 경향을 이용한 것이다. 한편, 능동 타게팅은 모노클로날 항체, 당, 당지질 또는 단백질 같은 특이적인 리간드와 리포좀이 결합하는 것에 의해 리포좀이 변경되거나, 로칼리제이션(localization)의 위치에서 자연적으로 발생하는 것과는 달리 기관과 세포 유형에 따른 타게팅이 되도록 리포좀의 크기 또는 조성물이 변화하여 리포좀이 변경된다.

투여량 뿐만 아니라 투여의 경로와 비도수도 환자에 따라 다양하다. 일바적으로 약제학적 조성물은 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 강내로 또는 경피로 투여될 수 있다. 1 내지 6의 투여량을 매일 투여할 수 있다. 적당한 투여량은 NF-κB 활성과 관련된 질병으로 고생하는 환자의 증상이 호전되기에 충분한 양이다. 상기 호전은 염증성 반응(예컨대, 부종, 이식 거부, 과민성)을 모니터하여 측정하거나 질병과 관련된 증상이 임상적으로 개선되는 것을 통하여 측정되 수 있다. 일반적으로, 한번의 투여량에 존재하는 조절제의 양 또는 한번의 투여량에 존재하는 DNA에 의해 원래위히에서 만들어진 조절제의 양은 약 1mg-100mg/숙주의 kg 정되이다. 적절한 투여량의 크기는 환자의 크리에 따라 매우 다양하지마. 일반적으로 10-60kg의 동물에 대하여 약 10- 500 mL 정도이다.

다음에는 발명에 의한 실시예를 설명한 것이나, 반드시 이것으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

유비큐틴화 분석법을 이용하는 IκB E3 인지 모티브의 확인

이 실시예들은 대표적인 유비큐틴화 분석법을 설명하고, IκB 의 유비큐틴화를 억제하게 하는 펩티드의 능력을 평가하기 위한 유비큐틴화 분석의 사용을 설명한다.

A. 세포내 유비큐틴화 시험법

HA-태그(tagged)된 IkBa 또는 HA-표지된 IkBb cDNAs(Haskill et al., Cell 65:1281-1289, 1991)는 제품 설명서(Promega, Madison, WI)에 따라 ³⁵S-메티오닌(³⁵S-methionine)의 존재하에 밀 배 추출물내의 세포내에서 해독되어졌다. IkBa 또는 IkBb를 인산화하기 위해서, 표지된 단백질을 포함하고 있는 1 ml 추출물을 100 mg HeLa 또는 Jurkat cell extract(Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995에서 기술된대로 제조되어진), 2mM ATP 및 1 mM 오카다익산(okadaic acid)을 포함하는 최종 부피를 30 ml로 만든 반응 혼합물을 30℃에서 90분간 배양하였다. 상기 배양중에, 표지된 IkB 폴리펩티드는 세린 32 및 36으로 인산화되어졌고 내인성의 NF-kB 복합체(complex)와 결합되어졌다(데이타는 나타내지 않음).

배양한 다음, 1 ml 항-p65 세럼(anti-p65 serum)을 첨가시키고 NF-kB 면역성의 복합체(NF-kB immune complex)가 단백질 A-세파로즈(A-Sepharose)에 고정시키 고, Alkalay et al.에 기술되어진 것처럼 HeLa 세포 추출물에서 in vitro 유비큐틴화가 이루어 졌다. 유비큐틴화된 단백질은 SDS-PAGE에 의하여 분리되어지고 방사선 사진에 의해 눈으로 볼 수 있게 되어졌다.

도 1A에서 보여주듯이, 와일드(wild) 타입 ³⁵S-pIkBa 만이 다양한 유비큐틴화된 종들(레인 4)를 발생시켰다. ³⁵S-라벨된 S32/36A(³⁵S-labeled S32/36A) 돌연변이(레인 1)나 인산화되지 않은 야생형 ³⁵S-IkBa (레인 2)도 유비큐틴화되지 않았으며 pIkBa 의 유비큐틴화도 APT의 부존재하(레인 3)에서는 보여지지 않았다.

상기 분석의 생리학적인 관련성은 더 나아가 단독의 ³⁵S-IkB의 in vitro 유비큐틴화를 복합체-결합으로 이루어진 인산화된 기질의 in vitro 유비큐틴화와 비교함으로써 입증되어 졌다. 이에 반해, 복합체-결합으로 되어진 S32/36A 돌연변이(mutant)는 그 것의 in vivo 에서의 운명에 따른 콘쥬게이션을 유비큐틴화하도록 하지 않았으며, 돌연변이 또는 야생형 IkBa 의 어느 하나의 단독형은 쉽게 콘쥬게이션되어졌다.(도 1B) 유사하게, IkBa의 복합체-결합된 라이신 21, 22 돌연변이만이 in vivo에서 유비큐틴화되어질 수 있었다.(자료는 제시되지 않음) 그래서, 단독의 IkBa 가 식별력이 있지 않는 방식으로 유비큐틴화 시스템으로서 인식되어지는 반면, 복합체-결합으로 이루어진 억제제는 만약 적당하게 인산화되지 않는다면 방해되어진다.

B. IkBa -유비큐틴화 리가제(IkBa -Ubiquitin Ligase) 인식모티브(Recognition Motif)의 확인

IkBa -유비큐틴화 리가제(IkBa -Ubiquitin Ligase) 인식 모티브(Recognition Motif)를 확인하기 위해서, 다양한 펩티드들을 펩티다제 억제제 베스타틴(Bestatin) (40 mg/ml) 존재하에 반응 혼합물에 다양한 농도로 첨가하였다. 펩티드들은 단백질의 N-terminal 시그날링 도메인이 있고, 세린 잔기들(32와 36) 하나 또는 둘 다에 인산화시키거나 변경되지 않거나 세린으로 치환되어지지(serine-substituted) 않았다. 이러한 펩티드들은 다른 농도들하에서의 유비큐틴화 반응에 수반되어지며 pIkBa 의 특별한 유비큐틴화의 억제를 위하여 테스트되어졌다. 단독의 IkBa이 콘쥬게이션된 것이 모니터되어졌을 때, 해독된 단백질을 컨쥬게이션 반응 혼합물에 직접 첨가하였다.

세린 32와 36 둘다가 인산화되어진 펩티드들(pIkBa 펩티드들)만이 pIkBa 유비큐틴화(ubiquitination)를 효과적으로 억제하였다(도 1A, 레인 7, 11-14). c-포스 포스포펩티드(c-Fos phosphopeptide) (ppFos, 레인 5), 세린 32 또는 36을 알라닌으로 치환시킨 IkBa 펩티드(p21 S/A, 레인 6) 그리고 인산화되어지지 않은 펩티드(p21, 레인 8)은 400 mM의 농도에서 pIkB 의 유비큐틴화에 대한 영향을 감지할 수 없었다. 인산화된 IkBa 펩티드들의 IC₅₀ 을 계산하였고 대표적인 억제 농도를 도 1A에 나타냈다. 이중으로 인산화된 IkBa 펩티드들은 pIkBa 콘쥬게이션 반응(conjugation reaction)(레인 7, 11-14)을 5 mM의 IC₅₀에서 억제하였다. 이러한 펩티드들의 염기서열은 표 I 상반부에 SEQ ID NOs:5-9으로 제시되어진다. 반대로, 하나씩 인산화된 펩티드들(레인 9, 10)은 400 mM의 IC₅₀ 에서 pIkBa 콘쥬게이션을 억제하였다. 단순히 시그날링은 인산화 위치에 놓여져 있는 테스트되어진 최소 크기의 펩티드(pp7, 레인 14)는 비록 다소 더 높은 IC₅₀ (10 mM)에서라도 유비큐틴화를 억제하기에 효과적일만큼 충분하였다. 그래서, SEQ ID NO:1인 잔기 21에서 41을 포함하는 펩티드는 E3 유비큐틴화 리가제를 위한 인식 영역을 포함한다. 흥미롭게도, 라이신 잔기 21과 22는 억제에 필수적이지 않은 유비큐틴화-시스템 인식 위치가 실제 콘쥬게이션 위치로부터 떨어져 있다는 것을 암시한다.

