KR100809866B1 - 미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포의 검침·분리방법 및 이를 위한 장치 - Google Patents

미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포의 검침·분리방법 및 이를 위한 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것으로, 보다 상세히는 미세유체채널 및 자장을 이용하여 적은 양의 시료로 짧은 시간에 저렴한 단가로 아폽토틱 세포를 검침하는 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
아폽토틱 세포의 표면을 인식하는 C2A 단백질 및 마그네틱 비드가 세포표면에 결합된 아폽토틱 세포를 포토리소그래피 공정을 이용한 PDMS 재질의 저렴하고 간단한 미소유체 구조물을 사용하여 검침 및 분리하는 방법 및 장치를 제공함으로써 장치의 소형화 및 저렴한 단가의 이점을 제공한다.
아폽토틱세포, apoptotic cell, 미세유체채널, magnetic bead

Description

미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치{Method and apparatus for detecting or sorting apoptotic cells using microfulidic channel and magnetic field}
도 1은 본 발명에 따른 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침 및 분리에 사용될 수 있는 PDMS 미세유체 채널 구조물의 제작과정을 설명하는 설명도이다.
도 2는 도 1에 의해 제작된 PDMS 미세유체 채널의 구조를 설명하기 위한 설명도이다.
도 3은 도 1에 의해 제작된 PDMS 미세유체 채널 구조물의 일예이다.
도 4은 도 2의 PDMS 미세유체 채널에서 주입구, 메인채널, 배출구를 설명하기 위한 설명도이다.
도 5는 아폽토시스를 유도하는 약물과 저캣세포(Jurkat cell)를 함께 배양하고 형광염색 후, FACS 장비로 측정한 결과이다. 정상 저켓세포 (1x106 cells/ml)를 클로로헥사미드 (10 μg/ml, 6시간)로 처리한 후, TRAIL (500 ng/ml, 15시간)로 처리하였다. 이후 세포를 아넥신 V-FITC 및 PI (BD Bioscience)로 이중염색하였다.
도 6은 아폽토시스화 된 세포에 마그네틱 비드(bead)를 결합시키는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
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도 7은 PDMS 미세유체채널에서의 유량의 변화의 효과를 보여 준다.
도 8은 약물처리전의 정상세포(A), 약물 처리 후 마그네틱 비드와의 결합단계 없이 배출된 아폽토틱세포(B), 약물 처리 후 마그네틱 비드를 결합시킨 뒤 배출구를 통해 수집된 세포(C), 약물처리 이후 C2A 단백질과 마그네틱 비드에 의해 결합된 아폽토틱세포와 결합하지 않은 정상세포(D) 등을 보여 준다.
본 발명은 미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것으로, 보다 상세히는 미세유체채널 및 자장을 이용하여 적은 양의 시료로 짧은 시간에 저렴한 단가로 아폽토틱 세포를 검침하는 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.
아폽토시스(apoptosis) 또는 프로그램드 셀 데스(programmed cell death)는 세포가 스스로 자살을 하는 것으로서, 생명체가 항상성을 유지하기 위한 기본적인 생명현상이다 (Heemels, M.-T., Nature 407, 769, 2000). 세포의 증식과 아폽토시스 간의 균형은 생체 내에서 세포의 수를 일정하게 유지시켜 준다. 암과 같이 세포의 증식이 활발한 경우나, 골다공증, 치매같이 골세포나 뇌세포의 사멸이 심하게 일어나는 경우는 아폽토시스에 문제가 발생한 것이다(Thompson, C.B., Science 267, 1456-1462, 1995). 암치료에 있어서 방사능 또는 화학적 치료요법으로 종양세포의 아폽토시스를 유도하고 괴사시킬 수 있으며, 따라서 아폽토틱 세포의 유도로 종양의 증식과 번식을 지연시키거나 막을 수 있다(Meyn, R.E.등, Anti-cancer Drugs, 6, 443-450, 1995). 이러한 이유로 아폽토틱 세포의 검침은 암 등의 종양질환이나 자기면역질환 환자의 치료효과를 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)에서 점검하는데 활용할 수 있다. 또한 신약개발에 있어서 아폽토시스 유도 물질 또는 아폽토시스 유도를 저해하는 물질을 검색함으로써 초고속 약물검색 시스템을 구축할 수 있다.
