CN102816743A

CN102816743A - 调节NF-κB的人遍在蛋白连接酶E3

Info

Publication number: CN102816743A
Application number: CN2012100910402A
Authority: CN
Inventors: 安东尼·M·曼宁; 弗兰克·默丘里奥; 沙伦·阿米特; 伊农·本-内里艾; 马蒂·戴维斯; 埃达·哈楚拜; 艾里斯·拉万; 亚伯拉罕·亚龙
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Signal Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Signal Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2012-12-12
Also published as: ES2361660T3; ATE499445T1; US20040203098A1; US20030166587A1; EP1135504B1; CN1346406A; WO2000034447A3; KR20020007284A; US8263326B2; KR20070050995A; IL187254A; WO2000034447A2; JP2002539766A; IL143516A0; AU779893B2; US20090233855A1; AU2004240212B2; AU2004240212A8; IL143516A; US20070208167A1

Abstract

本发明涉及调节NF-κB的人遍在蛋白连接酶E3。本发明提供了用于调节核因子κB(NF-κB)活化的组合物和方法。所述组合物包含一种或多种调节磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物质。这些组合物可用于治疗与NF-κB活化相关的疾病。调节剂包括人E3遍在蛋白连接酶、其抗体及其变体以及相关蛋白。

Description

调节NF-κB的人遍在蛋白连接酶E3

本申请是1999年12月9日提交的申请号为99814307.3(PCT/US99/29371)，发明名称为“调节NF-κB的人遍在蛋白连接酶E3”申请的分案申请。

技术领域

本发明在总体上涉及用于调节核因子κB(NF-κB)活化的组合物和方法。本发明具体地涉及调节磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化的物质，以及与NF-κB活化相关的疾病的治疗方法。本发明所使用的调节剂包括E3遍在蛋白连接酶、其部分及其变体。

发明背景

NF-κB是一种转录因子，它在针对免疫、炎症及急性期的应答基因(包括白细胞介素1、白细胞介素8、肿瘤坏死因子和某些细胞粘附分子)所观察到的基因表达的高特异模式中起关键作用。如同转录激活因子Rel家族的其他成员，NF-κB以非活化形式被隔离在大多数细胞类型的胞质中。包括促细胞分裂原、细胞因子、抗原、应激诱发剂、UV光和病毒蛋白在内的多种细胞外刺激物引发信号转导途径，该途径最终导致NF-κB的释放和活化。

重要的NF-κB活化调节剂是抑制剂蛋白IκBα和IκBβ(在此称作IκB)，它们与未受激细胞的胞质中的NF-κB结合(并因此失活)。在发生信号引导的IκB磷酰化之后，发生NF-κB的活化和核易位，这导致经遍在蛋白途径发生蛋白质的水解。对于IκBα，刺激诱发的在第32和36位丝氨酸上的磷酰化使所述抑制剂成为在第21和22位赖氨酸上遍在蛋白化的目标靶，而这将导致降解。与之相似，IκBβ在第19和23位丝氨酸上的磷酰化使所述抑制剂成为在第9位赖氨酸上遍在蛋白化的目标靶。然而，还没有鉴定出介导IκB识别的遍在蛋白系统的成分。

蛋白经遍在蛋白途径的降解通过两个非连续和连续步骤进行：(a)多个遍在蛋白分子共价附着到蛋白底物上，和(b)通过26S蛋白体复合物降解靶蛋白。遍在蛋白途径包含了多种成分，这些成分以分级方式共同发挥作用(综述参见Ciechanover，Cell 79：13，1994；Hochstrasser，Curr.Op.Cell.Biol.7：215，1995；Jentsch and Schlenker，Cell 82：881，1995；Deshaies，Trends Cell Biol.5：428，1995)。单一E1酶是一个这样的成分，它进行遍在蛋白的激活。在哺乳动物细胞、植物和酵母中分析表征了一些主要的E2酶。E2酶可能与连接酶E3结合(Reiss and Hersko，J.Biol.Chem.265：3685，1990；Dohmen et al.，Proc.Natl，Acad，Sci.USA88：7351，1991)，似乎每种E2酶都能与一种或多种E3蛋白作用(Nuberet al.，J.Biol.Chem.271：2795，1996；Orian et al.，J.Biol.Chem.270：21707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.15：7106，1995；Gonenet al.，J.Biol.Chem.271：302，1996)。

已经被描述过的E3酶(遍在蛋白连接酶)很少。哺乳动物E3α(酵母中的UBR1)和E3β通过它们的游离N端氨基酸残基来识别蛋白底物(“N末端规则”；Varshavsky，Cell 69：725，1992；Hershko and Ciechanover，Ann.Rev.Biochem.61：761，1992)。Cdc53可能是一种参与靶向磷酰化G1细胞周期蛋白的E3(Willems et al.，Cell 86：453，1996)。E6-AP参与对p53的识别(Scheffner et al.，Cell 75：495，1993)，已经鉴定了一系列独特的E6-AP同源蛋白(Huibregtse et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：2563，1995)：Nedd4参与上皮Na⁺通道的降解(Staub et al，Embo J.15：2371，1996)，RSP5(NIP1)参与通透酶Gap1和Fur1的示踪(Hein et al.，Mol.Microbiol.18：77，1995)，而Pub1靶向Cdc25(Nefsky and Beach，EMBO J.15：1301，1996)。最近分离的一些其他E3酶似乎参与肌蛋白c-Fos的降解，并参与NF-κB前体p105的加工(Orian et al.，J.Biol.Chem.270：21707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.15：7106，1995；Gonenet al.，J.Biol.Chem.271：302，1996)。因此看来，所述连接酶是个大的且其中大部分未阐明的酶家族，并且，除了“N末端规则”连接酶(E3α和E3β)的识别方式之外，尚没有鉴定出遍在蛋白系统的所有其他已知底物的识别基元。

因此，本领域需要提高对IκB经遍在蛋白途径降解的理解，并需要鉴定出此降解过程的调节剂，以将其用于治疗与NF-κB活化相关的疾病。本发明满足了这些需要并进一步提供其他有关优势。

发明概述

简要地说，本发明提供通过调节磷酰化IκBα和/或IκBβ的遍在蛋白化而调节核因子κB(NF-κB)活化的组合物和方法。一方面，本发明提供了分离的人E3遍在蛋白连接酶多肽。这些多肽可包括SEQ ID NO：16所示的人E3遍在蛋白连接酶序列、其部分或者其变体，所述变体的区别在于一个或多个氨基酸的替换、插入、缺失和/或添加，以致多肽(a)增强了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用或者(b)与磷酰化IκB结合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。在某些实施方案中，这样的一个多肽可具有SEQ ID NO：16或所示的序列其变体，该变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：16氨基酸残基上发生一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，以致多肽增强了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。在进一步的实施方案中，这样的一个多肽可包括人E3遍在蛋白连接酶的一部分或这一部分的变体，其中所述部分与磷酰化IκB结合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。

另一方面，本发明进一步提供分离的编码上述多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，这样的多核苷酸可编码上述人E3遍在蛋白连接酶的一部分或这一部分的变体。也提供了包含与所述多核苷酸互补的至少10个连续核苷酸的反义多核苷酸。进一步提供了包含所述多核苷酸的表达载体以及用该表达载体转化或转染的宿主细胞。

本发明更进一步提供包含与生理上可接受的载体相结合的上述多肽或多核苷酸的药物组合物。

此外，本发明提供分离的抗体及其抗原结合片段，它们和具有SEQID NO：16所示序列的人E3遍在蛋白连接酶相结合。这样的抗体可以是单克隆抗体。

本发明更进一步提供包含与生理上可接受的载体相结合的上述抗体或片段的药物组合物。

本发明进一步提供调节患者NF-κB活性的方法，包括给患者施用上述药物组合物。

更进一步，本发明提供治疗患有与NF-κB活化相关的病症的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的上述药物组合物，由此治疗与NF-κB活化相关的病症。所述病症包括炎症、自身免疫性疾病、癌症和病毒感染。

本发明进一步提供调节NF-κB活性的物质的筛选方法，包括以下步骤：(a)使候选物质与人E3遍在蛋白连接酶多肽接触，其中多肽包含SEQ ID NO：16所示序列或者其部分或变体，所述变体的区别在于一个或多个氨基酸的替换、插入、缺失和/或添加，以致多肽增强了磷酰化IκB的遍在蛋白化作用，该接触条件和时间足以使多肽和候选物质相互作用；和(b)随后评价相对于预先确定的在不存在候选物质时多肽增强磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力，多肽增强磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力；由此识别出调节NF-κB活性的物质。用于此筛选的候选物质包括但不仅限于组合文库中的小分子。

参照以下具体说明和附图，本发明的上述方面及其他方面将变得很明显。如同每篇文献分别引入一样，所有在此公开的文献以全文引入作为参考。

附图简述

图1A-1D是放射自显影图，其描绘了在各种IκB E3识别基元存在或不存在的条件下进行的遍在蛋白化实验的SDS-PAGE分析结果。除非另外指明，底物是³⁵S-标记的、以HA示踪的IκB多肽，该多肽是经磷酰化的并与NF-κB复合物结合。

在图1A中，泳道1显示在32和36位置上含有丙氨酸残基的IκBα多肽(S32/36A；SEQ ID NO：13)的遍在蛋白化作用，泳道2显示未磷酰化的野生型IκBα多肽(SEQ ID NO：12)的遍在蛋白化作用。在泳道3-14中，遍在蛋白化底物是野生型IκBα多肽(SEQ ID NO：12)。在泳道3中，在ATP不存在的条件下进行遍在蛋白化；在泳道4-14中，在ATPγS存在的条件下使用(泳道5-14)或不使用(泳道4)IκB E3识别基元或其他肽进行反应。所示肽为：400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道5)；400μM第32、36位丝氨酸被替换为丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO：11)，泳道6)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9)，泳道7)；400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO：9)，泳道8)；100μM单磷酰化的IκBα肽(ppS32(SEQ ID NO：9)，泳道9；ppS36(SEQID NO：9)，泳道10)；和40μM较短的、二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQID NO：8)，泳道11)；pp15(SEQ ID NO：7)，泳道12；pp11(SEQ ID NO：6)，泳道13；pp7(SEQ ID NO：5)，泳道14)。

在图1B中，遍在蛋白化底物是游离的野生型IκBα(SEQ ID NO：12，泳道1-3)或游离的S32/36A替换的IκBα(SEQ ID NO：13，泳道4-6)。在ATPγS不存在(泳道1和4)或存在(泳道2、3、5和6)的条件下进行反应。将40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9)加入泳道3和6所示样品的偶联反应混合物中。