펩티드들의 특이성은 두 개의 다른 유비큐틴화-콘쥬게이션 반응들내에서 테스트되어졌다: 단독의 야생형(도 1B 레인1-3) 또는 S32/36A 돌연변이 IkBa (도 1B, 레인 4-6)의 콘쥬게이션과 HeLa 추출물내의 세포 단백질의 벌크에 유비큐틴 콘쥬게이션(Alkalay et al.에 따라서 ¹²⁵I-표지된 유비큐틴화에 의해 감지됨, 도 1C). IkBa -유비큐틴 리가제 인식 모티브 또는 조절 펩티드의 첨가에 의해 영향을 받는 반응은 아무 것도 없다.

IkBa -유비큐틴(ubiquitin) 리가제(ligase) 인식 모티브를 포함하는 펩티드들은 기질 pIkBb 와 관련된 pIkBa의 유비큐틴화를 없애기 위해 발견되어졌다(도 1D). pIkBa의 콘쥬게이션과 유사하게, IkBb 의 특이적인 콘쥬게이션 역시 결합된 NF-kB 복합체(associated NF-kB complex)(보여지지 않음)가 요구되어졌으며 IkBa-상동의 잔기 Ser 19 및 23에 먼저 인산화하는 것이 요구되어졌다. 포스파타제(phosphatase) 억제제없이 준비된 IkBb 기질은 유비큐틴화되어 지지 않 았다(도 1D, 레인 1). 펩티드들은 pIkBa에 대해서 관찰되어진 것과 유사한 IC₅₀에서 pIkBb 유비큐틴화에 영향을 받았다 (도 1D, 레인 1). 펩티드들은 pIkBa에 대해서 관찰되어진 것과 유사한 IC₅₀에서 pIkBb 유비큐틴화에 영향을 받았다 (도 1D, 레인 4-7). 그러므로, 똑같은 효소가 유비큐틴 의존적인 분해(degradation)를 위한 IkBs 둘 다를 표적(target)으로 함을 나타낸다.

억제적인 pIkBa 펩티드들은 상보적인 유비큐틴-의존적인 in vitro 분해 분석법으로 테스트되어졌다(Orian et al., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski et al., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995). 상기 분석법을 사용하는 것은 자극되어진 세포로부터 유도된 pIkBa 만이 유비큐틴-의존적인 방식으로 in vitro에서 분해(degraded)되어지고, 반면에 같은 세포 추출물로부터의 비인산화되어진 IkBa 는 분해되지 않는다. 분해 분석으로 콘쥬게이션-억제적인 포스포펩티드를 수행한 결과 pIkBa 기질의 안정화가 이루어졌고(도 2, 레인 3, 4) 반면에, 비인산화되어진 펩티드 또는 콘트롤 포스포-Fos 펩티드는 특이적인 pIkBa 분해(레인 5, 6)상에 영향을 주지 않았다. Lys 21/22 에서 펩티드의 트리밍(trimming)은 분해 억제적인 효과 (레인 4)를 줄이지 았았다. 이는 펩티드들이 콘쥬게이션 가능한 기질로서 유비큐틴-프로테아좀 시스템을 사용하여 pIkBa 분해을 없애지 않음을 가리키는 것이다.

실시예 2

기질 인식에 수반되는 유비큐틴 시스템 구성성분의 확인

이 실시예는 pIkB 폴리펩티드의 인식에 반응하는 특이적인 E3의 확인을 설명한다.

pIkBa-유비큐틴 콘쥬게이션과 분해는 유비큐틴 시스템 효소들의 전체 컴플리먼트(complement)를 요구한다: E1, 유비큐틴 시스템 프랙션(fraction) I으로부터 유도된 특이한 E2, E2F1 (Alkalay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10599, 1995; Chen et al., Cell 84:853, 1996) 그리고 프랙션(Fraction) II-구성성분(component) E3. 유비큐틴 시스템의 구성성분을 확인하는 것은 기질 인식을 수반하였고, HeLa 라이세이트는 IkBa 포스포펩티드 컬럼상에서 분별증류되었으며 플로우-쓰루(flow-through) 부분은 pIkBa 콘쥬게이션을 위해 분석되어졌다. 펩티드들은 제조업자의 지시사항에 따라 2 mg/ml의 농도에서 NHS-세파로즈(Sepharose) (약학,Pharmacia)에 커플(coupled)되어졌다. HeLa 추출물의 100 mg 은 0.1% NP40 와 3% 오발버민(ovalbumin)의 존재하에 4℃에서 1시간동안 2.5 ml 커플되어진 레진과 함께 배양되어졌다. 레진은 버리고 결합되어지지 않은(unbound) 물질은 상기에서 묘사한 유비큐틴화 분석법으로 테스트되어졌다.

콘트롤 포스포펩티드 컬럼과 S32/36A 펩티드 컬럼으로부터의 플로우-쓰루 프랙션은 전체적인(full) IkBa 콘쥬게이션 용량(capacity)를 보유하는 반면에(도 3A, 레인 2,3), 두 개의 다른 pIkBa 펩티드로부터의 플로우-쓰루 프랙션은 그들의 IkBa 에 특이한(specific) 콘쥬게이션 카파시티를 잃는다(레인 4, 7).

격감된(depleted) 콘쥬게이션 활성은 E3 효소의 모든 알려진 종들(Ciechanover, Cell 79:13, 1994)을 포함하는 레티쿨로사이트(reticulocyte) 프랙션 II (레인 5, 8)에 의해 상보적일 수 있다. 상보성은 펩티드 컬럼들이 E2 또는 E1보다 E3를 써버리는 점을 가리키는, 프랙션 I 또는 프랙션 I와 E1(각각 레인 6과 9)의 첨가에 의해 얻을 수 있지 않았다. 다시, IkBa 라이신 잔기 21번과 22번은 E3를 유지하는데 필요하지 않았고(도 3A, 레인 7에서 레인 4을 비교하라), 기질 인식과 콘쥬게이션 위치 사이의 구별점을 강조하는데도 필요하지 않았다. 펩티드 컬럼의 소모는 모든 플로우-쓰루 프랙션이 랜덤(random)한 HeLa 단백질 콘쥬게이션내의 전체 활성을 유지한다(¹²⁵I 유비큐틴의 콘쥬게이션을 측정함으로써 감지되어진 것처럼, 도 3B)는 점에 의해, IkB E3에 특이함이 발견되어졌다. 이는 특이한 E3가 확인된 모티브에서 pIkBs 의 인식에 대해 반응가능하다는 것을 가리킨다.

실시예 3

대표적인 펩티드의 세포의 NF-kB 활성화에 대한 영향

이 실시예는 IkBa-유비큐틴 리가제 인식 모티브를 포함하는 펩티드의 미세 주입에 의해 세포의 NF-kB 활성화의 억제를 설명한다.

HeLa 세포들을 미세 주입전에 18시간동안 그리드 커버슬립(grid coverslips)(셀로게이트(Cellocate), 에펜도르프(Eppendorf))상에 놓았다. 미세주입은 반자동(semi-automated) 기구(에펜도르프, Eppendorf)를 이용하여 22 아미노산 pIkBa 펩티드 (pp21; 표 I and SEQ ID NO:9) 또는 콘트롤 포스포-Fos 펩티드(SEQ ID NO:10)을 가지고 수행했다. 펩티드들은 100 mM KCl, 5mM Na₂HPO₄ (pH 7.2) 용액에 5 mg/ml의 농도로 세포의 세포질안으로 주입되어졌고, 즉각적으로 20 분(NF-kB 트랜슬로케이션(translocation)을 위해) 또는 3 시간(E-선택 발현을 위해)동안 TNFa (200 units/mL)으로 활성화되어졌다. 활성화 후에, 세포들은 고정되어졌고 p65 특이성의 항체(specific antibodies)로 염색되어지거나(Mercurio et al., Genes & Dev. 7:705, 1993; Santa Cruz) 모노클로날(monoclonal) 항-E-선택항체(R&D Systems)로 염색되어졌다.