최근, 생명공학분야에서는 미세유체채널을 포함하는 미세유체소자 (microfluidics chip)를 이용한 실험 및 분석기술에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이와 같은 미세유체 소자를 이용한 방법은 적은 양의 시료만으로 빠른 시간에 간편하게 수행할 수 있다는 장점이 있어 차세대 분석 시스템으로 각광을 받고 있다.
세포치료용 줄기세포를 보관 후 해동할 때 많은 경우 세포들이 사멸을 할 수 있는데, 건강한 줄기세포를 얻기 위해서는 시료로부터 아폽토틱 세포를 빠른 시간 내에 분리하여 제거해야할 필요가 있다. 아폽토시스 단계의 세포를 알아내기 위해서 현재 실험실에서 사용하고 있는 방법은 세포의 배양과 약물처리 및 형광염색 등의 과정을 거쳐 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 장비를 통해 검침하는 것이다. FACS 장비는 정밀하고 고속으로 검색을 하는 장점이 있으나 장비가 크고 비싼 단점이 있다. 따라서 누구나 쉽고 간단하게 세포를 분리하기 위해서는 장비의 소형화 및 저렴한 단가가 필수적이다.
따라서 본 발명의 목적은 단가가 저렴하며 소형화된 아폽토틱 세포의 검침 및 분리장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 단가가 저렴하며 소형화된 아폽토틱 세포의 검침 및 분리장치 및 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 미세유체채널 및 자장을 이용하여 적은 양의 시료로 짧은 시간에 저렴한 단가로 아폽토틱 세포를 검침하는 아폽토틱 세포의 검침·분리 방법 및 이를 위한 장치를 제공하는 데 있다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포토리소그래피 공정을 이용하여 저렴하고 간단한 미소유체 구조물을 제작하고, 아폽토틱 세포 표면을 인식하는 C2A 단백질과 마그네틱 비즈를 이용하여 빠르고 간단하며, 정확도 높은 아폽토틱 세포 검침 및/또는 분리용 칩을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 미세유체채널을 이용한 칩을 사용하여 아폽토틱 세포를 검침 및/또는 분리하는 방법을 제공한다. 아울러 본 발명은 아폽토틱 세포의 검침을 통하여 암 등의 종양질환이나 자기면역질환 환자의 치료효과를 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)에서 점검하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 신약개발에 있어서 아폽토시스 유도 물질을 스크리닝하는 초고속 약물검색 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 미세유체채널을 이용한 아폽토틱세포의 검침 및/분리용 칩을 제공한다. 본 발명의 미세유체채널을 이용한 아폽토틱세포의 검침 및/분리용 칩은 다수의 시료 또는 완충용액 주입구, 메인 채널, 다수의 시료 배출구를 포함하는 미세유체채널구조물을 포함한다. 미세유체채널 구조물은 반도체 제조에 사용되는 포토리소그래피 공정을 응용하여 제조한다. 상기 미세유체채널 구조물을 제조하는 물질로는 폴리디메틸실록산(poludimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메티크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸린(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리올레핀, 폴리이미드, 폴리우레탄 등의 다양한 고분자 재질이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 아폽토틱 세포 검침용 칩에 있어서는 폴리디메틸실록산 을 사용하는 것이 바람직하다. 폴리디메틸실록산은 투명하여 실험관찰에 유용하며, 독성이 없으며, 가공이 쉽고 값이 싸다는 장점이 있다. 본 발명의 미세유체채널 구조물에서의 시료 및 완충용액의 흐름은 이 분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 조절할 수 있다. 여기에는 전기적으로 적은 양의 액체시료를 이동시키는 전기삼투유체흐름(electroosmotic flow), 박막펌프(membrane pump), 시린지펌프(syringe pump)를 사용하는 방법 등이 포함된다.