在图1C中，显示在HeLa提取物中大量细胞蛋白的遍在蛋白化。泳道1显示在ATP不存在的条件下的遍在蛋白化，泳道5显示在ATP存在的条件下的遍在蛋白化。在泳道3-5中，加入了IκB E3识别基元或其他肽：40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9)，泳道2)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道3)；和400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO：9)，泳道4)。

在图1D中，遍在蛋白化底物是磷酰化(泳道2-7)或未磷酰化(泳道1)的野生型IκBβ(SEQ ID NO：14)。在ATPγS不存在(泳道2)或存在(泳道1，3-7)的条件下使用(泳道4-7)或不使用(泳道1-3)IκB E3识别基元或其他肽来进行反应。所示肽为：40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQID NO：9)，泳道4)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道5)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO：8)，泳道6)；和400μM未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO：9)，泳道7)。

图2是放射自显影图，其描绘了使用受激HeLa细胞提取物进行的体外遍在蛋白依赖型降解实验的结果。在SDS-PAGE的每个泳道中，显示的是在降解实验后磷酰化(上带)和未磷酰化(下带)的以HA示踪的IκBα多肽(SEQ ID NO：12)的水平。泳道1显示这些多肽在不使用ATP进行的降解实验后的水平。在泳道2-6中，在反应混合物中包括了ATP。将40μM候选调节剂加入泳道3-6所示的反应：二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9)，泳道3)；二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO：8)，泳道4)；c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道5)；和未磷酰化的IκBα肽(p21(SEQ ID NO：9)，泳道6)。

图3A是放射自显影图，其描绘了使用HeLa细胞溶胞产物的分级流通级分进行的遍在蛋白化实验的SDS-PAGE分析结果，所述HeLa细胞溶胞产物经调节剂柱进行分级分离。在所有情况下，底物是³⁵S-标记的、以HA示踪的IκBα多肽(SEQ ID NO：12)，该多肽是经磷酰化的并与NF-κB复合物结合。泳道1显示使用未分离提取物的遍在蛋白化水平。在泳道2-9中，提取物经肽-琼脂糖凝胶柱进行分级分离。使用的肽为：c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道2)；第32、36位丝氨酸被替换为丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ ID NO：11)，泳道3)；二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9)，泳道4-6)；二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ ID NO：8)，泳道7-9)。另外，将网状细胞的级分II(160μg)加入泳道5和8所示的遍在蛋白化反应中，将级分I(160μg)加入泳道6和9中的反应。

图3B是放射自显影图，其显示了在HeLa细胞中大量细胞蛋白的遍在蛋白化作用。泳道1显示在ATP不存在的条件下的遍在蛋白化，泳道2显示在ATP存在但无候选调节剂的条件下的遍在蛋白化。在泳道3-6中，加入了候选调节剂：40μM二磷酰化的IκBα肽(pp19(SEQ IDNO：8)，泳道3)；400μM c-Fos磷酸肽(ppFos(SEQ ID NO：10)，泳道4)；400μM第32、36位丝氨酸被替换为丙氨酸的IκBα肽(pp21S/A(SEQ IDNO：11)，泳道5)；40μM二磷酰化的IκBα肽(pp21(SEQ ID NO：9，泳道6)。

图4A-4F是显微照片，其显示了候选调节剂对的核NF-κB易位的影响。在图4A-C中，pp21(图4A和4B)或ppFos(图4C)被显微注射入HeLa细胞的胞质中。接着立即用TNFα激活细胞并用抗p65的抗体对细胞进行免疫染色。在图4D-F中，pp21(图4D)或ppFos(图4F)被注射入人血管上皮细胞(HUVEC)的胞质中。接着立即用TNFα活化细胞并用抗E-选择蛋白的抗体对细胞进行免疫染色。图4E是图4D的相差显微照片。在每个显微照片中，注射的细胞用大箭头标出。在图4D和4E中，未注射的E-选择蛋白阴性细胞用小箭头标出。

图4G和4H呈现图4A-4F所示显微注射实验的概略。在图4G中显示了表现出核p65染色的HeLa细胞百分数。使用pp21和ppFos分别显微注射90和42个细胞。图4H显示了表现出E-选择蛋白染色的HUVEC的百分数。使用pp21和ppFos分别显微注射160和36个细胞。对于每一张图，柱1显示在IκB E3识别基元或其他肽以及TNFα活化不存在时的水平。柱2-4显示了在肽不存在(柱2)或者pp21存在下(柱3)或ppFos存在下(柱4)在TNFα激活后的水平。

图5是放射自显影图，其描绘了Western印迹分析结果，该Western印迹分析显示来自TNFα活化细胞的pIκBα相关性遍在蛋白-连接酶活性的免疫沉淀。将pIκBα/NF-κB复合物从蛋白体受抑制的、受TNFα刺激的或未受激的HeLa细胞中免疫沉淀出来，并通过遍在蛋白、ATP-γS和以下成分的加入进行体外的遍在蛋白化，所述成分为：泳道1，UBC5C；泳道2，UBC5C和E1；泳道3，无；泳道4-6，UBC5C和所标示的E1；泳道7，UBC5C、E1和pIκBα-肽；泳道8，UBC5C、E1和丝氨酸被替换的IκBα肽；泳道9，受TNFα刺激的HeLa溶胞产物样品。细胞刺激示于TNFα行。在图的左边、底部和顶部标出了单体及与遍在蛋白偶联的IκBα。

图6是放射自显影图，其说明当IκBα在DSGLDS(SEQ ID NO：8和19)位点发生IKK磷酰化后，遍在蛋白-连接酶和IκBα/NF-κB复合物的相关性。从未活化的细胞中免疫纯化出³⁵S标记的IκBα/NF-κB复合物。该复合物用IKK-2EE磷酰化(在上方用+标出)，作为E3源与未活化的HeLa溶胞产物一起温育，洗涤，并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C(除非被排除的成分由Abst Ub-Enz指明)的存在下在体外进行遍在蛋白化。泳道2-7显示由IKK产生的磷酰化；泳道1和3-7显示与HeLa溶胞产物一起温育的影响；在泳道4中，在与HeLa溶胞产物一起温育的过程中加入了pIκBα肽；在泳道5中，在HeLa温育的过程中加入了丝氨酸被替换的IκBα肽；在泳道6中，将E1从遍在蛋白化阶段中省去；在泳道7中，在遍在蛋白化过程中将UBC5C省去。

图7A和7B说明与遍在蛋白-连接酶活性相关的IκBα结合蛋白的识别。图7A显示SDS-聚丙烯酰胺凝胶样品的胶体蓝染色，所述样品为含有IκBα/NF-κB和相关蛋白的经免疫纯化的级分。IκBα/NF-κB复合物用IKK-2EE磷酰化(泳道2、3)或模拟磷酰化，并用于吸附来自HeLa溶胞产物的遍在蛋白-连接酶(泳道1、2)。在右边指出了分子大小标准参照物(kD)。在左边指出了通过质谱分析鉴定的蛋白。在左侧用括号标出对应于与遍在蛋白-连接酶活性相关的带(p54和p58)的凝胶位置。图7B是吸附到pIκBα/NF-κB上的蛋白的放射自显影图，其中所述pIκBα/NF-κB来自³⁵S标记的HeLa细胞。放射性标记的HeLa溶胞产物与IKK磷酰化的、抗体固定化的IκBα/NF-κB复合物一起温育。然后，洗涤免疫复合物，进行洗脱，用SDS-PAGE和放射自显影方法对其进行并分析。泳道1显示与HeLa溶胞产物一起温育的未磷酰化的IκBα/NF-κB复合物；泳道2-4显示在不存在(泳道2)或存在pIκBα肽(泳道3)或丝氨酸被替换的IκBα肽(泳道4)的条件下与HeLa溶胞产物一起温育的磷酰化IκBα/NF-κB复合物。在左边指出的是分子大小标准参照物(kD)、Rel A和IκBα带；在右边指出的是四个与pIκBα相关的带，其中三个用pIκBα肽展示(箭头)。

图8A-8D显示与遍在蛋白-连接酶相关的p54的质谱分析结果。图8A显示未分离的胰蛋白酶肽混合物的纳电子喷射质谱(nanoelectrospray mass spectrum)，其中所述混合物来自从连接酶阳性泳道(等价于图7B中的泳道2)切下的54kD凝胶带。将箭头所标的峰打碎并将其鉴定为由β-TrDP衍生的肽。横条指示在C中放大的区域。图8B和8C显示与遍在蛋白-连接酶活性相关(C)或不相关(B)的54kD带的纳电子喷射谱的比较。选择m/z为714.38的肽测序。图8D为在图8C中鉴定的肽的碎片谱。从一系列二价碎片离子中装配出序列标志，在nrdb数据库中搜索相符的模式。将针对检索到的β-TrCP序列AAVNVVDFDDKYIVSASGDR(SEQ ID NO：20)而计算出的碎片质量与全部碎片谱比较，以证实二者相符。用圆圈标出与预期碎片离子相符的峰。

图9A和9B表示编码人E3遍在蛋白连接酶的多核苷酸序列(SEQID NO：15)。

图10表示人E3遍在蛋白连接酶蛋白序列(SEQ ID NO：16)。

图11A-11C是Western印迹，其说明E3遍在蛋白连接酶家族成员的结合特异性和遍在蛋白化特异性。在这些图中，mβ-TrCP指小鼠β-TrCP，hβ-TrCP指人β-TrCP，Δβ-TrCP指缺失了F盒区域的人β-TrCP，Slimb指果蝇Slimb蛋白。图11A说明与pIκBα的选择性结合。利用FLAG抗原决定簇将蛋白从被转染的293T细胞中免疫沉淀出来，将该蛋白与经免疫纯化的IκBα/NF-κB复合物一起温育，所述复合物已进行过指定处理(-/+IKK)，并利用所指明的抗体通过Western印迹来分析已结合的物质。该图的上部显示特异性pIκBα结合；中部显示10％底物流通；下部为经免疫沉淀的蛋白的印迹；在左边指出了分子大小标准参照物(kD)。图11B显示，β-TrCP-pIκBα的结合被磷酸肽废除，所述磷酸肽为pIκBα降解基元¹(pp10)，而不被有关的未磷酰化肽(pS/A)废除。图11C说明由E3家族成员蛋白产生的pIκBα体外遍在蛋白化。将经免疫纯化的以FLAG示踪的蛋白与³⁵S标记的IκBα/NF-κB复合物一起温育，进行指定处理(-/+IKK)并在ATPγS、遍在蛋白、E1、UBC5C的存在下进行遍在蛋白化。在左边指出了IκBα底物(由全长的两个降解产物组成)、pIκBα-多遍在蛋白偶联物和分子大小标准参照物。