세포의 90%의 p65 핵 염색에 의해서 볼 수 있듯이 (도 4G, 컬럼 2를 보라), 펩티드가 없을 경우에 TNFa는 NF-kB의 핵안으로의 빠르게 이동하도록 유도한다. pp21 펩티드는 몇몇의 실험들에서 미세 주입된 50%-70% 세포들내에서 TNFa-자극되어진 NF-kB 활성화를 없앴다(도 4A 및 4B의 대표적인 필드(fields); 그리고 도 4G, 컬럼 3을 보라). 반대로, 콘트롤 pp-Fos 펩티드는 미세 주입되지 않은 세포들에 비해서 핵으로의 이동이 유도된 NF-kB의 속도에 영향을 주지 않았다(도 4C 및 4G, 컬럼 4).

NF-kB 억제의 기능적 결과를 더 평가하기 위해, IkB-E3를 억제하는 펩티드는 프라이머리(primary) 인간 맥관 내피세포 안으로 미세주입되어졌다(HUVEC; Chen et al , J. Immunol 155:3538 1995). 상기 세포들은 E-선택과 같은 NF-kB로 조절된 흡착 단백질의 표면 발현에 의해 TNFa 자극에 반응한다. HUVEC 세포들은 판에 놓여졌고, 미세주입되어졌고 상기에서 묘사한 바대로 자극되어졌다. 3 시간의 세포 사전 자극은 고정되어졌고 NF-kB 의존적인 E-선택의 표현을 위해 염색되어졌다. 75%-85%의 HUVEC 세포들은 몇몇의 실험에서 TNFa 자극에 따른 E-선택을 위해 매우 짙게 염색되어졌다. pp21 펩티드의 미세 주입은 미세주입된 세포들의 70%-80% 내에서 E- 선택 발현의 억제 결과를 가져왔다(도4D; 및 도 4H, 컬럼 3). 대조적으로, 콘트롤 pp-Fos 펩티드는 미세 주입되지 않은 세포에 비해서, E-선택 발현에 영향을 주지 않는다(도 4F 및 4H, 컬럼 4). 콘트롤의 미세 주입, S32/36A 치환된 IkBa 펩티드는 E-선택 발현의 속도상에 영향을 주지 않는다.

상기 결과는 시그날-유도된 인산화된 IkBa 및 IkBb의 서브유닛-특이성의(subunit-specific) 분해은 특별한 E3에 의해 조정되어진다는 점을 뒷받침한다. E3 유비큐틴 리가제를 위한 인식 도메인은, 첫번째 생리학적으로 관련된 E3 인식 모티브를 대표하는, 두 IkBs내에 보존되어진 두 개의 시그날-가지는 포스포세린 주위의 중심에 놓은 짧은 시퀀스이다. IkB 인식의 특이성은 인산화된 기질의 컨테스트(context)에 의해 지지되어진다: 결합된 세포의 복합체는 비특이성의 E3들로부터의 기질을 방해한다. 이러한 모습은 특별한 리가제에 위치-특이적인 인산화 반응 내내 노출되어진 사전 자극 단계(post-stimulation phase)에 대한 NF-kB 억제제 분해을 제한한다. NF-kB 활성화(activation)와 그 것의 결과적 기능은 여기에서 제시되어지는 조절제를 사용하는 IkB 리가제의 in vivo 억제에 의해서 특별히 없어질 수 있다.

실시예 4

IkBa 유비큐틴화의 또 다른 특성의 기술

이 실시예는 더 나아가 IkBa 유비큐틴화와 관련된 유비큐틴 리가제의 특성을 기술한다.

사이토킨(Cytokine) 자극은 pIkBa 와 특별한 유비큐틴-리가제 사이의 관련성 을 촉진한다.

인산화된 IkBa-복합체에 의한 유비큐틴 기관의 보충(recruitment) 구성성분을 더 연구하기 위해서, pIkBa/NF-kB 복합체는 프로티좀(proteasome)으로 억제되어진, TNF-a 자극되어진 HeLa 세포로부터 정제되어졌고, 그들의 유비큐틴화-잠재능력이 계산되어졌다. HeLa 세포들은 프로티좀 억제제 ALLN (150 mM)으로 1시간동안 미리-배양(pre-incubated) 되어졌으며 TNFa으로 10분동안 자극되어졌다. IkBa/NF-kB 복합체는 염소의 안티-렐 A(anti-Rel A) (p65) 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)와 코그네이트(cognate )p65 펩티드(ELFPLIFPAEPAQASGP (SEQ ID NO:21)로 면역친화성-정제되어졌는데 이는 합성가능하며 Alfa-Diagnostic, Inc. 로부터 구입되어져 HPLC-정제되어진(HPLC-purified) 뒤 질량분석기로 분석하고 예상된 구조를 확인하고 85% 이상의 순도를 확인하였다.

면역 정제되어진 프랙션은 유비큐틴 시스템의 다양한 구성성분으로 보충되어졌고 in vitro 유비큐틴화가 이루어졌다. 특별하게 상기 프랙션은 0.2 mg 정제되어진 El 및 1 mg 정제되어진 재조합 UBC5C(Jensen et al., J. Biol. Chem. 270:30408-30414, 1995)로 보충되어지고 하기 내용물을 포함하는 반응 완충액내에서 37℃ 에서 90분간 배양되어졌다: 50mM Tris (pH 7.6), 2mM MgCl₂, 1mM DTT, 20nM 오카다익산(okadaic acid), 1mg/ml 보바인 유비큐틴(bovine ubiquitin) (시그마, Sigma) 및 5mM ATPgS (시그마, Sigma). 그 후, 반응 혼합물은 SDS-완충액내에서 가열되고 샘플은 SDS-PAGE (8.5%)와 포스포-이미징(phospho-imaging)에 의해서 분석 되어졌다.

유비큐틴, 정제되어진 E1 그리고 특이적인 E2, UBC5C의 첨가는 IkBa-유비큐틴 콘쥬게이션 활성의 용량을 최대로 발생시키는데 충분하다는 것이 발견되어졌다(도 5, 레인 2). 이는 IkBa 특이적인 항혈청(antisera)과 반응하는 높은-분자량을 가진 종(species)이 축적(accumulation)된다는 증거이다. 이러한 활성도 E1-의존적이며(레인 1과 2를 비교하라), 자극되지 않은 HeLa 세포들과 대응하는 면역정제되어진 프랙션에 의해서 제공되어지지 않았다(레인 4, 5, 6을 비교하라). 자극되어진 HeLa 프랙션이 인산화되어진 IkBa 및 인산화되지 않은 IkBa 둘 다에 포함되어짐에 따라 관찰되어진 콘쥬게이트는 IkB 종들 중 어느 하나로부터 유도되어질 수 있다.

IkBa-콘쥬게이트의 소스(source)를 결정하기 위해서, 유비큐틴화 반응들은 pIkBa 펩티드(pp12; CDRHDS[PO3]GLDS[PO3]; SEQ ID NO:22) (레인 7) 또는 세린/클루타민산 치환되어진 IkBa 펩티드(p12S/E) (레인 8)의 존재하에 수행되어졌다. 펩티드 둘 다 합성가능하며 Alfa-Dlagnostic, Inc.로부터 구입되어져 HPLC-정제되어진(HPLC-purified) 뒤 질량분석기로 분석하고 예상된 구조를 확인하고 85% 이상의 순도를 확인하였다. IkBa 펩티드는 펩티다제 억제제 페스타틴(peptidase inhibitor Bestatin )(40 mg/ml)의 존재하에 반응 혼합물에 지시되어진 농도로 첨가되어졌다. pp12만이 유비큐틴화가 pIkBa에 특이적임을 가리키는 (Yaron et al., EMBO J. 16:6486-6494, 1997) 폴리유비큐틴- IkBa 콘쥬게이트의 형성을 없앤다.

