KR100769358B1 - 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법 및 그에이용되는 프라이머 세트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 비교함으로써 방사무늬김 중에서 일본품종과 자생품종을 유전학적으로 간편하게 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 김의 품종관리를 통해 각 지역 양식업계에서 원하는 적품종을 매년 지속적으로 공급할 수 있으며, 양식과정에서도 수시로 간편하게 품종의 혼입여부를 감시할 수 있게 되어 소비자에게 고품질의 다양한 제품(김)을 공급할 수 있게 된다.

또한, 방사무늬김의 자생품종을 정확히 동정하고 이에 육종기술을 추가하여 자생 신품종을 개발할 수 있게 되며 기타 다른 김류의 품종 동정까지 적용범위를 확대시킬 수 있게 된다.

김, 방사무늬김, 품종, 자생, SSU, 인트론, 동정

Description

방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법 및 그에 이용되는 프라이머 세트{Method for Genetically Discriminating a Korean Native Porphyra yezoensis Ueda, and a Primer Set for the Method}

도 1a 내지 1f는 일본산과 국내 자생품종 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 정렬한 도표이다.

도 2는 본 발명에 의한 PCR 증폭 기법에 따라 일본산과 자생품종의 SSU rDNA의 상부 인트론이 증폭됨을 보여주는 전기영동 사진이다.

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본 발명은 방사무늬김 중에서 일본품종과 자생품종을 유전학적으로 간편하게 구별하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 방사무늬김의 일본품종과 자생품종의 염기서열을 분석함으로써 유전학적으로 정확하면서도 간단하게 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

우리나라 양식 김의 연간 생산량은 약 22.8만톤이고, 생산액은 1,915억원으로 전체 해조류 연간 총생산액인 2,560억원의 약 75%를 차지하고 있다(해양수산부 어업생산통계 2004).

현재 국내에서는 참김(Porphyra tenera Kjellman), 방사무늬김(P. yezoensis Ueda), 모무늬돌김(P. seriata Kjellman) 그리고 잇바디돌김(P. dentata Kjellman) 등 4종이 주로 양식되고 있다. 인공채묘가 도입되기 전까지 우리나라에서 양식되어 온 김은 주로 참김으로 알려져 있다. 그러나 1968년부터 1970년까지 각 양식장의 표본을 채취하여 조사한 결과 참김은 일부 지역 또는 한 시기에 국한되어 양식되는 반면 방사무늬김은 대부분의 양식장에서 주류를 이루어 양식되는 것을 확인한 바 있다. 이러한 방사무늬김의 강세현상은 향후 인공채묘가 보급됨에 따라 더욱 가속화되었다(강제원, 한국수산학회지 3: 77-92, 1970).

현재 방사무늬김은 우리나라 양식김의 약 70%를 차지하고, 김밥용 김(190×210 mm)과 재래김(190×270 mm)으로 가공되고 있으며, 품종으로는 일본에서 도입된 품종과 자생품종으로 구분된다.

방사무늬김을 생산하고 있는 어업인들은 일본품종 또는 자생품종을 구분하여 공급해 줄 것을 종묘생산업계에 요구하고 있다. 그러나 김은 생육환경에 따라 형태·해부학적 형질 변이가 크기 때문에(황 등 Algae 16: 233-273, 2001) 이러한 형질만으로는 방사무늬김의 일본품종과 자생품종을 구분하기 어려우므로 종묘생산업체 에서는 품종을 명시하지 않은 상태로 종묘(사상체)를 판매하고 있으며 이로 인해 품종관리가 전혀 이루어지지 않고 있을 뿐 아니라 품종과 관련된 크고 작은 분쟁의 원인이 되고 있다. 따라서 김의 정상적인 품종관리 및 품질개선과 다양화를 위해 특정 염기서열과 primer 개발이 요구되고 있다.

현재까지 김을 대량으로 생산하고 있는 국가는 한국, 일본, 중국이며, 한국과 중국에서는 방사무늬김의 경우 상당 부분 일본품종이 사상체 형태로 유통되고 있는 실정이다. 종자전쟁이라고도 불리는 신품종보호제도를 대비하는 차원에서 국내 자생품종을 정확히 식별하고 이에 육종기술을 추가하여 신품종을 개발한다면 일본품종에 대한 로열티 지급을 최대한 방지하고, 나아가 자생품종 유래의 신품종 수출을 통하여 로열티 수익을 창출할 수 있게 될 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 염기서열 분석을 통해 보다 정확하면서도 간편한 품종 구별방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 핵의 SSU (small subunit) rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 비교함으로써 방사무늬김 중에서 일본품종과 자생품종을 유전학적으로 간편하게 구별할 수 있는 방법을 제공한다.