또한 본 발명의 아폽토틱세포 분리 및 검침용 장치는 메인 채널의 일 방향으로 자기장을 형성시켜주는 자기장치를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 자기장치로는 고정자석(permanent magnet), 전자석(electro magnet)이 포함된다. 또한 본 발명의 아폽토틱세포 분리 및 검침용 장치는 배출구로 배출되는 세포를 검출(detect)하는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 검출장치로는 스핀벨브센서(spin valve sensor)의 일종인 MTJ, GMR, Hall 센서가 사용될 수 있으나, 여기에 제한되지 아니하며, 당업계에서 널리 사용하는 검출장치는 모두 사용이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 미세유체채널을 이용한 칩을 사용하여 아폽토틱 세포를 검침 및/또는 분리하는 방법을 제공한다. 아폽토틱 세포의 표면에는 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS)이 나타나게 되는데, C2A 단백질은 아폽토틱 세포의 표면의 PS와 높은 친화력을 가지며 결합하는 특성이 있다. 이를 이용하여 바이오틴에 융합된 C2A 단백질(Biotinylated C2A(the C2A Domain of Synaptotagmin I)- GST(glutathione S-transferase) fusion protein)을 아폽토틱 세포에 결합시키고, 바이오틴-스트렙트아비딘 결합을 이용하여 2차로 마그네틱 비드 혹은 형광물질 등의 라벨표시 물질을 결합시킨다. 이렇게 하여 마그네틱 비드가 결합된 아폽토틱 세포는 자기장을 사용하여 분리 및 검침이 가능하다.
아울러 본 발명은 아폽토틱 세포의 검침을 통하여 암 등의 종양질환이나 자기면역질환 환자의 치료효과를 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)에서 점검하는 방법을 제공한다. 이는 상기 치료의 전과 후에 있어서, 환자로부터 채취한 시료에서 아폽토틱세포의 양의 변화를 측정함으로써 가능하다.
또한 본 발명은 신약개발에 있어서 아폽토시스 유도 물질 또는 아폽토시스 유도를 억제하는 물질을 스크리닝하는 초고속 약물검색 방법을 제공한다. 후보 물질을 세포와 배양하고 상기 아폽토틱 세포를 검침하는 방법을 사용하여 아폽토틱 세포가 검침되는지를 확인함으로써 아폽토시스 유도 물질을 스크리닝할 수 있다. 한편 아폽토시스 유도 억제물질의 스크리닝은, 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질과 후보 물질을 함께 세포와 배양하고 상기 아폽토틱 세포를 검침하는 방법을 사용하여 아폽토틱 세포로 유도된 정도를 비교하여 그 정도가 감소한 것으로부터 확인이 가능하다. 구체적으로, 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질과 후보 물질을 함께 세포와 배양하는 단계, 상기의 아폽토틱 세포를 검침하는 방법을 사용하여 아폽토틱 세포를 검침하는 단계, 상기 검침된 아폽토틱 세포의 양과 후보물질 없이 아폽토시스 유도물질과 세포를 배양하여 검침된 아폽토틱 세포의 양을 비교하는 단계, 후보물질을 함께 배양하였을 때 아폽토틱 세포의 유도가 감소된 것을 확인하는 단계를 포함한다.
이하 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 본 발명 을 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 실시예에 의하여 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
실시예1 미세유체를 이용한 세포 분리 장치 제작
도 1은 본 발명에 따른 아폽토틱 세포(apoptotic cell)의 검침 및 분리에 사용될 수 있는 PDMS 미세유체 채널 구조물의 제작과정을 설명하는 설명도이다. 도 1의 PDMS 미세유체 채널의 제작과정은 다음과 같다.
제1단계는 SU-8 스핀 코팅을 한다. 즉, SU-8(SU-8 2100, MicroChem Corp.) 에폭시 기반 포토리지스트를 웨이퍼에 붓기 전에, 웨이퍼를 메탄올, 아세톤, 증류수 등으로 세척하여, 깨끗한 웨이퍼 표면에 스핀코팅 장비를 이용하여 SU-8을 박막으로 올리고 핫플레이트를 이용하여 95oC에서 35분 동안 구웠다.
제2단계는 SU-8 주형의 패턴에 따라 자외선(UV) 광선에 노출하고 다시 굽는다. 즉, 제1단계에서 증착된 SU-8 포토리지스트를 365 nm 파장대의 UV 광선에 60초동안 노출하는데, 이때 원하지 않는 부위, 즉 도 1의 2에서와 같이 SU-8 스핀 코팅된 웨이퍼의 상부의 테두리부분에 UV 광선이 닿지 않도록 차광수단을 위치시킨다. 이렇게 UV 광선에 노출된 웨이퍼를 65oC에서 1분 그리고 95oC에서 31분 굽는다.