B. 인산화는 리쿠르트 특이적인 유비큐틴 리가제 활성에 필요적이고 충분하다.

E1과 E2가 특별히 자극되어진 HeLa 프랙션의 pIkBa-콘쥬게이션에 상보적이지만, 자극되어지지 않은 프랙션의 상보적이지 않다는 발견은 몇몇의 방식으로 설명되어질 수 있다: a) HeLa 자극이 특이성의 pIkB-유비큐틴 리가제(pIkB-ubiquitin ligase)를 활성화한다, b) HeLa 자극이 기질을 변형시켜서 그 것을 유비큐틴화하기 쉽게 한다, 또는 c) HeLa 자극이 기질과 리가제 둘을 변형시키기 위해 필요하다. 이러한 가능성들을 구별하기 위해서, 재조합 구조적인 활성 IKK2 단백질(IKK2-EE)에 사용되어졌다(Mercurio et al., Science 278:860-66, 1997). 상기 단백질들은 TNFa 활성화된(activated) IKK-복합체에 유사하게 세린 32/36에 IkBa를 인산화한다.

자극되어지지 않은 HeLa 라이세이트로부터 ³⁵S-라벨된(labeled) IkBa/NF-kB 복합체의 면역침전후에 재조합 ³⁵S-라벨된 IkBa와 함께 미리 배양되어졌으며 상기 복합체들은 재조합 IKK2-EE에 의해 인산화되어졌고 p65 코그네이트(cognate) 펩티드로 희석되어졌으며 세포태(in vitro) 유비큐틴화가 이루어졌다. IKK2-EE와 함께 배양되어진 후 ³⁵S-IkB 거의 모두가 인산화되어졌다. 아직, 유비큐틴, E1 그리고 UBC5C의 첨가는 pIkBa의 인산화의 결과를 가져오지 않았다(도 6, 레인 2). 그러므로 IKK에 의한 IkB 인산화는 E1와 E2의 존재하에 그 것의 유비큐틴화를 촉진하기에 충분하지 않았다. 필시, pIkBa 유비큐틴화는 자극되어지지 않는 세포들로부터 공동-면역정제(co-immunopurified)되어지지 않은 HeLa 라이세이트의 추가적인 구성성분을 필요로 한다.

상기 가설을 확인하기 위해서, 이뮤노-바운드(immuno-bound) IkBa/NF-kB 복합체들은 자극되어지지 않은 HeLa 라이세이트로 배양되어졌고 바로 쓰거나, IKK2-EE 인산화를 거친 뒤 높은-염농도(high-salt) 완충액으로 광범위하게 씻고 p65 팹티드로 희석하였다. 사실상, 인산화되어지지 않은 것의 HeLa 라이세이트와의 배양이 아니라(레인 1), 인산화되어진 IkB 복합체의 HeLa 라이세이트와의 배양(도 6, 레인 3)은 pIkBa 콘쥬게이션을 위해 필요한 pIkB-리가제 구성성분을 제공했다. 겔의 맨 윗부분에 시그날의 폴리-유비큐틴 IkBa-콘쥬게이트를 나타낸다는 것을 확인하는 반응으로부터 E1 또는 E2가 생략되어졌을 때 시그날은 포착되어지지 않았다(레인 5, 6). TNFa 자극되어진 HeLa 라이세이트는 필요한 리가제 구성성분을 제공하는 자극되어지지 않은 라이세이트 이상으로 뛰어나지 않았다.

pIkBa-유비큐틴화상의 pp12의 억제 효과(도 5)는 필수적인 HeLa 구성성분이 배양 기간동안 pIkBa 인식 모티브와 pIkB-유비큐틴 콘쥬게이션 이 후의 기능들과 특별히 그리고 안정하게 관련되어진다는 것을 제안했다. 상기 가정을 테스트하기 위해, 우리는 배양 단계에 pp12 또는 콘트롤 펩티드 p12S/E를 포함했고, 그 후 프랙션을 희석하기 전에 HeLa 라이세이트와 함께 제거되어졌다. p12S/E (레인 5)가 아닌 pp12 (도 6, 레인 4)의 첨가는 기질의 원상태를 보존하는 동안, pIkB-복합체와 관련된 유비큐틴-리가제 활성을 없앴다. 이는 E3 소스로서 레티쿨로사이트 프랙션 II(Reticulocyte Fraction II)의 존재하에 유비큐틴화를 수행하는 펩티드-처리된 프랙션의 능력에 대한 증거이다 (Alkalay et al., Mol. Cell Biol. 15:1294-301, 1995). 몇몇 결론들은 이 실험으로부터 이끌어질 수 있다:

1) pIkBa 유비큐틴화에 본질적인 유비큐틴-리가제 구성성분은 IKK 인산화에 따른 HeLa 라이세이트로부터 IkBa/NF-kB 복합체에 의해 고용되어진다.

2) 이 콘쥬게이션-촉진하는(conjugation-promoting) 구성성분은 TNF-자극에 의해 유비큐틴-리가제 활성화가 필요없다는 것을 가리키는 자극되어지지 않은 HeLa 라이세이트내에 포함되어지지 않는다.

3) 이 필수적인 리가제 구성성분은 pIkB 인식 모티브와의 직접적인 상호작용 내내 IkB에 명백해 특이적이고 관련성이 있다(pIkBa-콘쥬게이션의 pp12 억제에 의해 증명된다).

C. pIkBa 를 인식하는 특이성의 유비큐틴-리가제 구성성분의 분리

HeLa 추출물 (250mg)은 250 ml 항(anti)-p65 이뮤노비드(immunobeads)로 배양되어졌다. 그 후 완충액 A(1M KCl, 0.5 % NP40, 50mM Tris buffer PH 7.6, 1mM DTT)로 4번 씻어내고 완충액 B(50mM Tris buffer, pH 7.6, 1mM DTT)로 한 번 씻어낸 후, 절반의 비드가 IKK 로 세포내(in vitro) 인산화되어졌고, 나머지 반절은 가-인산화(mock-phosphorylation)가 수행되어졌다. 상기 비드들은 완충액 A로 두 번 씻어내고 완충액 B로 한 번 씻어낸 후, 25℃에서 30분동안 1 mm 오카다익산(okadaic acid)의 존재하에 100mg HeLa 추출물과 함께 흔들어 주었으며, 완충액 A로 4 번 씻어 냈는데, 완충액 A로 일단 씻은 후에는 1mg/ml p65 펩티드로 희석되어졌다. 유사한 실험이 10 mg ³⁵S-대사적으로(metabolically)-라벨된(labeled) HeLa 세포 라이세이트(100 mCi/ml Met/Cys for 8 hours)와 25 ml p65-이뮤노비드(immunobeads)를 가지고 수행되어졌다. 뜨겁고 찬 라이세이트로부터 유도된 희석된-프랙션은 혼합되어졌으며 SDS-샘플(sample) 완충액내에서 끓여지고 7.5% SDS-PAGE 및 자동방사선사진(autoradiography)에 의해 분석되어졌다. 오토라디오그램(autoradiogram) 시그날에 대응되는 겔 층(slices)은 잘라내어졌고 그들의 단백질-밴드는 하기에서 묘사하는 바대로 질량-분광분석법(mass-spectrometry)에 의해 시퀀스되어졌다.

세 면역친화성-정제된 프랙션은 SDS-page 분석에 의해 비교되었다(도 7A): 1) IKK2-EE에 의해 인산화도지 않은 IkBa/NF-kB 복합체를 포함하지만 HeLa 라이세이트로 배양되지 않은 프랙션; 2) IKK2-EE 인산화와 HeLa 라이세이트로 부가적인 배양을 한 프랙션; 3) IKK2-EE에 의하여 인산화되어졌으나 HeLa 라이세이트로 배양되지 않은 프랙션. 모든 배양은 이뮤노비드-고정화된(immunobead-immobilized) 복합체상으로 수행되어졌으며 그 후 상기 복합체들은 p65 펩티드로 광범위하게 씻겨지고 희석되어졌다.