이를 위하여 본 발명자는 먼저 국내 각지의 자연 및 양식장에서 김 샘플을 다수 채집한 다음 종래 알려진 방법(예컨대, 황미숙 등 논문 "한국 남서해안 자연채묘 양식 김의 DNA 염기서열과 동정" Algae, 20(3); 183-196, 2005)에 따라 동정하여 방사무늬김 9개 시료를 선별하였다(표 2 참조).

이어서 선별된 각 방사무늬김의 총 DNA를 추출하고 증폭하여 SSU rDNA의 상부(upstream) 인트론(intron)의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 이미 알려진 일본산 방사무늬김의 동일 염기서열(서열1)과 정렬하여 비교함으로써 SSU의 상부 인트론 염기서열의 특정 부위가 상이함을 확인하였다(도 1a~1f 참조). 일본산 방사무늬김의 SSU rDNA 인트론의 염기서열은 GenBank에서 입수하였다. 선별된 시료 중에서 한 종류는 일본산의 염기서열과 일치하였는데, 이는 양식과정에서 일본산 방사무늬김이 혼입되었기 때문인 것으로 판단된다.

SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 결정하기 위하여 PCR용 프라이머 세트(서열2 및 서열3)를 개발하였다(청구항 10).

이에 따라 본 발명은, (A) 방사무늬김 자생품종의 SSU rDNA의 상부(upstream) 인트론의 염기서열을 결정하고, 일본산 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열(서열 1)과 정렬한 다음, (B) 정렬된 염기서열에서 12, 71, 75, 82, 251, 331, 348번째 염기 중 어느 하나 이상이 T이거나, 343, 495번째 염기가 A이거나, 353, 356, 496번째 염기 중 어느 하나 이상이 G이거나, 485, 486번째 염기 중 어느 하나 이상이 C이면 자생품종으로 판단하는 단계를 포함하는 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법을 제공한다(청구항 1).

자생품종과 일본산 방사무늬김의 SSU rDNA 상부 인트론의 염기서열을 정렬하고 비교한 바, 도 1a 내지 도 1f에 나타난 바와 같이 14개소의 염기가 상이함을 확인할 수 있었다(이를 표 4에 정리하였다). 본 발명의 제 1항은 이들 14개소 염기 중에서 어느 하나라도 상이함이 확인되면 자생품종인 것으로 결정하는 방법이다.

한편, 전술한 바와 같은 염기서열 변이는 인접한 위치에서 3~5개소의 변이가 집중적으로 나타난다. 따라서 본 발명은 71, 75, 82번째 염기가 모두 T이거나(청구항 2), 331, 343, 348, 353, 356번째 염기가 각각 T, A, T, G, G 이거나(청구항 3), 485, 486, 495, 496번째 염기가 각각 C, C, A, G이면(청구항 4) 더욱 확실하게 자생품종으로 결정할 수 있게 된다.

본 발명에 의한 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법을 수행하기 위하여, 방사무늬김의 총 DNA로부터 SSU rDNA의 상부 인트론을 PCR 증폭한 다음 염기서열을 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 PCR 증폭을 위하여 InF1(서열2) 및 InR1(서열3)의 프라이머 세트를 사용한다(청구항 5). 이때 사용되는 상기 프라이머 세트에 관해서도 별도의 청구항으로 청구하였다(청구항 10).

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본 발명에서 사용되는 프라이머 세트의 서열을 표 1에 정리하여 나타내었다.

이하 실시·적용예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시·적용예는 본 발명의 확립과정과 적용예를 동시에 설명하기 위한 예시적인 것일 뿐 본 발명의 기술적 사상 또는 그 범위가 이에 의해 변하거나 한정되는 것은 아니다.

실시·적용예 1 : 시료의 채집 및 방사무늬김의 선별

우리나라의 서해안 및 남해안의 각지의 양식장 및 비양식장(자연 암반)에서 시료를 채집하였다. 시료는 멸균 해수용액으로 부착생물과 오염물질을 제거하고 Kimwipes로 수분을 제거한 후 건조기가 담긴 원심분리용 튜브에 넣어 상온에 보관하였다. 채집된 시료를 황 등의 방법("한국 남서해안 자연채묘 양식 김의 DNA 염기서열과 동정" Algae, 20(3); 183-196, 2005)에 따라 동정하여 방사무늬김 9개 시료를 선별하였다(표 2).

실시·적용예 2 : DNA 분리, 정제 및 SSU rDNA 염기서열 결정

선별된 방사무늬김 시료로부터 총 DNA를 추출한 다음 이를 주형으로 하여각각의 SSU rDNA 염기서열을 분석하였다.