제3단계는 SU-8 전용 현상액으로 원하지 않는 부위를 제거한다. 즉, 제2단계에서 UV 광선에 노출되고 구워진 웨이퍼에서 원하지 않는 부분인 제2단계에서 빛에 노출되지 않은 부분을 SU-8 전용 현상액(Sigma Aldrich)으로 제거한다. 이렇게 하여 높이 130μm의 SU-8 주형(鑄型)이 만들어진다. 이 SU-8 주형은 PDMS 미세유체 채널의 틀이 된다.
제4단계는 SU-8 주형에 혼합 PDMS 젤을 붇는다. 즉, 도 1의 3과 같이, SU-8 주형에 PDMS 젤과 전용 고형제로 9:1의 비율로 미리 섞어둔 혼합 PDMS 젤을 붇는다.
제5단계는 SU-8 주형에 부어진 혼합 PDMS 젤에서 기포를 진공에서 제거한 뒤 오븐에서 굽는다. 즉, 제4단계에서 SU-8 주형에 부어진 혼합 PDMS 젤에서 기포를 진공에서 제거한 뒤 오븐에서 80oC에서 45분동안 굽는다. 이렇게 구워서 완성된 PDMS 미소유체 채널 구조물은 도 1의 4와 같이, 그 밑면의 가운데 부분에 홈(메인 채널)을 형성한다.
제6단계는 PDMS 미소유체 채널 구조물에 호스관을 연결한다. 즉, 도 1의 5와 같이, PDMS 미소유체 구조물을 유리 기판(glass substrate)위에 위치시키고 PDMS 미소유체 구조물의 홈의 상단의 양측에 호스관을 연결한다.
도 2는 도 1에 의해 제작된 PDMS 미세유체 채널의 구조를 설명하기 위한 설명도이고, 도 3은 도 1에 의해 제작된 PDMS 미세유체 채널 구조물의 일예이며, 도 4는 도 2의 PDMS 미세유체 채널에서 주입구, 메인채널, 배출구를 설명하기 위한 설명도이다.
본 발명의 PDMS 미세유체 채널 구조물은 유리기판(90)위에 PDMS 미세유체 채널의 몸체(10)이 위치되며, PDMS 미세유체 채널의 몸체(10)는 메인체널(main channel)(100), 주입구(inlet)(300), 배출구(outlet)(200)을 구비한다. 상기 PDMS 미세유체 채널의 높이는 130μm이다.
주입구(inlet)(300)는 제1주입구(310), 제2주입구(320), 제3주입구(330)의 세개의 주입구가 순차적으로 구성되어 있다. 제1주입구(310), 제2주입구(320), 제3주입구(330)의 넓이는 각각 100μm, 90μm, 100μm이다. 제1주입구(310), 제3주입구(330)는 완충용액 주입구(buffer solution inlet)로 사용되며, 제2주입구(320)는 샘플 용액 주입구(sample solution inlet)로서 사용된다. 즉, 제1주입구(310)과 제3주입구(330)에는 완충용액이, 제2주입구(320)에는 샘플용액이 흘러들어 가게 된다. 그 이후 제1교차점(350)에서 제1주입구(310)과 제3주입구(330)의 유량이 제2주입구(320)의 유량을 채널 양 옆에서 밀어주어 초점을 맞추어 주게 된다. 좁은 폭으로 초점이 맞추어진 샘플용액은 이후 메인채널(100)을 통과하게 된다.
메인체널(100)은 250μm의 넓이를 가지는 몸통채널로 이루어지며, 메인체널(100)에는 영구자석(400)으로부터 인가된 자기장 영역을 구비되어 있다. 메인체널(100)은 상기 제1주입구(310)과 제3주입구(330)의 유량에 의해 제2주입구(320)의 유량이 좁은 폭으로 초점이 맞추어진 샘플용액이 통과하게 되며, 상기 샘플용액이 영구자석(400)으로부터 인가된 자기장 영역을 통과하게 되고 자기장의 영향을 받지 못한 샘플용액은 제2교차점(250)에서 모두 제1배출구(210)로 나가게 된다. 그러나 자기장의 영향을 받는 마그네틱 비즈 혹은 이와 결합된 세포는 자기장의 끌어 당기는 힘에 의해 궤적이 왼쪽으로 휘게 되어, 제2교차점(250)에서 제2배출구(220)으로 빠져나가게 된다.