세 프랙션의 SDS-PAGE분석은 IKK 인산화 또는 IkBa/NF-kB 단백질의 또 다른 면역-흡착(immuno-adsorption)에 기인한 패턴의 변화를 드러냈지만, IKK 인산화에 따른 IkB-복합체에 의해서 모아진 어떤 단백질도 식별하지 않았다. 단백질 염색의 복잡성은 면역정제되어진 단백질에 따라 이동하는(migrating) 어떤 모아진 단백질의 존재를 불명료하게 하였다. 모아진(recruited) 단백질을 확인하기 위해서, 질량 분광분석법이 프랙션 1과 2로부터 유도된 12개의 콜로이달 블루-염색된 밴드(Colloidal Blue-stained bands)상에 수행되어졌다. 이 분석법은 Rel류(family) 단백질과 IkBa의 전체 스펙트럼의 존재를 드러냈다: NF-kB1 (pl05), NF-kB2 (pl00), RelA (p65), p50, p49, C-Rel, IkBa 및 IkBe. 단지 적은 다른 단백질들만이, 특별히 GRP78/Bip, Hsp 70 및 Hsc 70 로 공동-면역침전(co-immunoprecipitated)되어졌다.

추정되는(putative) pIkB-유비큐틴 리가제의 가능한 마스킹(masking)을 막기 위해서, 우리는 ³⁵S-생합성적으로(biosynthetically)-라벨된(labeled) HeLa 라이세이트로 리가제 소스를 대체했고 SDS-PAGE 분석과 자동방사선사진에 의해 IkBa-결합된 단백질들은 추적했다(도 7B). 대응되게, 다양한 프랙션이 그들의 유비큐틴-리가제 카파시티를 위해 테스트되어졌다. 활성화 프랙션(레인 3)의 밴드-패턴은 비활성화 프랙션(레인 1)의 그 것과 비교되어졌다. 54, 58, 61 및 64 kD의 분자량을 가진 네 개의 ³⁵S-단백질 밴드는 레인 2에서 구별되어졌다. 상기 단백질 밴드의 몇몇은 pIkBa 을 직접 인식하는 유비큐틴 리가제의 구성성분을 나타낼 수 있으나 반면에 다른 것들은 pIkBa 와 간접적으로 관련되어지거나 IKK-인산화된 복합체의 또 다른 구성성분과 관련되어진다. pIkBa를 직접 인식하는 리가제 구성성분을 분류하기 위해서, pp12 또는 콘트롤(control) 펩티드 p12S/E는 라디오라벨(radiolabeled)된 HeLa 라이세이트에 첨가했으며, 이는 이뮤노-바운드(immuno-bound) IkBa/NF-kB 복합체와 함께 배양되어졌다. 희석되어진 프랙션의 비교는 네 개의 구별되는 밴드를 프랙션 2에만 나타나고, 세 개의 밴드는 특이성의 pp12 펩티드(p54, p58 및 p61)에 의해서 제거되어졌으나, 반면에 단지 64 kD 밴드만은 pp12 의 존재하에 잔존되었다(도 7B, 레인 2 및 3을 비교하라). 콘트롤 펩티드는 pIkBa 와 함께 구별되는 단백질의 어떠한 것에 대한 결합에 영향을 미치지 않았다(레인 4). 단백질 p58 및 p54과 상호작용하는 두 개의 pIkBa 는 일관되게 존재하고 특이성의 유비큐틴-리가제 활성과 항상 관련되어진다.

실시예 5

인체의 E3 유비큐틴 리가제의 확인

이 실시예는 인체의 E3 유비큐틴 리가제의 분리와 특성을 기술한다.

이 전 실시예에서 묘사한 54 및 58 kD 밴드는 리가제-포지티브(ligase-positive)와 리가제-네가티브(ligase-negative)(HeLa 라이세이트는 인산화되지 않은 IkBa-복합체와 함께 배양되어졌다) 레인, 인 시투(in situ)에서 정보를 얻은 단백질들 그리고 전형적인 펩티드들로부터 삭제되어졌고, 그래서 획득물들은 나노일렉트로스프레이(nanoelectrospray) 질량 분석법에 의해 시퀀스되어졌다 (Wilm et al., Nature 379:466-469, 1996). 단백질 밴드들은 겔안에서 리듀스(reduced)되어지고, S-알킬레이트되어진 뒤 (Shevchenko et al., Anal. Chem. 68:850-858, 1996; Wilm et al., Nature 379:466-469, 1996)에서 묘사한대로 과량의 트립신으로 겔안에서 소화되어(digested)졌다(실온에서 밤새동안).겔 조각들은 추출되어지고 결과로 남은 펩티드 혼합물들은 50 nl 포로스(Poros) R2 물질(material)을 포함하는 마이크로-컬럼(micro-column)을 사용하여 농축되어지고 염분이 제거되어졌다(Perceptive Biosystems, Framinsham, MA). 펩티드들은 나노일렉트로 스프레이 바늘(needle)안으로 직접 1 ml of 60% 메탄올(methanol) 및 5% 포름산(formic acid)으로 희석되어졌다. 나노일렉트로스프레이 스펙트럼들(spectra)은 쿠아드루폴(quadrupole) 타임-오브-플라이트(time-of-flight) 질량 분광분석기(QqTOF, Perkin-Elmer Sciex, Toronto, Canada)상에 기록되어졌다. 펩티드 시퀀스 태그들(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)은 조각 스펙트럼들로부터 조합되어졌고 유럽 바이오인포매틱 인스티튜트(the European BioInformatics Institute)(EBI, Hinxton Park, England)에서 보유하고 있는 과잉되지 않은(non redundant) 단백질 시퀀스 데이터베이스 (nrdb)에서 펩티드서치(PeptideSearch) 프로그램(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)을 이용하여 서치되어졌다.

54 kD 겔 밴드의 질량 스펙트럼은 프래그멘테이션(fragmentation)을 위해 선택되어진 몇몇의 펩티드들로부터 얻은 복합체 펩티드 혼합물(도 8A)로 드러났다. 펩티드 시퀀스 태그 서치(Mann and Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399, 1994)에 의해 확인된 단백질은 NF-kB1 (p50), IkB 키나제(kinase) a, IkBe, RelB, 투불린(tubulin) 베타(beta)-1 체인(chain) 및 티로이드 리셉터 억제제 바인딩 단백질(thyroid receptor initiator binding protein)을 포함한다. E3 활성, 부가적인(additional) 펩티드, 작은 양으로 존재하는 것과 관련된 단백질을 확인하는 것은 활성화 프랙션으로부터의 54 kD 밴드의 스펙트럼을 비-활성화 프랙션으로부터의 유사한 밴드의 스펙트럼을 비교함으로써 시퀀싱을 위해 선택되어졌다(도 8B). 펩티드 시퀀스 태그(1587.81) VVNV (SEQ ID NO:23) (1999.09)는 도 8에서 보여주는 프 래그먼트 스펙트럼으로부터 유도되어졌고 분명하게 AAVNVVDFDDKYIVSAS (SEQ ID NO:24)으로 확인되어졌다. 또 다른 스펙트럼들은 펩티드 LEGHEELVR (SEQ ID NO:25), LVVSGSSDNTIR (SEQ ID NO:26), IQDIETIESNWR (SEQ ID NO:27) 및 VISEGMLWK (SEQ ID NO:28)으로 확인되어졌다. 첫 번째 네 프래그먼트는 인체의 F-box/WD 단백질 b-TrCP내에서 존재하는 시퀀스를 가진다(Margottin et al., Mol. Cell 1:565-574, 1998). 그러나, 다섯번 째 펩티드(VISEGMLWK (SEQ ID NO:28))는 드로소필라 슬림 단백질(Drosophila Slimb protein)로부터의 펩티드의 그 것과 일치한다(Jiang and Struhl, Natrue 391:493-496, 1998를 보라), 상기 단백질은 인체의 b-TrCP에 매우 높게 일치(homologous)한다. 또 다른 시퀀싱은 도 9(SEQ ID NO:15)에서 제시되어진 인체의 E3 유비큐틴 리가제 뉴클레오티드 시퀀스와, 도 10(SEQ ID NO:16)에서 제시되어진 예상된 단백질 시퀀스를 확인했다. 그래서, 인체의 E3 유비큐틴 리가제는 상동(homologous)의 단백질의 b-TrCP/Slimb 류(family)의 신규한 멤버(member )가 된다고 보여진다.