图12A和12B说明Δβ-TrCP的过度表达对IκBα降解和NF-κB活化的抑制，Δβ-TrCP是一种显性阴性分子。图12A显示在受P/I刺激的Jurkat细胞中的κB依赖型荧光素酶实验结果，其中所述Jurkat细胞是用κB-Luc报告基因质粒和指明的表达载体(即，从左至右分别是：仅载体、编码人β-TrCP的载体、缺失了F盒区域的编码人β-TrCP的载体以及编码果蝇Slimb蛋白的载体)转染的。NF-κB活性显示为相对(倍数)的荧光素酶活性，并以未受激的空FLAG载体作为参照(单倍)。图12B显示IκBα的Western印迹分析结果，其中IκBα为佛波酯和受Ca⁺[P/I]刺激和未受激Jurkat细胞的IκBα，且所述Jurkat细胞是用空FLAG载体或Δβ-TrCP转染的。图中指出了刺激后的间隔(分钟)。

发明详述

如上所述，本发明总体上涉及有效用于调节核因子κB(NF-κB)活化和治疗与NF-κB活化相关的疾病的组合物和方法。本发明具体地涉及调节磷酰化IκB(即，IκBα和/或IκBβ)遍在蛋白化的物质。该遍在蛋白化导致NF-κB的释放和活化。

本发明部分基于对一种人E3遍在蛋白连接酶的鉴定和表征，该人E3遍在蛋白连接酶识别磷酰化的和与NF-κB相关的IκB。多肽(包括人E3遍在蛋白连接酶以及其一部分或其他变体)可用于调节NF-κB在体外和在患者中的活性。这样的多肽可用于例如对可用于调节NF-κB活性的物质(如小分子)进行识别，以及用于治疗与异常的NF-κB活化相关的疾病。

人E3遍在蛋白连接酶多肽和多核苷酸

在本发明中，已发现作为54kD蛋白迁移的人E3遍在蛋白连接酶与磷酰化IκBα(磷酰化IκBα在此也叫做pIκBα)结合，并增强其遍在蛋白化。在图9和SEQ ID NO：15中提供了编码人E3遍在蛋白连接酶的多核苷酸的序列；在图10和SEQ ID NO：16中提供了全长人E3遍在蛋白连接酶的蛋白序列。在本发明中还发现，人E3遍在蛋白连接酶是F盒/WD蛋白家族的成员，该家族包括β-TrCP(Margottin et al.，Mol.Cell1：565-574，1998)和果蝇Slimb蛋白(参见Jiang and Struhl，Nature391：493-496，1998)。如下所具体描述，此家族的其他成员共同具有E3的某些特性，并可在使用E3的本发明方法中使用这样的蛋白及其变体。

本发明所述人E3遍在蛋白连接酶包括天然的人E3遍在蛋白连接酶(在本文中也称作“E3”)以及其一部分或其他变体。E3变体与天然E3可在序列上存在差别，该差别可以源自一个或多个氨基酸的替换、缺失、添加和/或插入，如本发明所述，只要所述变体能与本发明所述IκB多肽结合并增强其遍在蛋白化。优选E3变体包含在不超过20％、优选不超过15％、更优选不超过10％的SEQ ID NO：16所示残基上发生的氨基酸替换。变体进一步包括截短的多肽和含有附加氨基酸序列的多肽，这些附加氨基酸序列对所述多肽活性的影响极小。人E3遍在蛋白连接酶多肽可以具有任何长度，其条件是它保留所述特性。换言之，这样的多肽可以是寡肽(即由相对较少的通过肽键连接的氨基酸残基构成，例如具有8-10个残基)、全长蛋白(或其变体)或具有中等大小的多肽(例如20、50、200或400个氨基酸残基)。

某些变体包含保守替换。在“保守替换”中，是用一个氨基酸替换另一个具有相似性质的氨基酸，从而肽化学领域的技术人员可预测出多肽的二级结构和亲水性实质上未改变。通常可基于残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性上的相似来进行氨基酸的替换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的极性头部基团(具有相似亲水性值)的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守性改变的其他氨基酸组包括：(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；(2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；(3)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。变体也可(或作为一种选择)包含非保守变化。也可(或作为一种选择)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性影响极小的氨基酸的删除或添加来对变体进行修饰。

如上所述，某些E3多肽可在氨基和/或羧基末段含有附加的氨基酸序列。例如，可将E3序列偶联到位于蛋白N末端的信号(或前导)序列上，该信号(或前导)序列以共翻译方式或以翻译后方式指导所述蛋白的转移。也可(或作为一种选择)将多肽偶联到接头或其他序列上，以易于进行多肽(如多组氨酸)的合成、纯化和鉴定，或者用于增强多肽和固相载体的结合。例如，可将多肽连接到免疫球蛋白的Fc区。

使用本领域普通技术人员所公知的任何结合实验，可容易地确定E3多肽与磷酰化IκB结合的能力。例如，可将IκBα/NF-κB复合物与固定的E3多肽一起温育，并(例如在Western印迹中)使用抗IκBα的抗体评价IκBα的结合水平。在这样的实验中，E3多肽应可测地结合IκBα；优选相对于天然人E3，所述E3多肽的结合水平基本上没有减少。换言之，相对于天然多肽，变体可测地结合磷酰化、复合化的IκBα的能力可以增强或不变，或者，相对于天然多肽，发生少于50％、优选少于20％的降低。很明显，可在这些实验中用其他合适的底物替换pIκBα/NF-κB复合物。

正如本发明所述，E3多肽增强磷酰化IκB遍在蛋白化的能力可通过以下步骤进行评估：使多肽与IκBα/NF-κB复合物、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起温育，利用IκBα的特异性抗体通过Western印迹测定缓慢移动的IκBα-遍在蛋白偶联物。通常，在这一实验中，E3多肽应产生可测水平的遍在蛋白化；优选相对于由近似量的天然人E3产生的遍在蛋白化水平，上述遍在蛋白化的水平基本上没有减少。

本发明还涉及包含了E3的一部分或其他变体的多肽，所述E3的一部分或其他变体保留了与磷酰化IκB结合的能力，但未保留增强IκB遍在蛋白化的能力。使用本发明提供的结合实验和遍在蛋白化实验可容易地识别该多肽，且通常可将其用于抑制IκB的遍在蛋白化。这样的多肽包括缺失了F盒区域(即与遍在蛋白级联物的一种或多种成分相互作用的蛋白区域)的多肽。通常可功能性地识别F盒区域(即，由F盒区域缺失所形成的蛋白导致在遍在蛋白机制中补充了合适的成分)，它通常是建立在F盒区域共有序列的基础上(参见Patton et al.，Trends inGenet.14：236-243，1998)。某些所述的多肽包含了SEQ ID NO：16的氨基酸122-168的缺失。在某些实施方案中，E3的一部分可包含SEQ IDNO：16所示序列的10-374个，优选50-250个连续氨基酸残基。

本发明进一步提供编码所述E3多肽的多核苷酸。本发明包括任何编码本发明所述多肽、其一部分或变体的多核苷酸。这些多核苷酸可以是单链的(编码或反义多核苷酸)或双链的，可以是DNA分子(基因组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。在本发明的多核苷酸中可以但不必须存在有附加的编码或非编码序列，可以但不必须将多核苷酸连接到其他分子和/或载体上。

可使用本领域普通技术人员熟知的各种杂交或扩增技术中的任一技术来分离编码人E3或其一部分的天然DNA序列。在这些技术中，可基于本发明提供的E3序列来设计探针或引物，并可购买或合成这些探针或引物。可筛选来自任何合适组织的文库。接着可利用熟知的技术使用已扩增的一部分或部分的cDNA分子从基因组DNA文库或从cDNA文库中分离全长基因。另外，可由多个PCR片段构建全长基因。本发明具体包括包含这些序列的一部分或全长多核苷酸、全长多核苷酸的其他部分以及与这些全长分子的全部或一部分互补的序列。此外，本发明具体涉及了来自其他物种的同源体，并通常如本发明所述制备这些同源体。

具有所述序列的多核苷酸变体与天然E3多核苷酸的区别在于一个或多个替换、缺失、插入和/或添加。优选的变体包含在不超过20％、优选在不超过10％的核苷酸位置上的核苷酸替换、缺失、插入和/或添加。某些变体基本上与天然基因或其部分同源或互补。这样的多核苷酸变体能够在中等严格的条件下杂交到天然存在的编码E3蛋白的DNA序列(或互补序列)上。合适的中等严格的条件包括在由5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA组成的溶液(pH 8.0)中预洗涤；在50-65℃下在5X SSC中杂交过夜；接着在65℃用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中各洗涤两次，每次20分钟。这样的杂交DNA序列也属于本发明的范围。

本发明的普通技术人员将意识到，作为遗传密码简并的结果，编码本发明所述多肽的核苷酸序列是许多的。这些多核苷酸中的一些与由任何天然基因构成的核苷酸的同源性极小。虽然如此，本发明仍具体包括由于密码子使用的不同而变化的多核苷酸。

如上所述，本发明进一步提供反义多核苷酸和具有任何上述序列的部分。通常可利用任何本领域公知的方法制备这些多核苷酸，包括例如固相的氨基磷酸酯化学合成法。另外，也可通过DNA序列在体外或体内的转录来产生RNA分子，所述DNA序列被引入载体，使之位于合适的RNA聚合酶启动子(例如T3、T7或SP6)的下游。如本文所述，也可将多核苷酸的某些部分用于制备被编码的多肽。另外，多核苷酸的一部分也可作为探针(例如用于测定E3在样品中的表达)，并可利用各种报告基团如放射性核素、荧光染料和酶标记此部分。这些部分的优选长度为至少10个核苷酸，更优选至少20个核苷酸。在某些优选的实施方案中，作为探针使用的部分包含E3基因特有的序列。也可将与编码序列互补的序列(即反义多核苷酸)的一部分用作探针或用于调节基因的表达。也可将可被转录成反义RNA的DNA构建体引入细胞或组织中，以便产生反义RNA。

可以进一步修饰任何多核苷酸以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于，在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶连接；和/或包括非传统碱(如肌苷、queosine和wybutosine)以及乙酰基、甲基、硫代和其他修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

可使用已知的重组DNA技术将本文所述的多核苷酸连接到各种其他核苷酸序列上。例如，可将多核苷酸克隆进多种克隆用载体中的任一种中，所述克隆用载体包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和装配型质粒。特殊目的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。通常，载体将含有在至少一种生物体中起作用的DNA复制起始点、便利的限制性内切酶位点和一种或多种可选标志。也可存在附加的起始、终止和/或间插DNA序列，其例如方便易于表达的载体的构建。可购得或利用本领域熟知的方法从所述序列组装得到合适的载体。在载体中可能存在的其它元件取决于所需用途，这些元件对于本领域普通技术人员是显而易见的。