배출구(200)는 제1배출구(210), 제2배출구(220)의 두개의 주입구가 순차적으로 구성되어 있다. 제1배출구(210), 제2배출구(220)의 넓이는 각각 156μm, 104μm이다. 제2교차점(250)에서 자기장의 영향을 받지 못한 샘플용액은 제1배출구(210)로 배출되며, 자기장의 영향을 받는 마그네틱 비즈 혹은 이와 결합된 세포는 자기장의 끌어 당기는 힘에 의해 궤적이 왼쪽(영구자석이 있는 쪽)으로 휘게 되어, 제2배출구(220)으로 배출된다. 영구자석(400)으로는 고정자석(permanent magnet) 또는 전자석(electro magnet)을 사용할 수 있다.
도 4의 설명을 다시 정리하면, 다음과 같다.
본 발명은 세 개의 주입구(300)와 두 개의 배출구(200)를 가지고 있으며, 제1주입구(310)과 제3주입구(330)에는 완충용액이, 제2주입구(320)에는 샘플용액이 흘러들어 가게 되며, 제1교차점(350)에서 제1주입구(310)과 제3주입구(330)의 유량이 제2주입구(320)의 유량을 채널 양 옆에서 밀어주어 초점을 맞추어 주게 되어, 좁은 폭으로 초점이 맞추어진 샘플용액은 이후 메인채널을 통과하면서 영구자석(400)으로부터 인가된 자기장 영역을 통과하게 되고 자기장의 영향을 받지 못한 샘플용액은 제2교차점(250)에서 제1배출구(210)으로 배출된다. 자기장의 영향을 받는 마그네틱 비즈 혹은 이와 결합된 세포는 자기장의 끌어 당기는 힘에 의해 궤적이 왼쪽으로 휘게 되어, 제2교차점(250)에서 제2배출구(220)로 배출된다.
실시예 2 세포배양 및 약물처리
아폽토틱 세포를 유도하기 위하여 저캣(Jurkat) 세포를 사용하였다. 정상의 저캣세포 (1x106 cells/ml)에 아폽토시스를 유도하기 위한 약물, 즉 클로로헥사미드 (chlorohexamide) 를 주입하였고 10μg/ml의 농도로 만들어 6시간 배양한 뒤 TRAIL 을 주입하여 500 ng/ml의 농도로 15시간 동안 배양하였다. 이런 과정을 거쳐 정상의 저캣세포들의 약 17%가 아폽토시스가 유도되었으며, 16% 정도가 괴사(necrosis)로 유도되었다(도 5).
도 5는 아폽토시스를 유도하는 약물과 저캣세포를 함께 배양하고 형광염색 후, FACS 장비로 측정한 결과이다. 정상 저켓세포 (1x106 cells/ml)를 클로로헥사미드 (10 μg/ml, 6시간)로 처리한 후, TRAIL (500 ng/ml, 15시간)로 처리하였다. 이후 세포를 아넥신 V-FITC 및 PI (BD Bioscience)로 이중염색하였다.
실시예 3 C2A 단백질의 바이오틴 결합
아폽토틱 세포에 결합시킬 C2A 단백질 표면에 바이오틴을 결합시켰으며, 이는 Jung HI 등에 의해 Bioconjug Chem. (Bioconjug Chem. 15(5) 983-987, 2004)에 기재된 방법으로 수행되었다. 즉 음성으로 대전된 SP 세파로즈 수지가 채워진 컬럼에 C2A 단백질을 가하여 SP 세파로즈 수지에 결합시켰다. C2A 단백질에 바이오틴에서 유도된 N-히드록시설포숙신이미드 (N-hydroxysulfosuccinimide; NHS) 에스테르를 이용하여 바이오틴과 결합시켰다. 이렇게 결합된 바이오틴-C2A 융합단백질은 아폽토틱 세포와 결합된 후 바이오틴-스트렙트아비딘(streptavidine) 결합을 이용하여 2차로 마그네틱 비즈 (magnetic beads) 혹은 형광물질 등의 라벨표시 물질의 결합을 가능하게 한다.