실시예 6

E3 유비큐틴 리가제 활성화의 또 다른 특성 기술

이 실시예는 인체의 E3 유비큐틴 리가제 류(family)의 멤버들인 b-TrCP 및 Slimb의 유비큐틴 리가제 활성화를 설명한다.

pIkBa에 특이적으로 결합(bind)하고 그 것의 유비큐틴화를 돕는 단백질들의 능력은 셀-프리 시스템(cell-free system)으로 조사되어졌다. IkBa/NF-kB 복합체는 HeLa 세포들로부터 면역정제되어졌고 면역(immune) 복합체는 IKK2-EE으로 인산화되 어지거나 상기에서 묘사한 바대로 가인산화되어졌다(mock-phosphorylated). 그리고나서 그 것은 트랜스펙트되어진(transfected) 293 세포로부터 면역침전되어진 하기 고정된(immobilized) FLAG-태그된(tagged) E3 류(family) 멤버와 함께 배양되어졌다: 마우스 b-TrCP (mb-TrCP), 인체의 b-TrCP (hb-TrCP), F 박스(box) 영역(region) 잔기들(residues) 122-168 (Db-TrCP)를 삭제한 인체의 b-TrCP 및 드로소필라 슬림 단백질(Drosophila Slimb protein). 경계의 물질(bound material)은 항-IkBa 및 항-FLAG 항체를 가지고 웨스턴 블럿(Western blotting)에 의해 분석되어졌다. 이러한 단백질 모두는 가인산화가 아닌 IKK-인산화되어진 IkBa (도 11A를 보라)를 광범위하게 잡는다(bound). 그러나, 인체 및 마우스 b-TrCP는 높은 정도로 상동적인 드로소필라 단백질보다 IkBa 를 멀리 붙든다(bound)(레인 2, 4, 6 및 8을 비교하라). Db-TrCP 는 야생형 단백질보다 pIkBa 를 붙든다, 이는 F-박스 영역이 바인딩을 위해 적용이 가능하다는 것을 가리킨다. 게다가, b-TrCP 바인딩은 pIkBa 인식 모티브(pp10; DRHDS(PO₃)GLDS(PO₃)M (SEQ ID NO:29)를 대표하는 펩티드에 의해서 없어졌다; 도 11B, 레인 3을 보라, 그러나 역(conserved) DS(PO₃)GLDS(PO₃) (SEQ ID NO:30) 시퀀스의 pIkBa 인식의 위치(site)를 특정화하는 콘트롤 펩티드(레인 4)에 의해서는 아니다.

유비큐틴화상의 바인딩의 영향을 계산하기 위해서, E3 류(family) 멤버와 삭제 변종(deletion mutant)은 pIkBa 유비큐틴화내에서 E3 활성화의 소스(source)로서 사용되어졌다. E1 및 E2 (UBC5C)의 존재하에서, 야생형 b-TrCP 단백질은 pIkBa 의 유비큐틴화를 촉진했으나 인산화되지 않은 IkBa 의 유비큐틴화는 촉진하지 않았다(도 11C, 레인 1-4를 보라). F-박스 단백질-단백질 상호작용 모쥴(module)이 없는 Db-TrCP는 그 것의 바인딩 카파시티(도 11A, 레인 6)에도 불구하고, 유비큐틴화(레인 7 및 8)를 촉진하는데 실패했다. 비록 슬림(Slimb)이 몇몇의 pIkBa 유비큐틴화를 촉진할지라도, 그 것의 더 약한 활성화에 대응하는 인체 및 마우스 b-TrCP (유사한 FLAG-태그 발현 레벨에 근거한)보다 최소한 10배(ten-fold) 덜 효과적이었다.

여기에서 묘사한 상기 류(family) 멤버 및 세포내(in vitro) 분석의 모듈러(modular) 디자인은 F-박스의 삭제가 생체내(in vivo) 주요한 네가티브 분자로서 기능하는 단백질내에서 이루어짐을 제안했다. 사실상, Db-TrCP 의 트랜지언트(transient) 과-발현(over-expression)은, pIkBa 의 어큐물레이션의 결과를 가져오는 자극되어진 쥬캐트(Jurkat) 세포들내에서 내인성의(endogenous) IkBa 의 분해을 방해했다(도 12A). 결과적으로, NF-kB 의 활성화는 억제되어졌다(도 12B). NF-kB 활성화는 NF-AT 리포터(reporter)의 활성화에 영향을 주지않고, Db-TrCP에 특이적이었다. 주지해야 할 점은 NF-kB 억제가 야생형 슬림과 함께 또한 관찰되어졌고 반면에, 야생형 인체의 b-TrCP 의 발현은 억제적이지 않았다는 사실이다(도 12B). 그러므로, 야생형 슬림의 과발현(overexpression)은, 아마도 그 것의 상대적으로 작은 pIkBa 유비큐틴화 활성화에 연결되어진, NF-kB 활성화에 주요한 부정적인 영향을 가졌다(도 11B).

앞서 말한 바로부터 비록 발명의 특이한 실시예(embodiments)가 설명을 목적 으로 여기에서 기술되었을지라도, 다양한 변형들이 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않도록 만들어질 수 있을 것이다. 따라서, 발명은 첨부된 청구항을 제외한 다른 부분에 의해서 제한되지 않는다.

시퀀싱 리스트의 요약

SEQ ID NO:1은 IkBa의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:2는 IkBa 의 DNA 시퀀스이다

SEQ ID NO:3 는 IkBb의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:4 는 IkBb의 DNA 시퀀스이다

SEQ ID NO:5 는 pp7의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:6 은 pp11의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:7 는 pp15의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:8 은 pp19의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:9 는 pp21의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:10 는 포스포-Fos 펩티드(phospho-Fos peptide)의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:11 은 pp21 S/A의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:12 는 HA-태그된(tagged) IkBa의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:13 은 HA-태그된 S32, 36 IkBa의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:14 는 HA-태그된 IkBb의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:15 는 인체의 E3 유비큐틴 리가제의 DNA 시퀀스이다

SEQ ID NO:16 은 인체의 E3 유비큐틴 리가제의 예상되는 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:17 는 인체의 b-TrCP의 DNA 시퀀스이다

SEQ ID NO:18 은 인체의 E3 b-TrCP의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:19 는 IkBa의 인산화 위치(site)이다

SEQ ID NO:20 은 회수된(retrieved) b-TrCP 시퀀스이다

SEQ ID NO:21 은 코그네이트(cognate) p64 펩티드의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:22 는 pIkBa 펩티드 pp12의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:23 는 인체의 E3 유비큐틴 리가제의 펩티드 시퀀스이다