通常可以通过本领域熟知的方法将此处所述的载体转染到合适的宿主细胞例如哺乳动物细胞中。这些方法包括磷酸钙沉淀、电穿孔和显微注射。

通常，可使用标准自动化合成技术来制备E3多肽，或者利用编码目的多肽的重组DNA的表达来制备这些多肽。可使用引入氨基酸和/或氨基酸类似物的标准技术来合成肽。在合成过程中，可以根据需要，使用例如叔丁基二碳酸酯(t-butyldicarbonate，t-BOC)基团或芴基甲氧羰基(FMOC)来保护氨基酸和/或氨基酸类似物的活性基团。氨基酸和/或氨基酸类似物可以商业购得(例如，Sigma Chemical Co.；AdvancedChemtec)或通过本领域公知方法合成。肽可以使用固相方法来合成，其中肽被附着到树脂上，例如4-methylbenzhydrylamine(MBHA)、4-(羟甲基)-苯乙酰氨基甲基-和4-(羟甲基)-苯氧甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)(Wang树脂)等树脂上(所有这些均可商业购得)；或附着到对硝基苯基苯甲酮肟聚合物上(肟树脂)，其可如De Grado和Kaiser所述(J.Org.Chem.47：3258，1982)进行合成。本领域的技术人员将意识到氨基酸和/或氨基酸类似物的选择将部分取决于所需的特定物理、化学或生物学特性。可通过给药方法和患者体内的靶位点来部分地确定这些特性。

肽反应基团的选择性修饰还可以产生有利的特性。可以在肽仍附着于树脂上的同时对它进行处理，以获得N端修饰的化合物如乙酰化的肽，或使用氟化氢或等价的切割剂将肽从树脂上切下，然后对其修饰。可在从树脂上切下之后或有时在溶液相合成之前，对合成的含有C端羧基的化合物(Wang树脂)进行修饰。肽的N端或C端修饰方法是本领域所熟知的，包括例如N端的乙酰化或C端的酰胺化。类似地，氨基酸或氨基酸类似物侧链的修饰方法是肽合成领域技术人员所熟知的。对肽反应基团的修饰的选择取决于所需特性。

E3多肽也可以是环肽。可以通过在例如肽的N端的氨基基团与C端的羧基基团之间诱导共价键的形成来获得环肽。也可以通过在末端反应基团与反应性氨基酸侧链之间或在两个反应侧链之间形成共价键来获得环肽。根据所需特性选择环肽对于本领域技术人员来说是显而易见的。例如，环肽可以在体内使稳定性增加、溶解性增加、免疫原性降低或者清除率降低。

可使用例如反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法或其他基于大小或电荷的分离方法来纯化新合成的肽。而且，可使用这些方法或其他已知方法来表征经纯化的肽，其他已知方法例如有氨基酸分析和质谱分析法。

另外，也可使用熟知的技术由目标多肽的编码核酸来制备多肽。可使用分离的eDNA来制备内源性蛋白。为制备变体多肽，可使用标准诱变技术，例如寡核苷酸定向的位点特异性诱变，并可除去DNA序列的片段以制备截短的多肽。

通常，可将任一种本领域普通技术人员公知的表达载体用于表达本发明的重组多肽。表达可在任何适宜的被表达载体转化或转染的宿主细胞中完成，其中所述表达载体含有编码重组多肽的DNA序列。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、杆状病毒感染的昆虫细胞和动物细胞。在表达后，可首先使用商业可得的滤膜来浓缩来自宿主/载体系统的上清液，所述宿主/载体系统将蛋白或多肽分泌到培养基中。在浓缩后，可将浓缩液施用到合适的纯化基质中，纯化基质例如为亲合性基质或离子交换树脂。可使用一步或多步反相HPLC，以进一步纯化重组多肽。

通常，本文所述多肽和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是被从其原始环境中取出的。例如，如果将天然形成的蛋白从自然体系的一些或全部共存物质中分离出来，则所获得的天然形成的蛋白是分离的。优选将本发明提供的多肽分离到纯度为至少80％(按重量计)，更优选分离到纯度为至少95％(按重量计)，最优选分离到纯度为至少99％(按重量计)。通常，可使用例如标准技术硫酸铵分级分离、SDS-PAGE电泳和亲合层析来完成该纯化。如果例如将多核苷酸克隆到并非自然环境一部分的载体中，则认为该多核苷酸是分离的。

抗体

本发明进一步提供与E3多肽特异性结合的抗体和其抗原结合片段。如果本文使用的抗体或抗原结合片段(例如在ELISA中)以可测水平与多肽反应且不与无关蛋白发生可测的反应，则称这些抗体或抗原结合片段与多肽“特异性结合”。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。优选的抗体是在本发明所述遍在蛋白化实验中抑制或阻断E3活性的抗体。其他所选的抗体(其可用于例如免疫激酶实验中)是免疫沉淀活性E3的抗体，所述活性E3使用任何标准实验(例如本发明提供的实验)进行检测。

可通过本领域普通技术人员公知的各种技术制备抗体(参见，例如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。在一种这样的技术中，一开始将包含多肽的免疫原注射到合适的动物体内(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)，优选按照预定的包括了一次或多次加强免疫的时间表进行注射，对动物定期取血。接着，通过例如亲合层析并使用偶联到合适固相载体上的多肽，从这些血清中纯化出多肽的特异性多克隆抗体。

单克隆抗体的制备例如可使用Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)及其改进方法。简言之，这些方法包括制备能产生具有所需特异性(即，与目的多肽的反应性)的抗体的无限增殖细胞系。这些细胞系可从例如上述免疫的动物脾细胞中得到。接着，通过例如和骨髓瘤细胞融合，优选和与免疫动物同系的骨髓瘤细胞融合，来无限增殖该脾细胞。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可与非离子型去垢剂结合数分钟，然后以低密度接种到选择性培养基中，该培养基支持杂交细胞的生长，而不支持骨髓瘤细胞的生长。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)选择。充足的时间通常约为1-2周。在这之后，观察到杂交细胞群落。可选择出单一的群落并检测其针对多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。

单克隆抗体可从生长中的杂交瘤克隆的上清液中分离。另外，可使用多种技术来提高产量，例如将杂交瘤细胞注射入合适的脊椎动物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后，可从腹水或血液中收获多克隆抗体。可利用常规技术将杂质从抗体中去除，所述常规技术例如为层析、凝胶过滤、沉淀和提取。

在某些实施方案中，优选使用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，其可使用标准技术制得。简言之，可通过A蛋白珠柱的亲合层析将免疫球蛋白从兔血清中提纯(Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白以得到Fab和Fc片段。Fab和Fc片段可通过例如A蛋白珠柱上的亲合层析得以分离。

遍在蛋白化实验

如上所述，E3多肽调节磷酰化IκB遍在蛋白化的能力可通过以下途径得以评估：将多肽与IκBα/NF-κB复合物(或其他合适的底物)、ATPγS、遍在蛋白E1、遍在蛋白E2一起温育，并通过例如Western印迹使用IκBα的特异性抗体来检测IκBα-遍在蛋白偶联物。用于此处所述遍在蛋白化实验的IκB多肽可以是天然人IκBα(SEQ ID NO：1)或IκBβ(SEQ ID NO：3)，或者可以是天然蛋白的变体。通常对IκB的多肽变体进行修饰，以便使该变体在此处所述遍在蛋白化实验中被磷酰化和遍在蛋白化的能力基本上没有降低。可标记IκB多肽。例如，使用标准技术，通过在体外多肽在³⁵S-蛋氨酸存在下的翻译，可将³⁵S引入IκB多肽。

通常，可使用体外系统如麦芽提取物，通过DNA在培养的宿主细胞中的表达或通过翻译，从编码该多肽的DNA制备IκB多肽。如果使用宿主细胞，该细胞优选是细菌、酵母、杆状病毒感染的昆虫细胞或哺乳动物细胞。使用本领域普通技术人员熟知的技术，可将重组DNA克隆进任何适合在所述宿主细胞中使用的表达载体中。通常可按照制造商的指示，进行多肽的体外翻译。

在体外翻译后，无需纯化即可使用表达的IκB多肽。多肽也可以是以基本上纯的形式分离的。可将IκB多肽分离到纯度为至少80％(按重量计)，更优选分离到纯度为至少95％(按重量计)，最优选分离到纯度为至少99％(按重量计)。通常，可使用例如本文所述的典型纯化方法或者硫酸铵分级分离、SDS-PAGE电泳和亲合层析的标准技术来完成该纯化。

某些遍在蛋白化实验可使用细胞E3去表征E3活性的调节剂。在这些实验中，可在体外将来自受激或未受激Jurket、HeLa、THP-1或内皮细胞的细胞提取物与IκB多肽一起在ATP和磷酸酶抑制剂冈田软海绵酸的存在下温育。通常可按照Alkalay等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10599，1995)制备细胞提取物。温育的条件应足以导致IκB多肽(在IκBα及其变体的丝氨酸32和36上)的磷酰化以及磷酰化多肽(pIκB)与细胞衍生的NF-κB复合物之间的结合。例如，IκB多肽可与HeLa或Jurket的细胞提取物、ATP和冈田软海绵酸一起温育。在30℃下温育90分钟已足以使IκB多肽磷酰化。在此温育之后，可如Alkalay等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10599，1995)，用例如抗p65的抗体免疫纯化pIκB/NF-κB复合物，并在无细胞系统中进行pIκB/NF-κB复合物的体外遍在蛋白化。接着，可先使用熟知的SDS-PAGE技术并随后使用放射自显影技术，来评定遍在蛋白化水平。

在这些条件下，野生型³⁵S-pIκBα多肽在ATPγS的存在下产生多个遍在蛋白化的类别(参见图1A，泳道4)。³⁵S标记的IκBαS32/36A突变体(泳道1)和未磷酰化的野生型³⁵S-IκBα(泳道2)均不能发生遍在蛋白化。然而，突变体或野生型IκBα的游离形式易于发生偶联(图1B)。与之相似，可使游离的(而不是与复合物结合)IκBα第21、22位赖氨酸突变体在体外遍在蛋白化。因此，不同于使用游离IκB多肽进行的遍在蛋白化实验，此处提供的遍在蛋白化实验只靶向与复合物结合的且已适当磷酰化的IκB多肽。