(1) DNA 분리 정제

건조 보관한 시료를 Strach-Crain 등(1997)의 방법으로 세포를 분해하고 단백질을 제거한 후 Wizard DNA Clean-Up System (Promega, WI, USA)의 resin을 1mL 첨가하여 column을 통과시켰다. 이어서 2㎕의 80% isopropanol을 column에 통과시킨 후 2분간 12,000rpm으로 원심분리한 다음 10분간 건조하였다. 이어서 50㎕의 증류수를 column에 넣고 20초간 12,000rpm으로 원심분리하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 에티디움브로마이드(EtBr)가 첨가된 0.8% agarose gel 상에서 확인하였다.

(2) SSU rDNA 염기서열 분석

추출된 총 DNA를 주형으로 하고, 사전에 확인된 일본산 방사무늬김의 핵 SSU rDNA 염기서열을 참조하여 제작한 InF1(서열2) 및 InR1(서열3) 프라이머 세트를 사용를 사용하여 각 시료에 대한 PCR을 수행하였다(도 2). 도 2 및 3에서 A: D976, B: NS06, C: HM012, D: HM014, E: NS01, F: NS02, G: NS03, H: NS04, I: NS05, J: NS07를 나타낸다.

증폭된 유전자 부위의 PCR 산물을 DNA 정제 키트를 사용하여 정제한 다음 서열분석 키트(BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit; ABI, USA) 및 DNA 분석기(Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer; Applied Biosystems, USA)로 각 시료에 대한 염기서열을 결정하였다.

실시·적용예 3 : SSU rDNA 염기서열의 정렬 및 염기서열 변이 분석

분석된 각 시료 및 일본산 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 Clustral X Program(v.1.64b, Thompson et al., 1997)을 사용하여 정렬시킨 후 MacClade Program(v.3.08a, Maddison and Maddison, 1999)을 사용하여 염기서열의 변화를 확인하였다(도 1a~도 1f). 도 1a~도 1f에서 P.ye는 방사무늬김인 P. yezoensis Ueda를 나타내며, 이어서 시료명을 기재하였다. 예를 들면, P.yeAB177은 시료명 AB177인 일본 홋카이도 하코다테의 자연산 방사무늬김을 의미한다.

비교를 위한 일본산 방사무늬김의 출처는 표 3과 같으며, 이들의 SSU rDNA 인트론의 염기서열은 GenBank에서 입수하였고 이들 중 D976(TU-1 culture)은 홋카이도대학에서 실물시료를 분양받아 실제 염기서열 분석에 활용하였다.

분석된 각 시료와 일본산 방사무늬김의 염기서열 변이를 검토한 바, 시료 NS06을 제외한 모든 시료는 14개소에서 일본산과 다른 염기를 나타내었다(표 4). 김 양식장에서는 일본품종과 자생품종이 함께 양식되고 있으므로, 예외가 된 NS06은 일본품종으로 판명될 수 있다.

따라서 본 발명에 의한 방법에 따라 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열을 분석하고 검토하는 경우 간편하고 정확하게 일본산과 한국 고유의 자생품종을 구분할 수 있게 된다.

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본 발명에 의하면 방사무늬김의 품종관리 및 제품(김)의 품질관리를 용이하게 할 수 있고 나아가 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 검출키트를 활용하여 비전문가에 의해서도 간편하게 품종관리 및 품질관리가 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 의해 방사무늬김의 자생품종을 정확히 동정하고 이에 육종기술을 추가하여 자생 신품종을 개발할 기반을 확립할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

1. (A) 방사무늬김 자생품종의 SSU rDNA의 상부(upstream) 인트론의 염기서열을 결정하고, 일본산 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론의 염기서열(서열1)과 정렬하는 단계;

   (B) 정렬된 염기 서열에서 12, 71, 75, 82, 251, 331, 348번째 염기 중 어느 하나 이상이 T이거나, 343, 495번째 염기가 A이거나, 353, 356, 496번째 염기 중 어느 하나 이상이 G이거나, 485, 486번째 염기 중 어느 하나 이상이 C이면 자생품종으로 판단하는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 (B) 단계에서, 71, 75, 82번째 염기가 모두 T이면 자생품종으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 (B) 단계에서, 331, 343, 348, 353, 356번째 염기가 각각 T, A, T, G, G 이면 자생품종으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방사무늬김 자생품종의 유전학 적 구별방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 (B) 단계에서, 485, 486, 495, 496번째 염기가 각각 C, C, A, G이면 자생품종으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 (A) 단계 전에, InF1(서열2) 및 InR1(서열3)의 프라이머 세트를 사용하여 방사무늬김의 SSU rDNA의 상부 인트론을 PCR 증폭하는 단계가 추가되는 것을 특징으로 하는 방사무늬김 자생품종의 유전학적 구별방법.
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10. 방사무늬김의 SSU rDNA 상부 인트론 PCR 증폭용 InF1(서열2) 및 InR1(서열3)의 프라이머 세트.

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