SEQ ID NO:24 는 인체의 E3 유비큐틴 리가제로부터의 펩티드이다

SEQ ID NO:25 는 인체의 E3 유비큐틴 리가제로부터의 펩티드이다

SEQ ID NO:26 은 인체의 E3 유비큐틴 리가제로부터의 펩티드이다

SEQ ID NO:27 은 인체의 E3 유비큐틴 리가제로부터의 펩티드이다

SEQ ID NO:28 은 인체의 E3 유비큐틴 리가제로부터의 펩티드이다

SEQ ID NO:29 는 pIkBa 인식 모티브의 아미노산 시퀀스이다

SEQ ID NO:30 은 보존되어진 pIkBa 시퀀스이다

<110> MANNING, Anthony M MERCURIO, Frank AMIT, Sharon BEN-NERIAH, Yinon DAVIS, Matti HATZUBAI, Ada LAVON, Iris YARON, Avraham <120> COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING ACTIVATION OF NF-kB <130> 1 <150> US <151> 1998-12-10 <160> 30 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln 85 90 95 Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140 Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu 165 170 175 Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile 180 185 190 His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220 Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu 245 250 255 Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu 260 265 270 Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285 Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 290 295 300 Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu 305 310 315 <210> 2 <211> 1550 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgccgccgtc ccgcccgcca gcgccccagc gaggaagcag cgcgcagccc gcggcccagc 60 gcacccgcag cagcgcccgc agctcgtccg cgccatgttc caggcggccg agcgccccca 120 ggagtgggcc atggagggcc cccgcgacgg gctgaagaag gagcggctac tggacgaccg 180 ccacgacagc ggcctggact ccatgaaaga cgaggagtac gagcagatgg tcaaggagct 240 gcaggagatc cgcctcgagc cgcaggaggt gccgcgcggc tcggagccct ggaagcagca 300 gctcaccgag gacggggact cgttcctgca cttggccatc atccatgaag aaaaggcact 360 gaccatggaa gtgatccgcc aggtgaaggg agacctggct ttcctcaact tccagaacaa 420 cctgcagcag actccactcc acttggctgt gatcaccaac cagccagaaa ttgctgaggc 480 acttctggga gctggctgtg atcctgagct ccgagacttt cgaggaaata cccccctaca 540 ccttgcctgt gagcagggct gcctggccag cgtgggagtc ctgactcagt cctgcaccac 600 cccgcacctc cactccatcc tgaaggctac caactacaat ggccacacgt gtctacactt 660 agcctctatc catggctacc tgggcatcgt ggagcttttg gtgtccttgg gtgctgatgt 720 caatgctcag gagccctgta atggccggac tgcccttcac ctcgcagtgg acctgcaaaa 780 tcctgacctg gtgtcactcc tgttgaagtg tggggctgat gtcaacagag ttacctacca 840 gggctattct ccctaccagc tcacctgggg ccgcccaagc acccggatac agcagcagct 900 gggccagctg acactagaaa accttcagat gctgccagag agtgaggatg aggagagcta 960 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Thr Glu Asp Gly Asp Thr Ala Leu His Leu 50 55 60 Ala Val Ile His Gln His Glu Pro Phe Leu Asp Phe Leu Leu Gly Phe 65 70 75 80 Ser Ala Gly His Glu Tyr Leu Asp Leu Gln Asn Asp Leu Gly Gln Thr 85 90 95 Ala Leu His Leu Ala Ala Ile Leu Gly Glu Ala Ser Thr Val Glu Lys 100 105 110 Leu Tyr Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Val Ala Glu Arg Gly Gly His 115 120 125 Thr Ala Leu His Leu Ala Cys Arg Val Arg Ala His Thr Cys Ala Cys 130 135 140 Val Leu Leu Gln Pro Arg Pro Ser His Pro Arg Asp Ala Ser Asp Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Thr Gln Ser Gln Asp Cys Thr Pro Asp Thr Ser His Ala Pro 165 170 175 Ala Ala Val Asp Ser Gln Pro Asn Pro Glu Asn Glu Glu Glu Pro Arg 180 185 190 Asp Glu Asp Trp Arg Leu Gln Leu Glu Ala Glu Asn Tyr Asp Gly His 195 200 205 Thr Pro Leu His Val Ala Val Ile His Lys Asp Ala Glu Met Val Arg 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Ala Gly Ala Asp Leu Asn Lys Pro Glu Pro Thr Cys 225 230 235 240 Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Val Glu Ala Gln Ala Ala Ser Val 245 250 255 Leu Glu Leu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Pro Thr Ala Arg Met Tyr 260 265 270 Gly Gly Arg Thr Pro Leu Gly Ser Ala Leu Leu Arg Pro Asn Pro Ile 275 280 285 Leu Ala Arg Leu Leu Arg Ala His Gly Ala Pro Glu Pro Glu Asp Glu 290 295 300 Asp Asp Lys Leu Ser Pro Cys Ser Ser Ser Gly Ser Asp Ser Asp Ser 305 310 315 320 Asp Asn Arg Asp Glu Gly Asp Glu Tyr Asp Asp Ile Val Val His Ser 325 330 335 Gly Arg Ser Gln Asn Arg Gln Pro Pro Ser Pro Ala Ser Lys Pro Leu 340 345 350 Pro Asp Asp Pro Asn Pro Ala 355 <210> 4 <211> 1212 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcgcactgga gctcatcgca gagcccagcg acaggcaggc gaccacaggg ggccacccga 60 ggtggctggg gccatggccg gggtcgcgtg cttggggaaa actgcggatg ccgatgaatg 120 gtgcgacagc ggcctgggct ctctaggtcc cgacgcagcg gctcccggag gaccaggtct 180 gggcgcagag cttggcccag agctgtcgtg ggcgccctta gtctttggct acgtcactga 240 ggatggggac acagccctgc acttggctgt gattcatcag catgagccct tcctggattt 300 cctcctgggc ttttccgccg gccacgagta ccttgacctg cagaatgacc taggccaaac 360 agccctgcat ctagcagcca tccttgggga ggcatctaca gtagagaagt tgtatgcagc 420 cggtgcagga gtgttggtgg ctgagagagg gggccacacg gcattgcact tggcctgccg 480 ggtcagggca cacacgtgcg cgtgcgtact gctccagccc cgtcccagcc acccaagaga 540 tgcctcagat acctacctca ctcagagcca ggactgtacc ccagacacca gccatgcccc 600 tgctgccgtg gattcccaac ccaacccaga gaacgaagag gagccgcgtg atgaagactg 660 gaggctacaa ctagaagctg aaaactatga tggccatacc ccactccatg tagctgtcat 720 ccacaaagat gcagagatgg tccggctgct cagggatgcc ggagccgacc tcaataaacc 780 ggagcctacg tgtggccgga cccctctgca cctggcagta gaagcccagg cagccagcgt 840 gctggaactt ctcctgaaag ccggtgctga ccccaccgcc cgcatgtatg ggggccgcac 900 cccgcttggc agtgccctgc tccggcccaa ccccatcctt gcccgcctcc tccgtgcaca 960 tggggcccct gaacctgagg acgaggacga taagcttagc ccttgcagca gcagcggcag 1020 cgacagtgac agtgacaaca gagatgaggg cgatgaatat gatgacatcg tggttcacag 1080 tggcaggagc caaaaccgac aaccgccttc cccggcatcc aaacctcttc ctgatgaccc 1140 caaccctgcc tgacttaagt gctaatatta atataatttc caacttaata aaattgcaga 1200 cctgacaacc ag 1212 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Asp 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900 cagaaaatag taagcggcct tcgagacaac acaatcaaga tctgggataa aaacacattg 960 gaatgcaagc gaattctcac aggccataca ggttcagtcc tctgtctcca gtatgatgag 1020 agagtgatca taacaggatc atcggattcc acggtcagag tgtgggatgt aaatacaggt 1080 gaaatgctaa acacgttgat tcaccattgt gaagcagttc tgcacttgcg tttcaataat 1140 ggcatgatgg tgacctgctc caaagatcgt tccattgctg tatgggatat ggcctcccca 1200 actgacatta ccctccggag ggtgctggtc ggacaccgag ctgctgtcaa tgttgtagac 1260 tttgatgaca agtacattgt ttctgcatct ggggatagaa ctataaaggt atggaacaca 1320 agtacttgtg aatttgtaag gaccttaaat ggacacaaac gaggcattgc ctgtttgcag 1380 tacagggaca ggctggtagt gagtggctca tctgacaaca ctatcagatt atgggacata 1440 gaatgtggtg catgtttacg agtgttagaa ggccatgagg aattggtgcg ttgtattcga 1500 tttgataaca agaggatagt cagtggggcc tatgatggaa aaattaaagt gtgggatctt 1560 gtggctgctt tggacccccg tgctcctgca gggacactct gtctacggac ccttgtggag 1620 cattccggaa gagtttttcg actacagttt gatgaattcc agattgtcag tagttcacat 1680 gatgacacaa tcctcatctg ggacttccta aatgatccag ctgcccaagc tgaacccccc 1740 cgttcccctt ctcgaacata cacctacatc tccagataaa taaccataca ctgacctcat 1800 acttgcccag gacccattaa agttgcggta tttaacgtat ctgccaatac caggatgagc 1860 aacaacagta acaatcaaac tactgcccag tttccctgga ctagccgagg agcagggctt 1920 tgagactcct gttgggacac agttggtctg cagtcggccc aggacggtct actcagcaca 1980 actgactgct tcagtgctgc tatcagaaga tgtcttctat caattgtgaa tgattggaac 2040 ttttaaacct cccctcctct cctcctttca cctctgcacc tagttttttc ccattggttc 2100 cagacaaagg tgacttataa atatatttag tgttttgcca gaaaaaaaaa a 2151 <210> 18 <211> 569 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met 1 5 10 15 Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys 20 25 30 Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala 35 40 45 Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met 50 55 60 Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser 65 70 75 80 Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys 85 90 95 Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp 100 105 110 Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln 115 120 125 His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe 130 135 140 Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile 145 150 155 160 Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys 165 170 175 Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu 180 185 190 Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu 195 200 205 Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly 210 215 220 Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile 225 230 235 240 Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser 245 250 255 Leu Gln Arg Ile His Cys Arg Ser Glu Thr Ser Lys Gly Val Tyr Cys 260 265 270 Leu Gln Tyr Asp Asp Gln Lys Ile Val Ser Gly Leu Arg Asp Asn Thr 275 280 285 Ile Lys Ile Trp Asp Lys Asn Thr Leu Glu Cys Lys Arg Ile Leu Thr 290 295 300 Gly His Thr Gly Ser Val Leu Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Arg Val Ile 305 310 315 320 Ile Thr Gly Ser Ser Asp Ser Thr Val Arg Val Trp Asp Val Asn Thr 325 330 335 Gly Glu Met Leu Asn Thr Leu Ile His His Cys Glu Ala Val Leu His 340 345 350 Leu Arg Phe Asn Asn Gly Met Met Val Thr Cys Ser Lys Asp Arg Ser 355 360 365 Ile Ala Val Trp Asp Met Ala Ser Pro Thr Asp Ile Thr Leu Arg Arg 370 375 380 Val Leu Val Gly His Arg Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp 385 390 395 400 Lys Tyr Ile Val Ser Ala Ser Gly Asp Arg Thr Ile Lys Val Trp Asn 405 410 415 Thr Ser Thr Cys Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Gly His Lys Arg Gly 420 425 430 Ile Ala Cys Leu Gln Tyr Arg Asp Arg Leu Val Val Ser Gly Ser Ser 435 440 445 Asp Asn Thr Ile Arg Leu Trp Asp Ile Glu Cys Gly Ala Cys Leu Arg 450 455 460 Val Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg Cys Ile Arg Phe Asp Asn 465 470 475 480 Lys Arg Ile Val Ser Gly Ala Tyr Asp Gly Lys Ile Lys Val Trp Asp 485 490 495 Leu Val Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ala Pro Ala Gly Thr Leu Cys Leu 500 505 510 Arg Thr Leu Val Glu His Ser Gly Arg Val Phe Arg Leu Gln Phe Asp 515 520 525 Glu Phe Gln Ile Val Ser Ser Ser His Asp Asp Thr Ile Leu Ile Trp 530 535 540 Asp Phe Leu Asn Asp Pro Ala Ala Gln Ala Glu Pro Pro Arg Ser Pro 545 550 555 560 Ser Arg Thr Tyr Thr Tyr Ile Ser Arg 565 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Ser Gly Leu Asp Ser 1 5 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Tyr Ile Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Gly Asp Arg 20 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Leu Phe Pro Leu Ile Phe Pro Ala Glu Pro Ala Gln Ala Ser Gly 1 5 10 15 Pro <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> PHOSPHORYLATION, <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> PHOSPHORYLATION, <400> 22 Cys Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Val Val Asn Val 1 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Ala Val Asn Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Tyr Ile Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Leu Glu Gly His Glu Glu Leu Val Arg 1 5 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Leu Val Val Ser Gly Ser Ser Asp Asn Thr Ile Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Ile Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Val Ile Ser Glu Gly Met Leu Trp Lys 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> PHOSPHORYLATION, <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> PHOSPHORYLATION, <400> 29 Asp Arg His Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met 1 5 10 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> PHOSPHORYLATION, <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> PHOSPHORYLATION, <400> 30 Asp Ser Gly Leu Asp Ser 1 5