上述遍在蛋白化实验可用于识别调节IκB遍在蛋白化的物质。调节剂可包括抗体(例如单克隆抗体)、肽、小分子(例如来自组合文库)和其他刺激或优选抑制IκBα和/或IκBβ多肽遍在蛋白化的药物。通常，可通过将候选调节剂包括在遍在蛋白化反应中并评价它对遍在蛋白化水平的影响，来识别所述的调节剂，所述遍在蛋白化的反应可如上所述另外进行。候选物质用于这一实验的合适浓度为约0.1μM-约1mM。对于肽候选物质，可加入肽酶抑制剂，例如苯丁抑制素(40μg/ml)，优选的肽量为约10μM-约1mM。对遍在蛋白化水平产生统计学上有意义的影响的候选物质包括在本发明的调节剂范围之内。

可通过将物质(例如约5mg/ml的肽物质)显微注射到合适的细胞(例如HeLa细胞或初级人血管内皮细胞)中，进一步评价该物质。在显微注射之后，可(例如用TNFα)刺激细胞，并温育细胞以使NF-κB活化。在HeLa细胞中，TNFα诱发NF-κB快速核易位至细胞核中，这可用p65的特异性抗体通过染色进行检测。调节剂引起NF-κB易位的统计学上有意义的降低，并可将此易位降低至不可测的水平。

通过受NF-κB调控的粘附蛋白在表面上的表达，初级人血管内皮细胞(HUVEC)对TNFα刺激产生响应，所述粘附蛋白例如为ICAM-1、V-CAM-1和E-选择蛋白(Read et al.，Immunity 2：493，1995；Chen et al.，J.Immunol.155：3538，1995)。E-选择蛋白特别是NF-κB依赖性的，它是主要可诱导的内皮粘附分子，最初贴附于嗜中性粒细胞上并在活化了的内皮上滚动。受激细胞可被固定并染色，以检测一种或多种受NF-κB调控的粘附蛋白的表达。多肽或其他调节剂的显微注射对该表达产生统计学上有意义的抑制，但不影响NF-κB非依赖型粘附蛋白如ICAM2的表达。

治疗应用

如上所述，本文所述的某些E3多肽、多核苷酸、抗体和其他物质通常可用作调节剂以特异性地抑制或增强细胞NF-κB的功能。调节剂也可用于调节患者体内IκBα和/或IκB β的遍在蛋白化，由此在体内调节NF-κB的细胞功能。此处使用的“患者”可以是包括人在内的任何哺乳动物，其可以患有与NF-κB活化相关的疾病，或者未患有可测的疾病。因此，治疗可以是针对现有疾病的或者是预防性的。与NF-κB活化相关的疾病包括但不限于，炎症、自身免疫性疾病、癌症和病毒感染。

治疗是指本文所述调节剂的给药。为给药至患者，通常将一种或多种所述化合物配制成药物组合物。药物组合物可以是无菌的水溶液或非水溶液、混悬液或者乳剂，其另外还包含生理上可接受的载体(即不干扰活性成分的活性的无毒材料)。可将本领域普通技术人员所公知的任何合适的载体用于本发明的药物组合物中。典型载体包括生理盐水、明胶、水、醇类、天然或合成的油、糖溶液、乙二醇、注射用有机酯如油酸乙酯或者这些材料的组合。可任选地，药物组合物另外还可含有防腐剂和/或其他添加剂和/或其他活性成分，所述添加剂例如有抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和/或惰性气体。

此外，药物组合物还可包含与生理上可接受的载体相结合的编码调节剂的多核苷酸(从而使调节剂在原位生成)。在该药物组合物中，多核苷酸可存在于本领域普通技术人员公知的各种传递系统(包括核酸、细菌和病毒表达系统)和胶体分散系统(包括脂质体)中的任何一种系统中。适宜的核酸表达系统包含了对在患者体内表达所必需的多核苷酸序列(例如合适的启动子和终止信号)。正如例如Ulmer等人所述，DNA也可以是“裸露的”(Science 259：1745-1749，1993)。

可用来将核酸序列导入目标患者细胞中的多种病毒载体包括，但不限于，牛痘或其他痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒或腺病毒。将DNA导入这些载体的技术是本领域普通技术人员所熟知的。优选逆转录病毒载体是鼠类或鸟类逆转录病毒的衍生物，包括但不限于莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠类肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠类乳腺瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。逆转录病毒载体可另外转移或掺入作为可选标志的基因(以有助于被转导细胞的识别或选择)和/或一特定靶细胞上受体的配体的编码基因(以使载体具有靶特异性)。例如，可通过插入编码糖、糖脂或蛋白的核苷酸序列，使逆转录病毒载体是靶特异的。也可使用抗体经本领域普通技术人员公知的方法来完成靶向。

病毒载体一般是非病原性的(缺陷性的)可复制病毒，它们需要帮助以产生传染性的载体颗粒。例如，可通过使用含有质粒的辅助细胞系来提供此帮助，所述质粒在LTR中的调控序列的控制下编码逆转录病毒的所有结构基因，但这些质粒不含能使装配机构识别出用于包装的RNA转录物的核酸序列。这样的辅助细胞系包括(但不限于)ψ2、PA317和PA12。可对引入所述细胞的逆转录病毒载体进行装配，产生载体病毒体。接着，可将用此方法产生的载体病毒体用于感染组织细胞系如NIH 3T3细胞，以产生大量嵌合的逆转录病毒体。

另一针对多核苷酸的靶向传递系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括高分子复合物、毫微囊、微球体、珠和基于类脂的系统，基于类脂的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作传递工具的优选胶体系统是脂质体(即人工膜囊泡)。业已显示，大小为0.2-4.0μm的单层大囊泡(LUV)可封装绝大部分的含有高分子的缓冲水溶液。可将RNA、DNA和完整的病毒体封装在含水的内部，并将它们以生物活性形式传递到细胞中(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.6：77，1981)。除了哺乳动物细胞之外，脂质体还可用于将多核苷酸传递到植物、酵母和细菌的细胞中。为使脂质体成为有效的基因转移工具，以下特征必须存在：(1)对目的基因进行高效封装而同时不危及其生物活性；(2)与非靶细胞相比，优先且主要与靶细胞结合；(3)高效地将囊泡的含水内容物传递到靶细胞的胞质中；和(4)准确并有效地表达遗传信息(Mannino，et al.，Biotechniques 6：882，1988)。

脂质体的寻靶可基于解剖学和机械因素进行分类。解剖学分类建立在选择性的基础上，其可以是例如器官特异的、细胞特异的和/或细胞器特异的。机械寻靶可基于其是被动还是主动来进行区分。被动寻靶利用了脂质体倾向于分布到器官的网状内皮系统(RES)细胞中的自然倾向，其中所述的器官含有窦状毛细血管。在另一方面，主动寻靶涉及通过将脂质体偶联到特异性配体上导致的脂质体变化，或通过改变脂质体组成或大小导致的脂质体变化，所述特异性配体例如为单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白，所述改变脂质体组成或大小是为了实现向器官和细胞类型寻靶，而不靶向天然形成的局部位点。

给药的途径、频率和剂量随患者的不同而不同。通常，药物组合物可经静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮给药。每天可给药1至6次。合适的剂量应足以改善患与NF-κB活化相关的疾病患者的症状。这样的改善可通过监测炎性反应(例如水肿、移植排斥、超敏性)或通过与所述疾病相关的临床症状的改善来得以检测。通常，存在于一剂中的调节剂或由一剂中的由DNA原位产生的调节剂的量为约1μg-约100mg/kg宿主。合适的剂量大小随患者的大小而变，但一般为约10mL-500mL/10-60kg动物。

提供以下实施例作为说明而非限制。

实施例

实施例1

使用遍在蛋白化实验鉴定IκB E3识别基元

本实施例说明一典型遍在蛋白化实验以及该实验在评价肽抑制IκB遍在蛋白化的能力上的应用

A.体外遍在蛋白化实验

按照制造商的指示(Promega，Madison，WI)，在麦芽提取物中，在³⁵S-蛋氨酸的存在下，在体外翻译以HA示踪的IκBα或以HA示踪的IκBβ cDNA(Haskill et al.，Cell 65：1281-1289，1991)。为了磷酰化IκBα或IκBβ，1μl含有标记蛋白的提取物在终体积为30μl的反应混合物中在30℃温育90分钟，所述反应混合物为100μg HeLa或Jurkat细胞提取物(如Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10599，1995所述进行制备)、2mM ATP和1μM冈田软海绵酸。在此温育过程中，标记的IκB多肽在丝氨酸32和36上发生磷酰化，并与内源性NF-κB复合物结合(数据未列出)。

在温育后，加入1μl抗p65的血清，将NF-κB免疫复合物固定到蛋白A-琼脂糖凝胶

上并在如Alkalay等人所述的HeLa细胞提取物中进行体外遍在蛋白化。已遍在蛋白化的蛋白通过SDS-PAGE得以分离，并通过放射自显影得以显影。

如图1A所示，只有野生型³⁵S-pIκBα多肽生成多个遍在蛋白化的类别(泳道4)。³⁵S标记的IκBαS32/36A突变体(泳道1)和未磷酰化的野生型³⁵S-IκBα(泳道2)均不能发生遍在蛋白化，在ATP不存在的条件下未观察到pIκBα的遍在蛋白化(泳道3)。

通过比较游离的³⁵S-IκB的遍在蛋白化和复合物结合型磷酰化底物的体外遍在蛋白化，进一步证明本实验的生理关联性。依据复合物结合型S32/36A突变体在体内的命运，它不能与遍在蛋白偶联，而突变体或野生型IκBα的游离形式易于发生偶联(图1B)。与之相似，只有游离的而非与复合物结合的IκBα第21、22位赖氨酸突变体可在体外遍在蛋白化(数据未列出)。因此，当以无差别形式通过遍在蛋白系统识别游离的IκBα时，与复合物结合的抑制剂被遮蔽了，除非它经过适当地磷酰化。

B.鉴定IκBα-遍在蛋白连接酶识别基元

为了鉴定IκBα-遍在蛋白连接酶识别基元，在肽酶抑制剂苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，将多种肽以不同浓度加入反应混合物中。这些肽横跨蛋白的N端信号域，它们在一个或两个丝氨酸残基(第32和36位)上发生磷酰化，或者它们是未经修饰的或丝氨酸被替换的。将这些肽以不同浓度包括在遍在蛋白化反应中，并测试其对pIκBα特异性遍在蛋白化的抑制。当监测到游离IκBα的偶联时，直接将经翻译的蛋白加入偶联反应混合物中。