실시예 4 아폽토틱 세포에의 마그네틱 비즈의 결합
C2A-바이오틴 융합단백질은 세포가 아폽토시스화 되었을 경우 세포표면에 나타나는 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS)와 높은 친화력을 가진다. 따라서 아폽토시스 유도약물을 처리한 아폽토틱 세포 (5x105 cells/ml, 200μl)를 차가운 인산완출용액(PBS)에 두 번 씻은 후, 준비된 C2A-바이오틴 융합 단백질 용액 5μl를 주입하고 염화칼슘 용액 (200mM, pH 7.4, 10μl)을 추가하여 C2A 단백질을 결합시켰다. 10분간의 반응시간 이후 세포 표면에 남아있는 반응하지 못한 바이오틴을 내포하고 있는 C2A 단백질을 차가운 PBS 용액으로 두 번 씻어 제거하여, 세포표면에 결합된 C2A-바이오틴 융합단백질과 마그네틱 비즈-스트렙트아비딘과의 반응을 방해하지 않도록 하였다. 스트렙트아비딘과 결합되어 있는 0.8 μm 크기의 마그네틱 비즈 (6x106 beads/ml, 10 μl, Bangs laboratory)를 주입하고 20분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 주었다. 이러한 일련의 과정은 도 6에 도식적으로 나타내었다. 즉, 도 6은 아폽토시스화 된 세포에 마그네틱 비드를 결합시키는 과정을 도식적으로 나타낸다. 이런 과정을 거쳐 처리된 저캣세포들 중 일부가 마그네틱 비즈와 결합한 모습을 도8의 C에서 관찰할 수 있다.
실시예 5 유량의 최적화
아폽토틱 세포를 분리하기 위하여 샘플용액 및 완충용액의 적절한 유량조건을 실험하였다. 샘플용액의 유량은 너무 느릴 경우 샘플이 주입구에서 막히는 현상이 발생하며, 고안된 장비의 목표인 빠른 분리 기능을 저해할 수 있어 0.8 μm 크기의 비드를 이용하여 장비에서 인가 가능한 최대 자기장인 3000 가우스에서 안정적인 분리가 가능한 5μl/min (1ml 시린지) 유량으로 정하였으며, 완충용액은 안정적인 초점 유지 및 샘플용액과의 낮은 유속차이, 그리고 교차점2에서의 높은 성능을 고려하여 100μl/min (5ml 시린지)로 정하게 되었다. 도 7은 샘플용액의 유량이 5μl/min (1ml 시린지)로 일정한 가운데, 완충용액의 유량을 100 μl/min (5ml 시린지)에서 25 μl/min (5ml 시린지)까지 변화를 주어 제1교차점과 제2교차점에서의 특성을 나타낸 것이다.
실시예 6 아폽토틱 세포의 분리 및 검침
유량을 최적화시킨 후, 아폽토시스 유도 약물처리 및 마그네틱 비즈가 처리된 저캣세포 샘플용액을 5μl/min (1ml 시린지) 유속으로 고안된 장치 속으로 흘려 보냈으며, 완충용액은 100 μl/min (5ml 시린지) 유속으로 흘려 보냈다. 영구자석은 몸통 채널로부터 4 mm 떨어진 곳에서 국부적으로 최대 3000 가우스의 자기력을 인가하였다. 도 8에는 아폽토시스 유도 약물을 처리하기 이전의 정상세포 (도8-(A))와 약물 처리 후 마그네틱 비즈와의 결합단계 없이 제1배출구을 통해 수집된 아폽토틱 세포(도8-(B)), 마그네틱 비즈를 결합시킨 뒤 제2배출구를 통해 수집된 세포(도8-(C)), 약물처리 이후 C2A 단백질과 마그네틱 비즈에 의해 결합된 아폽토틱 세포와 결합하지 않은 정상세포(도8-(D))가 나타나 있다.
표1은 실험결과를 종합적으로 나타낸다. 마그네틱 비즈 만 흘려 보냈을 경우 0.8 μm, 8.8 μm 모두 자기력에 의해 궤도가 편향되어 배출구 2를 통해 대부분이 수집되었으며, 마그네틱 비즈 처리를 하지 않았거나, 정상세포, 그리고 자기장을 인가하지 않은 경우엔 대부분이 편향 없이 배출구 1을 통하여 수집되었다. 하지만 아폽토시스 유도 약물처리 후 마그네틱 비즈 처리까지 한 경우 자기력에 의해 약 35.5%가 궤도 편향을 그리며 배출구 2를 통해 수집되었다. 이는 도2에서 보여준 17%의 아폽토시스 수치 보다 많은 것으로, 후기 아폽토시스와 괴사(necrosis) 단계 (16%)까지 포함하는 결과를 나타내고 있음을 알 수 있다.