Claims

인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는, SEQ ID NO:16에 열거된 시퀀스를 갖는 단리된 폴리펩티드.
인산화된 IκB에 결합하고 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 억제하는, SEQ ID NO:16의 시퀀스 중 아미노산 잔기 122-168이 결실된 시퀀스를 갖는 단리된 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 암호화는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 3항에 의한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 최소 10개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드.
제 3항 내지 제 5항 중에서 선택된 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제6항의 발현벡터로 형질전환(transformed) 되거나 트랜스펙션된 숙주세포.
(a) 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는, SEQ ID NO:16에 열거된 시퀀스를 갖는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드; 및

(b) 생리학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
(a) 인산화된 IκB에 결합하고 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 억제하는, SEQ ID NO:16의 시퀀스 중 아미노산 잔기 122-168이 결실된 시퀀스를 갖는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드; 및

(b) 생리학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
(a) 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는, SEQ ID NO:16에 열거된 시퀀스를 갖는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

(b) 생리학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
(a) 인산화된 IκB에 결합하고 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 억제하는, SEQ ID NO:16의 시퀀스 중 아미노산 잔기 122-168이 결실된 시퀀스를 갖는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및

(b) 생리학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
(a) 제 5항의 안티센스 폴리뉴클레오티드; 및

(b) 생리학적으로 허용되는 담체

를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
SEQ ID NO:16으로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는, 단리된 항체 또는 그들의 항원 결합 프래그먼트.
제 13항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체인 항체 또는 그들의 프래그먼트.
생리학적으로 허용되는 담체와 함께 제 13항의 항체 또는 그들의 프래그먼트를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
삭제
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삭제
(a) SEQ ID NO:16에 열거된 시퀀스를 갖는 인간 E3 유비큐틴 리가제 폴리펩티드를 후보약제(candidate agent)와 반응이 일어나기에 충분한 시간과 조건하에서 접촉시키는 단계;

(b) 후보 약제가 없는 경우에 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는 미리 결정된 폴리펩티드의 능력과 비교하여, 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는 폴리펩티드의 능력을 후속적으로 측정하는 단계; 및

그로부터 NF-κB 활성을 조절하는 약제를 식별하는 단계

를 포함하는, NF-κB 활성을 조절하는 약제를 스크리닝하는 방법.
제 19항에 있어서, 후보약제(candidate agent)는 조합 라이브러리(combinatorial library) 내에 있는 소분자인 방법.
인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시켜 NF-κB 활성을 조절하는, β-TrCP 단백질(SEQ ID NO:18)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
인산화된 IκB의 유비큐틴화를 억제하는, β-TrCP 단백질(SEQ ID NO:18) 중 아미노산 잔기 122-168이 결실된 β-TrCP 단백질(SEQ ID NO:18)을 포함하는 폴리펩티드를 치료적으로 유효한 양으로 포함하는, 염증성 질병, 자가면역질병, 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제 조성물.
삭제
a) β-TrCP 단백질(SEQ ID NO:18)을 포함하는 폴리펩티드를 후보약제(candidate agent)와 반응이 일어나기에 충분한 시간과 조건하에서 접촉시켜, 폴리펩티드가 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키도록 하는 단계;

b) 후보 약제(candidate agent)가 없는 경우에 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는 미리 결정된 폴리펩티드의 능력과 비교하여, 인산화된 IκB의 유비큐틴화를 증가시키는 폴리펩티드의 능력을 후속적으로 측정하는 단계; 및

그로부터 NF-κB 활성을 조절하는 약제를 식별하는 단계

를 포함하는, NF-κB 활성을 조절하는 약제를 스크리닝하는 방법.
제 24항에 있어서, 후보약제(candidate agent)는 조합 라이브러리(combinatorial library) 내에 있는 소분자인 방법.