只有在丝氨酸32和36上均发生磷酰化的肽(pIκBα肽)才能有效地抑制pIκBα的遍在蛋白化(图1A，泳道7、11-14)。在浓度为400μM时，c-Fos磷酸肽(ppFos，泳道5)、第32、36位丝氨酸替换为丙氨酸的IκBα肽(p21S/A，泳道6)和未磷酰化的肽(p21，泳道8)不对pIκB的遍在蛋白化产生可测的影响。计算磷酰化IκBα肽的IC₅₀，典型抑制浓度示于图1A。二磷酰化的IκBα肽抑制pIκB的偶联反应(泳道7、11-14)，其IC₅₀为5μM。在上面的表1和SEQ ID NO：5-9中提供了这些肽的序列。相反，单磷酰化的肽(泳道9、10)抑制pIκBα的偶联反应，其IC₅₀为400μM。测试的最小肽(pp7，泳道14)仅横跨信号磷酰化位点，它足以有效地抑制遍在蛋白化，尽管其IC₅₀较高(10μM)。因此，包含SEQ IDNO：1中的残基21-41的肽包含了针对E3遍在蛋白连接酶的识别域。有趣的是，第21和22位的赖氨酸对于抑制并非是必需的，这意味遍在蛋白系统的识别位点与实际的偶联位点是不同的。

在两个其他的遍在蛋白偶联反应中测试肽的特异性，所述两个偶联反应为：游离野生型(图1B，泳道1-3)或S32/36A突变IκBα(图1B，泳道4-6)的偶联，以及遍在蛋白与HeLa提取物中的大量细胞蛋白间的偶联(按照Alkalay等人所述，用¹²⁵I标记的遍在蛋白检测，图1C)。IκBα-遍在蛋白连接酶识别基元或对照肽的加入不影响这两个反应。

已发现，包含IκBα-遍在蛋白连接酶识别基元的肽使与pIκBα相关的底物pIκBβ不能遍在蛋白化(图1D)。与pIκBα的偶联相似，IκBβ的特异性偶联也要求有结合的NF-κB复合物存在(未显示)，并在与IκBα同源的残基第19和23位丝氨酸上已经发生了磷酰化。在磷酸酶抑制剂不存在的条件下制备的IκBβ底物不发生遍在蛋白化(图1D，泳道1)。肽影响pIκBβ的遍在蛋白化，其IC₅₀类似于在pIκBα情况中观察到的IC₅₀(图1D，泳道4-7)。因此，这显示相同的酶靶向两种IκB，以进行遍在蛋白依赖型降解。

在互补的遍在蛋白依赖型体外降解实验中测试抑制性pIκBα肽(Orian et al.，J.Biol.Chem.270：21707，1995；Stancovski et al.，Mol.Cell.Biol.15：7106，1995)。使用该实验，只有受激细胞产生的pIκBα以依赖于遍在蛋白的方式发生体外降解，而来自相同细胞提取物的未磷酰化的IκBα不发生降解。将抑制偶联的磷酸肽引入降解实验，这导致pIκBα底物的稳定(图2，泳道3、4)，而未磷酰化的肽物质或磷酸-Fos肽对照不影响特异的pIκBα降解(泳道5、6)。所述肽在赖氨酸21/22上的修整不降低降解抑制作用(泳道4)，这说明所述肽不会通过消耗作为可偶联的底物的遍在蛋白-蛋白体系统来废止pIκBα的降解。

实施例2

鉴定参与底物识别的遍在蛋白系统成分

本实施例说明对负责pIκB多肽识别的特定E3的鉴定。

pIκBα-遍在蛋白偶联和降解需要全套遍在蛋白系统酶：E1、源自遍在蛋白系统级分I的特定E2、E2F1(Alkalay et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：10599，1995；Chen et al.，Cell 84：853，1996)和级分II-成分E3。为了鉴定参与底物识别的遍在蛋白系统成分，将HeLa溶胞产物经IκBα磷酸肽柱分级分离，分析流通级分以用于pIκBα偶联。按照制造商的指示，将肽以2mg/ml的浓度连接到NHS-琼脂糖凝胶(Pharmacia)上。在0.1％NP40和3％卵清蛋白的存在下，100μg HeLa提取物与2.5μl偶联树脂在4℃一起温育1小时。弃去树脂，在上述遍在蛋白化实验中测试未结合的物质。

从对照磷酸肽柱和S32/36A肽柱得到的流通级分保留了全部IκBα偶联能力(图3A，泳道2、3)，而从两个不同pIκBα肽得到的流通级分失去了它们的IκBα特异性偶联能力(泳道4、7)。消耗的偶联活性可由网状细胞级分II进行补充(泳道5、8)，该级分含有E3酶的所有已知类别(Ciechanover，Cell 79：13，1994)。补充不能通过加入级分I或者级分I和E1获得(分别为泳道6和9)，这表明肽柱消耗E3，而不消耗E2或E1。此外，IκBα的第21和22位赖氨酸残基对于保留E3不是必要的(比较图3A，泳道7至泳道4)，这强调在底物识别位点和偶联位点的不同。当所有流通级分在随机HeLa蛋白偶联中维持全部活性时，肽柱消耗被发现是对IκB E3特异的(通过检查¹²⁵I遍在蛋白的偶联来进行检测，图3B)。这表明特定E3负责在识别基元处识别pIκB。

实施例3

典型肽对细胞NF-κB活化的影响

本实施例说明，通过显微注射包含IκBα-遍在蛋白连接酶识别基元的肽，抑制细胞NF-κB活化。

在显微注射前，将HeLa细胞植在方格盖玻片(Cellocate，Eppendorf)上18小时。使用半自动器械(Eppendorf)，用22个氨基酸的pIκBα肽(pp21；表1和SEQ ID NO：9)或对照磷酸-Fos肽(SEQ ID NO：10)进行显微注射。将在100mM KCl、5mM Na₂HPO4(pH 7.2)中浓度为5mg/ml的肽注射入细胞质中，然后立即用TNFα(200单位/mL)活化20分钟(用于NF-κB易位)或3小时(用于E选择蛋白的表达)。在活化后，将细胞固定，并用p65的特异性抗体(Mercurio et al.，Genes & Dev.7：705，1993；Santa Cruz)或抗E选择蛋白的单克隆抗体(R&D Systems)将细胞染色。

正如90％细胞的p65核染色所示，当肽不存在时，TNFα引发NF-κB快速核易位至细胞核中(参见图4G，第2列)。在一些试验中，pp21肽废止了TNFα刺激的NF-κB活化(参见图4A和4B中的典型区域；和图4G，第3列)。相反，与未显微注射的细胞相比，对照pp-Fos肽不影响NF-κB诱导核易位的速率(图4C和4G，第4列)。

为了进一步评估NF-κB抑制的功能性结果，将IκB-E3抑制性肽显微注射到初级人血管内皮细胞中(HUVEC；Chen et al.，J.Immunol155：3538，1995)。通过由NF-κB调控的粘附蛋白(例如E选择蛋白)在表面的表达，这些细胞对TNFα产生响应。如上所述培植、显微注射和刺激HUVEC细胞。在刺激后3小时，细胞被固定并染色，以标明NF-κB依赖型E选择蛋白的表达。在一些试验中，在TNFα刺激后，75％-85％的HUVEC细胞由于E选择蛋白而深度染色。显微注射pp21肽导致在70％-80％显微注射的细胞中E选择蛋白的表达受到抑制(图4D；和图4H，第3列)。相反，与未经显微注射的细胞相比，对照pp-Fos肽不影响E选择蛋白的表达(图4F和图4H，第4列)。对照S32/36A替换的IκBα肽的显微注射不影响E选择蛋白表达的速率。

这些结果证明，由信号诱导而磷酰化的IκBα和IκBβ的亚基特异性降解由特定E3介导。针对E3遍在蛋白连接酶的识别域是一短序列，其以两个由信号得到的磷酸丝氨酸为中心，这代表第一个生物学上有关的E3识别基元，在两种IκB中所述的磷酸丝氨酸是保守的。IκB识别的特异性由描述磷酰化底物的上下文所支持：结合的细胞复合物使底物与非特异性E3隔绝。该特征将NF-κB抑制剂的降解限制于刺激后的阶段，此时它通过位点特异性磷酰化与特异的连接酶相接触。使用本发明提供的调节剂，通过在体内抑制IκB连接酶，可废止NF-κB的活化和其产生的作用。

实施例4

进一步表征IκBα的遍在蛋白化

本实施例进一步说明与IκBα遍在蛋白化相关的遍在蛋白连接酶的特征

A.细胞因子刺激促进pIκBα和特异性遍在蛋白-连接酶之间的结合

为了进一步研究由磷酰化IκBα-复合物引起的遍在蛋白结构成分的补充，从蛋白体抑制的、TNF-α刺激的HeLa细胞中纯化出pIκBα/NF-κB复合物，并评价其遍在蛋白化能力。HeLa细胞与蛋白体抑制剂ALLN(150μM)预温育1小时，用TNF-α刺激10分钟。IκBα/NF-κB复合物用山羊抗Rel A(p65)的抗体(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)和同源p65肽(ELFPLIFPAEPAQASGP(SEQ ID NO：21)，其是合成的并购自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其经HPLC纯化，经质谱分析，证明了预计的结构并证实纯度超过85％)进行免疫亲合纯化。

向经免疫纯化的级分中添加遍在蛋白系统的多种成分，并进行体外遍在蛋白化。具体地讲，所述级分中添加有0.2μg纯化的E1和0.1μg纯化的重组UBC5C(Jensen et al.，J.Biol.Chem.270：30408-30414，1995)，并在反应缓冲液中在37℃温育90分钟，所述反应缓冲液含有：50mM Tris(pH 7.6)、2mM MgCl₂、1mM DTT、20nM冈田软海绵酸、1mg/ml牛遍在蛋白(Sigma)和5mM ATPγS(Sigma)。反应混合物接着在SDS-缓冲液中加热至沸，样品通过SDS-PAGE(8.5％)和磷酸成像进行分析。

业已发现，遍在蛋白、纯化的E1和特定E2、UBC5C的加入足以产生全容量IκBα-遍在蛋白偶联活性(图5，第2列)，这在与IκBα特异性抗血清反应的大分子物质的积聚中十分明显。该活性是依赖于E1的(比较泳道1和2)，来自未受激HeLa细胞的相应的免疫纯化级分不能提供该活性(比较泳道4、5、6)。当受激HeLa的级分同时含有磷酰化和未磷酰化的IκBα时，观察到的偶联物可以源自两种IκB中的任一种。