주입된 샘플타입 마그네티즘 (magnetism) 단위 수(Number of Units)
출구(1) 출구(2)
정상세포 활성화 42x104 cells/ml 0.5x104 cells/ml
비활성화 44.9x104 cells/ml 0.13x104 cells/ml
마그네틱 비즈 (0.8 μm) 활성화 0.8x104 beads/ml 11.4x104 beads/ml
비활성화 33.1x104 beads/ml 0 beads/ml
마그네틱 비즈 (8.8 μm) 활성화 4.3x104 beads/ml 22.1x104 beads/ml
비활성화 83.4x104 beads/ml 0.6x104 beads/ml
아폽토틱 세포+ 마그네틱 비즈(0.8 μm) 활성화 26.3x104 cells/ml 14.5x104 cells/ml
비활성화 39.5x104 cells/ml 0.15x104 cells/ml
본 발명에 따르면 미세유체채널 및 자장을 이용한 아폽토틱 세포의 검침 방법 및 이를 위한 장치를 제공한다. 아폽토틱 세포의 표면을 인식하는 C2A 단백질 및 마그네틱 비드가 세포표면에 결합된 아폽토틱 세포를 포토리소그래피 공정을 이용한 PDMS 재질의 저렴하고 간단한 미소유체 구조물을 사용하여 검침 및 분리하는 방법 및 장치를 제공함으로써 장치의 소형화 및 저렴한 단가의 이점을 제공한다.
아폽토틱 세포의 검침은 암 등의 종양질환이나 자기면역질환 환자의 치료효과를 in vivo 또는 in vitro에서 점검하는데 활용할 수 있다. 또한 신약개발에 있어서 아폽토시스 유도 물질 또는 아폽토시스 유도를 저해하는 물질을 검색함으로써 초고속 약물검색 시스템을 구축할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하였지만 해당 기술분야의 숙련된 당업자라면 명세서 및 특허청구범위에 기재된 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. 샘플용액 주입구, 완충용액 주입구, 메인 채널, 제1배출구, 제2배출구를 포함하는 미세유체채널구조물, 메인 채널의 일 방향으로 자기장을 형성시켜주는 자기장치를 포함하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치에 있어서,
    바이오틴-C2A 융합단백질(Biotinylated C2A(the C2A Domain of Synaptotagmin I)- GST(glutathione S-transferase) fusion protein)을 이용하여 마그네틱 비즈와 결합된 아폽토틱 세포를 포함하는 샘플용액을 상기 샘플용액 주입구로 흘려보내고,
    완충용액을 상기 완충용액 주입구로 흘려 보내며,
    상기 메인채널의 일측에 위치되어 국부적으로 자기력을 인가하는 상기 자기장치에 의해 상기 샘플용액 주입구로부터 상기 메인채널에 흘러들어온 샘플용액 중 마그네틱 비즈에 의해 결합된 아폽토틱 세포는 자기력에 의해 궤도가 편향되어 제2배출구로 배출되며, 샘플용액 중 마그네틱 비즈에 의해 결합되지 않은 세포는 편향없이 제1배출구로 배출되는 것을 특징으로 하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1배출구 및 상기 제2 배출구를 통하여 나오는 세포를 수집하여 검침하는 장치를 더 포함하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  3. 제1항에 있어서, 미세유체채널구조물이 폴리디메틸실록산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 자기 장치는 고정자석(permanent magnet) 또는 전자석(electro magnet) 인 것을 특징으로 하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  5. 샘플용액 중의 아폽토틱 세포에 바이오틴이 융합된 C2A 단백질을 이용하여 마그네틱 비드를 결합시키는 단계;
    마그네틱 비드와 결합된 아폽토틱 세포를 포함하는 샘플용액을 제1항 내지 제4항의 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치의 미세유체채널 구조물의 샘플용액 주입구에 주입하는 단계;