为了确定IκBα-偶联物的来源，在pIκBα肽(pp12；CDRHDS[PO3]GLDS[PO3]；SEQ ID NO：22)(泳道7)或丝氨酸/谷氨酸替换的IκBα肽(p12S/E)(泳道8)的存在下进行遍在蛋白化反应。两种肽均是合成的并购自Alfa-Diagnostic，Inc.，而后其经HPLC纯化，经质谱分析，证明了预计的结构并证实纯度超过85％。在肽酶抑制剂苯丁抑制素(40μg/ml)的存在下，将IκBα肽以指定浓度加入反应混合物中。只有pp12使多遍在蛋白-IκBα偶联物不能形成，这表明遍在蛋白化对pIκBα是特异的(Yaron et al.，EMBO J.16：6486-6494，1997)。

B.磷酰化对于补充特异性遍在蛋白-连接酶活性是必要且充分的

E1和E2特异性地补充受激HeLa级分的pIκBα-偶联物，但不补充未受激级分，这一发现可有若干解释：a)HeLa刺激活化了特异性pIκB-遍在蛋白连接酶；b)HeLa刺激修饰了底物，由此使它易于遍在蛋白化；或c)HeLa刺激对于修饰底物和连接酶均是必要的。为了区分这几种可能，使用重组的、组成活化的IKK2蛋白(IKK2-EE)(Mercurio et al.，Science 278：860-66，1997)。类似于TNFα激活IKK-复合物，该蛋白在丝氨酸32/36上磷酰化IκBα。

先使未受激HeLa的溶胞产物与重组的³⁵S标记的IκBα一起温育，再将来自未受激HeLa溶胞产物的³⁵S标记的IκBα/NF-κB复合物免疫沉淀，之后，复合物用重组IKK2-EE磷酰化、用p65同源肽洗脱并进行体外遍在蛋白化。在与IKK2-EE温育后，几乎所有的³⁵S-IκB都发生磷酰化。而遍在蛋白、E1和UBC5C的加入并不能导致pIκBα的磷酰化(图6，泳道2)。因此，由IKK引起的IκB磷酰化不足以促进其在E1和E2存在下的遍在蛋白化。可以想象，pIκBα遍在蛋白化需要附加的HeLa溶胞产物成分，该成分没有从未受激细胞中共免疫纯化。

为证明这一假说，或直接地或在IKK2-EE磷酰化后，将免疫结合的IκBα/NF-κB复合物与未受激HeLa的溶胞产物一起温育，用高盐缓冲液彻底洗涤，并用p65肽洗脱。事实上，HeLa溶胞产物与磷酰化IκB复合物(图6，泳道3)而不是与未磷酰化的IκB复合物(泳道1)的温育提供了pIκBα偶联所需的pIκB-连接酶成分。当把E1或E2从反应中略去时，没有得到任何信号，这证明凝胶上方的信号代表多个遍在蛋白IκBα-偶联物(泳道5、6)。在提供必要的连接酶成分方面，受TNFα刺激的HeLa的溶胞产物不比未受激的溶胞产物优越。

pp12对pIκBα遍在蛋白化的抑制作用(图5)暗示，在温育过程中基本HeLa成分特异并稳定地与pIκBα识别基元结合，之后，这些基本成分在pIκB-遍在蛋白偶联中发挥作用。为了测试这一设想，将pp12或对照肽p12S/E包括在温育过程中，在洗脱级分前，可将这些肽与HeLa溶胞产物一同除去。pp12(图6，泳道4)而不是p12S/E(泳道5)的加入废止了与pIκB-复合物相关的遍在蛋白-连接酶活性，同时保持了底物的完整。这对于肽处理级分在网状细胞级分II的存在下发生遍在蛋白化的能力是明显的，所述网状细胞级分II是E3源。可从此试验中得出若干结论：

1)pIκBα遍在蛋白化所必须的遍在蛋白-连接酶成分由IκBα/NF-κB复合物在IKK磷酰化后从HeLa溶胞产物中补充。

2)此促进偶联的成分含在未受激的HeLa溶胞产物中，这表明不需要通过TNF刺激来活化遍在蛋白-连接酶。

3)基本连接酶成分显然是特异的，该成分通过与pIκB识别基元的直接作用来与IκB结合(通过pp12对pIκBα-偶联物的抑制来证实)。

C.分离识别rIκBα的特异性遍在蛋白-连接酶成分

HeLa提取物(250mg)与250μl抗p65的免疫珠一起温育。在A缓冲液(1M KCl、0.5％NP40、50mM pH 7.6的Tris缓冲液、1mM DTT)中洗涤四次，在B缓冲液(50mM pH 7.6的Tris缓冲液、1mM DTT)中洗涤一次。然后，这些珠中的一半用IKK进行体外磷酰化，另一半进行模拟磷酰化。珠在A缓冲液中洗涤两次，在B缓冲液中洗涤一次。它们与100mg HeLa提取物在1μm冈田软海绵酸存在下于25℃搅拌30分钟，在A缓冲液中洗涤四次，在B缓冲液中洗涤一次，用1mg/ml p65肽洗脱。使用10mg ³⁵S代谢标记的HeLa溶胞产物(100μCi/ml蛋氨酸/半胱氨酸，8小时)和25μl p65-免疫珠进行相似的试验。源自热和冷溶胞产物的洗脱物-级分相互混合，在SDS-样品缓冲液中加热至沸，并通过7.5％SDS-PAGE和放射自显影进行分析。将与放射自显影信号对应的凝胶片切下，并如下所述通过质谱测定其蛋白带的序列。

通过SDS-PAGE分析，比较三个经免疫亲合纯化的级分(图7A)：1)一个含有IκBα/NF-κB复合物的级分，该级分未经IKK2-EE磷酰化，但与HeLa溶胞产物一起温育；2)一个经IKK2-EE磷酰化且随后与HeLa溶胞产物一起温育的级分；3)一个经IKK2-EE磷酰化但未与HeLa溶胞产物一起温育的级分。所有温育均在由免疫珠固定的复合物上进行，然后，彻底洗涤该复合物并用p65肽洗脱。

三个级分的SDS-PAGE分析揭示了模式变化，该变化归因于IKK磷酰化或归因于IκBα/NF-κB蛋白的进一步免疫吸附，但所述分析没有辨明任何在IKK磷酰化后补充到IκB复合物中的蛋白。蛋白染色的复杂性可能会掩盖任何补充的蛋白的存在，所述蛋白与经免疫纯化的蛋白一起迁移。为了识别补充的蛋白，在源自级分1和2的经胶体蓝染色的珠上进行质谱分析。此分析揭示几乎全部Rel家族蛋白和IκBα的存在，包括：NF-κB1(p105)、NF-κB2(p100)、RelA(p65)、p50、p49、C-Rel、IκBα和IκBε。只有少数其他蛋白与IκB/NF-κB复合物共免疫沉淀，特别是GRP78/Bip、Hsp 70和Hsc 70。

为了避免可能造成对推定的pIκB-遍在蛋白连接酶的遮蔽，用³⁵S生物合成性标记的HeLa溶胞产物代替连接酶源，并通过SDS-PAGE分析和放射自显影来跟踪与IκBα结合的蛋白(图7B)。相同地，测试不同级分的遍在蛋白-连接酶容量。将活性级分的带模式(泳道2)与非活性级分的带模式(泳道1)进行比较。在泳道2中辨别了分子量为54、58、61和64kD的四个³⁵S-蛋白带。这些蛋白带中的一些可代表直接识别pIκBα的遍在蛋白连接酶的成分，而其他的则可能与pIκBα间接相关或者与IKK磷酰化复合物的另一成分相关。为了挑选出直接识别pIκBα的连接酶成分，将pp12或对照肽p12S/E加入放射标记的HeLa溶胞产物，接着将该溶胞产物与免疫结合的IκBα/NF-κB复合物一起温育。对洗脱级分的比较显示，针对所述四个特殊带的级分只存在于级分2中，三个带被特异性pp12肽所消除(p54、p58和p61)，而只有64kD带在pp12的存在下继续存在(图7B，比较泳道2和3)。对照肽不影响特殊蛋白中任一个与pIκBα的结合(泳道4)。p58和p54这两个与pIκBα相互作用的蛋白是一贯存在的，它们总与特异性遍在蛋白-连接酶活性相关。

实施例5

鉴定人E3遍在蛋白连接酶

本实施例说明人E3遍在蛋白连接酶的分离和表征。

将前实施例所述的54和58kD带从连接酶阳性和连接酶阴性(HeLa溶胞产物与未磷酰化的IκBα-复合物一起温育)的泳道中切下，通过纳电子喷射质谱，对原位消化的蛋白(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68：850-858，1996)和由此得到的胰蛋白酶肽测序(Wilm et al.，Nature379：466-469，1996)。正如所述，蛋白带以凝胶态还原，S-烷化，并以凝胶态由过量胰蛋白酶消化(室温过夜)(Shevchenko et al.，Anal.Chem.68：850-858，1996；Wilm et al.，Nature 379：466-469，1996)。提取凝胶片，将所得肽混合物浓缩并脱盐，其中使用含有50nl Poros R2材料(Perceptive Biosystems，Framingham，MA)的微柱。使用1μl 60％甲醇、5％甲酸，将肽直接洗脱到纳电子喷射针中。在四级飞行时间质谱仪(QqTOF，Perkin-Elmer Sciex，Toronto，Canada)上记录纳电子喷射图谱。从碎片谱中装配出肽序列标志(Mann and Wilm，Anal.Chem.66：4390-4399，1994)，并使用肽搜索程序(PeptideSearch，Mann and Wilm，Anal.Chem.66：4390-4399，1994)，在欧洲生物信息研究所(EBI，HinxtonPark，England)维护的非冗余蛋白序列数据库(nrdb)中搜索该序列标志。

54kD凝胶带的质谱揭示出一个复杂的肽混合物(图8A)，从该混合物中选择一些肽用于碎裂。通过肽序列标志搜索(Mann and Wilm，Anal.Chem 66：4390-4399，1994)鉴定的蛋白包括NF-κB1(p50)、IκB激酶α、IκBε、RelB、微管蛋白β-1链和甲状腺受体起始子结合蛋白。为了鉴定与E3活性相关的蛋白，选择少量存在的附加肽用于通过比较来自活性级分和来自非活性级分的54kD带的谱来进行测序(图8B)。肽序列标志(1587.81)VVNV(SEQ ID NO：23)(1999.09)由图8C所示的碎片谱导出，并被明确地鉴定为AAVNVVDFDDKYIVSAS(SEQ ID NO：24)。其他谱鉴定了肽LEGHEELVR(SEQ ID NO：25)、LVVSGSSDNTIR(SEQ ID NO：26)、IQDIETIESNWR(SEQ ID NO：27)和VISEGMLWK(SEQ ID NO：28)。最初的四个片段具有人F盒/WD蛋白β-TrCP中的序列(Margottin etal.Mol.Cell 1：565-574，1998)。然而，第五个肽(VISEGMLWK(SEQ IDNO：28))与来自果蝇Slimb蛋白的肽(参见Jiang and Struhl，Nature391：493-496，1998)相符，其与人β-TrCP高度同源。进一步的测序鉴定了图9提供的人E3遍在蛋白连接酶的核酸序列(SEQ ID NO：15)，预计的蛋白序列(SEQ ID NO：16)示于图10。因此，人E3遍在蛋白连接酶看起来是同源蛋白β-TrCP/Slimb家族的一个新成员。

实施例6

进一步表征E3遍在蛋白连接酶活性

本实施例进一步说明人E3遍在蛋白连接酶家族成员β-TrCP和Slimb的遍在蛋白连接酶活性。

在无细胞系统中检测这些蛋白特异性结合pIκBα和辅助其遍在蛋白化的能力。IκBα/NF-κB复合物从HeLa细胞中免疫提纯，如上所述，免疫复合物用IKK2-EE磷酰化或模拟磷酰化。它接着与下列已固定的以FLAG示踪的E3家族成员一起温育，所述成员从转染的293细胞中免疫沉淀，包括小鼠β-TrCP(mβ-TrCP)、人β-TrCP(hβ-TrCP)、缺失了F盒区域残基122-168的人β-TrCP(Δβ-TrCP)和果蝇Slimb蛋白。使用抗IκBα和抗FLAG的抗体，通过Western印迹来分析结合的物质。所有这些蛋白只结合IKK磷酰化的IκBα，而不结合模拟磷酰化的IκBα(参见图11A)。然而，人和鼠β-TrCP结合IκBα的能力比高度同源的果蝇蛋白好得多(比较泳道2、4、6和8)。Δβ-TrCP结合IκBα的能力甚至比野生型蛋白好，这表明F盒区域对于结合不是必需的。此外，β-TrCP的结合可被代表pIκBα识别基元的肽(pp10；DRHDS(PO₃)GLDS(PO₃)M，(SEQ ID NO：29))所废止(参见图11B，泳道3)；而不被对照肽废止(泳道4)，进而指明了保守DS(PO₃)GLDS(PO₃)(SEQ ID NO：30)序列的pIκBα识别位点。

为了评价结合对遍在蛋白化的影响，在pIκBα遍在蛋白化中，使用E3家族成员和所述缺失突变体作为E3活性的来源。在E1和E2(UBC5C)的存在下，野生型β-TrCP蛋白促进pIκBα的遍在蛋白化，而不促进未磷酰化的IκBα的遍在蛋白化(参见图11C，泳道1-4)。Δβ-TrCP缺乏F盒蛋白-蛋白相互作用组件，尽管它具有结合能力(图11A，泳道6)，但它不能促进遍在蛋白化(泳道7和8)。尽管Slimb促进一些pIκBα的遍在蛋白化，但其效力至少比人和鼠β-TrCP低10倍(基于相似的FLAG-标志表达水平)，这与其较弱的活性相对应。

这些家族成员的模块设计和本文所述的体外分析间接表明，F盒的缺失将形成在体内起显性阴性分子作用的蛋白。事实上，在受激Jurkat细胞中，Δβ-TrCP的瞬时过度表达抑制了内源性IκBα的降解，从而导致pIκBα的积聚(图12A)。随后，NF-κB的活化受到抑制(图12B)。由于Δβ-TrCP不影响NF-AT受体的活化，所以NF-κB的活化是特异性的。应注意这样一个事实，即在使用野生型Slimb时也观察到NF-κB受到抑制，而野生型人β-TrCP的表达不产生抑制作用(图12B)。因此，野生型Slimb的过度表达对于NF-κB活化具有显性阴性影响，这可能与其相对弱的pIκBα遍在蛋白化活性有关(图11B)。

基于前面的叙述，可以理解的是，尽管为举例说明而在本文描述了本发明的具体实施方案，但仍可进行改进而同时不背离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求的限制。

序列表概要

SEQ ID NO：1是IκBα的氨基酸序列

SEQ ID NO：2是IκBα的DNA序列

SEQ ID NO：3是IκBβ的氨基酸序列

SEQ ID NO：4是IκB β的DNA序列

SEQ ID NO：5是pp7的氨基酸序列

SEQ ID NO：6是pp11的氨基酸序列

SEQ ID NO：7是pp15的氨基酸序列

SEQ ID NO：8是pp19的氨基酸序列

SEQ ID NO：9是pp21的氨基酸序列

SEQ ID NO：10是磷酸-Fos肽的氨基酸序列

SEQ ID NO：11是pp21S/A的氨基酸序列

SEQ ID NO：12是以HA示踪的IκBα的氨基酸序列

SEQ ID NO：13是以HA示踪的S32、36IκBα的氨基酸序列

SEQ ID NO：14是以HA示踪的IκBβ的氨基酸序列

SEQ ID NO：15是人E3遍在蛋白连接酶的DNA序列

SEQ ID NO：16是预测的人E3遍在蛋白连接酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：17是人β-TrCP的DNA序列

SEQ ID NO：18是人E3 β-TrCP的氨基酸序列

SEQ ID NO：19是IκBα的磷酰化位点

SEQ ID NO：20是检索到的β-TrCP序列

SEQ ID NO：21是同源p64肽的氨基酸序列

SEQ ID NO：22是pIκBα肽pp12的氨基酸序列

SEQ ID NO：23是人E3遍在蛋白连接酶的肽序列标志

SEQ ID NO：24是来自人E3遍在蛋白连接酶的肽

SEQ ID NO：25是来自人E3遍在蛋白连接酶的肽

SEQ ID NO：26是来自人E3遍在蛋白连接酶的肽

SEQ ID NO：27是来自人E3遍在蛋白连接酶的肽

SEQ ID NO：28是来自人E3遍在蛋白连接酶的肽

SEQ ID NO：29是pIκBα识别基元的氨基酸序列

SEQ ID NO：30是保守的pIκBα序列

Claims

1.具有SEQ ID NO：16所示序列的分离的多肽或其变体，该变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：16中的氨基酸残基上发生一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用。

2.包括SEQ ID NO：16所示的人E3遍在蛋白连接酶的一部分的分离的多肽或其变体，其中所述部分与磷酰化的IκB结合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用。

3.分离的编码权利要求1所述多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸不编码全长人E3遍在蛋白连接酶。

4.分离的编码权利要求2所述多肽的多核苷酸。

5.包含至少10个连续的与权利要求3所述多核苷酸互补的核苷酸的反义核苷酸。

6.包含权利要求3-5中任一项所述多核苷酸的表达载体。

7.用权利要求6所述表达载体转化或转染的宿主细胞。

8.药物组合物，包含：

(a)人E3遍在蛋白连接酶多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO：16所示的序列或其一部分或其变体，该变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：16中的氨基酸残基上发生一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用；和

(b)生理上可接受的载体。

9.药物组合物，包含：

(a)人E3遍在蛋白连接酶多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO：16所示序列的一部分或其变体，该变体的区别在于一个或多个氨基酸的替换、插入、缺失或添加，以致多肽与磷酰化的IκB结合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用；和

(b)生理上可接受的载体。

10.药物组合物，包含：

(a)编码人E3遍在蛋白连接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO：16所示的序列或其一部分或其变体，该变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：16中的氨基酸残基上发生一个或多个氨基酸的缺失、插入、添加或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用；和

(b)生理上可接受的载体。

11.药物组合物，包含：

(a)编码人E3遍在蛋白连接酶多肽的多核苷酸，其中所述多肽包括SEQ ID NO：16所示序列的一部分或其变体，该变体的区别在于一个或多个氨基酸的替换、插入、缺失或添加，以致多肽与磷酰化的IκB结合并抑制磷酰化IκB的遍在蛋白化作用；和

(b)生理上可接受的载体。

12.药物组合物，包含：

(a)权利要求5所述的反义多核苷酸；和

(b)生理上可接受的载体。

13.分离的抗体或其抗原结合片段，其与SEQ ID NO：16所示的人E3遍在蛋白连接酶序列相结合。

14.权利要求13所述的抗体或其片段，其中抗体是单克隆抗体。

15.包含权利要求13所述的抗体或其片段以及生理上可接受的载体的药物组合物。

16.权利要求8-12或15中任一项所述的药物组合物，在药品制造中的应用，其中所述药品用于调节患者的NF-κB的活性。

17.权利要求8-12或15中任一项所述的药物组合物，在药品制造中的应用，其中所述药品用于治疗患有与NF-κB活化相关的疾病的患者。

18.权利要求17所述的组合物，其中所述疾病选自炎症、自身免疫性疾病、癌症和病毒感染。

19.调节NF-κB活性的物质的筛选方法，包括以下步骤：

(a)使候选物质与人E3遍在蛋白连接酶多肽接触，其中所述多肽包含SEQ ID NO：16所示序列或者其部分或其变体，所述变体的区别在于一个或多个氨基酸的替换、插入、缺失或添加，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，候选物质与人E3遍在蛋白连接酶多肽接触的条件和时间足以使多肽和候选物质相互作用；和

(b)随后相对于预先确定的在不存在候选物质时多肽增强磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力，评价多肽增强磷酰化IκB的遍在蛋白化作用的能力；

由此识别出调节NF-κB活性的物质。

20.权利要求19所述的方法，其中候选物质是存在于组合文库中的小分子。

21.调节患者中NF-κB活性的方法，包括将包含β-TrCP蛋白(SEQID NO：18)或者其部分或其变体的多肽给药至患者，并因此调节患者中的NF-κB活性，所述变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：18中的残基上发生一个或多个氨基酸的插入、缺失、添加或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用。

22.在药品制造中使用的治疗有效量的多肽，该多肽包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO：18)或者其部分或其变体，所述变体的区别在于在不超过20％的SEQ ID NO：18中的残基上发生一个或多个氨基酸的插入、缺失、添加或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，其中所述药品用于治疗患有与NF-κB活化相关的疾病的患者。

23.权利要求22所述的多肽，其中所述病症选自炎症、自身免疫性疾病、癌症和病毒感染。

24.调节NF-κB活性的物质的筛选方法，包括以下步骤：

(a)使候选物质与包含β-TrCP蛋白(SEQ ID NO：18)或者其部分或其变体的多肽接触，所述变体的区别在于在不超过20％的SEQ IDNO：18中的残基上发生一个或多个氨基酸的插入、缺失、添加或替换，以致多肽增强磷酰化的IκB的遍在蛋白化作用，候选物质与多肽接触的条件和时间足以使多肽和候选物质相互作用；和

由此识别出调节NF-κB活性的物质。

25.权利要求24所述的方法，其中候选物质是存在于组合文库中的小分子。