    주입된 상기 샘플용액이 상기 미세유체채널의 메인채널을 통과하는 동안 상기 메인채널의 일측에 위치한 자기장치에 의해 자기장을 걸어 주는 단계;
    상기 메인채널을 통과하여 상기 자기장치의 자기력에 의해 궤도가 편향되어 제2배출구를 통해 나오는 세포 및, 상기 자기력에 의해 궤도가 편향되지 않고 제1배출구를 통해 나오는 세포를 수집하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플용액 중에서 아폽토틱 세포를 분리 또는 검침하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 샘플용액 중의 아폽토틱 세포에 바이오틴이 융합된 C2A 단백질을 이용하여 마그네틱 비드를 결합시키는 단계는,
    저캣(Jurkat) 세포에 아폽토시스 유도 약물을 주입하고 배양하는 과정을 거쳐 아폽토틱 세포를 유도하는 단계;
    상기 아폽토틱 세포에 바이오틴-C2A 융합 단백질 용액을 주입하고 염화칼슘 용액을 추가하여 아폽토틱 세포에 바이오틴-C2A 융합단백질을 결합시키는 단계;
    상기 바이오틴-C2A 융합단백질과 결합된 아폽토틱 세포에, 스트렙트아비딘과 결합되어 있는 마그네틱 비즈를 주입하여 아폽토시스화 된 세포에 마그네틱 비드를 결합시키는 단계;
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 아폽토틱 세포를 분리 또는 검침하는 방법.
  7. 암을 포함하는 종양질환이나 자기면역질환 환자의 치료의 전과 후에 있어서, 환자로부터 채취한 시료에서 제5항에 기재된 방법으로 아폽토틱세포를 검침하여 아폽토틱세포의 양의 변화를 측정함으로써 치료효과를 측정하는 방법.
  8. 후보 물질을 세포와 배양하는 단계, 제5항의 아폽토틱 세포를 검침하는 방법을 사용하여 아폽토틱 세포가 검침되는지를 확인하는 단계를 포함하는 아폽토시스 유도 물질을 스크리닝하는 방법.
  9. 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 물질과 후보 물질을 함께 세포와 배양하는 단계, 제5항의 아폽토틱 세포를 검침하는 방법을 사용하여 아폽토틱 세포를 검침하는 단계, 상기 검침된 아폽토틱 세포의 양과 후보물질 없이 아폽토시스 유도물질과 세포를 배양하여 제5항의 아폽토틱 세포를 검침하는 방법으로 검침된 아폽토틱 세포의 양을 비교하는 단계, 후보물질을 함께 배양하였을 때 아폽토틱 세포의 유도가 감소된 것을 확인하는 단계를 포함하는 아폽토시스의 유도를 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 영구자석으로부터 일방향으로 자기력이 인가되어 자기장의 영향을 받는 자기장 영역을 구비하며, 샘플 용액이 흐르는 통로를 제공하는 메인 채널;
    상기 메인 채널의 일측에 제1주입구, 제2주입구, 제3주입구를 순차적으로 위치되어 있으며, 상기 제1주입구과 상기 제3주입구는 완충용액 주입구이며, 상기 제2주입구는 샘플용액 주입구인 주입구들;
    상기 메인 채널의 다른 일측에 위치하며 제1배출구, 제2배출구가 순차적으로 위치되어있으며 상기 제1배출구는 자기장의 영향을 받지 못한 샘플용액을 배출하며, 상기 제2배출구는 바이오틴-C2A 융합단백질을 이용하여 마그네틱 비즈와 결합된 아폽토틱 세포가 자기장의 영향을 받아 편향되어 배출되도록 이루어진 배출구들;
    을 구비하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 제1주입구, 상기 제2주입구, 상기 메인채널이 교차하는 제1교차점에서 상기 제1주입구와 상기 제3주입구의 유량이 상기 제2주입구의 유량을 채널 양 옆에서 밀어주어 초점을 맞추어 주게 되어, 좁은 폭으로 초점이 맞추어진 샘플용액은 이후 상기 메인채널을 통과하면서 상기 영구자석으로부터 인가된 자기장 영역을 통과하게 되도록 이루어진 것을 특징으로 하는 아폽토틱세포 분리 또는 검침용 장치.
  12. 삭제
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